Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy tạo rễ in vitro và chuyển cây Bình vôi (Stephania glabra (Roxb). Miers) ra vườn ươm

Nồng độ than 1 g/1 thích hợp choquá trình nuôi cấy tạo rề cây Bình Vôi in vitro - Công việc 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của thànhphần hữucơ đến quá trình ra rề cây Bình Vôi Môi trường thích

BÁO CÁO TÒNG KÉT

Tên đề tài: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy tạo rễin vitro và chuyển cây

Bình vôi (Stephania glabra (Roxb.) Miers) ra vườn ưưm

Số hợp đồng: 2020.01.98/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Mai Thị PhươngHoa

Đơn vị công tác: Đại Học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện: 03/2020 - 11/2020

TP Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 11 năm 2020

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấnđề 9

2 Mục đích 10

Chương 1 TÓNG QUAN 1.1 Giới thiệu cây Bình Vôi 11

1.1.1 Đặcđiểm hình tháivàphân bố 11

1.1.2 Giá trị kinh tế 12

1.1.3 Thành phần dược liệu 12

1.1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và thếgiới 13

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

1.1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.2 Cơsở khoa học của nhân giống bằng phươngpháp nuôi cấy mô te bào 15

1.2.1 Cơ sở của việc nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mầunuôi cấy mô từ chồi ngủ 15

1.2.2 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào 16

1.2.3 Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫunuôi cấy mô từ choi ngủ 16

1.2.4 Cơ sở của việc nghiên cứukhả năng tạo chồi từ chồi ngủnuôi cấy mô 17

1.2.4.1 Cơsở của việc nghiên cứu khả năng phát triển cây từ chồi nuôi cấymô 17

1.2.4.2 Tạo cây hoàn chỉnh 17

1.2.5 Một sốyếutố ảnh hưởng đến quá trìnhnuôi cấy mô tế bào thực vật 18

1.2.5.1 Vật liệunuôi cấy 18

1.2.5.2 Điềukiện nuôi cấy 19

1.2.5.3 Môi trường nuôi cấy mô te bào thực vật 19

2.1 Thời gian, địa điếm và vật liệu nghiên cứu 28

2.2 Phươngpháp nghiên cứu 28

2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu tạo rễ cây Bình Vôi in vitro 28

2.2.1.1 Công việc 1.1: Khảo sátảnh hưởng của tỷ lệ NAA/IAAvà NAA/IBA đến quátrình tạo rề BìnhVôi in vitro 28

2.2.1.2 Công việc 1.2: Khảo sát ảnh hưởng củathan hoạt tính đến quá trìnhtạo rề Bình Vôi

2.2.1.3 Công việc 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần hữu cơ đến quá trình ra rề cây

Bình Vôi 29

2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần giáthể đến tỷ lệsống của cây Bình Vôi khi chuyến ra vườn ươm 29

2.3 Phươngpháp thu thập và xửlý số liệu 30

2.3.1 Phương phápthu thập số liệu 30

2.3.2 Xửlý kết quả 30

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ket quả công việc 1: Vômẫutạo nguyênliệu cây Bình Vôi in vitro 33

3.1 Ket quả nội dung 1: Nghiêncứu tạo rễ cây Bình Vôi in vitro 31

3.1.1 Ket quả công việc 1.1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ NAA/IAA và NAA/IBA đến quá trình tạorễ Bình Vôi in vitro 31

3.1.2 Ket quả công việc 1.2: Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình tạo rễ BìnhVôi in vitro 34

3.1.3 Ket quả công việc 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần hữu cơ đến quá trình ra rễ cây Bỉnh Vôi in vitro 36

3.2 Ket quả nội dung 2: Nghiêncứu ảnh hưởng của thành phầngiáthể đến tỷ lệ sống của cây Bình Vôi khi chuyển ra vườn ươm 38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 1: QUY TRÌNH NUÔI CÁY TẠO RỀ IN VITRO NẰ CHUYẾN CÂY BÌNH VÒI RA VƯỜN ƯƠM 43

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT

Môi trường thạch: môi trường có bố sung agar 8 g/1

BA: 6-Benzylaminopurine

B5: môi trường Gamborg 1968

CTV: cộng tác viên

IBA: indolebutyric acid

IAA: Indole-3-acetic acid

LV: môi trường Litvay 1985

MS: môi trường Murashige-Skoog 1962

NAA: a-Naphthalene acetic acid

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Ketquả khảo sát ảnh hưởng của nong độ IAA, IBA vàNAA đến quá trình nuôi

cấytạo rễ câyBình vôi 32

Bảng 3.2 Ket quả khảo sát ảnh hưởng của thanđến quátrình nuôi cấy tạo rễ cây Bình vôi

in vitro 35

Bảng 3.3. Ket quả khảo sát ảnh hưởng của B1 và glycineđến quá trình nuôi cấytạo rề cây

Bình vôi 37

Bảng 3.4 Ket quả khảo sát ảnh hưởng cùa tỷ lệ phối trộn giá thể đến tỷ lệ sống của cây

Bình Vôi khi chuyển ravườn ươm 39

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1. Choi và rề cây bình vôi 45 ngày nuôi cấy trên môi trường có bo sung IB A 0,5

Hình 3.2 Chồi bìnhvôi trênmôi trường có bo sung than 1 g/1 35

Hình 3.3. Chồi bình vôi trên môi trường có bổ sung BI 10 mg/1: Mầu ban đầu (A) và sau

TÓM TẤT KÉT QUẢ NGHIÊN cứu

1 Nội dung 1: Nghiên cứu tạo rễ cây Bình Vôi in vitro

- Công việc 1.1: Khảo sát ảnh

hưởng của tỷ lệ NAA/IAA và

NAA/IBA đến quá trình tạo rễ

Bình Vôi in vitro

Để tạo rễ cây binh vôi in vitro cẩn bốsung NAA (1 mg/1) kết họp với IBA (0,5 mg/1) trên nền môi trường MS

- Công việc 1.2: Khảo sát ảnh

hưởng của than hoạt tính đến quá

trình tạo rễ Bình Vôi in vitro

Nồng độ than (1 g/1) thích hợp choquá trình nuôi cấy tạo rề cây Bình Vôi

in vitro

- Công việc 1.3: Khảo sát ảnh

hưởng của thànhphần hữucơ đến

quá trình ra rề cây Bình Vôi

Môi trường thích họp cho quá trình nuôi cấy tạo cây bình vôi in vitro hoànchỉnh là MS có bổ sung NAA (1 mg/1) + IBA (0,5 mg/1) + sucrose (30 g/1) + than (1 g/1) + B1 (10 mg/1)

