Hàng chục công ty quy mô nhỏ và quy mô lớn đang hoạt động để phát triển gia cầm, cừu, thịt bò và thịt lợn được nuôi trồng nhằm nâng cao sản xuất chăn nuôi công nghiệp để cung cấp thịt sạch hơn, không có dư lượng và không có độc tố. Các cuộc điều tra ước tính rằng hai phần ba số động vật có vú trên trái đất là gia súc, một phần ba là con người, và số lượng yếu ớt còn lại là động vật hoang dã. Thịt và các sản phẩm từ thịt là những thực phẩm phổ biến nhất và được tiêu thụ rộng rãi nhất. Chúng tạo thành nguồn protein động vật thiết yếu và đắt tiền; việc tiêu thụ thịt đã tăng lên theo cấp số nhân do dân số ngày càng tăng. Người ta dự đoán rằng đến năm 2050, lượng thịt tiêu thụ sẽ tăng lên nhiều lần, do đó nguồn cung thịt thông thường sẽ không đủ đáp ứng nhu cầu. Các phương pháp tiếp cận bổ sung như sản xuất thịt trong ống nghiệm là một trong những nguồn thay thế sắp tới để đáp ứng nhu cầu cung cấp thịt 1.
TỔNG QUAN
Thịt nuôi cấy
Thịt nuôi, còn gọi là thịt cấy ghép trong phòng thí nghiệm, được sản xuất từ tế bào mô cơ hạt lấy từ ống sinh thiết của động vật hoặc phôi động vật, sau đó làm giàu trong môi trường dinh dưỡng đặc biệt Quá trình này diễn ra trong các lò phản ứng sinh học với điều kiện kiểm soát chặt chẽ nhằm thúc đẩy sự phát triển của tế bào thịt Thịt nuôi là một hình thức nông nghiệp tế bào tiên tiến, giúp giảm thiểu tác động môi trường và nâng cao hiệu quả sản xuất thực phẩm.
Hình 2.1:Hình ảnh thịt nhân tạo nuôi trong ống nghiệm
Thịt nuôi cấy được sản xuất bằng kỹ thuật mô giống nhau như trong y học tái sinh Khái niệm về thịt nuôi đã được phổ biến bởi Jason Matheny vào đầu những năm 2000 Ông cùng đồng tác giả một bài báo về sản xuất thịt trong ống nghiệm và sáng lập tổ chức phi lợi nhuận New Harvest, tổ chức đầu tiên trên thế giới hỗ trợ nghiên cứu về thịt nuôi trong phòng thí nghiệm.
Năm 2013, Giáo sư Mark Post của Đại học Maastricht đã tiên phong trong lĩnh vực thịt nuôi cấy, khi tạo ra miếng bánh mì kẹp thịt đầu tiên từ tế bào nuôi cấy trực tiếp Kể từ đó, các nguyên mẫu thịt nuôi cấy đã thu hút sự chú ý lớn từ truyền thông, với SuperMeat mở nhà hàng phòng thí nghiệm gọi là "The Chicken" tại Tel Aviv để thử phản ứng của người tiêu dùng với "Chicken Burger" Thị trường thịt nuôi tế bào còn ghi nhận bước tiến quan trọng vào tháng 12 năm 2020, khi thương hiệu Eat Just của Mỹ bán thịt nuôi cấy đầu tiên tại nhà hàng ở Singapore mang tên "1880".
Quy trình sản xuất thịt ngày càng phát triển nhờ vào những tiến bộ công nghệ của các công ty hàng đầu Sự khác biệt giữa thịt nuôi và thịt truyền thống đã đặt ra những vấn đề quan trọng về đạo đức, sức khỏe, môi trường, văn hóa và kinh tế trong tương lai.
2.1.2 Thịt nuôi trong bối cảnh thời đại công nghiệp 4.0
Thịt nuôi đang là cuộc cách mạng kỹ thuật, đồng thời mang lại cuộc cách mạng kinh tế và xã hội, có khả năng thay đổi ngành công nghiệp thịt truyền thống Bởi vì nông nghiệp chăn nuôi tiêu thụ hơn 75% diện tích đất nông nghiệp toàn cầu, thịt nuôi có tiềm năng định hình lại thế giới theo hướng bền vững hơn Công nghệ này có thể giúp giảm ô nhiễm không khí, đất đai và nước do phương pháp chăn nuôi truyền thống gây ra, đồng thời giảm nguy cơ các bệnh truyền nhiễm mới nổi liên quan đến sản xuất và tiêu thụ thực phẩm động vật (Espinosa et al., 2020) Thịt nuôi có thể được sản xuất trong nhà, ngay cả trong điều kiện thời tiết khắc nghiệt hoặc thiên tai, góp phần đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu Ngoài ra, do quy trình sản xuất vô trùng, nó gần như loại bỏ nguy cơ nhiễm mầm bệnh gây bệnh Điều đặc biệt, thịt nuôi không liên quan đến việc khai thác và giết mổ động vật, mang ý nghĩa đạo đức mạnh mẽ trong việc bảo vệ quyền lợi của động vật.
2.1.3 Ảnh hưởng của vấn đề đạo đức và tiếng nói của các tổ chức bảo vệ động vật
Thịt nuôi được coi là hình thức nông nghiệp không gây tàn ác, vì không cần giết động vật để lấy thịt Nhiều nhà bảo vệ động vật và triết gia coi việc thúc đẩy đổi mới trong lĩnh vực này là một nghĩa vụ đạo đức (Hopkins và Dacey, 2008) Các tổ chức phi chính phủ, như PETA, đã hỗ trợ phát triển thịt nuôi bằng cách thưởng lớn, như vào năm 2008, PETA đã trao một triệu đô la cho phòng thí nghiệm nghiên cứu sản xuất gà nuôi thương phẩm Ngoài ra, nhiều tổ chức từ thiện đã tài trợ cho nghiên cứu và phát triển (R&D) về thịt nuôi, góp phần thúc đẩy sự tiến bộ của ngành công nghiệp này.
