Khóa luận tốt nghiệp: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun) thu hái ở

Đề tài Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun) thu hái ở Thanh Hóa nghiên cứu nhằm định tính được các nhóm chất có trong phần trên mặt đất của Sa sâm nam; chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài Sa sâm nam.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

 - -

TÔ MINH NGỌC

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT LOÀI SA SÂM NAM

(Launaea sarmentosa (Willd.) Merr et Chun)

THU HÁI Ở THANH HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

 - -

TÔ MINH NGỌC

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT LOÀI SA SÂM NAM

(Launaea sarmentosa (Willd.) Merr et Chun)

THU HÁI Ở THANH HÓA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH.2017Y Người hướng dẫn: 1 ThS NGUYỄN THỊ THU

2 ThS LÊ HƯƠNG GIANG

HÀ NỘI – 2022

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập, rèn luyện của em tại Đại học

Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy Cô của Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và đội ngũ nghiên cứu viên của Viện Dược liệu cùng gia đình và bạn bè

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Đỗ Thị Hà, PGS.TS

Vũ Đức Lợi cùng ThS Nguyễn Thị Thu, ThS Lê Hương Giang- những người

Thầy đã hết lòng tận tình, chỉ bảo em trong quá trình làm khóa luận

Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến ThS Vũ Thị Diệp, DS Nguyễn Trà My và các cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược

liệu đã giúp đỡ và hướng dẫn em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dược, Bộ môn Dược liệu

& Dược học cổ truyền và các Thầy Cô trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học tập và rèn luyện trong suốt 5 năm học, đồng thời có thể trực tiếp tham gia thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học loài Sa sâm

nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr et Chun)”- Đề tài nghiên cứu cấp cơ sở,

Viện Dược liệu, Bộ Y tế đã tạo điều kiện và hỗ trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ

em trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tốt nghiệp

Do vốn kiến thức còn hạn chế cũng như ảnh hưởng của dịch bệnh Covid-19, quá trình làm khóa luận của em không tránh khỏi thiếu sót Em rất mong nhận được những lời nhận xét, góp ý của các Thầy Cô để khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2022

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT

DANH MỤC HỈNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG BIỂU

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1. Tổng quan về chi Launaea 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Một số loài thuộc chi Launaea được tìm thấy trên thế giới 2

1.1.3 Phân bố 3

1.2. Tổng quan về loài Launaea sarmentosa (Willd.) Merr et Chun 4

1.2.1 Danh pháp 4

1.2.2 Đặc điểm thực vật 4

1.2.3 Phân bố và sinh thái 5

1.2.4 Thành phần hóa học 5

1.2.5 Tác dụng dược lý 6

1.2.6 Công dụng 8

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 Đối tượng nghiên cứu 9

2.2 Hóa chất, thiết bị 9

2.2.1 Hóa chất 9

2.2.2 Thiết bị 10

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10

2.3.1 Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp 10

2.3.2 Phương pháp chiết xuất và phân lập 14

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 14

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16

3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp 16

3.2 Chiết xuất và phân lập các chất 17

3.2.1 Chiết xuất cao toàn phần 17

3.2.2 Chiết xuất và phân lập hợp chất 18

3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 20

3.3.1 Hợp chất SS-1C 20

3.3.2 Hợp chất SS-3B 24

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 25

4.1 Về định tính 25

4.2 Về chiết xuất 25

4.3 Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất 25

4.3.1 Hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol 25

4.3.2 Hợp chất Esculetin 28

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32

Kết luận 32

Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT

5 AMPK Adenosine Monophosphate (AMP)-activated Protein

Kinase (AMP hoạt hóa protein kinase)

7 CD3OD Deuterated methanol

9 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

10 DMSO Dimethyl sulfoxid

15 GOT Glutamic oxalacetic transaminase

16 GPT Glutamic pyruvic transaminase

17 HAEC Human aortic endothelial cell (Tế bào nội mô động mạch

chủ người)

18 HDL High Density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng cao)

19 IC50 50% Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế 50%)

20 LDL Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng thấp)

21 Ls-ME L sarmentosa methanolic extract (Cao chiết methanol từ

26 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

27 TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

28 TNF-α Tumor Necrosis Factor-α (Yếu tố hoại tử khối u alpha)

29 v/v Volume by volume (Thể tích/ thể tích)

30 v/v/v Volume by volume by volume (Thể tích/ thể tích/thể tích)

31 VSMCs Vascular smooth muscle cells (Các tế bào cơ trơn mạch

máu)

