Thẩm định quy trình phân tích áp dụng đánh giá hàm lượng flavonoid tổng trong trà khô thành phẩm và nước trà ở nhiều điều kiện pha chế khác nhau

Quá trình thực nghiêm được tiến hành thông qua các phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tông total flavonoid contents hay TFCs dựa trên nguyên lý của kỹ thuật quang phô hấp thu phân

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỀN TÁT THÀNH KHOA KỸ THUẬT THỤC PHÁM VÀ MỒI TRƯỜNG

NGUYEN TAT THANH

TÓM TẮT

Trà (Camellia sinensis L.) được biết đến là một thức uống phô biến trên thế giới Trên thị trường hiện nay có nhiều sản phẩm trà, tùy thuộc vào giong và quả trình chế biến Chat lượng và giả trị của trà được quyết định bởi thành phần nội chất, đặc biệt là những hợp chất kháng oxy hóa Quá trình thực nghiêm được tiến hành thông qua các phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tông (total flavonoid contents hay TFCs) dựa trên nguyên lý của kỹ thuật quang phô hấp thu phân tử (UV- Vis) được xem là một trong những phương pháp phân tích đơn giản nhất nham đảnh giá sự khác biệt về hàm lượng của loại hợp chất này Đối với trà, quercetin đirợc sử dụng làm chất chuẩn để định lượng TFCs, tinh theo milligram quercetin equivalence trên gram mầu khô (mg QE g l) Mặc dù có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định hàm lượng flavonoid tông nhưng tat cả đều dựa trên khả năng tạo phức chelate với ion nhôm với sự bô sung của một so loại tác chat khác nhưNaNCẸ, CHỉCOOH, CHĩCOONa, Quy trình với sự có mặt của NaNO? trong môi trường kiềm dành cho rutin, luteolin và catechin,

có độ hấp thụ đảng kể ở bước sóng 510 nm Đường chuẩn của phương pháp được xây dựng từ

50 đến 700 mg L ‘, cho độ tuyến tính tot với R2 = 0.998, độ lặp và độ tái lặp thóa mãn yêu cầu của AOAC (2016) Hảm lượng flavonoid tổng trong các mầu trà giảm dần theo thứ tự trà xanh, trà pu ’erh, trà trắng, trà đen và trà oolong Khi pha trà, nhiệt độ và thời gian tăng cỏ xu hướng làm tăng hàm lượng flavonoid tong chiết được và đạt giả trị cao nhất ở 90 °C trong 40 phút.

ỉii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

MỤC LỤC V DANH MỤC CHỮVIÉT TẨT viii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

MỞ ĐẦU 1

1 ĐẬT VẤN ĐÈ 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN cứu 1

2.1 Mục tiêu tong quát 1

2.2 Mục tiêu cụ thê 1

3 NỘI DUNG NGHIÊNcứu 2

4 PHẠM VI NGHIÊNcứu 3

4.1 Đối tuợng nghiên cứu 3

4.2 Thời gian nghiên cứu 4

CHƯƠNG 1 TÓNG QUAN VÈ NGHIÊN cúư 7

1.1 Giới thiệu về trà 7

1.1.1 Nguồn gốc củatrà và nơi phân bố 7

1.1.2 Phân loại trà 8

1.2 Thành phần hóa học của trà 9

1.3 Các phuơng pháp phân tích hàm lượng flavonoid trong trà 11

V

1.3.1 Phương pháp chiết các hợp chất polyphenol trong trà 11

1.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tống trong trà 11

1.4 Tổng quan vềtình hình nghiên cứu liên quan đếnđề tài 12

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 13

2.1 Hóachất, dụng cụvà thiết bị 13

2.1.1 Hóa chất 13

2.1.2 Chuẩnbị hóa chất 13

2.1.3 Dụngcụ 13

2.1.4 Thiếtbị 14

2.2 Lấy mầu và bảo quản mẫu 14

2.2.1 Lấy mẫu 14

2.2.2 Tiềnxửlý mẫu và bảo quản mầu 15

2.3 Quy trình chiết mầu 15

2.4 Quy trìnhlên màu 15

2.5 Thấmđịnh phương pháp 16

2.5.1 Giới hạnphát hiện và giới hạn định lượng 17

2.5.2 Đường chuẩnvà khoảng tuyến tính 18

2.5.3 Độ lặp lại và độ tái lặp 18

2.6 Xác định hàm lượng flavonoid tổng trong các mẫu trà 18

2.6.1 Phântích hàm lượngflavonoid tổngtrong các mầu trà 18

2.6.2 Phântích hàm lượng flavonoid tống trong nước trà ở các nhiệtđộ và thời gian pha trà 18

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Thẩm định phươngpháp phân tích hàm lượng flavonoid tống trong trà 20

3.2 Hàm lượng flavonoid trong các mẫu trà ở Việt Nam 21

VI

3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ pha trà 23

3.4 Ảnh hưởng cùa thời gian đến hàm lượng flavonoid tong 24

CHƯƠNG 4 ĐỀ XUÁT CÁC GIẢIPHÁP 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾNNGHỊ 27

1 Kết luận 27

2 Kiến nghị 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

PHỤLỤC 31

vii

DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà hóa học phân tích

Chemists chínhthức

EC Epicatechin

ECG Epicatechin gallate

EGC Epigallocatechin

EGCG Epigallocatechin gallate

GAE Gallic Acid Equivalent Đương lượng gallic acid

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng caoISO International Organization for