Việc phát triển thịt nuôi có thể gây ra các tác động lớn đối với ngành sản xuất truyền thống và làm giảm đáng kể số lượng động vật nuôi, thậm chí có thể dẫn đến sự biến mất của một phần ngành chăn nuôi Điều này có thể tạo ra cú sốc xã hội và văn hóa, khi đã tồn tại hơn 9000 năm qua, chăn nuôi động vật đã trở thành một phần quan trọng trong lịch sử của nhân loại cũng như quan hệ của chúng ta với tự nhiên và thế giới động vật Nhiều người cho rằng động vật trang trại nhận được lợi ích từ các tương tác với con người, nhưng sự xuất hiện của thực phẩm thay thế có thể đe dọa sự cân bằng này Lời cảnh báo này làm nổi bật một luận điểm cũ gọi là, đề cập đến những hệ quả xã hội và sinh thái của việc thay đổi phương thức sản xuất thực phẩm truyền thống.
“logic của mỡ”, theo đó chúng ta làm ơn cho động vật bằng cách sản xuất và ăn thịt chúng vì nếu không chúng sẽ không tồn tại.
Chúng tôi cam kết rằng việc sản xuất thịt nhân tạo hoàn toàn không gây tổn thương hoặc ảnh hưởng đến bất kỳ bộ phận nào trên cơ thể con vật Quá trình này tuân thủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt do các tổ chức bảo vệ động vật quốc tế đặt ra Thịt nhân tạo là một giải pháp nhân đạo, giúp giảm bớt đau đớn và tổn thương cho động vật trong quá trình sản xuất thực phẩm.
Kỹ thuật mô
Kỹ thuật mô (Tissue engineering) là lĩnh vực kỹ thuật kết hợp công nghệ tế bào, kỹ thuật vật liệu cùng các yếu tố sinh hóa và hóa lý để phục hồi hoặc thay thế các chức năng trong cơ thể người Đây là ngành mang lại giải pháp sáng tạo để điều trị các bệnh lý liên quan đến tổn thương mô và cơ quan Việc ứng dụng kỹ thuật mô giúp thúc đẩy quá trình tái tạo mô, nâng cao chất lượng cuộc sống và giảm thiểu các phương pháp điều trị truyền thống.
Hình 2.2Mô hình hoạt động nghiên cứu trong kỹ thuật mô
Tổng quan về thịt bò Kobe
Thịt bò Kobe nổi tiếng toàn cầu và là đặc sản độc đáo của thành phố Kobe, vùng Kinki, Nhật Bản Được lấy từ giống bò Kobe, một trong ba giống bò Wagyu nổi tiếng với thịt ngon nhất, thịt bò Kobe sở hữu hương thơm nhẹ và vị béo đặc trưng, hòa quyện cùng những thớ thịt mượt mà tan dần trong miệng Nhờ vào đặc điểm này, thịt bò Kobe đã trở thành một trong những "cực phẩm" cao cấp, được săn đón khắp nơi trên thế giới.
Hình 2.3Hình ảnh thịt bò kobe
2.3.2 Tiêu chuẩn làm nên thương hiệu
Hyogo là nơi sinh ra, lớn lên và phát triển của bò Kobe, nơi bò không di chuyển hay thay đổi môi trường sống trong suốt quá trình phát triển Để đảm bảo sự thuần khiết, bò phải là bò đực hoặc bò cái chưa sinh đẻ và được thiến trước khi giết mổ Quá trình giết mổ bò Kobe phải diễn ra tại các nhà giết mổ nằm trong khu vực Hyogo hoặc các thành phố như Kobe, Sanda, Kakogawa, Himeji, Nishinomiya, nhằm đảm bảo chất lượng và nguồn gốc của thịt bò.
Bê con được cai sữa và mang đi đấu giá để các hộ nông dân vỗ béo, với độ mỡ được kiểm tra chính xác bằng các thiết bị hiện đại Bò được tắm bằng nước ấm hàng ngày kết hợp dịch vụ massage từ người chăn nuôi nhằm kiểm soát lượng mỡ thừa, không để vượt quá 0,6kg mỗi ngày Các nông dân áp dụng chế độ dinh dưỡng đặc biệt, bao gồm cả bia, giúp thịt bò mềm mại, tan chảy trong miệng khi xuất trại, mang lại giá trị cao cho sản phẩm.
Hình 2.4 Tiêu chuẩn thịt bò kobe
2.3.3 Cơ sở cung cấp nguyên liệu ở Việt Nam
Trang trại bò Kobe đầu tiên tại Việt Nam được xây dựng tại xã Tân Lạc, huyện Bảo Lâm, Lâm Đồng, cách trung tâm thành phố Bảo Lộc hơn 20km Nằm giữa thung lũng trà và cà phê xanh mát, trang trại nuôi gần 100 con bò Kobe thế hệ F1 (50% máu Kobe), trong đó số lượng đàn bò vẫn tiếp tục tăng theo thời gian Đây là nguồn cung cấp nguyên liệu đáng tin cậy nhất để sản xuất thịt nhân tạo tại Việt Nam hiện nay.
2.3.4 Qui trình kiểm tra trước khi lấy mẫu mô động vật
Các con bò được chọn cần đáp ứng các tiêu chuẩn nghiêm ngặt về trọng lượng và chất lượng thịt để đảm bảo độ an toàn thực phẩm Việc lấy mẫu sinh thiết phải tuân thủ các quy trình an toàn nhằm kiểm tra chất lượng thịt và đảm bảo không có nhiễm mầm bệnh Chọn lựa con bò khỏe mạnh, không mắc bệnh hoặc các nguy cơ gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng là yếu tố quan trọng trong quá trình này.
Qui trình kiểm tra trước sinh thiết bao gồm 4 bước cơ bản như sau:
Kiểm tra trực quan bằng mắt thường thông qua màu sắc con vật, kiểm tra màu mắt, tứ chi và toàn bộ hình dạng con vật bên ngoài
Kiểm tra nguồn gốc, mã vạch, thông tin chuỗi sản phẩm từ nhà cung cấp, kiểm tra qui trình nuôi cho đến thời gian xuất chuồng.