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Bản vẽ thực vật Launaea sarmentosa vào thế kỷ XIX 4

Hình 1.2: Hình ảnh thực tế của Launaea sarmentosa 4

Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ rễ L sarmentosa 6

Hình 2.1: Dược liệu Sa sâm nam khô 9

Hình 3.1: Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ phần trên mặt đất của Sa sâm nam 18

Hình 3.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc từ cao chiết Sa sâm nam 20 Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất SS-1C 21

Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất SS-3B 24

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Launaea trên thế giới 2

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong Sa sâm nam 16 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ của chất SS-1C và hợp chất tham khảo 22

Bảng 3.3: Dữ liệu phổ của chất SS-3B và hợp chất tham khảo 24

MỞ ĐẦU

Nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa cùng vị trí địa lý trải dài trên

15 vĩ tuyến, Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo ước tính nước ta có trên 12.000 loài thực vật bậc cao, chiếm khoảng 4 - 5% tổng số loài thực vật bậc cao đã biết trên thế giới Trong số đó, có khoảng 5.000 loài thực vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc [4] Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thường gặp cũng như nâng cao sức khỏe Những bài thuốc này được sử dụng rất rộng rãi và cho thấy tính hiệu quả tốt, tuy nhiên đa số chỉ dựa trên kinh nghiệm dân gian mà chưa có cơ sở khoa học vững chắc

Ngày nay, sự xuất hiện của các bệnh truyền nhiễm mới và sự gia tăng các bệnh rối loạn chuyển hóa đã thúc đẩy sự quan tâm mới trong việc nghiên cứu và phát hiện

ra các hợp chất tiềm năng từ thảo dược Các nhà khoa học, các tập đoàn dược phẩm lớn hiện đang chú trọng vào sàng lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới có dược tính mạnh hơn, ít độc hơn và với chi phí cho nghiên cứu phát triển thấp hơn so với tổng hợp hóa học

Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.)) được biết đến với nhiều công dụng

như hạ sốt, giảm ho, long đờm, lợi sữa, nhuận tràng, lợi tiểu [1] Các tác dụng sinh học bao gồm: chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, tác dụng lên hệ thần kinh trung

ương,… đã được chứng minh bằng thử nghiệm in vitro

Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu cụ thể về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Sa sâm nam trên thế giới và ở Việt Nam còn rất hạn chế Do vậy,

để góp phần xây dựng cơ sở khoa học nhận biết loài, về thành phần hóa học của loài, ứng dụng cây Sa sâm nam nhiều hơn nữa trong việc chăm sóc sức khỏe, đề tài: “Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài Sa

sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr et Chun) thu hái ở Thanh Hóa” đã

được thực hiện với những mục tiêu sau:

1 Định tính được các nhóm chất có trong phần trên mặt đất của Sa sâm nam

2 Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài Sa sâm nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Launaea

1.1.1 Vị trí phân loại

Vị trí phân loại của chi Launaea trong giới thực vật [1] theo “Cây thuốc và

động vật làm thuốc ở Việt Nam” như sau:

1.1.2 Một số loài thuộc chi Launaea được tìm thấy trên thế giới

Hiện nay người ta đã tìm thấy và định danh khoảng 50 loài thuộc chi Launaea

Các loài thuộc chi thực vật này được liệt kê theo Bảng 1.1 dưới đây

Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Launaea trên thế giới

1 Launaea acaulis (Roxb.) Babc

Launaea mucronata (Forssk.)

Muschl

2 Launaea amal-aminiae N.Kilian 21 Launaea nana (Baker) Chiov

3 Launaea angustifolia (Desf.)

Launaea nudicaulis (L.) Hook.f

4 Launaea arborescens (Batt.)

8 Launaea cabrae (De Wild.)

Launaea procumbens (Roxb.)

Ramayya & Rajagopal

9 Launaea capitata (Spreng.)

Launaea pseudoabyssinica

(Chiov.) N.Kilian

10 Launaea cervicornis (Boiss.)

Font Quer & Rothm 29

Launaea pumila (Cav.) Kuntze

11 Launaea cornuta (Hochst ex

Oliv & Hiern) C.Jeffrey 30

Launaea quercifolia (Desf.)