2 Nội dung2: Nghiên cứu ảnh

hưởng của thành phần giá the đến

tỷ lệ sống của cây Bình Vôi khi

chuyển ravườn ươm

Thành phần giá thể thích họp cho giai đoạn ươm cây bình vôi hậu nuôi cấy

mô là: phân bò khô 10% và mụn dừa90%

01 Bài báo khoa học đăng trên tạp

chí/ kỷ yếu khoa học trong nước/

Tạp chí trường Đại học Nguyễn

01 Quy trình nuôi cấytạo rễ in Quy trình nuôi cấy tạo rễ in vitro và

vitrovà chuyên cây Bình vôi ra

vườn ươm

chuyến cây Bình vôi ravườn ươm

Thời gian đăng ký : từ ngày

Thời gian nộp báo cáo: ngày

đến ngày

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Theo cục quản lý y dược cổ truyền, hàng năm ngành dược ViệtNam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu Trong đó có khoảng 80 - 85% là nhập khẩu (chủ yếu từ Trung Quốc) Nguồn dược liệu trong nước chủ yếu là khai thác tự nhiên (70%), gieo trồng chỉchiếm khoảng 30% với sự phát triển nhỏ lẽ, thiếu sự quyhoạch đồng bộ Bên cạnh đó, tìnhtrạng nguồn gốc, chất lượng cây giống không đảm bảo cũng làm cho việc nuôi trồng sảnxuất dược liệu gặp nhiều khó khăn

Ngày nay nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm nhiêu hơn các sản phẩm dược liệu

có nguồn gốc từ thiên nhiên Có rất nhiều sản phấm được ra đời đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường, đã đem lại doanh thu và lợi nhuận rất cao cho các công ty dược Song song với đó là nhu cầu về nguyên liệu dược liệu ngày càng tăng, nguồn cung tự nhiênngàycàng khan hiếm Xuất phát từ vấn đềđó nước tađãquy hoạch 8 vùng trong tậpchung các loại cây dược liệu thế mạnh của nước ta Tuy nhiên, đế có thế manglại hiệu quảcao trong quá trình nuôi trồng và sản xuất cây dược liệu cần phải có chiến lược tuyển chọn, bảo ton và nhân giống cây dược liệumột cách khoa học và hợp lý

Tại Việt Nam, Rotundin từ cây Bình Vôi đà được chứng minh tác dụng an thần, giảm đau, gây ngủ, tác dụng hạ sốt, bảo vệ thần kinh, chống động kinh, hạ huyết áp, giãn

cơ trơn Học viện Quân Y cũng đã nghiên cứu tổng hợp thành công Rotundin sunfat từ Rotundin chiếtxuất từ củ Bình Vôi để sản xuất thuốc tiêm Hiện nay, trên thị trường dược liệu đã có rất nhiều sản phấm có chứa Rotundin và Rotundin sunfat như sản phẩm viên Rotunda, Sen vông, Roxen, Nightqueen Việc sừ dụng Rotundin nguồn gốc tự nhiên chothấy những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủsinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi, nhức đầu, hoa mắt, buồn nôn, khô miệng, vụng về,giảm tập trung, không bị lệ thuộc thuốc, giảm trí nhớ nếu sử dụng kẻo dài như các loại thuốc tong họp từ hoá chat (Seduxen, Valium, Stinox, Xanax, Temesta ) Các nghiên cứu gần đây nhất còn cho thấy Rotundin khi sử dụng với liều thấp còn có tác dụng làm giảm ảnh hưởnggây nghiện của cocain

Với những đặc tính dược liệu ưu việt như trên, cây Bình vôi đã được đưa vào danh mục 54 cây dược liệu được ưu tiên phát triển giai đoạn 2015 - 2020 của bộ y tế Theo kếtquả khảo sát các cửa hàng kinh doanh sản phẩm dược liệu trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh của Trung tâm Tưvấn và Hồ trợ Nông nghiệp thuộc sở Nông nghiệp và Phát triểnNông thôn Thành phố Ho Chí Minh (2018), Bình Vôi là loại dược liệu có lượng tiêu thụ

rất lớn với khoảng 640 kg/tháng/200 cửa hàng với giá trung bình 415.000 Đ/kg Nguồncung Cây Bình vôi ở nước ta chủ yếu do người dân khai thác ngoài tự nhiên nên khôngđảm bảo về số lượng vàthường phải nhập khấu.

Chi Stephania có khoảng trên 50 loài, ở Việt Nam có khoảng 14-16 loài Các loàiBình vôi ở nước ta phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam, thường gặp ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Ọuang, Hoà Bình, Cao Bằng, Thanh Hoá, Lâm Đồng, Bà Rịa -Vũng Tàu Thành phần hóa học chính của Bình vôi là alkaloid, trong đó hoạt chất chính

có tác dụng là L-tetrahydropalmatin (rotunđin), stepharin, roemerin, cycleanin, cepharanthin vớihàm lượng rất khác nhau trong từng loài

Nhu cầu củ Bình Vôi trên thị trường ngày càng tăng với giá thành ngày càng được tăng cao dần đến tình trang khai thác quá mức, không có qui hoạch đã làm cho loài cây nàyngày càng cạng kiệt ngoài tự nhiên Cùng với đó, hàm lượng dược chất có trong các loàibình vôi là rất khác nhau, phương thức nhân giong truyền thống không đảm bảo số lượng, chất lượng cây giống cũng gây ảnh hưởng rất lớn đến việc quy hoạch trồng loài cây này

Vì vậy việc khảo sát đe tìm kiếm loài Bình vôi có hàm luợng dược chất cao, đe xây dựng

kế hoạch bảo tồn và nhân giống, trồng bình cây vôi là hoàn toàn cần thiết Xuất phát từ những lý do trên tôi nhân thấy cần thiết phải thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện quytrình nuôi cấy tạo rễ in vitro và chuyển cây Bình vôi (Stephania glabra (Roxb.) Miers) ravườnươm ”

2 Mục tiêu đề tài

- Xác định được môitrường nuôi cấytạo rễ câyBình Vôi in vitro

- Xác định được thành phần gíá thể thích hợp để chuyển cây Bình Vôi từ điềukiện nuôi cay in vitroravườn ươm

Chương 1

TÓNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu cây Bình Vôi

Giới (genum): Plantea

Ngành: Magloliophyta

Phân lớp: Magloliosida (Dicotyedones)

