Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym αglucosidase của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve) trên mô hình in vitro và in silico

Đề tài Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym αglucosidase của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve) trên mô hình in vitro và in silico nghiên cứu nhằm đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây Chè vằng trên mô hình in vitro; xác định những hợp chất trong cây Chè vằng có tác dụng ức chế enzym αglucosidase bằng phương pháp docking phân tử.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

LÊ MINH NGỌC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

α – GLUCOSIDASE CỦA CÂY CHÈ VẰNG

(Jasminum subtriplinerve)

TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO VÀ IN SILICO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

LÊ MINH NGỌC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

α – GLUCOSIDASE CỦA CÂY CHÈ VẰNG

(Jasminum subtriplinerve)

TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO VÀ IN SILICO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS BÙI THANH TÙNG

HÀ NỘI - 2022

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo công tác tại trường đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và đã luôn tận tâm truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tại trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô tại bộ môn Dược lý đã tạo điều kiện để tôi được thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp này

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến PGS.TS Bùi Thanh Tùng, Bộ môn Dược lý, Trường Đại học Y Dược Thầy là người

đã trực tiếp hướng dẫn và luôn tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm

đề tài Bên cạnh đó, thầy cũng đưa ra những lời khuyên, kinh nghiệm để giúp tôi định hướng cho tương lai sau này

Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm cho đề tài

Tiếp đến, tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Bảo Kim – sinh viên lớp Dược học khoá QH.2018.Y đã nhiệt tình hỗ trợ tôi rất nhiều Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, quan tâm và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Tuy có nhiều cố gắng, nhưng kiến thức và kinh nghiệm của tôi còn hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót trong đề tài nghiên cứu này Kính mong nhận được những lời nhận xét, góp ý của các quý thầy cô để Khoá luận tốt nghiệp của tôi được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2022

Sinh viên

Lê Minh Ngọc

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường

ADA Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các mẫu nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Kết quả docking 39 hợp chất thành phần trong cây Chè vằng vào enzym

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc không gian ba chiều của GH13 Agases 6

Hình 1.2 Cấu trúc không gian 3D của GH31 Agases 6

Hình 1.3 Cấu trúc của hoạt chất acarbose, miglitol 7

Hình 1.4 Đặc điểm thực vật của cây Chè vằng 12

Hình 1.5 Cấu trúc hoá học của 6 terpene glycosides 13

Hình 2.1 Lá cây Chè vằng được phơi khô (Jasminum subtriplinerve)……… … 16

Hình 2.2 Mô phỏng hệ thống sàng lọc ảo hợp chất ức chế α-glucosidase 19

Hình 3.1 Quy trình và kết quả chiết cao Chè vằng……… 22

Hình 3.2 Vùng hoạt động của Isomaltase 24

Hình 3.3 Kết quả re-docked của α-D-glucopyranose 24

Hình 3.4 Hình ảnh ba chiều (3D) tương tác bề mặt của thụ thể và phối tử trong vị trí hoạt động của α-glucosidase 29

Hình 3.5 Hình ảnh tương tác hai chiều giữa 4 hợp chất tiềm năng với

α-glucosidase 30

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Bệnh đái tháo đường 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Phân loại 2

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh 2

1.1.4 Các biến chứng của bệnh ĐTĐ 3

1.1.5 Điều trị bệnh ĐTĐ 4

1.2 Enzym α-glucosidase và chất ức chế enzym α-glucosidase 5

1.2.1 Enzym α-glucosidase 5

1.2.2 Chất ức chế enzym α-glucosidase 7

1.3 Phương pháp docking phân tử 8

1.3.1 Khái niệm 8

1.3.2 Quy trình docking 9

1.3.3 Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc 10

1.3.4 Dự đoán các thông số dược động học và độc tính 10

1.4 Cây Chè vằng - Jasminum subtriplinerve 11

1.4.1 Vị trí phân loại của cây Chè vằng 11

1.4.2 Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố 11

1.4.3 Thành phần hoá học 12

1.4.4 Tác dụng sinh học 14

1.4.5 Công dụng 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 16

2.1.1 Nghiên cứu trên mô hình in vitro 16

2.1.2 Nghiên cứu trên mô hình in silico 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Nghiên cứu trên mô hình in vitro 18

2.2.2 Nghiên cứu trên mô hình in silico 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 22

3.1 Kết quả quá trình chiết cao Chè vằng 22

3.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây Chè vằng trên mô hình in vitro 23

3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các hợp chất trong cây Chè vằng bằng phương pháp docking phân tử 24