13 Launaea fragilis (Asso) Pau 32 Launaea rogersii (Humbert)

Humbert & Boulos

14 Launaea gorgadensis (Bolle)

Launaea rueppellii (Sch.Bip ex

Oliv & Hiern) Amin ex Boulos

15 Launaea hafunensis Chiov 34 Launaea sarmentosa (Willd.)

1.2 Tổng quan về loài Launaea sarmentosa (Willd.) Merr et Chun

1.2.1 Danh pháp

Danh pháp của Sa sâm nam theo “Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam” [1] như sau:

• Tên tiếng Việt: Sa sâm nam, Cỏ chân vịt, Hải cúc

• Tên khoa học: Launaea sarmentosa (Willd.) Merr et Chun

• Họ thực vật: Cúc (Asteraceae)

• Tên đồng nghĩa: Launaea sarmentosa (Willd.) Sch Bip Ex Kuntze,

Launaea pinnatifida Cass

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Launaea sarmentosa (L sarmentosa) hay còn được biết đến với cái tên Sa sâm

nam là cây thảo, sống lâu năm Cây thân leo có rễ bên mang chồi kéo dài, mỗi rễ có

từ 2-3 thân Thân mọc bò, cao khoảng 20-90 cm, phân nhánh [1, 32]

Lá mọc thành chùm, kích thước 3-8 × 0,6-1 cm, hình răng cưa thành thùy hình chùy, nhỏ dần về phía gốc, có răng cưa rõ rệt, đỉnh nhọn, tù hoặc tròn Tận cùng lá thứ cấp xếp hình hoa thị dọc theo thân, thường có 14-18 bông hoa; với cánh hoa dài khoảng 1-3 cm Quả sa sâm nam có rìa vảy màu trắng rõ rệt, đỉnh nhọn đến tù; bên ngoài hình con thoi hoặc hình trứng đến hình mũi mác [1, 32]

Hình 1.1: Hình ảnh thực tế của Launaea sarmentosa Hình 1.2: Bản vẽ thực vật Launaea sarmentosa

vào thế kỷ XIX

Rễ của L sarmentosa có màu vàng nhạt, khi trưởng thành có màu nâu nhạt

Rễ có mùi thơm, hơi tròn, hình trụ, xốp, ít rễ con, không có mấu và được nghiên cứu rằng có chứa alkaloid, acid amin, glycosid, tanin, cacbohydrat và steroid [32, 48]

1.2.3 Phân bố và sinh thái

Ở Việt Nam, L sarmentosa tìm thấy ở vùng ven biển và các đảo lớn từ Quảng

Ninh, Hải Phòng vào đến Bến Tre Cây cũng phân bố ở vùng ven biển phía nam Trung Quốc, Ấn Độ, Ai Cập và một số nơi ở châu Phi [1]

L sarmentosa có phần trên mặt đất thường lụi vào mùa đông Toàn bộ phần

rễ và phần gốc sẽ mọc lên chồi mới vào mùa xuân hoặc đầu mùa hè năm sau Cây ưa sáng, chịu được mặn; thường mọc trên bãi cát ven biển, thành từng đám hoặc rải rác thành khóm riêng rẽ Cây ra hoa quả hàng năm; quả có túm lông thuận lợi cho việc phát tán nhờ gió [1]

1.2.4 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của L sarmentosa được thực hiện chủ

yếu trên lá và rễ của loài thực vật này [12] Kiểm tra sơ bộ hóa thực vật cho thấy rễ

cây L sarmentosa có mặt các hợp chất thuộc nhóm alkaloid, flavonoid, triterpenoid,

saponin [14]; lá có chứa steroid, alkaloid, terpenoid, đường khử, flavonoid, saponin

nam, mới chỉ có một số hợp chất được phân lập từ dược liệu này, gồm: α-amyrin

acetat (1), β-amyrin acetat (2), lupeol acetat (3), Ψ-taraksasterol acetat (4), luteolin

(5), 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol glucopyranosid (6), scorzosid (7), ixerisosid D (8), 9α-hydroxypinoresinol (9) từ rễ; taraxasterol (10) được phân lập từ lá, glutenol (11),

3-O-L-rhamnopyranosyl-(13)-O-L-arabinopyranosyl(13)-O-D-galactopyranosyl

spergulatriol (12) và hopenol-b (13) từ hạt [56]

Hoạt tính chống oxy hóa của L sarmentosa đã được nghiên cứu bằng cách

đánh giá tác dụng của nó với các gốc tự do DPPH, OH•, Fe3+ Khả năng ức chế gốc DPPH của cao chiết ethanol (liều 200 μg) là 71,22%, của mẫu chứng dương BHA là 89,1% Khả năng ức chế gốc OH• của cao chiết ethanol và nước (liều 200 μg) là 72,46% và 71,23%, cao hơn nhiều so với BHA (% ức chế là 24,26%) [33]