Bộ(ordo): Ranunculales

Họ (familia): Menispermaceae

Mộtsố tên gọi khác ờ Việt Nam : Cây củ một, cu moi tron, oay moi trơn

Chi Bình Vôi hay chi Thiên Kim Đằng (Stephania spp) là một chi thực vật có hoatrong họ Biến bức cát (Menispermacea hay còn gọi là họ Tiết dê) có nguồn gốc miền Đông, Nam Châu Á vàAustraylia

ớ Việt Nam, chi Bình Vôi biết gần 15 loài gồm các loài s brachyandra Diels; s

Cambodia Gagnep; s cepharantha Hayta; s dieỉsiana Y.C.Wu; s kwangsiensis H s Lo;

s pierrei Dield; 5. rotunda Lour; s. venosa (Blume) Spreng v.v tất cả đều có thể được dùng làm thuốc; 4 loài đã có tên trong sách đỏ3 Rễ phình thành củnên hình thái bên ngoài chúng tươngđối giống nhau

1.1.1 Đặc điểm hình thái và phân bố

Theo Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (1997), Bình Vôi thuộc dây leo có rề củ, dạng thân thảo; thường bám vào vách đá, dưới gốc hình thành củ sống hàng năm Thân nonnhằn, thường xanh và sống lâu năm, khi già có nhiều bì khống, hơi hóa gồ có khi xoắn vặn Rễ củ đa dạng, có the to và nặng tới 40 - 50 kg, vỏ ngoài xù xì màu nâu hoặc nâuđen

Lá mọc so le, cuống lá dài, đính vào trongphiến lá khoảng 1/3, phiến lá mỏng hìnhnhư trái tim hoặc gần tròn, hai mặt lá nhằn; gốc bằng, đầu tù, mép hơi lượn sóng, hai mép nhằn Gân lá xuất pháttừ chồ đính của cuống lá, tỏa ra hình chân vịt nôi rõ ở mặt dưới củalá

Cụm hoa mọc ở kè lá hoặc những cành già đã rụng lá thành sim tán Hoa đực vàhoa cái khác gốc, hoa đực có 5 - 6 lá đài, 3-4 cánh hoa màu vàng cam, 3-6 nhị, thường

lá 4; hoa cái có 1 lá đài, 2 cánh hoa; bầu hình trứng Mùa hoa là từ tháng4 -tháng 6 Mùa quảkhoảng tháng 8-10

Quả hạch hoi dẹt, mọng nước màu đỏ hoặc da cam; hạt cứng, hình móng ngựa ở giữa có lồ thủng hoặc không với những hàng vân ngang dạng gai, hai mặtbên lõm,

Là loại cây trồng phát triển tốt với điều kiện khí hậu thuận lợi nước ta Thích họp ở nhiệt độ trung bình năm 21 - 23°c, lượng mưa 2000 - 2500 mm, ưa đất nhiều mùn, thoátnước, độ pH = 6.5 - 7 Phân bố rất rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Việt Nam, tậptrung nhiều ở những vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ,Lạng Son, Quảng Ninh, Thanh Hóa Sự phân bố của mồi loài là khác nhau, tùy theo đặctính sinh học của từng loại8

1.1.2 Giá trị kinh tế

Theo sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Thành phố Ho Chí Minh (2018),Bình Vôi là loại dược liệu có nhu cầu sử dụng tiêu thụ lớn trong nước (ước tính 50-100 tấn/năm lượng với khoảng 640 kg/tháng/200 cửa hàng; 415.000 Đ/kg Từ 1992 đến nayBình Vôi dần khan hiếm và cạn kiệt Khai thác ngoài tự nhiên là chủ yếu nên không đảm bảo về số lượng và thường phải nhập khấu Mang lại giá trị kinh tế cao cho người dân địaphương, “xóa đói giảm nghèo” củamột số dân tộcvùng cao

1.1.3 Thành phần dược liệu

Củ thái lát dùng làm thuốc theo y học cổ truyền sử dụng tươi hay sấy khô, Nhómhoạt chất chủ yếu là các alkaloid: L-tetrahydropamatin, stepharin, cycleanin, tuduranin, palmatin, dihydropalmatin, dicentrin dễ gây ngộ độc (gây nôn) Hoạt chat rotundin cầnthiết trong y học tác dụng anthần, giảm đau, điều trị một số trường họp: rối loạn tâm thầnchức năng, trạng thái căngthẳng thần kinh, mất ngủ dai dắng, sốt, lỵ, dạ dày [Phan Thanh

Kỳ và cs, 1997; T T Thuy và cs, 2006] Stephania brachyandra Diels có hàm lượng L- tetrahydropalmatin cao nhất (khoảng 2,3-3,5%) trong một số những loài đã biết Cepharantin chừa ung thư, mới chỉ phát hiện ở 2 điếm tại Quảng Ninh và Hòa Bình mức đe dọa tuyệt chủng cao thuộc danh mục Sách đỏ và Danh mục đỏ cây thuốc Việt Nam

Đẻ khai thác lâu dài nguồn Bình vôi ở Việt Nam, trước mắt nên khai thác hạn chế, với khối lượng vừa đủ cho) Bên cạnh đó, cần hoàn tất việc nghiên cứu, phát triển một số

loài có hàm lượng cao như Stephania brachyandra Diels và Stephania kwangsienssis H s

Lo tại các tỉnh phía Bắc

1.1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giói

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 1940, Bùi Đình Sang đã chiết từ củ Bình Vôi mọc ở Việt Nam các chất tinhbột, đường khử oxy, axit malic, men oxydaza và một alkaloid với tỷ lệ 1,2 - 1,5% (tính trên củ tươi), được ông đặttên là rotundin3

Năm 1941, Trần Xuân Thuyết cùng với Đồ Tất Lợi, Bonnet và Bùi Đình Sang đàchiết xuấttừ củ bình vôi Stephania

Đen 1964, Ngô Vân Thu nghiên cứu thành phần dịch chiết từ củ Bình Vôi đà xácđịnh được một alkaloid mới với tỷ lệ 1 % và đặttên là alkaloid A

Năm 1965, Phan Quốc Kính cũng đã tách chiết từ cù Bình Vôi một so alkaloid khác và đặt tên là alkaloid A, alkaloid c và D với tỷ lệ 0,08% mồi loại Đối với những alkaloi khác của củ Bình Vôi, chỉ có alkaloid A (tức là roemerin) do Ngô Vân Thu chiết, được Dương Hữu Lợi thí nghiệm dược lý:

(1) Dungdịch alkaloid A có tác dụng gây tê niêm mạc vàphong bế: Tính theo công thức G Valette, dung dịch 0,5% có tác dụng gây tê niêm mạc tương đươngvới dung dịch 1,8% clohydrat cocain, theo thí nghiệm của Mak vàNelson, dung dịch alkaloid A 0,5%cótác dụng gây tê phong bế mạnhhơn dung dịch clohydrat cocain 1%và dung dịchnovocain 3%