Kiểm tra mẫu máu, mẫu nước tiểu và phân tích hàm lượng dư lượng kháng sinh trong động vật là các bước quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm Việc này giúp xác định rằng tất cả các chỉ số nằm trong mức cho phép, đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng không bị ảnh hưởng bởi dư lượng kháng sinh không hợp lệ Thực hiện kiểm tra định kỳ giúp duy trì chất lượng sản phẩm và tuân thủ các quy chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm.
Sau khi lấy mẫu sinh thiết, cần giữ lại một mẫu vật để làm công cụ hỗ trợ chẩn đoán trong trường hợp mẫu thịt thành phẩm gặp vấn đề sau này, đảm bảo quá trình phân tích và xác định chính xác nguyên nhân.
2.3.5 Kĩ thuật và qui trình sinh thiết
Sinh thiết mô là thủ tục tiêu chuẩn trong y học con người và thú y, thường được thực hiện bằng kỹ thuật sinh thiết kim nhằm lấy mẫu nhanh chóng, ít gây căng thẳng và chấn thương cho bệnh nhân Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm về kích thước mẫu giới hạn (khoảng 0,5 g) và tính mù mờ trong quá trình lấy mẫu, có thể dẫn đến thất bại nếu mẫu không đạt chất lượng hoặc không đúng loại mô mong muốn.
Kỹ thuật thứ hai để lấy sinh thiết, phù hợp cho ứng dụng nuôi cấy thịt, là qua một vết rạch nhỏ để chèn sinh thiết, giúp kiểm soát tốt hơn lượng mẫu lấy được và thu nhận tối đa đến 15 g vật liệu Phương pháp này xâm lấn hơn so với sinh thiết bằng kim, nhưng mang lại lợi ích trong việc lấy mẫu lớn hơn và linh hoạt hơn Để đảm bảo an toàn và chất lượng mẫu, quy trình tối ưu thường gồm cố định động vật trong lồng điều trị, sử dụng an thần bằng xylazine (hoặc tương đương), cùng với gây tê bằng lidocain/ adrenaline nhằm giảm đau, căng thẳng và nâng cao hiệu quả thu thập mẫu.
Hình 2.5 (a) sinh thiết kim (b) sinh thiết chèn
Môi trường DMEM
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) là môi trường cơ bản được sử dụng rộng rãi để hỗ trợ sự phát triển của nhiều loại tế bào động vật có vú khác nhau Các tế bào được nuôi cấy thành công trong DMEM bao gồm nguyên bào sợi chính, tế bào thần kinh, tế bào thần kinh đệm, HUVEC và tế bào cơ trơn, cùng với các dòng tế bào như HeLa, 293, Cos-7 và PC-12 [4].
DMEM nổi bật so với các phương tiện khác nhờ chứa nồng độ axit amin và vitamin cao gấp 4 lần so với phương tiện tối thiểu ban đầu của Eagle, giúp cung cấp dinh dưỡng tối ưu cho tế bào Ban đầu, DMEM được pha chế với glucose thấp (1g/L) và natri pyruvate, nhưng hiện nay thường được sử dụng với lượng glucose cao hơn, có hoặc không có natri pyruvate, phù hợp với nhu cầu của nhiều loại tế bào Việc bổ sung GlutaMAX™ trong DMEM giúp giảm thiểu tích tụ amoniac độc hại, nâng cao khả năng sống và tăng trưởng của tế bào trong môi trường dễ quản lý Tuy nhiên, DMEM không chứa protein, lipid hoặc các yếu tố tăng trưởng, do đó cần thiết phải bổ sung các thành phần này, thường là 10% huyết thanh bò thai (FBS) Hệ thống đệm natri bicacbonat (3,7g/L) giúp duy trì pH sinh lý của môi trường, cần có 5-10% khí CO₂ để ổn định pH phù hợp với điều kiện sinh học của tế bào.
Nước công nghệ (WFI)
Nước công nghệ (WFI) là nước tinh khiết đã được xử lí để cung cấp nước cho các quá trình sản xuất.
Hình 2.7 Thông số nước WFI
Hệ thống sản xuất nước công nghệ (WFI) xử lý nước thô để loại bỏ các chất gây ô nhiễm hiệu quả qua nhiều bước tiên tiến như đèn UV, vi lọc và siêu lọc, đảm bảo nước đạt tiêu chuẩn cao về độ sạch Quá trình còn bao gồm các bộ lọc đa phương tiện và bộ lọc khử mùi bằng than hoạt tính, giúp loại bỏ các tạp chất và mùi hôi không mong muốn Ngoài ra, hệ thống còn sử dụng bộ làm mềm nước bằng trao đổi ion và các bước lọc tinh cuối cùng để đảm bảo nước sạch và tinh khiết cho các ứng dụng của ngành công nghiệp sản xuất.
Lò phản ứng sinh học
Lò phản ứng sinh học là thiết bị lên men kín, được sử dụng để sản xuất các hóa chất và phản ứng sinh học khác nhau Nó được trang bị hệ thống hút khí, khuấy trộn, kiểm soát nhiệt độ và pH để đảm bảo quá trình lên men hiệu quả Ngoài ra, lò phản ứng còn có chức năng thoát nước hoặc xả tràn nhằm loại bỏ sinh khối chất thải của vi sinh vật và thu hoạch các sản phẩm sinh học mong muốn, góp phần nâng cao hiệu suất sản xuất.
- Kích động (để trộn các tế bào và môi trường)
- Sục khí (thiết bị lên men hiếu khí) để cung cấp O2.
- Quy định các yếu tố như nhiệt độ, pH, áp suất, cho ăn chất dinh dưỡng và mức chất lỏng.
- Khử trùng và duy trì sự vô trùng.
- Rút tế bào/ môi trường [8].
Hình 2.8 Lò phản ứng sinh học [9].
Mực in sinh học
2.7.1 Định nghĩa mực in sinh học
Mực sinh học là vật liệu dùng để in mô sống bằng công nghệ in sinh học 3D, gồm các tế bào sinh học sống, hydrogel, và các yếu tố hóa học, phân tử sinh học giúp tạo ra cấu trúc 3D chức năng và vật lý của mô sống.