Trong một nghiên cứu khác, giá trị SC50 trong việc dọn gốc DPPH của cao

chiết methanol của L sarmentosa (Ls-ME), tương ứng với nồng độ cần thiết để dọn

50% các gốc tự do trong mẫu là 26,7 µg/mL (tương đương với 5,5 µg/mL vitamin C) Những kết quả này đã chứng minh rằng Ls-ME thể hiện khả năng chống oxy hóa một cách hiệu quả [35]

1.2.5.2 Tan huyết khối, ổn định màng

Ảnh hưởng của L sarmentosa đối với quá trình ly giải cục máu đông trên lâm

sàng được chứng minh trong một nghiên cứu vào năm 2016 Người ta quan sát thấy

tỷ lệ ly giải cục máu đông là 45,49% khi sử dụng 100 µl Streptokinase (30.000 I.U.) làm đối chứng dương tính Mặt khác, nếu sử dụng nước là đối chứng âm, tỷ lệ ly giải

Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ rễ L sarmentosa

cục máu đông là không đáng kể (6,03%) Vì vậy, phần trăm ly giải cục máu đông phụ thuộc vào liều lượng và nồng độ Trong đó, tại nồng độ 10mg/ml cho thấy mức ý nghĩa (p <0,001) ly giải cục máu đông cao nhất (22,57%) [31]

Hoạt động ổn định màng của dịch chiết methanol của L sarmentosa (Ls-ME)

cũng được thực hiện trong nghiên cứu này Nồng độ cao hơn (10 mg/ml) của dịch

chiết methanol của L sarmentosa tạo ra % ức chế đáng kể quá trình tan máu tương

ứng bằng dung dịch nhược trương (12,11 ± 0,037) và nhiệt (20,55 ± 0,87) [31] Trong khi đó, ASA (dung dịch chứa hoạt chất ethanol natri salicylat và acid acetylsalicylic) được sử dụng làm tiêu chuẩn (0,10 mg/ml) trong ổn định màng, cho thấy khả năng

ức chế tan máu do dung dịch nhược trương là 70,01 ± 0,017% và ức chế tan máu do nhiệt tương ứng là 56,32 ± 0,228% [31]

1.2.5.3 Chống viêm, giảm đau, hạ sốt

Cao chiết methanol của L sarmentosa ở các mức liều 100 - 400 mg/kg đều thể

hiện tác dụng hạ sốt, giảm đau và chống viêm, tác dụng mạnh nhất ở liều 400 mg/kg Nhiệt độ cơ thể chuột từ 38,4℃ giảm còn 36,38℃ sau 5h khi dùng Sa sâm nam ở liều 400 mg/kg, còn 35,89℃ khi dùng aspirin liều 30 mg/kg Thời gian phản ứng đau của chuột trong thử nghiệm ngâm đuôi trong nước nóng tăng khi dùng Sa sâm nam, thời gian phản ứng khi dùng liều 400 mg/kg là 6,93 giây (khi dùng pentazocine 30 mg/kg là 7,62 giây) Trong thử nghiệm gây đau quặn bằng acid acetic, Sa sâm nam (400 mg/kg) làm giảm số cơn đau quặn, tỉ lệ ức chế đau là 63,10% (tỉ lệ ức chế của aspirin (30 mg/kg) là 69,23%) Sa sâm nam (400 mg/kg) ức chế 32,48% độ phù chân chuột và ức chế 34,7% sự hình thành u hạt, tỉ lệ ức chế tương ứng của indomethacin

là 40,13% và 63,22% Các kết quả này cho thấy, Sa sâm nam có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm cấp hiệu quả, gần như tương đương với các thuốc chứng dương [46] 1.2.5.4 Kháng khuẩn

Một số thí nghiệm cho thấy rằng các cao chiết methanol của L sarmentosa thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, chống lại cả vi khuẩn gram âm (Salmonella typhi ở nồng

độ 100 µg/ml) và vi khuẩn gram dương (Escherichia coli ở nồng độ 50-100 µL, và Pseudomonas aeruginosa ở nồng độ 100 µL) Cao chiết ethanol của cây Sa sâm nam

kháng trực khuẩn lao ở nồng độ 50 µg/ml [30]

Nhiều bộ phận của L sarmentosa, đặc biệt là lá, có đặc tính kháng khuẩn do

sự hiện diện của tannin và flavonoid [9, 49] Có thể đó là lý do tại sao các cao chiết

thô của L sarmentosa có hoạt động kháng khuẩn đáng kể, chống lại cả vi khuẩn gram

âm và gram dương một cách đáng ngạc nhiên [45]