(2) Alkaloid A làm giảm biên độ và tần số co bóp của tim ếch cô lập, nhưng với liều mạnh hon, tim ếch ngừng ở thời kỳ tâm trương Điều này chứng tỏdung dịch alkaloid

A có ảnh hưởng trực tiếp trên tấm cơ và làm ngừng co bóp Dung dịch alkaloid A có tácdụng đối lập với tác dụng gây tăng trương lực và nhu động co bóp ruột của dung dịch axetylcholin Dung dịch alkaloid A có tác dụng an thần gây ngủ với liều lượng nhẹ nhưng với liều cao kích thích thần kinh hệ trung ương, gây co giật và chết, ớ điểm này, dung dịch alkaloid A hoàn toàn khác han với dung dịch rotundin Ngoài ra, ancaloit A có tácdụng giãnmạch hạ huyết áp, giảm cả huyết áp tối đa và tối thiểu

(3) Dung dịch alkaloid A có độc tính LD50: 0,125g/kg thể trọng chuột, như vậy liều độc tươngđương với clohydratcocain, đồngthời dung dịch alkaloid A cũng có nhữngbiểu hiện độc như cocain (kích thích thần kinh hệ trung ương, biểu hiện co giật ) Năm

1965, chất này đã được xác định L-tetrahydropalmatin Việt Nam trở thành nước trên thếgiới chiết xuấtđược rotundin.

Bảo tồn, duytrì và đảm bảo nguồn dược liệu nhân giống in vitro các cây dược liệumang lại hiệu quả phục vụ cho sản xuất cùa Ngô Vân Thu và Trần Hùng Tiến (1986) ở Bình vôi tím và Bình vôi biển

Năm 1999, Tác giả Nguyễn Tiến Vũng đã tong hợp kết quả các chi Stephaniatrên the giới gồm 164 hoạt chất thuộc 8 nhóm hóa học khác nhau (Benzyllisoquinolin- bwnzyllisoquinolin, protoberin, aporphin, proaporphin, hasubanan, morphinan, dibenzazonin)

Năm 1999, theo Ngô Đại Quang tác dụng dược lý rotundin đã được áp dụng từ

1994 và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp thuộc Điều trị một số trường hợp đautim, mất ngủ, hen, đau bụng, tácdụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần

Phan Thị Kim và cộng sự đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột(150mg/kg thetrọng) tưong đương 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dượcđiển Trung Quốc - 1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LDso đường uống

Năm 2007, Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia pháttriển công nghiệp hoá dược đen năm 2020" nhiệm vụ đề ra trong Lĩnh vực 1: Ke thừa và phát huy các kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ trước đây để sản xuất các hoạt chất thiên nhiên từ thanh haohoa vàng, hoa hoè, chè xanh, gấc,

Nghiên cứu chiết tách, bán tổng hợp một số hoạt chất chính từ củ Bình Vôi

(stephanỉa rotunda) sản xuất L-rotundin và L-rotundin sulfat làm nguyên liệu sản xuất

thuốc [Quyết định số 61/2007/QĐ-TTg]

Trịnh Ngọc Nam và Nguyễn Văn Vinh (2011) nhân giống in vitro và khảo sát hợpchat alkaloid rotundine từcây BìnhVôi (Stephanỉa rotunda Lour)

1.1.4.2 Tình hình nghiên cún trên thế giới

Năm 1962, Falkhrutdinov Sf xác định roemerin gây tê niêm mạc và phong bế đối với tim ếch cô lập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp, với liều lượng cao tim éch ngừng đập ở thời kì tâm trương Roemerin đoi kháng với tác dụng tăng

co bóp ruột củaacetylcholine Đối với hệ thầnkinh trung ươngvới liều thấp roemerin còn

có tác dụng dãn mạch hạ huyết áp

Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo kozuka và cộng sự (1984), cepharanthin có tác dụng giãn mạch nhẹ trên nhũng mạch vi tuần hoàn, tăng cường sinh sản kháng thể nên

có tác dụng rõ rệt đối với các bệnh giảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốc chữa ungthư, sự biến động số lượng hồng cầu hoặc sắc

tố máu hầu như không thay đổi khi dùng cepharanthin Tác dụng phụ do uốngcepharanthin liều cao không thấy xuất hiện6

Kondo (1944), đưa ra công thức của rotundin là CisHiọíOCHỉhCH.vN7

Tại Ẩn Độ, năm 1950 và 1952, Ọiaudry và Siddiqui nghiên cứu và chiết từ củ câyBình Vôi nhiều alkaloid và đặt tên là hyndarin (C23H25O4N), stefarin (C18H19O3N) vàxyckanin (C38H42O6N2) Trong đó, hyndarin chiếm thành phần chủ yếu (khoảng 30%hyndarin, 15 - 18% stefarin và rất ít xycleanin) Nghiên cứu cấu tạo hyndarin cho là mộtalkaloid đã biết có tên là tetrahydropanmatin4

Mutsuo Kozuka và cộng sự (1984), Cepharanthin có tác dụng giãn mạch nhẹ trênnhững mạch vi tuần hoàn, tăng cường sinh sản

1.2 Cơ sở khoa học ciia nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

1.2.1 Cơ sở cua việc nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ

Chồi ngủ: Cây thường tạo ra các chồi "ngủ" để chắc chắn rằng cây có thể sống còn, nếu chồi ngọn chết đi hoặc bị sâu bọ ăn Trong một thời dài, khi ngọn lớn lên và sản xuất chất điều hoà sinh trưởng (hormone- kích thích tố) đế ngăn cản sựphát triển của các chồikhác trên thân cây Neu ngọn chết đi, chất điều hoà sinh trưởng bị thiếu hụt và các choi

"ngủ" bắt đầu pháttriển

Phương pháp nuôi cấy mô-tế bào: Cơ sở cùa sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

là tính toàn năng của tế bào Mồi tế bào đã chuyên hóa đều chứa một lượng thông tin ditruyền (bộ nhiễm sac the) giongvớitoàn bộ các tế bào khác trong một cơ the trưởng thành

và giống tế bào họp tử Nếu những tế bào đã chuyên hóa đề trong điều kiện nhất định tế bào đó có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đặc tính đó của tế bào gọi là tínhtoàn năng của tế bào Như vậy bất cứ một tế bào nào cũng có thể phát triển thành một câyhoàn chỉnhvà đó cũng là cơ sở của phương pháp nuôi cay in vitro, về mặt di truyền phân

tử có the nói rằng toàn bộ quá trình phát triến cá the của cây từ hợp tử cho đến khi câychết ở tuổi tối đa đà được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN đặc trưng cho loài Đờisống của câylà quá trình thực hiện dần dầnchương trình di truyền đó