3.3.1 Đánh giá mô hình Docking 24

3.3.2 Tiến hành docking các hợp chất có tiềm năng ức chế alpha-glucosidase……… 24

3.3.3 Kết quả đánh giá quy tắc 5 tiêu chí của Lipinski 27

3.3.4 Dự đoán đặc tính hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính (ADMET) 28

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 31

4.1 Về tác dụng ức chế enzym α-glucosidase 31

4.2 Về phương pháp sàng lọc ảo 32

4.3 Về kỹ thuật docking phân tử 32

4.4 Về kết quả sàng lọc ảo 33

4.4.1 Astragalin 34

4.4.2 Isoquercitrin 35

4.4.3 Verbascoside 35

4.4.4 Stigmasterol 35

KẾT LUẬN 36

ĐỀ XUẤT 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đời sống con người không ngừng thay đổi về mọi mặt văn hoá, xã hội hay chăm sóc sức khoẻ Theo đó,

mô hình bệnh tật ở Việt Nam cũng có sự thay đổi, các bệnh không truyền nhiễm đang

có xu hướng gia tăng nhanh chóng Theo thống kê của Hiệp hội đái tháo đường quốc

tế, tính đến năm 2021, thế giới có 537 triệu người trưởng thành từ 20-79 tuổi đang sống chung với bệnh tiểu đường 1 Tại Việt Nam, bệnh đái tháo đường được dự báo

sẽ trở thành một trong bảy căn bệnh gây tử vong và tàn tật hàng đầu ở Việt Nam vào năm 2030 2

Hiện nay, để kiểm soát mức đường huyết trong điều trị bệnh tiểu đường, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ức chế enzym α-glucosidase là một chiến lược điều trị tiềm năng Enzym α-glucosidase (AG) đóng một vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân tinh bột thành glucose 3 Tuy nhiên, các hợp chất ức chế AG như miglitol, metformin và acarbose vẫn còn gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm kiếm các hợp chất nguồn gốc thiên nhiên an toàn và hiệu quả điều trị đái tháo đường đang ngày càng trở nên cấp thiết

Tại Việt Nam, nhiều dược liệu có chứa những hợp chất có tác dụng sinh học như flavonoid, anthocyanosid, tannin, các polyphenol…được dùng làm thực phẩm, nước uống bổ dưỡng, giải độc hằng ngày, trong đó có cây Chè vằng Các tác dụng sinh học của cây Chè vằng đã được nghiên cứu trước đây như kháng khuẩn, chống oxy hóa và gây độc tế bào 4

Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của cây Chè vằng để phục vụ cho việc phát triển thành sản phẩm tiềm năng trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường Bên cạnh đó, docking phân tử

đã trở thành một công cụ hiệu quả trong việc khám phá và phát triển các loại thuốc

mới Do vậy, đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym

α-glucosidase của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve) trên mô hình in vitro và

in silico” được thực hiện nhằm các mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây Chè vằng trên mô

hình in vitro

2 Xác định những hợp chất trong cây Chè vằng có tác dụng ức chế enzym glucosidase bằng phương pháp docking phân tử

α-CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường

1.1.1 Khái niệm

Đái tháo đường là hội chứng các rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, đặc trưng bởi sự tăng glucose huyết do rối loạn bài tiết insulin hay sự giảm hoạt tính của insulin, hoặc cả hai 5 Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh 6

Bệnh đái tháo đường là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, cần được chẩn đoán, phát hiện và điều trị theo đúng nguyên tắc để đảm bảo sức khoẻ và chất lượng cuộc sống

- ĐTĐ tuýp 2: hay còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin

- ĐTĐ thai kỳ: được chẩn đoán vào giai đoạn thứ hai hoặc thứ ba của thai

kỳ mà trước thời kỳ mang thai không có dấu hiệu rõ ràng của bệnh đái tháo đường

- ĐTĐ do các nguyên nhân khác: các nguyên nhân khác gồm hội chứng đái tháo đường đơn gen , bệnh của tuyến tuỵ ngoại tiết, bệnh nội tiết, hoặc do thuốc, hoá chất như sử dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi cấy ghép nội tạng

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh

1.1.3.1 Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1

Đái tháo đường typ 1 là một tình trạng đặc trưng bởi sự phá hủy các tế bào β đảo tụy thông qua hệ thống trung gian miễn dịch, dẫn đến tình trạng thiếu hụt insulin

8 Cụ thể, các tế bào bạch huyết bao quanh tiểu đảo (viêm quanh mô) và sau đó đi vào bên trong tiểu đảo, gây ra sự suy giảm tế bào β và kết quả dẫn đến tiểu đường typ 1 9

Quá trình bệnh sinh được thúc đẩy thêm bởi sự tương tác giữa các yếu tố di truyền và các yếu tố môi trường bên ngoài Nghiên cứu chỉ ra rằng, hơn 60 gen có thể ảnh hưởng đến nguy cơ phát triển bệnh ĐTĐ typ 1, đặc biệt là những người mang kháng nguyên HLA DR4, DQ2, DQ8 10 Bên cạnh yếu tố di truyền, một số yếu tố môi trường được coi là yếu tố nguy cơ như virus, vị trí địa lý, tuổi, cân nặng, chế độ ăn uống và tập luyện 11

1.1.3.2 Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2

Bệnh ĐTĐ typ 2, hay còn gọi là "bệnh tiểu đường không phụ thuộc insulin", chiếm 90–95% tổng số người mắc bệnh tiểu đường 7 Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến bệnh tiểu đường typ 2, trong đó hai yếu tố đóng vai trò quan trọng là

sự đề kháng insulin và sự suy giảm chức năng bài tiết insulin 12 Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, cơ chế của sự kháng insulin bao gồm các thụ thể insulin bị rối loạn chức năng, các con đường truyền tín hiệu của thụ thể không ổn định và những bất thường trong vận chuyển glucose hoặc chuyển hóa glucose 13