1.2.5.5 Các tác dụng khác

Ngoài các tác dụng chính đã liệt kê ở trên, L sarmentosa còn được nghiên cứu

có tác dụng bảo vệ gan Cao chiết ethanol 70% lá Sa sâm nam (i.p., 0,66 g/kg/ngày)

khi sử dụng trong 7 ngày, các chỉ số chức năng gan bao gồm GOT, GPT, alkalin

phosphat, glucose máu, cholesterol máu và protein tổng số của chuột bị nhiễm độc

CCl4 được duy trì ở mức gần như bình thường Khả năng hạ men GOT, GPT, alkalin

phosphat, glucose máu và protein tổng số của cao chiết này hiệu quả hơn so với thuốc

chứng dương Silymarin [40]

Sa sâm nam thể hiện tác dụng ức chế enzym α-glucosidase với IC50 = 67,09

μg/ml, tốt hơn so với thuốc chứng dương acarbose (IC50 = 138,2 μg/ml) Cùng với

khả năng bảo vệ gan, L sarmentosa được cho là cây thuốc hiệu quả trong điều trị tiểu

đường type 2 và các biến chứng liên quan đến bệnh tiểu đường, hạn chế tác dụng phụ

của các thuốc ức chế α-glucosidase [12]

Ngoài ra, hợp chất saponin triterpen phân lập từ hạt của cây Sa sâm nam thể

hiện tác dụng ức chế với nhiều chủng nấm khác nhau, bao gồm Penicillium notatum,

Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum và Trichoderma viride [56]

1.2.6 Công dụng

Theo y học cổ truyền, Sa sâm nam có vị ngọt, nhạt, hơi đắng, tính mát, vào

kinh phế, có tác dụng bổ, mát phổi, giảm ho, long đờm, lợi sữa, nhuận tràng, lợi tiểu

Do thuộc tính galactagogue, Sa sâm nam thường được sử dụng như một thức

uống giúp lợi sữa sau khi sinh cho cả người và động vật [57] Loại cây này chủ yếu

được biết đến nhiều trong điều trị về rối loạn tiêu hóa và nhiễm trùng đường tiết niệu

Toàn cây có hiệu quả trong bệnh viêm khớp dạng thấp, các vấn đề về khớp và bệnh

gút [48] Các chế phẩm từ lá được dân gian sử dụng để làm dịu các vết thương ngoài

da Lá tươi giã nát uống trị tiêu chảy [53] Rễ cây phơi khô sao vàng chữa sốt, ho

khan, ho có đờm [1] Nước ép quả dùng trị thấp khớp, giúp dễ ngủ ở trẻ em [20]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Sa sâm nam (Hình 2.1) thu hái tại phường Quảng Thành, thành phố Thanh Hóa, tỉnh Thanh Hóa vào ngày 05/02/2022 Tên khoa học của mẫu nghiên cứu được ThS Nguyễn Quỳnh Nga và

ThS Phan Văn Trường, Viện Dược liệu giám định là Launaea sarmentosa (Willd.)

Merr et Chun, họ Cúc (Asteraceae), tên Việt Nam là Sa sâm nam Mẫu được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu với số hiệu: DV-

050222 Dược liệu được sấy khô và bảo quản trong túi nilon để nơi khô ráo, tránh

NaOH, HCl, cloroform, …

- Dung môi dùng trong chiết xuất và phân lập: EtOH, EtOAc, MeOH, DCM,

aceton, n-hexan, đạt tiêu chuẩn công nghiệp

- Dung môi đo phổ: DMSO-d6, CDCl3

- Dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% để phát hiện vết chất trên bản mỏng

Hình 2.1: Dược liệu Sa sâm nam khô

- Silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), silica gel đảo (75 μm, YMC Co., Ltd, Nhật)

- Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

2.2.2 Thiết bị

- Cân kĩ thuật Ohaus PA2102 (Mỹ), cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa, Thụy Sỹ)

- Bếp cách thủy Memmert WNB14 (Đức)

- Bể siêu âm Vevor Ultrasonic Cleaner 10L (Ruianshisuikangxieyeshanghang)

- Máy cất quay Rotavapor R-124, Rotavapor R-210 (Buchi, Swichzerland, Thụy Sỹ)

- Máy cất quay chân không Rotavapor R-220 Pro 20L (Buchi, Thụy Sỹ)

- Tủ sấy Binder FD 115 (Đức), Memmert UF110 (Đức)

- Đèn tử ngoại VL-6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp)