1.2.2 Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào

Tính toàn năng của tế bào do Haberlandt (1902) mồi tế bào bất kì của một cơ thesinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành mộtcá thể hoàn chỉnh Theoquan điểm của sinh học hiện đại thì mồi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sè mang toàn bộthông tin di truyền cần thiết và đủ của cơthể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, mồi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thểhoàn chỉnh [21]

Sơđồ thể hiện sự biệt hóavà phản biệt hóa của tế bào

Quá trình biệt hóa TB->TB phôi sinh->TB giãn TB phân hóa chức năng-> Quá trình phản biệt hóa TB

Cơ sở thứ hai cùa phươngpháp nuôi cấy mô - tế bào là sựbiệt hóa và phản biệt hóacủa tế bào Sự biệt hóa tế bào là quá trình tế bào chuyển từ giai đoạn sinh trưởng tế bàosang giai đoạn chuyên hóa chức năng Các tế bào trong giai đoạn này đã có các đặc trưng khác nhau về cấu trúc và chức năng Sự phản phân hóa tế bào là quá trình diễn ra ngượclại, các tế bào đã biệt hóa trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia màtrong những điều kiện nhất định chúng có thể quay trở lại đóng vai trò như mô phân sinh

và có khả năng phân chiađe cho ra các tế bào mới [3], [1]

1.2.3 Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ

Trong giai đoạn này người ta thường sử dụng các loại hóa chất như: HgCỈ2, NaClO,Ca(OCl)2, H2O2 đế khử trùng mầu cấynhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn và tạo sựchủ động về nguồn mẫu cấy Nguồn mầu ban đầu có the là chồi, hạt hoặc các bộ phận khác của cây Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn vật liệu sạch để đưa vào nuôicấy ở các giai đoạn tiếp theo

Cần đảm bảo các yêu cầu: tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại sinh trưởngtốt Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cay Nayak s và cs (2011) [32] nghiên cứunhân giong cây riềng in vitro cho thấy: Khi thử nồng độ BA từ 1 - 3 mg/1 đến khả năng bậtchoi thì cho thấy ởnồng độ BA 3mg/l cho kết quả tốt nhất Behera K.K và cộng sự (2010)[30] sử dụng BAP 2 mg/1 vàNAA 0,5 mg/1 đế cảmứng chồi cây Nghệ Vàng Bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuối của mầu đem vào nuôi cấy Thường các mô non, chưa phânhoá có khả năng tái sinh cao hơn nhữngmô đã chuyển hoá

1.2.4 CƠ sở của việc nghiên cứu khả năng tạo chồi từ chồi ngủ nuôi cấy mô

Nhóm các chất điều hoà sinh trưởng như: auxin, cytokinin, gibberellin, và các chất phụ gia khác như nước dừa, chuối, khoai tây, có vai trò rất quan trọng, vì chúng thúc đẩy sự phân hoá cơ quan, đặc biệt là chồi Mục tiêu cúa giai đoạn này là tạo ra số lượng chồi, chồi sinh trưởng và phát triến tốt nhất đe chủ động sản xuất lượng lớn câygiống cung cấp cho thị trường

1.2.4.1 Cơ sở của việc nghiên cứu khả năng phát triển cây từ chồi nuôi cấy mô

Tạo câycon nuôi cấymô hoàn chỉnh: Khi các chồi đạt kích thước nhất định từ môi trường nhân nhanh được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ Thông thường, trong môi trường tạo rề hàm lượng Cytokinin giảm xuống, ngược lại tăng hàm lượng Auxin

Các chất ĐHST như: a - NAA, IBA, IAA ở nồng độ 0,1 - 5,0 mg/1 thường được sửdụng đetạo rễ chohầu hết các loài cây trong, ớ giai đoạn này, cây mô rất nhạy cảm vớiđộ

ẩm, ánh sáng và dễ nhiễmbệnh do hoạt động của lá và rề mới sinh ra vì vậy phải lưuýđếnyếu tốmôi trường trong nuôi cấy

Làgiai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hìnhthái và tăng số lượng thông quacác con đường: hoạt hóa choi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Mục đích củagiai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Đe tăng hệ số nhân chồi người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều ha sinh trưởng (auxin, cytokinin, ), các chất bổ sung khácnhư nước dừa, dịch chiết nấm mem, , kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Chế độ nuôi cấy thường là 25-27°C, có 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng

2000 - 4000 lux Tuỳ thuộc vào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển củacác choi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từphôi vô tính TheoJala A và cs (2012)[38] nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi kết hợp BA 1,0 mg/1 và NAA 0,1 mg/1cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8 chồi/mẫu sau 80 ngày nuôicấy

I.2.4.2 Tạo cây hoàn chinh

Khi đạt được kích thước nhất định các choi được chuyến sang môi trường ra rễ Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sè ra rề và trở thành cây hoàn chỉnh, ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộcnhóm auxin, nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rề phụ từ mô nuôi cấy.Trong nhóm này các chat IAA, IBA, NAA, 2.4D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất

để tạo rề cho chồi Nguyền Thị Liễuvà cs (2011) [13] đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D

đến khả năng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh cho thấy nồng độ tốt nhất cho sự hình thành

rễ bất định sâm Ngọc Linh là 2,4-D 1,0 mg/1 trong môi trường MS bo sung sucrose 50mg/1

Thíchứng cây in vitro ngoàiđiều kiệntự nhiên

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năng ứng dụng củaquá trình nhân giong in vitro trong thực tiễn sản xuất Là giai đoạn chuyến cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàn toàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích họp đe cây có the đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất Chú ỷ đảm bảo độ ấm, chế độ ánh sáng (tránh ánh sáng trực xạ cho câycon trong 2-3 tuần đầu), nhữngngày sau chế độ chăm sóc như cây hom hoặc cây ươm từ hạt ngoài vườnươm Sen A và cs (2010) [34] khi chuyến cây nghệ in vitro sang đất vườn

và cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây vi giống sinh trưởng và phát triển bình thườngtrong môi trường tự nhiên Shahinozzaman M (2013) chuyến cây con tái sinh in vitrosang chậu nhựa có chứa hồn họp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được làm thích nghi Kết quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao Theo Goer (1993) để đưa cây từ ốngnghiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một sốyêu cầu: - Cây trong ống nghiệm đã đạt nhùng tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều caocây) - Có giá the tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá the sạch, tơi xốp, thoát nước - Phải chủ động điều chỉnh được độ ấm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù họp