Các yếu tố môi trường cũng đóng vai trò lớn trong cơ chế phát sinh bệnh ĐTĐ typ 2, như béo phì, ít tập luyện thể thao, tuổi cao,…Phần lớn các bệnh nhân tiểu đường typ 2 bị thừa cân hoặc béo phì Việc có cân nặng quá mức sẽ gây ra tình trạng kháng insulin ở một mức độ nào đó 7 Ở người bị béo phì, nồng độ axit béo tự do 13trong máu cao sẽ ức chế cạnh tranh với glucose, gây nên tình trạng kháng insulin 13

Tăng axit béo tự do còn ức chế trực tiếp lên quá trình gắn insulin với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào và hoạt động của insulin tại tế bào gan 14

Khi glucose huyết tăng, sẽ xuất hiện tăng bài tiết insulin để kiểm soát nồng độ glucose huyết Nhưng sau đó, glucose huyết vẫn tiếp tục tăng cao, lúc này khả năng bài tiết insulin của tuỵ sẽ không đáp ứng kịp với mức độ tăng glucose huyết Do ảnh hưởng của việc tăng đường huyết quá mức sẽ dẫn đến chức năng của tế bào β bị suy giảm Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin 14

1.1.4 Các biến chứng của bệnh ĐTĐ

Bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ, nếu không được chăm sóc và điều trị đúng cách,

sẽ gặp phải các bệnh và biến chứng nguy hiểm, lâu dài có thể dẫn đến tử vong Một

số biến chứng thường gặp của bệnh ĐTĐ có thể kể đến như: nhiễm toan ceton – nguyên nhân gây tử vong cao nhất trong các biến chứng cấp tính của ĐTĐ, hạ glucose huyết, hay các biến chứng mạn tính trên thận, mắt và tim mạch 14,6

Đối với các biến chứng mạn tính, người bệnh cần được kiểm tra sức khoẻ thường xuyên Bệnh thận do ĐTĐ nên được đánh giá albumin niệu và mức lọc cầu thận ít nhất mỗi năm một lần Bệnh lý võng mạc do ĐTĐ cũng cần được khám mắt

toàn diện và đo thị lực định kỳ hàng năm, để có thể kiểm soát được tiến triển bệnh và giảm nguy cơ mù loà về sau 6 Nhìn chung, các biến chứng do bệnh ĐTĐ để lại sẽ ảnh hưởng một phần đến sức khoẻ và chất lượng cuộc sống của người bệnh, nếu không được điều trị tích cực sẽ gây ra hậu quả nặng nề

1.1.5 Điều trị bệnh ĐTĐ

1.1.5.1 Điều trị ĐTĐ typ 1

Do cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là tuỵ không còn khả năng bài tiết insulin

để đáp ứng nhu cầu cơ thể, nên nguyên tắc điều trị chính là điều trị insulin thay thế suốt đời và phối hợp chế độ ăn uống khoa học, cũng như tập luyện thể lực một cách hợp lý 14 Hiện nay có rất nhiều dạng insulin khác nhau, như: insulin tác dụng nhanh, tác dụng trung gian, tác dụng kéo dài Căn cứ vào từng trường hợp cụ thể mà bác sĩ

sẽ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp với từng bệnh nhân, để có được kết quả tốt nhất

1.1.5.2 Điều trị ĐTĐ typ 2

Đối với người mắc bệnh ĐTĐ typ 2, nguyên tắc điều trị chung là thay đổi lối sống, có một chế độ tập luyện và ăn uống khoa học, kết hợp sử dụng thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 Thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 hiện nay rất đa dạng, mỗi loại thuốc có cơ chế tác dụng và tương tác khác nhau, đem lại nhiều thuận lợi trong việc lựa chọn thuốc cho bệnh nhân

Thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 được chia làm 3 nhóm chính 14

:

- Nhóm thuốc kích thích bài tiết insulin: sulfonylurea, meglinid

- Nhóm thuốc làm tăng tác dụng insulin tại cơ quan đích và chống lại tình trạng kháng insulin: metformin, thiazolidindion

- Nhóm thuốc ức chế hấp thu glucose tại ruột: acarbose, miglitol

Ngoài ra, bệnh nhân ĐTĐ typ 2 cần được điều trị hỗ trợ bằng insulin trong một số trường hợp sau 14

- Chuẩn bị can thiệp phẫu thuật, trong thời gian phẫu thuật và hậu phẫu

- Có biến chứng nặng ĐTĐ: bệnh lý võng mạc, suy gan nặng, suy thận nặng, bệnh lý tim mạch nặng

- Khi dùng thuốc uống liều tối đa không có tác dụng, bệnh nhân thất bại thứ phát với thuốc uống hạ glucose huyết

Một số yếu tố cần xem xét khi lựa chọn thuốc hạ đường huyết 6

:

- Hiệu quả giảm glucose huyết

- Nguy cơ hạ glucose huyết: sulfonylurea, insulin

- Tăng cân: Pioglitazon, insulin, sulfonylurea

- Giảm cân: GLP-1 RA, ức chế kênh đồng vận chuyển natri-glucose (SGLT2i), ức chế enzym α-glucosidase (giảm cân ít)