- Bộ dụng cụ chiết hồi lưu gồm bếp đun bình cầu (Daihan), bình cầu 5L, sinh hàn thẳng

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ)

- Sắc ký cột: Các loại cột sắc kí có kích cỡ khác nhau

- Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: Ống nghiệm, bình nón, bình gạn, phễu thủy tinh, cốc có mỏ, pipet…

- Các thiết bị khác: Tủ hút, bếp điện, máy chụp ảnh UV…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp

Một số nhóm chất thường gặp trong dược liệu được định tính bằng các phản ứng hóa học theo các tài liệu [2, 3]

2.3.1.1 Định tính các thành phần trong dịch chiết n-hexan

Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet Chiết bằng n-hexan

đến khi dung môi trong bình chiết không màu Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng làm các phản ứng định tính chất béo, tinh dầu, phytosterol và carotenoid

(1) Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc Phản ứng dương tính khi hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy

(2) Định tính carotenoid

Cô 5 ml dịch chiết tới cắn Thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc, thấy xuất hiện màu xanh ve thì phản ứng dương tính

(3) Định tính phytosterol

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết n-hexan Bốc hơi dung môi đến khô Cho

vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ

H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm Kết quả dương tính cho thấy mặt phân cách

có vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh

2.3.1.2 Định tính các thành phần trong dịch chiết cồn

Bã dược liệu sau khi chiết bằng n-hexan để bay hơi dung môi đến khô Chiết

hồi lưu với 50 ml cồn 90º trong 30 phút Dịch chiết được lọc và cô còn 10 ml để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, saponin, acid hữu cơ, acid amin và đường khử tự do

(4) Định tính saponin

Phản ứng tạo bọt: Cho 0,5 g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung tích 20

ml, thêm vào đó 5 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm 2 ml nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút

Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml ethanol

90%, đun sôi cách thủy Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn Hòa tan một ít cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5

ml cloroform Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách

Phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid: Lấy khoảng 1g bột dược

liệu, chiết bằng EtOH 90% trên nồi cách thủy trong 10 phút, lọc nóng được dịch chiết cồn Cho dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 5 giọt

+ Ống 1: thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,1 N

+ Ống 2: thêm 5 ml dung dịch HCl 0,1 N

Lắc mạnh đồng thời 2 ống trong 1 phút và quan sát Nếu cột bọt ống 1 cao hơn ống 2, sơ bộ xác định là saponin steroid Nếu cột bọt trong 2 ống cao ngang nhau thì

sơ bộ xác định là saponin triterpenoid

(5) Định tính coumarin

Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch

chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Sau đó đun cả

2 ống nghiệm trên cách thủy sôi trong vài phút Ống thứ nhất có màu vàng xuất hiện Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất thấy ống thứ nhất trong hơn ống thứ 2, nhưng sau khi acid hóa thì cả 2 ống đều đục như nhau (phản ứng dương tính)

Quan sát huỳnh quang: Nhỏ 1 giọt dung dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên

đó 1 giọt dung dịch NaOH 5%, sấy nhẹ Che ½ vết bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút, sau đó cất đồng xu đi, quán sát thấy nửa hình tròn không che và nửa hình tròn bị che sáng như nhau

Phản ứng với thuốc thử diazo: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm

vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính) (6) Định tính flavonoid

Phản ứng cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc Đun nóng trên cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ (phản ứng dương tính)

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh sẫm

Phản ứng với kiềm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng thêm (7) Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn và cô tới cắn Hòa cắn trong 1 ml nước và thêm vài tinh thể Na2CO3 thấy có bọt khí nổi lên

Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 30 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:

Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm Thêm vào đó 0,5 ml TT Fehling

A và 0,5 ml TT Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính)

(11) Định tính polysarcharid

Cho vào 2 ống nghiệm: ống 1: 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol, ống 2:

4 ml dịch chiết nước + 5 giọt thuốc thử Lugol Quan sát màu ống 2 đậm hơn ống 1 thì phản ứng dương tính

2.3.1.4 Định tính các nhóm chất khác

(12) Định tính alcaloid

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml dung dịch

H2SO4 2%, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6 N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml để làm các phản ứng sau:

Với thuốc thử Mayer (tủa trắng hay vàng nhạt)

Với thuốc thử Bouchardat (tủa nâu)

Với thuốc thử Dragendorff (tủa vàng cam hoặc đỏ)

(13) Định tính anthranoid (Phản ứng Borntraeger)

Cho vào ống nghiệm 5 g bột dược liệu, thêm dung dịch H2SO4 25% tới ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với