1.2.5 Một so yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

I.2.5.I Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, ), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm ), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ ) [24], Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưngcác cấu trúc mô khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quátrình nuôi cấy, vì vậyviệc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý

và tuoi của mầu, chất lượng cây lấy mầu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khảnăng nuôi cấy [24] Mầu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng Phươngpháp phổ biến nhất trong vô trùng mầu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêudiệt vi sinh vật Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mầu phải đảm bảo 2 điều kiện: Có

khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốtvà không hoặc ít độc đối với mầu Hiệu quả vô trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật của hóa chất Một số hóa chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mầu là: Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgC12-thủy ngân clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin )

I.2.5.2 Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấyđược tiến hành trong buồng cấy vô trùng Buồng cấy có hệ thống màng lọc giúp lọc vi sinh vật, có hệ thống đèn tử ngoại giúptiêu diệt vi sinh vật trong không khí và trên bề mặtcác dụng cụ thiết bị nuôi cấy Đe khử trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy có thể sửdụng các phương pháp: Khử trùng khô (bằng nhiệt), khử trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc - Ánh sáng và nhiệt độ: Mầu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánhsáng và nhiệt độ

I.2.5.3 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điềukiện tối cần thiết, là yếutố quyết định cho sự phân hoá

tế bào và cơ quan nuôi cấy Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật a) Điều kiện vô trùngNuôi cay in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Neu không đảm bảo điều kiện vôtrùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sê bị nhiềm Điều kiện vô trùng có

ý nghía quyết định đen sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro Phương pháp vô trùng vậtliệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tiauv có khả năng diệt nấm và vi khuẩn Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định.Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích họp sèmang lại hiệu quả vô trùng mầu tốt, tỷ lệ sốngcao Thông thường hay sử dụng một số hoáchất như: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2, HgC12 0,1% để khử trùng, b) Điều kiện ánhsáng, nhiệt độ, pH - Ánh sáng Sự phát sinh hình thái cùa mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từcác yếutố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sángvàchất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sựtạo choi Nhìn chung cường độ ánhsángthích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh

hưởng tới sự phát sinh hình thái củamô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều caocủa thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Neu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sè ứcchế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay trongcác phòng thí nghiệm nuôi cấy mô cung cấp nguồn ánh sáng cócường độ 2000 - 2500 luxngười ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 - 40 cm - Nhiệt độ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy

mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù họp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinhtrưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [21] - pH pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự onđịnh của pH môi trường là yếu tố duy trìtrao đoi chất trong tế bào pH của đa

số môi trường được điều chình giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng pH dưới 5,5 làm agarkhó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớnhơn 6 agar có thể rất cứng

Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loạimôi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vilượng, đường làm nguồn cacbon, các vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng Ngoài ra,người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ cóthành phần xác định (amino acid, EDTA, ) vàmột số chất có thành phần không xác định như nước dừa,dịch chiết khoai tây, cao nấm men

Dinh dưỡng vô cơ

Dinh dường vô cơ được chia ra làm 2 loại: các nguyên tố dinh dường đa lượng vànguyên tố dinh dưỡng vi lượng Theo thống nhất của Hội sinh lí học thực vật quốc tế (IAPP), nguyên tố khoáng mà thực vật cần với nong độ lớn hơn 0,5 mmol/1 gọi là nguyên

tố đa lượng, nguyên tố khoáng mà thực vật cần có nồng độ nhỏ hơn 0,5 mmol được gọi là nguyên tố vi lượng Nguyên tố khoáng là nhu cầu rất cần thiết đối với nuôi cấy mô thực vật Giống như cây trồng ngoài tự nhiên các mô và cơ thể thựcvật khi nuôi cấy trong ốngnghiệm trên môi trường nhân tạo chúng cần được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡngcần thiết cho sự pháttriển Trong tự nhiên câytrồng muốn sinh trưởng và phát trien mạnhthì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau [21]: - Các nguyên tố đa lượng: các ion của nitơ

(N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S) - Các nguyên tố vilượng: sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), vàmolipden (Mo) Mười bốn nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là cácnguyên to dinh dưỡng thiết yếu của thực vật Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng Hệ rễ thực vậtlấy dinh dường từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dường khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính Theo nguyên tắcthành phần môi trường nuôi cấy sè được xây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dường có mặt trong mô Môi trường nhân tạo sử dụng phổ biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựatrên nguyên tắc này

Dinh dưỡng hữucơ tự nhiên

- Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dường như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạttính auxin

- Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid

- Dịch chiết nấmmen: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B

- Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, càrốt, nước épchuối xanh

Vitamin

Thực vật can vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có the tự tống họp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin Bl), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol Vitamin có tác dụng thúc day sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cay - Vitamin Bl (Thiaminee HC1): Là chat bo sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbonvà sinhtổnghợp amino acid

- Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đồichất

- Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuồi hô hấp

- Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham giavận chuyến đường, các nguyênto khoáng, trao đổi hydratcacbon

Nước: Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi trường dinh dưỡng Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu Neu môi trường chuẩn bị nuôi cấy protoplast, tế bào hay meristem thì nên dùng nước cất 2 lần Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô Trong trường hợp không cósằn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thế chứa nguồn lâynhiễm hữu cơ vàcác loài vi khuân

Đường: Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật Đường cần thiết cho sự sinh trưởng vàphát triển vì quá trình quanghợp cùa mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối) Các mô có màu xanh cũng không đủ khả năng để tự dường in vitro Mặtkhác, quá trình quang hợp cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong binh cấy Trênthực tế việc bổ sung CO2 là rất khó khăn vàtốn kém Đường được sử dụng phổ biến trongnuôi cấy mô thực vật là đường saccharose ở nồng độ 1-5% Đường saccharose là dạng đường được tổng hợp và vận chuyến tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôicấy Cũng có the sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật Nong

độ đường sửdụng phụ thuộc vào loại và tuoi mầu cấy

Agar Agar là một loại polysacharit của tảo Agar là chất keo đông thường được sửdụng nhất, nguồn gốc chủ yếu cùa nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysacharit do đường saccloze và galactose tạo thành Nong độ của thạch dùng trong nuôi cấy rất daođộng tùy theo độ tinh khiết của hóachất và mụctiêu nuôi cấy (thường4-12 g/1, trung bình6-12 g/1) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh dưỡng sè rất cứng chất dinh dưỡng khókhuếch tán đế nuôi dưỡng mô cấy ớ 800C thì ngậm nước chuyền sang trạng thái sol còn