- Không ảnh hưởng nhiều lên cân nặng: ức chế enzym DPP-4, metformin

- Giá thuốc: cân nhắc dựa trên chi phí và hiệu quả điều trị

1.2 Enzym 𝛂-glucosidase và chất ức chế enzym 𝛂-glucosidase

1.2.1 Enzym 𝜶-glucosidase

Enzym -glucosidase (E.C.3.2.1.20) là một nhóm các enzym, bao gồm một số enzym như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α-glucopyranosidase, α-D-glucosidase, α-glucosid hydrolase, α1,4-glucosidase, α-D-glucosid glucohydrolase

Enzym -glucosidase là một exohydrolase điển hình xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrate để giải phóng phân tử -D-glucose Cơ chất đặc trưng của enzym này là oligosaccharide, disaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside 15

Enzym α-glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycoside hydrolase (GH), là một lớp các enzym thường tách các liên kết glycoside giữa 2 phân

tử carbohydrate – một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer

tự nhiên Khả năng phân cắt các liên kết glycoside của enzym này nhanh hơn 10-17 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác 16

Enzym α-glucosidase tồn tại trong hầu hết các sinh vật Ở người, enzym α-glucosidase được tìm thấy trên màng bề mặt của đường ruột, tham gia trong bước cuối cùng của quá trình chuyển hóa carbohydrate 17

1.2.1.1 Cấu trúc của enzym 𝛼-glucosidase

Các α-glucosidase (AGases) thuộc về glycoside họ hydrolase (GH) 13 và 31, GH13 và GH31 AGases thể hiện các đặc điểm về cấu trúc, chức năng đa dạng 15 Cấu trúc tinh thể của cả hai các enzym được xác định bằng cách sử dụng các dạng tự do

và liên kết với phối tử GH13 có cấu trúc tương tự như oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10; O16G) và dextran glucosidase (glucan 1,6- α-glucosidase; EC 3.2.1.70; DG) 15

Hình 1.1 Cấu trúc không gian ba chiều của GH13 Agases 15

A Cấu trúc tổng thể của phức hợp Halomonas sp a-glucosidase và maltose

(PDB, 3WY4)

B Cấu trúc tổng thể của phức hợp Streptococcus mutans DG và isomaltotriose

(PDB, 2ZID)

Hình 1.2 Cấu trúc không gian 3D của GH31 Agases 15

A Mô hình cấu trúc của N-terminal maltase-glucoamylase

B Vùng hoạt động của N-terminal maltase-glucoamy 1.2.1.2 Cơ chế hoạt động của enzym 𝛼-glucosidase

Carbohydrate là chất dinh dưỡng đa lượng chính trong chế độ ăn của con người chúng ta Khi đưa thức ăn vào cơ thể, các phân tử carbohydrate sẽ được thủy phân

thành những phân tử đường đơn bởi hệ enzym ở ruột non Cụ thể, nguồn carbohydrate này sau khi vào cơ thể sẽ được enzym α-amylase ở tuỵ và enzym α-glucosidase ở

ruột non tiết ra, tiếp tục thủy phân thành những phân tử glucose nhỏ hơn rồi thẩm thấu vào máu 15

Do vậy, bằng việc ức chế hoạt động của enzym α-glucosidase có thể làm giảm

quá trình thủy phân carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu 16

1.2.2 Chất ức chế enzym 𝜶-glucosidase

Chất ức chế enzym α-glucosidase (α-glucosidase inhibitors-AGIs) là các chất làm chậm quá trình hấp thụ carbohydrate từ ruột non, do đó có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu sau bữa ăn 18

Hầu hết các AGIs có thể gắn vào vị trí liên kết carbohydrate của α-glucosidase

vì chúng có cấu trúc giống với disaccharide hoặc oligosaccharide 19 Phức hợp này

có ái lực mạnh hơn so với phức hợp carbohydrate-glucosidase, tạo ức chế cạnh tranh, dẫn đến hoạt động của α-glucosidase trong niêm mạc của ruột non bị ức chế 20 Carbohydrate không được hấp thụ trong đường ruột có thể bị thủy phân dần dần ở tá tràng, hỗng tràng và hồi tràng, nghĩa là sự hấp thụ glucose bị chậm lại 19

Theo các nghiên cứu trước, các loại thuốc AGIs điển hình như miglitol và acarbose, có thể tăng cường tiết GLP-1 (Glucagon like peptide-1), có thể làm giảm cảm giác thèm ăn 19 Acarbose làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate bằng cách

ức chế cạnh tranh với enzym α-glucosidase ở ruột non, dẫn đến làm giảm đường huyết sau ăn Tuy nhiên, acarbose thường gây các tác dụng không mong muốn như đầy bụng, tiêu chảy, buồn nôn…21

Do vậy, việc nghiên cứu và tìm ra các AGIs mới có thể giúp quá trình điều trị đái tháo đường typ 2 được hiệu quả hơn Hiện nay, chất ức chế enzym α-glucosidase đã được tìm thấy ở nhiều loài sinh vật khác nhau, và một trong những nguồn cung phổ biến nhất chính là từ thực vật