Hydrogel
Hydrogel là các polyme ưa nước có khả năng liên kết chéo, hấp thụ và trương nở trong nước và nước thải sinh học, tạo thành mạng lưới 3D không hòa tan Chúng có thể được làm từ nhiều loại vật liệu hòa tan trong nước, bao gồm polyme tổng hợp, tự nhiên, protein và các phân tử khác Cấu trúc của hydrogel chủ yếu được xác định bởi quá trình liên kết chéo, hình thành mạng lưới không hòa tan trong môi trường nước Mạng lưới hydrogel luôn duy trì trạng thái cân bằng trong môi trường nước nhờ sự cân bằng giữa lực đàn hồi của các polyme liên kết ngang và lực thẩm thấu từ chất lỏng.
Hình 2.9 Nguyên lý hình thành hydrogel
Hydrogel đóng vai trò chính trong việc duy trì độ ổn định cơ học của mô tự thiết kế, góp phần quan trọng vào độ chính xác 3D của các mô in sinh học Nhờ khả năng giữ hình dạng và kết cấu, hydrogel đảm bảo mô in 3D phản ánh chính xác cấu trúc sinh học tự nhiên Việc sử dụng hydrogel phù hợp cải thiện độ trung thực của mô in, hỗ trợ các ứng dụng trong y học tái tạo và nghiên cứu sinh học Do đó, hydrogel là thành phần then chốt để nâng cao hiệu quả và độ tin cậy của công nghệ in sinh học 3D.
Khả năng liên kết chéo của vật liệu đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính chất của hydrogel, bao gồm khả năng liên kết chéo dễ dàng và bền vững Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến công thức, hình dạng và quá trình phân hủy của hydrogel, giúp tối ưu hóa khả năng ứng dụng trong các lĩnh vực y tế và kỹ thuật.
Khả năng tương thích sinh học là khả năng của vật liệu sinh học để phù hợp và thực hiện vai trò cụ thể trong cơ thể, đồng thời tạo ra phản ứng thích hợp từ vật chủ Tính tương hợp sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo các vật liệu y học như implant hoặc thiết bị sinh học không gây phản ứng phụ hay đào thải, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị Việc chọn lựa vật liệu sinh học có khả năng tương thích sinh học tối ưu giúp giảm thiểu các biến chứng, thúc đẩy quá trình phục hồi và duy trì chức năng của các mô hoặc cơ quan trong cơ thể.
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
2.8.3 Phân loại mực sinh học dựa trên hydrogel tự nhiên
- Mực sinh học dựa trên protein:
- Mực sinh học dựa trên polysaccharide:
- Mực sinh học dựa trên dECM
- Mực sinh học đa thành phần.
Lựa chọn thành phần tạo mực sinh học
Gelatin là một loại protein hòa tan trong nước, được tạo ra bằng cách thủy phân một phần collagen từ xương, da và các mô liên kết đã qua quá trình nấu chín của động vật như gia súc và lợn Nhờ quá trình này, gelatin có thể có các trọng lượng phân tử khác nhau, dao động từ 20 kDa đến 250 kDa Tùy thuộc vào phương pháp sản xuất, gelatin có thể là loại A hoặc loại B, dựa trên việc thủy phân bằng axit hoặc bazơ.
Gelatin là một hợp chất chứa chuỗi peptide hòa tan trong nước ấm, dễ dàng tạo gel nhờ vào liên kết chéo kỵ nước khi nhiệt độ thấp Sản phẩm này hoạt động hiệu quả trong việc hình thành cấu trúc gel ổn định, phù hợp với nhiều ứng dụng thực phẩm và y tế Nhờ tính chất dễ hòa tan và khả năng tạo gel nhanh chóng, gelatin thường được sử dụng trong làm bánh, đồ ngọt và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe.
Gelatin được công nhận là một ứng cử viên sáng giá cho mực sinh học nhờ tính tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học Tuy nhiên, việc sử dụng gelatin còn bị hạn chế do lo ngại về khả năng in thấp của nó Để khắc phục nhược điểm này, các đặc tính lưu biến của gelatin có thể được cải thiện thông qua việc pha trộn với các thành phần khác, như đã được chứng minh trong nghiên cứu của Shin và Kang.
Hỗn hợp gelatin chứa hyaluronan và glycerol được chuẩn bị làm chất phụ gia để đánh giá khả năng in của mực sinh học Nghiên cứu cho thấy rằng sự kết hợp gồm 10/20 mg/mL gelatin, 3 mg/mL axit hyaluronic và 10% v/v glycerol tạo ra một loại mực sinh học đồng nhất với độ phân giải in ấn vượt trội Mực sinh học dựa trên gelatin có khả năng tạo ra các đường có chiều rộng khoảng 200 μm, giữ lại tế bào và định vị chính xác trong cấu trúc 3D, chứng tỏ tiềm năng trong ứng dụng in sinh học đa dạng.
Công nghệ in sinh học 3D
In sinh học 3D là công nghệ quan trọng trong kỹ thuật mô, giúp tạo ra các cấu trúc sinh học từ mực sinh học một cách chính xác và hiệu quả Công nghệ này mở ra tiềm năng lớn trong lĩnh vực y học tái tạo, hỗ trợ phát triển các mô và cơ quan nhân tạo Ngoài ra, in sinh học 3D còn ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, góp phần nâng cao chất lượng và đa dạng sản phẩm dinh dưỡng Với khả năng tạo dựng các cấu trúc sinh học phức tạp, công nghệ này hứa hẹn mang lại nhiều đột phá trong y học và công nghiệp thực phẩm tương lai.
2.10.2.1 Máy in sinh học dựa trên đùn
Kỹ thuật in sinh học dựa trên quy trình ép đùn, bao gồm các phương pháp in sinh học bằng khí nén, piston và trục vít để ứng dụng trong lĩnh vực sinh học Máy in sinh học đùn đã được giới thiệu lần đầu tiên vào năm, mở ra cơ hội mới cho các nghiên cứu và sản xuất sinh học chính xác và hiệu quả.