5 ml ether Lấy 1 ml dịch ether cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml KOH 10%, quan sát màu của lớp dung dịch KOH (đỏ)

2.3.2 Phương pháp chiết xuất và phân lập

2.3.2.1 Phương pháp chiết xuất

Phần mặt đất của Sa sâm nam được chiết xuất với EtOH 80% bằng phương pháp ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng sau đó lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao toàn phần

Cao toàn phần được phân tán trong nước nóng và chiết phân đoạn lần lượt với

dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần

với tỉ lệ 1:1, v/v) thu được các phân đoạn tương ứng

+ Nạp mẫu: Dùng pipet đưa mẫu vào cột Sau đó, sử dụng dung môi rửa giải chạy qua cột cho đến khi ổn định, đặt một miếng bông lên để bảo vệ bề mặt cột

+ Khai triển cột: Sử dụng hệ dung môi thích hợp để khai triển cột, với độ phân cực tăng dần

+ Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng Thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G F254, độ dày 0,2 mm và RP-18 F254 (Merck), độ dày 0,25 mm Sau khi triển khai sắc ký, phát hiện các chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm và quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phu thuốc thử H2SO4

10% trong EtOH 96% và hơ nóng

+ Thu gom các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau

+ Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các

hệ dung môi phù hợp

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) Thiết lập bộ dữ liệu của chất phân

lập được Sau đó so sánh dữ liệu thu được từ các chất đã phân lập với dữ liệu phổ các chất đã công bố trong các tài liệu tham khảo

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ có trong phần trên mặt đất của Sa sâm

nam được trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong Sa sâm nam

5 Coumarin Phản ứng mở - đóng vòng lacton (++) Có

Phản ứng với thuốc thử diazo (–)

Phản ứng với FeCl3 5% (++)

7 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 (–) Không có

9 Tannin Phản ứng với dd FeCl3 5% (+) Không có

Phản ứng với dd chì acetat 10% (+++) Phản ứng với dd gelatin 1% (–)

10 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling

A và thuốc thử Fehling B

11 Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol (++) Có

12 Alcaloid Phản ứng với thuốc thử Mayer (+) Có

Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

(+)

Phản ứng với thuốc thử Dragendorff

(++)

13 Anthranoid Phản ứng Borntraeger (–) Không có

Ghi chú: (+): Dương tính, (++): Dương tính rõ, (+++): Dương tính mạnh,

(–): Âm tính

Nhận xét: Qua các phản ứng định tính, sơ bộ thấy trong phần trên mặt đất của Sa sâm

nam có chứa các hợp chất của: chất béo, carotenoid, phytosterol, saponin, coumarin, flavonoid, acid amin, đường khử, polysaccharid và alcaloid

3.2 Chiết xuất và phân lập các chất

3.2.1 Chiết xuất cao toàn phần

Sa sâm nam (3,0 kg) sau khi thái nhỏ được ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng với dung môi EtOH 80%, 3 lần x 3 ngày Lọc loại bã dược liệu, gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 1,0 kg cao tổng EtOH 80% Phân tán cao tổng trong nước nóng và chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng

dần: n-hexan, EtOAc và BuOH Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn tương ứng: Cao n-hexan (76,47 g), cao EtOAc (131,96 g), cao BuOH

(53,35 g) và cắn nước (583,87 g)

Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ phần trên mặt đất của

Sa sâm nam được tóm tắt ở sơ đồ Hình 3.2

Hình 3.1: Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ phần trên mặt đất của

Cao BuOH (53,35 g)

1 Chiết EtOH 80%, 3 lần x 3 ngày

2 Loại bã dược liệu, gộp dịch chiết

3 Cất thu hồi dung môi

1 Phân tán trong nước nóng

2 Chiết với n-hexan

Cao EtOAc (131,96 g)

Cắn nước (583,87 g)

Dịch chiết nước

Cất thu hồi dung môi

Chiết với EtOAt

Dịch chiết nước

Dịch chiết EtOAt

Chiết với BuOH

Cất thu hồi dung môi

Tiến hành phân tách cao phân đoạn EtOAc (131,61 g) bằng sắc ký cột silicagel

(Φ 70 mm x 70 mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexan :

aceton (20:1 → 1:1, v/v), DCM : aceton (9:1 → 1:1, v/v) và DCM : MeOH (8:2 → 1:1, v/v) thu được 8 phân đoạn ký hiệu là 1A ~ 1H