Hình 1.3 Cấu trúc của hoạt chất acarbose, miglitol 19

Cây nghệ, có tên khoa học là Curcuma longa, được biết đến với các đặc tính

nổi bật như chống oxy hoá, chống viêm và nhiều công dụng hữu ích khác Ba hợp chất curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin đã được phân lập từ cây nghệ và được tiến hành đánh giá về hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của chúng trong ống nghiệm Kết quả chỉ ra rằng hợp chất bisdemethoxycurcumin cho thấy tác dụng ức chế tiềm năng với IC50 là 23,0 μM 22

Năm 2007, một saponin triterpenoid mới, axit (1→4)-α-l-arabinopyranosyl-(1→3)-β-d-xylopyranosyl-(1→4)-α-l-

28-O-α-l-arabinopyranosyl-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-fucopyranosyl ester đã được phân lập từ dịch chiết

EtOH 70% của rễ cây của loài Gypsophila oldhamiana, một loài thực vật có hoa

thuộc họ Cẩm chướng Đánh giá về hoạt động ức chế α-glucosidase cho thấy hợp chất trên có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase với giá trị IC50 khoảng 23,1 ± 1,8 μM 23

Năm 2008, ba alkaloids piperumbellactam A, piperumbellactam B và

piperumbellactam C đã được phân lập từ loài Piper umbellatum, và các hợp chất này

cho thấy hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt 98.07 ± 0.44

μM, 43.80 ± 0.56 μM và 29.64 ± 0.46 μM 24

1.3 Phương pháp docking phân tử

Quá trình phát minh thuốc luôn đòi hỏi các công đoạn phức tạp, tốn kém thời gian, cũng như nguồn lực tài chính Ngày nay, sàng lọc ảo (Virtual Screening) là một

kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định các hợp chất tiềm năng và góp phần tối

ưu hoá quá trình phát triển các loại thuốc mới Trong đó, docking phân tử là phương pháp sàng lọc ảo được áp dụng phổ biến nhất và ngày càng trở thành công cụ hữu ích với sự phát triển vượt bậc của cấu trúc 3D tia X và NMR 25

Đây được coi là một kỹ thuật tiết kiệm nguồn lực, tài nguyên, chi phí lớn, đem đến nhiều cơ hội cho các nhà nghiên cứu, học viện và ngành công nghiệp dược phẩm nói chung

1.3.1 Khái niệm

Docking là một phương pháp dự đoán vị trí liên kết của một phân tử với một phân tử khác để tạo thành một phức hợp ổn định với năng lượng liên kết thấp nhất Docking phân tử là một trong những phương pháp được sử dụng thường xuyên nhất trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc bởi các ưu điểm của chúng như: khả năng dự đoán cấu trúc của các phối tử phân tử nhỏ trong vị trí liên kết đích thích hợp với mức

độ chính xác đáng kể 26

Cụ thể, docking phân tử thực hiện các dự đoán về cấu trúc phức hợp phối thụ thể bằng cách sử dụng các hàm đánh giá Một chương trình docking gồm 2 phần

tử-chính: thuật toán tìm kiếm cấu dạng tương thích của phân tử trong vị trí gắn và thuật toán đánh giá sự phù hợp của phối tử-thụ thể hoặc ái lực liên kết giữa chúng bằng phương pháp cho điểm và sắp xếp thứ hạng 25

Các thuật toán tìm kiếm cấu dạng thực hiện những thay đổi ngẫu nhiên các thông số cấu trúc của phối tử, như lực xoắn (nhị diện), bậc tự do tịnh tiến và bậc tự

do quay, thường được biến đổi tăng dần 27

Tiếp đó, chức năng cho điểm sẽ được sử dụng để ước tính lực liên kết protein-phối tử bằng các phương pháp toán học 26

Chức năng tính điểm cung cấp ứng dụng quan trọng trong thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, là để xác định hợp chất hits/leads tiềm năng cho một mục tiêu protein nhất định bằng phương pháp sàng lọc ảo Chức năng tính điểm sẽ xếp hạng độ bền liên kết của phối tử khi gắn với vị trí hoạt động trong quá trình sàng lọc cơ sở dữ liệu 28

1.3.2 Quy trình docking

Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn

bị protein, mô phỏng docking

➢ Chuẩn bị cấu tử

Cấu trúc các cấu tử có thể được lấy từ hệ thống dữ liệu có sẵn như Pubchem, ZINC Trong trường hợp không có sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc cấu tử bởi các phần mềm như ChemDraw, ChemSketch… Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, cấu tử cần được chỉnh sửa và chuẩn bị cho docking, các bước chuẩn bị thường có: chỉnh sửa điện tích, gắn trường lực, tối ưu hoá năng lượng

➢ Chuẩn bị protein

Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng dữ liệu protein (Protein data bank) Trong trường hợp chưa có sẵn, có thể tự xây dựng cấu trúc 3D của protein theo phương pháp mô hình hoá tương đồng (Homology modeling) Sau khi chuẩn bị xong cấu trúc 3D, sử dụng các phần mềm chuyên dụng để chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking, gồm các bước: loại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và lập file pdbqt

➢ Mô phỏng docking

Trước khi thực hiện mô phỏng docking, cần khoanh vùng tìm kiếm (grid box) cho thuật toán Kích thước của vùng tìm kiếm không nên quá lớn, gây tốn kém thời gian và độ lặp lại không cao, cũng không nên quá nhỏ vì như vậy phần mềm chỉ tìm