Trong in sinh học, 2002 được sử dụng phổ biến nhất nhờ vào tính linh hoạt, tính thực tiễn, khả năng chi trả hợp lý và khả năng tạo ra các cấu trúc 3D quy mô lớn, giúp hỗ trợ hiệu quả trong các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phức tạp.
Máy in sinh học đùn thường có hai hoặc nhiều đầu in để phun mực sinh học chứa tế bào, yếu tố tăng trưởng hoặc vật liệu như hydrogel bằng cách áp dụng áp lực liên tục Hệ thống này cho phép phân tán sợi mực qua các vòi phun nhỏ, tạo điều kiện in ấn chính xác và đa dạng mẫu Trong các loại máy in sinh học, hướng lắng đọng của lớp mực có thể khác nhau, và hộp mực thường được cố định vào cánh tay in di chuyển theo hướng z-y trên bộ thu di chuyển theo trục x, từ đó tạo ra các cấu trúc 3D phức tạp.
Hình 2.10 Máy in sinh học dựa trên đùn
2.10.2.2 Máy in sinh học dựa trên giọt Được giới thiệu vào năm 1988, phương pháp in sinh học dựa trên giọt có thể được chia nhỏ hơn nữa thành phản lực điện thủy động lực học, máy in phun, âm thanh hoặc in sinh học dựa trên vi mảnh In phun sinh học là phương pháp in sinh học dựa trên giọt đầu tiên được phát triển Phương pháp in phun sinh học có thể được chia thành in sinh học liên tục và in theo yêu cầu, trong đó các giọt đơn lẻ được lắng đọng theo một đường dẫn xác định Kỹ thuật thả giọt theo yêu cầu dựa trên ba cơ chế tạo giọt khác nhau: áp điện, nhiệt và tĩnh điện [1]
Hình 2.11: Máy in sinh học dựa trên giọt
2.10.2.3 Máy in sinh học hỗ trợ bằng laser Được giới thiệu vào năm 1999, in sinh học có sự hỗ trợ của laser cho thấy sự tương đồng với phương pháp viết trực tiếp Quá trình in sinh học có hỗ trợ bằng laser bao gồm chuyển tiếp chuyển tiếp do laser tạo ra, chuyển tiếp chuyển tiếp do laser hỗ trợ bởi màng hấp thụ và viết bay hơi bằng laser có ma trận trực tiếp hỗ trợ [1].
Hình 2.12: Máy in sinh học hỗ trợ bằng laser
2.10.2.4 Máy in sinh học dựa trên trùng hợp Vat
Kỹ thuật in sinh học dựa trên trùng hợp Vat được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1984 và đang phát triển mạnh mẽ nhờ vào độ chính xác sản xuất cao phù hợp với nhiều ứng dụng kỹ thuật mô khác nhau Phương pháp này sử dụng các chất khởi tạo quang khác nhau trong quá trình in sinh học để thúc đẩy liên kết chéo cần thiết cho việc xây dựng các cấu trúc mô phức tạp và có độ phân giải cao.
Hình 2.13 Máy in sinh học dựa trên trùng hợp Vat
2.10.3 Lựa chọn công nghệ in 3D thịt nhân tạo
Dựa trên kết quả đánh giá các kỹ thuật in 3D và khả năng tương thích để sản xuất thịt nhân tạo, kỹ thuật in 3D dựa trên đùn đã được lựa chọn nhằm đảm bảo về mặt kinh phí và chất lượng sản phẩm Ưu điểm chính của phương pháp in đùn là tốc độ tương đối thấp, giúp tránh các điều kiện khắc nghiệt như cắt, sốc và nhiệt độ, mà tế bào có thể gặp phải trong các phương pháp in sinh học khác Phương pháp này còn cho phép sử dụng nhiều loại mực sinh học với độ nhớt đa dạng, mật độ tế bào cao và nồng độ tế bào khác nhau, phù hợp cho sản xuất thịt nhân tạo chất lượng cao.
Bảng 2.1 So sánh các kỹ thuật in
Phương pháp đùn được sử dụng để chế biến thịt nhuyễn có thớ cơ thô và tính nhất quán bán rắn dai, làm nguyên liệu chính trong sản xuất thực phẩm Công nghệ in sinh học 3D sử dụng máy in kiểu đùn nhằm tạo ra các biến thể thịt với cấu trúc đa dạng, mở ra tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và nghiên cứu phát triển sản phẩm mới.
Hình 2.14 Ứng dụng công nghệ in đùn sinh học trong kỹ thuật nuôi cấy thịt
Kích thước lỗ phun, áp suất tác dụng và hình dạng lỗ phun đóng vai trò quan trọng trong kết quả in, ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của tế bào trong hydrogel chứa đầy tế bào in Tỷ lệ tế bào chết phụ thuộc vào đường kính vòi phun và áp suất hệ thống, với khả năng sống sót của tế bào giảm khi áp suất in tăng và khẩu độ vòi phun giảm Sợi in có chiều rộng tối thiểu là 1,3 mm, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong quá trình in 3D sinh học.
Tốc độ in ảnh hưởng lớn đến hiệu quả xây dựng cấu trúc sinh học theo tỷ lệ milimet hoặc centimet, vì khả năng tồn tại của tế bào sau quá trình in kéo dài phụ thuộc chặt chẽ vào việc duy trì tốc độ in phù hợp Việc kiểm soát tốc độ in có thể thực hiện dễ dàng bằng công nghệ điện tử, đảm bảo độ chính xác và ổn định Đặc biệt, tốc độ đùn vật liệu đạt 1 mL/phút giúp tối ưu quá trình in sinh học, đảm bảo tế bào được bảo vệ và duy trì chức năng trong quá trình in ấn.
Tốc độ dòng chảy theo thể tích, hay khối lượng mực sinh học in đi qua đầu phun trên một đơn vị thời gian, là yếu tố quyết định hình dạng của các sợi hoặc giọt in sinh học Tốc độ dòng chảy cao khi kết hợp với tốc độ in thấp nhất sẽ giúp tối đa hóa đường kính sợi, còn tốc độ dòng chảy thấp hơn kết hợp với tốc độ in lớn hơn sẽ giảm kích thước của chúng Điều này cho thấy rằng việc kiểm soát chính xác tốc độ dòng chảy và tốc độ in là yếu tố quan trọng trong quá trình in sinh học để đạt được kích thước và hình dạng mong muốn của các cấu trúc in.