ở 400C thì trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12 gam/lítnước Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để chocác ion vận chuyển dề dàng [21]

Chất điều hoà sinh trưởng

Auxin: Auxin là một trong những loại hormone đầu tiên được khám phá Hormone auxinđiều tiết sự sinh trưởng của thực vật có tác dụng rộng rài, thúc đẩy sự phân bào và phân hóa tổ chức, dùng để kích thích quả to, thân, rễ củ lớn Gây hiện tượng hình thành rễ nhánh vàcác rề lá, dùngđể tăng nhanh tốc độ giâm trồng cácđoạn nhánh và hạt giống chonhanh ra rễ Ngoài ra, auxin còn có thể dùng để giữ hoa, quả, nâng cao sản lượng, tăng thêm sức đềkháng,

ví dụ như:NAA (a - Naphthaleneacetic acid) đóng vai trò trong việc hình thành chồi

và rề, IAA (3 - Indoleacetic acid) kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, 2,4-D (Dichlorophenoxyacetic acid) thường được sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứngtạo mô sẹo và huyền phù tế bào auxin hiện diệntrong tất cả bộ phận của cây với nồngđộkhác nhau Vai trò của auxinđối với thực vật:

Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn dài của tế bào, đặc biệt giãn theo chiều ngangcủa tế bào làm tế bàoto theo chiều ngang, vì vậy làm cho các bộ phận của cây to về chiềungang Ngoài ra, auxin còn kích thích sự tong hợp các hợp cấu trúc nên thành tế bào như các chat cenlulose, pectin, hemicenlulose Auxin còn ảnh hưởng đen sự phân chia tế bào,tuy nhiên ảnh hưởng của auxin lên sự giãn và sự phân chia tế bào trong mồi tác độngtương hồ với các phytohormone khác

Trong kỹ thuật nhân giốngvô tính thì việc sử dụng auxin để kíchthích sự ra rề là cực

kỳ quan trọng Đặc biệt là sự hình thành rề phụ của các cành giâm, cành chiết Đe khởi xướng sự phản phân hóa tế bào mạnh mè thì cần hàm lượng auxin khá cao Ngược lại,ởcác giai đoạn sinh trưởng của rề cần ít auxin hơn và có khi còn gây ức chế.Vậy nên vai trò của auxin đối với sựphân hóa rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấy mô

Auxin kích thích sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt Từ te bào trứng sau khi thụ tinh tạo nên hợp tửvà sau phát triển thành phôi Phôi hạt hoa là cơquan tống hợp auxin nội sinh quan trọng của cây, khuyếch tán vào bầu và kích thích sựsinh trưởng của bầu để hìnhthành quả Vì vậy quả chỉ được hình thành khi có sựthụ tinh.Neu không có quá trình thụ tinh thì không hình thành phôi và hoa sẽ bị rụng Việc áp dụng

xử lý auxin ngoại sinh cho hoa sẽ thay thế nguồn auxin nội sinh vốn được hình thành trong phôi hoa, do đó không cần quá trình thụ phấn nhưng bầu nhụy vần có the lớn lênthành quả nhờ auxin ngoại sinh của phôi hoa.Trường hợp này quả không qua thụ tinh vàkhông có hạt

Auxin gây kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây, vì nó ức chế sựhình thành tầng rờiở cuống lá, hoa, quả vốn được cảm ứng bởi các chất ức chế sinh trưởng Vì vậy, khi phun auxin ngoại sinh có thế gâygiảm sự rụng lá, làmtăng khả năng đậu quả và hạn chế sự rụng

nụ hay quả non, dần đếntăng năng suất cho cây Trong điều kiệntự nhiên,khi cây tống hợp

đủ lượng auxin sè ức chế sự rụng hoa, quả, lá (Nguyễn Bá Lộc và ctv, 2005)

Cytokinin

Nhóm chất cytokinin kích thích sự phânchia tế bào và quyết định sựphân hóa chồi

Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định sựphân hóa củamô theo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo Nồng độ sử dụng là 0,l-2mg/l ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến

sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Các cytokininthường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin,isopentenyladenin (2 ĨP) và Zeatin (cytokinin tự nhiên) Trong các chất này, BAP và sau

đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt Zeatin làmột loạicytokinin tự nhiên có hoạt tính rất mạnh chỉ dùng trong những trường hợp đặc biệt do rấtđắt Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một so chat cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là mộtcytokinin có hoạt tính cao thường dùngtrong nuôi cấy nhânnhanh câythân gồ

Giberellin

Giberellin được tìm thấy vào những năm 1926.Là chất điều hòa sinh trưởng thực vậtthuộc nhóm kích thích sinh trưởng có trong thực vậtđược phát hiện sauchat Auxin Trong đời sống thực vật, GA3 đống vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: Sinh

lý ngủ nghỉ của hạt và choi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài củathực vật Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vậtnhiều kỳ sưđã sử dụng và coi đó là thành phần không the thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó

Trong số hon 20 chất thuộc nhóm Giberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hon

cả trongthực tiễn và có cácchức năng cơbản sau:

Các mô phân sinh trẻ, đang sinh trưởng, các phôi non, tế bào đầu rễ, quả non, hạtchưa chínhoặc đang nảy mầm đềucó chứa nhiều Giberellin axit Kích thích kéo dài choi,tăng cường phân bào và kéo dài te bào, ví dụ ở đồng lúa sau khi phun GA3 làm kéo dàiđốt thân, suy ra các cây lùn thường bi thiếu Giberellin Kích thích sinh tổng họp a - amylase ở hạt cây ngủ cốc nảy mầm, giúp tiêu hóa các chất dự trừ trong nội nhũ để nuôicâymầm Làmkích thích sựhình thánh của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn

Giberellin làm phá ngủ hạt giống hoặc củ giống, ví dụ trường Đại học Nông nghiệp

Hà Nội đã nghiên cứu thành công biện pháp phá ngủ nghỉ cho củ khoai tây thu hoạch vụđông để có mầm kịp trồng vụ xuân bằng phun dung dịch GA, tỉ lệ củ nấy mầm đạt trên 90% trong 5-7 ngày Các chất ức chế tong họp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thânhành và củ) và gây ức chế sự hình thành rễ bất định.PhunGA lên lá và quả khi quả già sắp

chín để neo quả trên cây, làm chậm thời gian thu hoạch để giãn vụ hoặc chờ giá cao, với cam quýt, chanh có the chậmthu hoạch hàng tháng.