được đặt ở trung tâm hoạt động của protein Sau khi xác định vị trí và kích thước của vùng tìm kiếm, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và đưa ra cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất Các tương tác của các cấu dạng thu được sẽ được tiến hành phân tích trên các phần mềm chuyên dụng như MOE, Pymol, Discovery studio 29

1.3.3 Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc

“Quy tắc 5 của Lipinski”, hay còn gọi là RO5, là bộ quy tắc được sử dụng để đánh giá đặc tính giống thuốc của các hợp chất RO5 đã trở thành công cụ hữu ích trong quá trình tìm kiếm các loại thuốc mới, theo đó một hợp chất được gọi là “giống thuốc” khi chúng đáp ứng ít nhất 2 trong 5 các tiêu chí của qui tắc Lipinski 30:

- Có không quá 5 nhóm cho liên kết hydro (chứa –NH và –OH)

- Có không quá 10 nhóm nhận liên kết hydro (chứa O, N)

- Khối lượng phân tử: MW < 500 Dalton

- Hệ số phân bố octanol/nước: LogP < 5

- Độ khúc xạ mol nằm trong khoảng từ 40 đến 130

Nếu một hợp chất không đáp ứng “quy tắc 5 của Lipinski”, thì có khả năng cao nó sẽ gặp vấn đề khi sử dụng đường uống Tuy nhiên, do RO5 không nói đến các đặc điểm cấu trúc hóa học cụ thể được tìm thấy trong thuốc hoặc các hợp chất không phải thuốc, nên việc đáp ứng RO5 không đảm bảo rằng hợp chất đó có đặc tính giống thuốc 31

1.3.4 Dự đoán các thông số dược động học và độc tính

Việc dự đoán các thông số ADMET (absorption, distribution, metabolism, elimination, toxicity) cho mỗi loại thuốc là một bước sàng lọc quan trọng trước khi đưa vào các thử nghiệm lâm sàng để giảm thiểu việc thu hồi thuốc, cũng như tiết kiệm thời gian và chi phí 32

Hiện nay có rất nhiều công cụ dự đoán ADMET, trong đó một số là công cụ thương mại và một số là công cụ trực tuyến Các công cụ thương mại như CASE ULTRA, DEREK, META-PC, METEOR, PASS, GUSAR,… Bên cạnh đó, các công

cụ trực tuyến như ADMETlab, admetSAR, pkCSM, SwissADME, thường được ưa chuộng hơn do ưu điểm về thời gian và tiết kiệm chi phí 32

Công cụ trực tuyến pkCSM là một công cụ dự đoán và tối ưu hoá dược động học phân tử nhỏ và độc tính dựa trên đồ thị ký hiệu Đây được coi là một phương pháp dự đoán chính xác với bộ

dữ liệu lớn và khả năng xử lý dữ liệu nhanh chóng, được đánh giá là hoạt động tốt hơn một số phương pháp đang được sử dụng rộng rãi khác 33

1.4 Cây Chè vằng - Jasminum subtriplinerve

1.4.1 Vị trí phân loại của cây Chè vằng

Vằng hay còn gọi Chè vằng, chè cước man, dây cẩm văn, cây dâm trắng, lài

ba gân là loài thực vật có hoa thuộc họ Nhài Oleaceae Có tên khoa học là Jasminum

subtriplinerve Blume 34,35 Chè vằng có vị trí phân loại như sau:

và vươn dài tới 15-20m, thân và cành đều nhẵn, không lông Lá mọc đối xứng nhau,

có hình dạng mũi mác Cuống lá tù hay hơi tròn, nhẵn, dài 0,3-1,2cm; đầu lá nhọn, dài 4-7,5cm, rộng 2-4,5cm Các lá ở phía trên nhỏ hơn lá ở phía dưới, mép nguyên, mặt trên có 3 gân nổi rõ rệt 34

Hoa màu trắng, cụm hoa mọc ở đầu cành thành chuỳ, gồm 7-9 hoa Đài hoa

có ống ngắn 3mm, 8-10 thuỳ rất hẹp và nhọn Tràng có ống dài phình lên ở đầu 18mm, 8-10 cánh hoa hẹp; nhị dính ở họng tràng; bầu tù Quả mọng hình cầu, đường kính 7-8mm Khi chín có màu vàng hoặc đen, trong quả có 1 hạt rắn chắc Thời kỳ ra hoa vào khoảng tháng 3 – 4 Mùa quả chín vào tháng 5 – 6 34,36

16-Chè vằng thường mọc ở bờ rào hay bụi tre, hoặc bám vào các cây khác ở ven rừng, ven đồi và xung quanh các làng bản Chè vằng phát triển tốt trong điều kiện ẩm ướt và ấm áp Chè vằng phân bố khá phổ biến, tập trung ở khu vực các nước Đông Nam Á và Nam Á và có ở cả các tỉnh phía nam Trung Quốc và đảo Hải Nam Ở Việt Nam, Chè vằng có rải rác ở hầu hết các tỉnh thuộc vùng đồng bằng, trung du và vùng núi dưới 1500m Chè vằng được tìm thấy nhiều ở một số khu vực: Hoà Bình, Thái Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh 36