- Tính chất lưu biến của mực sinh học
Các đặc tính lưu biến của mực sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ trung thực của quá trình in và độ bền của tế bào Khi công nghệ in sinh học ngày càng phát triển, lưu biến học sẽ trở thành một tham số cực kỳ quan trọng để tối ưu hóa mực sinh học dựa trên hydrogel Các đặc tính lưu biến chính như hành vi chảy, độ nhớt, ứng suất cắt và độ nhớt ảnh hưởng trực tiếp đến các đặc điểm cuối cùng của mô sinh học 3D và cấu trúc sinh học.
Kỹ thuật chụp ảnh siêu kính cận (HSI)
Công nghệ HSI là kỹ thuật phát hiện phổ phái sinh dựa trên công nghệ hình ảnh viễn thám siêu kính, bao gồm các dải phổ từ tử ngoại đến hồng ngoại nhiệt, giúp phân tích thành phần và đặc điểm của mẫu một cách chính xác và không phá hủy Đây là công nghệ nhiệt hạch phát hiện quang điện mới nổi, kết hợp giữa phát hiện quang phổ và thị giác máy tính kỹ thuật số, cho phép tích hợp độ phân giải quang phổ và hình ảnh Thông tin quang phổ phản ánh thành phần bên trong của mẫu, trong khi hình ảnh thể hiện đặc điểm bên ngoài; giúp nhận diện mẫu nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật HSI được phân thành HSI nhìn thấy/cận hồng ngoại (Vis-NIR-HSI: 400–1.000 nm) và HSI cận hồng ngoại (NIR-HSI: 900–1.700 nm), với khả năng thu đồng thời cả dữ liệu quang phổ và hình ảnh độ phân giải cao trong thời gian thực.
HSI sử dụng nền tảng phần cứng và phần mềm kết hợp truyền thống của hình ảnh hai chiều và quang phổ để thu thập thông tin không gian và phổ của từng pixel, giúp phân tích toàn diện đối tượng Dữ liệu HSI là một khối ba chiều bao gồm hình ảnh quang phổ với dữ liệu trong hàng trăm dải liên tiếp, gọi là siêu khối hoặc khối quang phổ (x, y, λ), trong đó (x, y) là tọa độ của pixel và λ là bước sóng thể hiện phổ một chiều Nhìn ở kích thước một chiều λ, HSI là hình ảnh hai chiều (x, y), còn từ hai chiều (x, y), nó trở thành một dải quang phổ Thông tin hình ảnh tại một bước sóng cố định có thể được trích xuất từ khối dữ liệu siêu kính, đồng thời, giá trị độ hấp thụ hoặc phổ của một điểm hay vùng nhất định của mẫu tại mỗi bước sóng cũng có thể được lấy ra để phân tích đặc điểm của đối tượng.
Hình 2.15 Sơ đồ thông tin siêu khối của hình ảnh siêu kính cận để phát hiện thịt.
- Đánh giá chất lượng cảm quan: Độ tươi, màu sắc và độ pH.
- Phát hiện các thành phần dinh dưỡng: Độ ẩm của thịt, protein và chất béo
- Theo dõi thời gian thực của quá trình chế biến và phân loại chất lượng thịt.
Công nghệ HSI ngày càng được công nhận là một trong những kỹ thuật phát triển nhanh nhất trong lĩnh vực kiểm tra không phá hủy chất lượng và độ an toàn của thịt Nhờ khả năng cung cấp hình ảnh toàn diện về đặc tính của sản phẩm, HSI giúp đánh giá chất lượng thịt một cách chính xác và nhanh chóng hơn, góp phần nâng cao tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong những năm gần đây Công nghệ này đã được sử dụng phổ biến, mở ra nhiều cơ hội mới trong quản lý chất lượng và kiểm tra thực phẩm.
QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ
Thuyết minh quy trình công nghệ
3.2.1 Xử lí mẫu mô thịt
Loại bỏ các tác nhân gây hại trong mẫu mô ban đầu để tiến hành công đoạn tách tế bào.
Mẫu sạch, rửa và sát trùng bằng cồn, bảo quản trong PBS
Nước muối đệm photphat (PBS) là dung dịch đệm có pH khoảng 7.4, thường dùng trong nghiên cứu sinh học để duy trì ổn định môi trường tế bào Nó chứa các thành phần chính như dinatri hydro photphat, natri clorua, và đôi khi bổ sung kali clorua cùng kali dihydro photphat để phù hợp với nồng độ trong cơ thể người Bộ đệm PBS giúp duy trì độ pH không đổi, đồng thời đảm bảo nồng độ thẩm thấu và ion phù hợp, giữ cho môi trường sinh học ổn định trong các thí nghiệm.
PBS có nhiều công dụng quan trọng nhờ đặc tính đẳng trương và không độc đối với hầu hết các tế bào Nó được sử dụng để pha loãng chất và rửa các hộp đựng tế bào một cách an toàn Ngoài ra, PBS kết hợp với EDTA còn được sử dụng để tách các tế bào gắn chặt và tập hợp lại, hỗ trợ quá trình chuẩn bị mẫu hiệu quả trong các nghiên cứu sinh học và xét nghiệm y học.
Bảng 3.1 Thành phần dung dịch PBS
Xử lý sơ bộ mẫu mô: rửa nhiều lần bằng dd PBS có bổ sung kháng sinh, kháng nấm sau đó cắt bỏ các phần mô chết phần thừa.
Cắt mô thành các mẫu nhỏ giúp tăng diện tích tiếp xúc bề mặt, tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme tương tác hiệu quả với mẫu mô Quá trình này nâng cao khả năng phân tách tế bào chính xác hơn Việc chuẩn bị mẫu mô nhỏ gọn là bước quan trọng để tối ưu hóa quá trình phân tích sinh học.