Trong nhiều truờng họp của Gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt Ánh hưởng đặc biệtcủa gibberellin đối vói sự ra hoa làkích thích sự sinh trưởng nhanh chóng và kéo dài cụm hoa Gibberellinkíchthích cây ngày dài làmrahoa trong điều kiện trong thời gian ngắn

GA đã được ứng dụng rộng rài trong sản xuất nông nghiệp và đã mang lại những hiệu quả to lớn như kích thích sự sinh trưởng cùa cây đe tăng sản lượng (như với các rau

ăn lá), kích thích ra hoa nhanh và nhiều, hạn chế rụng hoa, rụng quả non và tăng kích thước của quả (với các cây lấy quả), kích thích hạt nẩy mầm (với lúa ) và nhiều ứngdụng khác Với mồi nhóm cây có thể sử dụng GA tùy theo mục đích(Nguyễn Bá Lộc vàctv, 2005)

1.7.5.4.Nhiệt độ

Đối vớithực vật, nhiệt độ có ảnh hưởng đen hình thái, chức năng sinh lý và khả năng sinh sản về hình thái của cây: Tùy theo nơi sống có nhiệt độ cao hay thấp mà cây hình thành nên những bộ phận bảo vệ,cây mọc ở nơi trống trãi, cường độ ánh sáng mạnh, nhiệt

độ cao thìcây có vỏ dày, màu nhạt, tầng bần phát triển nhiều lóp có tác dụng cách nhiệt, lá nhỏ, có tang cutin dày hạn chế sự bốc hơi nước Trong quá trình sống thực vật: Trongnhững giai đoạn phát triển cá the khác nhau, nhu cầu nhiệt độ cũng khác nhau Chang hạnnhư ở giai đoạn nảy mầm, hạt cần nhiệt độ thấp hơn thời kỳ nở hoa, vào thời kỳ quả chín đòi hỏi nhiệtđộ cao hơn cả Nhiệt độ chủ yếu tác động đến cây qua con đường quang họp theo chiều tăng của của nhiệt độ, như nhiệt độ của môi trường tăng 10°Cthì thể cường độquanghọp tăng hai lần Tuy nhiên, mồi loại cây đềucó nhiệt độ tối cao hoặc tối thấp thích họp khác nhau và khả năng chịu đựng nhiệt độ bất lợi ở các bộ phận của thực vật cũng không giống nhau Điều kiện nhiệt độ thấp làm giảm sự sinh trưởng của cây, mất sự hô hấp và thúc đấy sự phân giải tinh bột và các chất dự trữ khác có the cải thiện trực tiếp sựđong hóa cung cấp cho đỉnh choi và thúc đây quá trình theo hướng sinh sản, lá là cơquan tiếp xúc nhiều và trực tiếp với không khí, do đó chịu đựng được sự thay đối về nhiệt độ thấp (Ngô XuânBình, 2010)

Đồng thời nhiệt độ có thể ảnh hưởng riêng đến sự sinh trưởng của cây thông qua sựxuân hoá, hay cảm ứngvề sự nở hoa bởi nhiệt độlạnh Sự xuân hóa chỉ được dùng đểkích thích hoặc thúc đấy sự ra hoa bởi việc xử lý nhiệt độ thấp Như là một nguyên tắc, sự khởi phát hoa xuất hiện trong thời kỳ xuân hóa nhưng hoa chỉ xuất hiện ở điều kiện nhiệt độ

thích hợp cho sự sinh trưởng.Ví dụ, cây Aconitum carmichaeli Debx (ò đầu) yêu cầu sựxuân hoá cho việc nở hoa ớ một số loài khác, như hoa hìnhnón(cúc Echinacea purpurea)thì lại không yêu cầu quá trình xuân hoá, nhưng sau khi xử lý qua quá trình xuân hoá lại làm cho quá trình ra hoa nhanh hon và tăng chất lượng hoa Rất nhiều loài hoa lâu năm yêu cầu quá trinh xuân hoá cho việc sản xuất nhanh và hiệu quả kinh tế, trong đó sử dụng phương pháp xử lý lạnh đối với hạt để tăng khả năng nảy mầm là một ví dụ điển hình trong việc xuân hoá hạt giống hoa, nhất là các loài hoa có nguồn gốc ôn đới.Đối với một

số loài hoa, người ta làm giảm nhiệt độ xuống vài độ so với nhiệt độ tối thích trong vòngkhoảng 1 đến vài tuần trước khi thu hoạch đe làm tăng chất lượng hoavà kéo dài thời gian thu hoạch (NgôXuân Bình,2010)

Than hoạt tính: Bổsung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy mô sè cung cấp dinhdưỡng thiết yếu và có tác dụng khử độc Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôicấy thì sẽ kích thích sựtăng trưởngvà biệt hóa phong lan, hành, carot, cà chua, cây trườngxuân nhưng lại có tác dụngức chế đối với cây thuốc lá, đậu nành và trà mi Than hoạt tínhnhìn chung có ảnh hưởng ở ba mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinhtrưởng hoặc làm đệm môi trường Người ta cho rằng,nguyên nhân gây ức chế sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường là do than hút chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường NAA, IAA, kinetin, BAP, 2ÍP liên kết với than hoạt tính Trong khi đó, khả năng kích thích sự tăng trưởng của than hoạt tính đối với

mô cấy là do nó kết hợp với các hợp chat phenol độc trong thời gian nuôi cấy Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng độ 0,5 - 3% (w/v)(Ngô Xuân Bình,2010)

Vitamin: Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tong hợp tất cả các loạivitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu Đe mô có sức sinh trưởng tốt phải bo sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hóa Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HC1 (Bl), pyridoxine HC1 (B6), nicotinic axit, trong đó vitamin Bl là không thể thiếu và được sử dụng trong hầu hết nhừng môi trường nuôi cấy mô và tế bàothực vật Linsmaier và Skoog đã khăng định vitamin Bl là cần thiết cho sự sinh trưởngcùa cây sau khi nghiên cứu kỳ lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS Các tácgiả khác cũng khẳng định vai trò rất quan trọng của BI trong môi trường nuôi cấy mô Inositol thường được nói đến như một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh

trưởng và phát triến của thực vật, mặc dù nó không phải cần thiết trong mọi trường hợp Các vitamin khác, đặc biệt là ticotinic axit (vitamin B3), canxi phantothenate (vitamin B5)

và biotin cũng được sử dụng đe nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy Ảnh hưởng của vitamin lên sự phát triểncủa tế bào nuôi cayin vitro ở các loài khác nhau là khác nhauhoặc thậm chí còn gây hại (Ngô Xuân Bình, 2010)