Tinh chế phân đoạn 1C (1,54 g) bằng chạy sắc ký cột silicagel với hệ dung

môi rửa giải n-hexan : DCM : Aceton (9:1:1, v/v/v) thu được hợp chất SS-1C (21,09 mg)

Phân tách phân đoạn 1H (4,81 g) bằng sắc ký cột silicagel (Φ 30 mm x 30 mm) với hệ pha động DCM : MeOH (20:1; 10:1; 5:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn

là 2A ~ 2E Phân đoạn 2B (1,56 g) được phân tách bằng sắc ký cột pha thường với

hệ dung môi n-hexan : DCM : aceton (9:1:1, 6:4:1, v/v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ

hơn 3A ~ 3C Tinh chế phân đoạn nhỏ 3B (172 mg) bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton : H2O (1:1, v/v) thu được hợp chất SS-3B (31,0 mg)

Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc được tóm tắt ở Hình 3.3

Hình 3.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc từ cao chiết Sa sâm nam

3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được

3.3.1 Hợp chất SS-1C

Hợp chất SS-1C phân lập được dưới dạng bột màu trắng; 1H-NMR (500 Hz,

CD3OD) và 13C-NMR (125 Hz, CD3OD): Bảng 3.2

Phổ 1H-NMR chỉ ra sự có mặt của nhóm hydroxymethin tại δH 3,51 (1H, m,

H-3) Tín hiệu tại δH 5,35 (1H, m) đặc trưng cho proton olefin tại H-6 của sterol Các

Cao EtOAc (131,61 g)

Sắc ký cột

n-hexan : Aceton (20:1 → 1:1)

DCM : Aceton (9:1 → 1:1) DCM : MeOH (8:2 → 1:1)

1C (1,54 g)

1H (4,81 g)

2B (1,56 g)

3B (172 mg)

Sắc ký cột HDA (9:1:1 → 4:6:1)

SS-3B

(31 mg)

Sắc ký cột Aceton : H2O (1:1)

cặp tín hiệu singlet của nhóm methyl tại δH 0,68/ 0,70 (s, H-18) và 1,01 (s, H-19) cùng với các cặp tín hiệu doublet và triplet trong vùng 0,78 - 1,03 ppm của các nhóm

methyl bậc 1, 2 và bậc 3 cùng với các tín hiệu nằm trong vùng trường cao (δH 0.78 -

2,31) gợi ý SS-1C là một hỗn hợp các sterol Tín hiệu tại δH 5,02 (1H, dd, J = 15,0; 8,0 Hz) và 5,15 (1H, dd, J = 15,0; 8,0) tương ứng với 1 nối đôi có cấu hình trans

trong cấu trúc của SS-1C Phổ 13C-NMR cũng cho thấy tín hiệu của các nối đôi tại δC

121,7, 129,3, 138,3 và 140,9; 1 nhóm hydroxymethin tại δC 71,8 Ngoài ra, trên phổ DEPT còn cho thấy sự có mặt của 12 CH, 14 CH2 và 9 CH3, trong đó có các tín hiệu

có cường độ lớn, điều này cũng gợi ý sự tồn tại của hỗn hợp 2 sterol trong cấu trúc

của SS-1C

Dựa trên các dữ liệu phổ thu được, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo

[44], SS-1C được xác định là hỗn hợp của stigmasterol (cấu trúc A) và β-sitosterol

(cấu trúc B) (Hình 3.4)

Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất SS-1C

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ của chất SS-1C và hợp chất tham khảo

3.3.2 Hợp chất SS-3B

Hợp chất SS-3B phân lập được dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt;

1H-NMR (600 MHz, DMSO-d 6) và 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d 6 ): Bảng 3.3

Phổ 1H-NMR cho thấy SS-3B có 4 proton gắn vào vòng thơm trong đó 2

proton doublet tại δH 7,85 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-3) và 6,15 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-4) và

2 proton ở dạng singlet tại δH 6,97 (1H, s, H-5) và 6,73 (1H, s, H-8) Phổ 13C-NMR

cho biết SS-3B có 9 carbon, trong đó có 8 carbon của nhân thơm hay của liên kết đôi

nằm trong vùng từ 102,6 đến 150,4 ppm Tín hiệu tại 160,8 ppm kết hợp với UV 366

nm cho thấy SS-3B có vòng lacton trong phân tử

Từ những dữ liệu phổ thu được, có thể dự đoán SS-3B là 1 Esculetin; so sánh

với tài liệu [5] có thể khẳng định SS-3B là esculetin (Hình 3.5)

Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất SS-3B Bảng 3.3: Dữ liệu phổ của chất SS-3B và hợp chất tham khảo