Hình 1.4 Đặc điểm thực vật của cây Chè vằng 4

1: Cành mang lá; 2: Hoa; 3: Lá

1.4.3 Thành phần hoá học

Năm 2003, W.Kraus đã phân lập được 6 hợp chất từ cao chiết methanol của

J subtriplinerve bằng phân tích HPLC Tất cả các hợp chất đều là terpene glycoside

(Hình 1.5) 6

Theo một nghiên cứu khác, lá của J subtriplinerve có chứa alkaloid, nhựa,

flavonoid Tuy nhiên chưa có hợp chất được phân lập 37

Năm 2008, Dai Hue Ngan cùng cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất từ cao

chiết petroleum ether và ethyl acetate của J subtriplinerve bằng phương pháp đo phổ

IR, MS, 1D-NMR, 2D-NMR Trong đó có hai triterpenoit là 3𝛽-acetyl-oleanolic acid

và lup-20-en-3𝛽-ol, một hợp chất còn lại là stigmast-5-en-3𝛽-ol 4

Từ cao chiết ethyl acetate của J subtriplinerve, phân lập được các hợp chất

như sau: 6’-O-menthiafoloylverbascoside (1), rutin (2), isoverbascoside (3), isooleoverbascoside (4), apiosylverbascoside (5), astragalin (6), isoquercitrin (7), và verbascoside (8) bằng quang phổ MS và NMR Hợp chất (2), (6) và (7) là flavonoid glycosides Hợp chất (3), (4), (5) và (8) là các phenylpropanoid glycosides 38

3

3

Năm 2012, Nguyen Thi Diem Huong và cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất

3,4-dihidroxibenzoic acid; 3,4,5-trihidroxibenzoic acid và verbascosid từ cao chiết

ethyl acetate trích từ thân và lá của J subtriplinerve 4

Hình 1.5 Cấu trúc hoá học của 6 terpene glycosides 39

1.4.4 Tác dụng sinh học

1.4.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Năm chiết xuất thô thu được từ lá và thân của J subtriplinerve đã được thử nghiệm cho hoạt tính kháng khuẩn bằng cách sử dụng Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis làm vi sinh vật đích

Quá trình chiết được thực hiện với petroleum ether, ethyl acetate, ethanol, methanol

và nước Kết quả cho thấy bốn trong số chúng biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn: cao

chiết petroleum ether thể hiện tác dụng ức chế chống lại B subtilis cho thấy mức thấp

nhất nồng độ ức chế (nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)) 100 𝜇g mL-1

, cao chiết ethyl acetate và ethanol có giá trị MIC là 200 𝜇g mL-1

chống lại S aureus và cao chiết methanol chống lại E coli (MIC: 200 𝜇g mL-1

) Mặt khác, nước chiết xuất không cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại bất kỳ chủng vi khuẩn nào ở nồng độ bằng hoặc thấp hơn 200 𝜇g mL-1

Tất cả các cao chiết không cho thấy bất kỳ tác dụng ức chế nào đối với nấm hoặc nấm men 4

1.4.4.2 Hoạt tính chống oxy hoá

Hoạt tính chống oxy hóa của J subtriplinerve được khảo sát bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH Khả năng chống oxy hoá của các chất chiết xuất từ J

subtriplinerve được xác định ở 200 𝜇g mL-1

và so sánh với hoạt tính chống oxy hóa của 44 𝜇g mL-1 acid ascorbic Chiết xuất có SC (khả năng bẫy gốc tự do) trên 50% được coi là có hoạt tính chống oxy hóa Kết quả thu được cho thấy đa số các chiết xuất đều có hoạt tính kháng oxy hoá trừ petroleum ether, trong đó hoạt tính bẫy gốc

tự do DPPH của cao ethyl acetate là mạnh nhất với SC% là 68.7 ± 0.9% 4,40

1.4.4.3 Hoạt tính gây độc tế bào

Dựa trên tương quan liều lượng – đáp ứng, chỉ chiết xuất petroleum ether là chất độc tế bào chống lại cả hai dòng tế bào ung thư ở người được sử dụng ở đây là: Hep-G2 và RD (IC50 = 19,2 và 20,0 𝜇g mL-1, tương ứng) 40

Trong một nghiên cứu khác, chiết xuất nước và ethanol của J subtriplinerve

thể hiện hoạt tính yếu trong thử nghiệm độc tính cấp tính và mạn tính Thử nghiệm được tiến hành trên chuột và thỏ Kết quả thu được cho thấy không có sự khác biệt giữa nhóm thử nghiệm và nhóm chứng về các chỉ số sinh hóa, huyết học, và các bộ

phận gan, thận Điều này chứng minh được J subtriplinerve rất ít độc hại và có thể

được sử dụng như trà uống hàng ngày với liều lượng thích hợp 4

1.4.5 Công dụng

Theo Y học cổ truyền, Chè vằng có vị hơi đắng, chát, tính ấm, quy kinh tâm

và tỳ; có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, khu phong, hoạt huyết điều kinh, tiêu viêm, trừ mủ Chè vằng dùng tươi hoặc khô dưới dạng thuốc sắc hoặc nấu nước tắm với lượng thích hợp, được sử dụng trị rối loạn kinh nguyệt, dùng cho phụ nữ sau sinh bị nhiễm khuẩn sốt cao Ngoài ra, còn dùng trị phong thấp do huyết kém, đau nhức xương khớp và các bệnh ngoài da 36,41