Máy cắt lạnh vi phẫu mô tế bào Model HM525 NX [13]
Hình 3.2 Máy cắt lạnh vi phẫu mô tế bào Model HM525
Màn hình điều khiển cảm ứng (Touch Screen) kết hợp phần mềm trực quan giúp người dùng dễ dàng theo dõi và điều chỉnh các thông số như nhiệt độ, độ dày lát cắt, khoảng di chuyển còn lại của giá mang dao, cùng các chức năng khác của máy Người dùng có thể tùy chỉnh độ sáng màn hình để phù hợp với nhu cầu sử dụng, nâng cao trải nghiệm vận hành linh hoạt và chính xác.
Chức năng tạm dừng máy khi không sử dụng giúp tiết kiệm năng lượng và giảm độ ồn, có thể kích hoạt thức thì.
Hệ thống tiệt trùng bằng đèn UV:
- Chọn lựa 4 mức thời gian cài đặt sẵn bên trong máy.
- Có thể lập trình thời gian tiệt trùng tùy ý.
- Có thể lập trình thời gian kích hoạt chu trình tiệt trùng.
- Hiển thị thời gian còn lại của chu trình.
Máy có bộ nhớ trong để lưu trữ các thông số thực và trạng thái lỗi, giúp dễ dàng theo dõi và bảo trì thiết bị Ngoài ra, thiết bị còn hỗ trợ tải dữ liệu nhanh chóng qua ngõ giao tiếp USB, đảm bảo thuận tiện trong quá trình vận hành Với độ ồn thấp chỉ 45dBA khi hoạt động, máy vận hành êm ái, không gây ồn ào hay phiền nhiễu cho người dùng.
Môi chất lạnh thân thiện môi trường R404a. Đặc điểm buồng cắt lạnh:
- Buồng cắt làm bằng thép không rỉ, tạo không gian rộng rãi bên trong buồng cắt.
- Bộ phận máy cắt nằm ngoài buồng lạnh giúp:
+ Mẫu cần cắt đông nhanh hơn.
+ Dễ dàng trong việc lau chùi.
+ Không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ nên tuổi thọ sẽ cao hơn
+ Nhiệt độ cài đặt sẽ đạt nhanh hơn.
- Thanh làm lạnh nhanh có đến 27 vị trí.
Hệ thống nhiệt độ buồng cài đặt linh hoạt từ +5°C đến -35°C phù hợp với nhiều yêu cầu kiểm nghiệm và bảo quản Khi nhiệt độ môi trường đạt +20°C, hệ thống tích hợp công nghệ làm lạnh nhanh sử dụng công nghệ Peltier giúp kiểm soát 4 vị trí độc lập, đảm bảo đạt nhiệt độ lý tưởng -55°C Điều này giúp nâng cao hiệu quả làm lạnh và duy trì trạng thái ổn định của các mẫu vật trong quá trình sử dụng.
Cửa kính dạng trượt hiện được tích hợp hệ thống chiếu sáng bằng đèn LED, giúp duy trì ánh sáng đồng đều và tiết kiệm năng lượng Đặc biệt, đèn LED có khả năng điều chỉnh cường độ sáng linh hoạt, mang lại ánh sáng lạnh phù hợp với nhiều không gian Công nghệ này không chỉ nâng cao tính thẩm mỹ mà còn tối ưu hóa hiệu quả sử dụng năng lượng, phù hợp với xu hướng xanh hóa và tiết kiệm điện hiện nay.
- Chu trình xả đông có thể lập trình hẹn giờ hay kích hoạt ngay tức thì, tích hợp chức năng xả đông tức thì (tối đa
- Ngàm giữ mẫu có nhiều màu khác nhau giúp dễ phân biệt mẫu, kích thước tùy chọn 20/30/40 mm hay 50x50 mm hoặc 70x55 mm
- Góc cắt lưỡi dao dùng cho dao sử dụng 1 lần có thể điều chỉnh từ 8 - 16°. Đặc điểm bộ phận cắt mẫu:
- Mẫu di chuyển bằng các vòng bi chéo thẳng hàng không cần bảo trì.
- Điều chỉnh xoay giá mang mẫu 80 theo trục X/Y có vị trí Zero và xoay 360° theo trục Z.
- Độ dày lát cắt tinh từ 1 - 100mm với các bước chỉnh sau:
+ 1-10mm với mỗi bước chỉnh 1mm.
+ 10 - 20mm với mỗi bước chỉnh 2mm.
+ 20 - 50mm với mỗi bước chỉnh 5mm.
+ 50 - 100mm với mỗi bước chỉnh 10mm.
- Độ dày lát cắt thô từ 5 - 500mm với các bước chỉnh sau:
+ 5 - 30mm với mỗi bước chỉnh 5mm.
+ 30 - 100mm với mỗi bước chỉnh 10mm.
+ 100 - 200mm với mỗi bước chỉnh 20mm.
+ 200 - 500mm với mỗi bước chỉnh 50mm.
Khoảng di chuyển lên xuống của giá mang mẫu 64mm, cắt được những mẫu to lớn.
- Khoảng di chuyển ngang của giá mang mẫu 28mm.
- Chức năng lùi mẫu trên đường về với khoảng cách 20mm, có thể tắt mở tùy ý.
- Có bộ phận chống cuộn mẫu trên giá mang dao Tích hợp thanh bảo vệ lưỡi dao đảm bảo an toàn cho người sử dụng.
- Khay chứa sáp thừa có thể tháo rời.
Tách tế bào ra khỏi mẫu mô ban đầu nhờ enzyme phân giải, tế bào đơn sau khi tách phải còn sống để tiến hành nuôi cấy sơ cấp.
Mô được phân tách thành các tế bào đơn nhờ enzyme thủy phân protein, trong đó enzyme trysin được sử dụng để phân cắt mẫu mô thành các tế bào riêng lẻ Quá trình này giúp tách mô hiệu quả, đảm bảo các tế bào được phân lập rõ ràng để phục vụ các nghiên cứu và phân tích sinh học Sử dụng enzyme trysin là bước quan trọng trong quy trình tiêu chuẩn hóa để chuẩn bị mẫu sinh học phù hợp cho các phân tích tiếp theo.