Trong dân gian, lá vằng phơi khô được nấu hay pha nước uống cho phụ nữ sau sinh để kích thích tuyến sữa, điều trị viêm nhiễm, hoặc dùng lá nấu nước tắm trị ghẻ

lở 35

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nghiên cứu trên mô hình in vitro

2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Lá cây Chè vằng, tên khoa học là Jasminum subtriplinerve Blume., được thu

hái tại Hà Nội vào tháng 10 năm 2021 Mẫu được làm sạch, phơi khô và bảo quản Hiện mẫu nghiên cứu đang được lưu giữ tại Trường Đại Học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Hình 2.1 Lá cây Chè vằng được phơi khô (Jasminum subtriplinerve)

2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

500 gam lá cây Chè vằng sau khi thu hoạch được làm sạch, phơi khô tự nhiên

Lá cây Chè vằng khô được nghiền nhỏ, chiết xuất bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt

độ phòng, 3 lần x 3 ngày với tỷ lệ dược liệu/dung môi 1:10 (kg/l) Lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết toàn phần ethanol

Cao chiết được phân tán trong nước nóng, sau đó chiết lỏng - lỏng tỉ lệ 1:2, mỗi lần 1 lít x 3 lần với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate

và n-butanol, mỗi dung môi 3 lần Gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới

áp suất giảm thu được phân đoạn tương ứng là n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và cắn nước

2.1.1.3 Hoá chất và thuốc thử

- Acid ascorbic (99%, Sigma- Aldrich, Singapore)

- Enzym Yeast -glucosidase

- P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG)

- 4-Nitrophenol (Sigma)

- Dung môi: n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH), ethanol (EtOH) (Trung Quốc), methanol (MeOH) (Merck), nước cất

- Các loại hóa chất khác đều đạt độ tinh khiết cao

2.1.1.4 Thiết bị nghiên cứu

- Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

- Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức)

- Máy đo ELISA Plate Reader (Biotek)

- Giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc, đầu côn các loại

- Các dụng cụ thủy tinh: Pipet, bình định mức, bình chiết, các loại cốc có

mỏ dung tích 25 – 500 ml, bình cầu và các dụng cụ cần thiết khác

2.1.2 Nghiên cứu trên mô hình in silico

2.1.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở dữ liệu cấu trúc các hợp chất có nguồn

gốc từ lá cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume.) Thông tin của 39 hợp chất

đã được xác định cấu trúc trong 3 nghiên cứu trong nước được công bố trên tạp chí Natural Product Research và Journal of Asian natural products research được tập hợp lại thành một CSDL CSDL có các thông tin về hợp chất (tên, biểu diễn cấu trúc dưới dạng SMILE, InChI và InChiKey), tên nguồn dược liệu (tên thông thường, tên khoa học), địa chỉ thu hái, thời gian thu hái, bộ phận sử dụng

2.1.2.2 Nguyên liệu

Cấu trúc tinh thể isomaltase (ID: 3A4A) đã được chứng minh tương đồng với

alpha-glucosidase từ Saccharomyces cerevisiae được lựa chọn và lấy từ cơ sở dữ

liệu RCSB (www.rscb.org) 42 Cấu trúc của isomaltase từ Saccharomyces cerevisiae

và phối tử đồng kết tinh là alpha-D-glucopyranose được xác định ở độ phân giải lần lượt là 1,30 và 1,60 Å

Các cấu trúc phối tử được lấy từ cơ sở dữ liệu PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov) hoặc được vẽ bằng phần mềm Chem Office 19.0

và được chuyển thành cấu trúc 3D nhờ phần mềm Avogadro

2.1.2.3 Thiết bị nghiên cứu

- Máy tính MSI Gaming GF63, Ram 8GB, hệ điều hành Window 10, CPU Intel Core i5 10200H

- Phần mềm:

1 MGL tools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu/)

2 Autodock Vina 4.2 (http://vina.scripps.edu/)

3 UCSF Chimera 1.14 (https://www.cgl.ucsf.edu/)

4 Avogadro 1.2.0 (http://avogadro.cc/)

5 Discovery Studio 2020 Client (https://discover.3ds.com/)

6 Công cụ online pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/)

7 Microsoft Office 2016

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu trên mô hình in vitro

Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của mẫu nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp của Moradi-Afrapoli F và cộng sự 43

Thử nghiệm đánh giá được tiến hành tại Viện công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Nguyên lý

Enzym α-glucosidase là enzym thủy phân liên kết α-1,4-glycoside, xúc tác quá trình chuyển cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside thành α-D-glucose và p-Nitrophenol có màu vàng Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm Khi enzym α-glucosidase bị ức chế một phần, lượng sản phẩm p-Nitrophenol được tạo ra sẽ ít hơn so với khi không có mặt chất ức chế α-glucosidase

Quy trình nghiên cứu

- Chất thử được hòa tan trong DMSO 100% để có dung dịch gốc (20 mg/mL)

và pha loãng trong phosphate buffer 10 mM (pH 6.8) và 50 l mẫu đã pha loãng được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 256 g/ml, 64