Mô được cắt nhỏ và khuấy từ ở 37oC trong 30 phút với trypsin.
Pha loãng và đem nhuộm với trypan blue, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang
Kết quả phân tích trong buồng đếm hồng cầu cho thấy tỷ lệ tế bào sống không cao, nhưng đây là bước đầu thành công, khi tế bào đơn vẫn còn sống và có khả năng nuôi cấy sơ cấp Các thao tác như nhuộm tế bào sống cũng đã được thực hiện thành công, giúp phân biệt rõ ràng giữa tế bào sống và tế bào chết, mở ra triển vọng cho các nghiên cứu và ứng dụng y học.
Hình 3.4 Phương trình phản ứng thủy phân để phân tách tế bào nhờ enzyme trysin
3.2.3.3 Kiểm soát phản ứng thủy phân
Kiểm soát phản ứng thủy phân của enzyem,ngăn cản sự phá hủy tế bào của trypsin
Dừng phản ứng thủy phân bằng cách đo pH,đây là phương pháp phổ biến và chính xác nhất
Bất hoạt enzyme trypsin bằng FBS(Fetal bovine serum hoặc Di-Isopropyl-Fluorophosphat(DFP)
Scaffold là dạng cấu trúc khung xốp đóng vai trò quan trọng trong kỹ thuật mô, giúp tạo dựng cấu trúc mô ba chiều hiệu quả Nghiên cứu này tập trung vào chế tạo scaffold từ polymer phân hủy sinh học polylactic acid (PLA), nhằm phát triển các ứng dụng trong lĩnh vực y học và kỹ thuật mô Việc sử dụng PLA trong sản xuất scaffold đảm bảo tính an toàn sinh học và khả năng phân hủy tự nhiên, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác động môi trường.
Phương pháp tách pha dung môi đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành scaffold và bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như loại dung môi, nồng độ polymer, nhiệt độ trao đổi, tỷ lệ ethanol/nước trong hệ dung môi trao đổi, cũng như tỷ lệ dung dịch so với dung môi trao đổi Các nghiên cứu cho thấy rằng, khi nồng độ polymer và lượng nước trong dung môi trao đổi tăng, kích thước lỗ xốp của scaffold sẽ giảm, trong khi ngược lại, tăng nhiệt độ trao đổi và tỷ lệ dung môi hòa tan so với dung môi trao đổi sẽ làm tăng kích thước lỗ xốp.
Scaffold có kích thước lỗ xốp 42,4 mm, có thể được chế tạo bằng PLA ở nồng độ 150 g/L, với nhiệt độ trao đổi là 40ºC và dung môi trao đổi có tỷ lệ ethanol/nước là 96/4 Tỷ lệ thể tích dung môi hòa tan/dung môi trao đổi là 1/20, giúp tối ưu quá trình chế tạo Kết quả thử nghiệm cơ học cho thấy, khi kích thước lỗ xốp tăng, độ bền kéo của scaffold giảm, với scaffold có lỗ xốp 42,4 mm đạt độ bền kéo 65,5 MPa và diện tích bề mặt riêng là 25,7, phù hợp cho ứng dụng trong lĩnh vực nha khoa và y học.
Tạo khung cho tế bào gắn vào và phát triển.
Lưu giữ và thể hiện vai trò sinh học của các tác nhân hóa sinh.
Tiếp xúc với môi trường qua hệ thống lỗ xốp để khuếch tán chất dinh dưỡng nuôi cấy tế bào và loại bỏ các chất thải.
Khung cần có độ cứng chắc và mềm dẻo phù hợp tương tự như các mô sinh học.
Nhiều vật liệu đã được chọn làm khung hỗ trợ, trong đó các vật liệu kim loại phù hợp với đặc tính cấy ghép vào cơ thể người nhưng không phân hủy sinh học Vật liệu vô cơ như calcium phosphates hay hydroxyapatite có khả năng tái tạo mô xương nhưng gặp khó khăn trong việc tạo cấu trúc lỗ xốp phù hợp Các loại polymer sinh học được ưa chuộng nhờ khả năng thiết lập, điều chỉnh thành phần và cấu trúc theo mong muốn, đồng thời nhiều khung hỗ trợ mô mô phỏng tự nhiên dựa trên các protein – thành phần của cấu trúc sinh học cơ bản.
Một số đặc tính của mô, cơ quan sinh học được xem xét và áp dụng để phỏng sinh học bao gồm:
Vật liệu làm khung nên có khả năng phân rã sinh học trong môi trường sinh học, lý tưởng nhất là tốc độ phân rã phù hợp với quá trình hình thành mô mới Các vật liệu như PLA, PGA, và PLGA không những có khả năng phân rã sinh học tốt mà còn có độ tương hợp sinh học cao với cơ thể con người Ngoài ra, phương pháp mô phỏng đặc tính phân rã bởi enzyme đặc hiệu, chẳng hạn như matrix metalloproteases, đã được phát triển bằng cách tổng hợp các vật liệu polymer sinh học có cấu trúc BAB, trong đó A là PEG và B là chuỗi oligopeptide ngắn làm đích cho enzyme cắt, tạo thành mạng lưới hydrogel liên kết chéo.
Tính đàn hồi của một số mô và cơ quan như cơ tim, van tim và mạch máu đặc biệt, trong đó các vật liệu polymer tổng hợp như poly(ε-caprolactone) (PCL) và polyurethane (PU) được sử dụng để tái tạo tính đàn hồi tự nhiên, mặc dù vẫn gặp vấn đề về khả năng phân rã chậm và độc tính cao Một ứng dụng của công nghiệp sinh học là bắt chước đặc tính của elastin, một protein có tính đàn hồi cao có trong nhiều mô của cơ thể, được tổng hợp từ các phân tử tropoelastin Tropoelastin có cấu trúc lặp lại gồm các phần kị nước và ưa nước liên kết chéo xen kẽ, có khả năng hình thành giọt tụ (coacervate), tạo thành các thể không tan khi nhiệt độ tăng, giúp mô phỏng độ đàn hồi tự nhiên của elastin trong tế bào và mô mềm.