Standardization To chức Tiêu chuẩn quốc te

LAL Lower Action Limit Giới hạn hành động dưới

LWL Lower Warning Limit Giới hạn cânh báo dưới

MP Mobile phase Pha động

MS Mass Spectrometer Máy đo khối pho

PTFE Polytetrafluoroethylene

Kiểm soát chất lượng

ỌC Quality Control

rpm round perminute vòng trên phút

RSD Relative Standard Deviation Độ lệchchuẩn tươngđối

SP Stationary phase Pha tĩnh

TFC Total Flavonoid Contents Hàm lượng flavonoid tổng

UAL Upper Action Limit Giới hạn hành độngtrên

UPLC Ultrahigh Performance Liquid

Chromatography Sac ký lỏng siêu hiệu năngUV-Vis UltraViolet-Visible Tữ ngoại-Khà kiến

UWL UpperWarning Limit Giới hạn cảnh báotrên

viii

DANH MỤC HINH

Hình 1.1 Cây trà cổ thụ ở Suối Giàng, Yên Bái (Việt Nam) 7

Hình 1.2 Sáu loại trà chính 9

Hình 1.3 Các hợp chất sản phẩm Phenylalanine 10

Hình 2.1 Quy trình chiết/trích lyphân tích TFCs trong mầutrà 15

Hình 2.2 Quy trình lên màu cáchọp chat flavonoid tổng 16

Hình 2.3 Thiết bị ƯV-Vis 1800 Shimadzu tại Phòng thí nghiệm Hóa Phân tích, Khoa Kỹ thuật thực phẩm vàmôi trường 17

Hình 3.1 Đường chuan quercetin 20

Hình 3.2 Biểuđồ kiếm soát chất lượng 21

Hình 3.3 Hàm lượng flavonoids trong các mầu trà 22

Hình 3.4 Ánh hưởng nhiệt độ pha trà đến hàm lượng flavonoid tổng 23

Hình 3.5 Ảnh hưởngthời gian pha trà đến tỉ lệ chiết flavonoids 24

viii

DANH MỤC BANG

Bảng 1.1 Thành phần chính cùa lá trà 9

Bảng 2.1 Thôngtin các mầu trà được thực hiện trong đề tài 14

Bảng 2.2 Các điều kiện phatrà 19

Bảng 3.1 Ket quả thẩmđịnh phương pháp 20

Bảng PL 1 Độ chệch của các điểm chuẩn

Bảng PL 2 Ket quả đánh giá độ tái lặp cùa mầu trà

Bảng PL 3 Kết quả hàmlượng flavonoid tổngtrong cácmầu trà

Bảng PL 4 Ket quả khảo sát nhiệt độ đầu của nước pha trà đến phần trăm flavonoid tong chiết được trong mầutrà trắng

Bảng PL 5 Ket quả khảo sát nhiệt độ đầu cùanước pha trà đếnphần trăm flavonoid tongchiết được trong mầu trà đen

Bảng PL 6 Ket quả khảo sát nhiệt độ đầu của nước pha trà đến phần trăm flavonoid

tổngchiết được trong mầu trà pu’erh

Bảng PL 7 Ket quả khảo sát nhiệt độ đầu của nước pha trà đến phần trăm flavonoid tổng chiết được trong mầu trà xanh

Bảng PL Ket quả khảo sát thời gianpha tràđến phần trăm flavonoid tống chiết được trong mầu trà xanh

Bảng PL 9 Ketquả khảo sát thời gianpha tràđến phần trăm flavonoidtổng chiết được trong mầu trà Pu’erh

Bảng PL 10 Ket quả khảo sát thời gian pha tràđến phần trăm flavonoid tổng chiết được trong mầu hồng tràđen

Bảng PL 11 Ket quả khảo sát thời gian pha trà đếnphần trăm flavonoid tống chiết được trong mầu trà trắng

ix

MỞ ĐÀU

1 ĐẶT VẤN ĐÈ

Flavonoid là một loại sản phẩm tự nhiên quan trọng đặc biệt, chúng thuộcvề một

loại chất chuyến hóa thứ cấp thực vật có cấu trúc polyphenol, đuợc tìm thấy rộng rãi

trong trái cây, rau và một số đồ uống Flavonoid cũng đuợc tìm thấy nhiềutrong thực phẩmvà đồuống có nguồngốcthực vật, chắng hạn nhu trái cây, rau, trà, ca cao và rượuvang Flavonoid có một số phân nhóm, bao gồm chaicones, flavon, flavonols vàisoflavone Flavonoid có liên quan đến nhiều tác dụng tăng cường sức khỏe và là mộtthành phần khôngthể thiếu trong nhiều ứng dụng dinh dường, dược phẩm và mỳ phẩm Điều này là do các đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống đột biến và chống ung

thưcùng với khảnăng điều chỉnh các chức năng chính của enzym tế bào Chúng cũng

được biết đến là chất ức chế mạnh đối với một so enzym, chăng hạn như xanthine oxidase (XO), cyclo-oxygenase (COX),lipoxygenasevà phosphoinositide3-kinase(4-6).Tràlàmột loại thức uốngcóthe dễ dàng tìm thấy trên thịtrường với nhiều dòng tràkhácnhau, với giá thành họp lý vì vậy, chúng phổ biến khắp mọi noi từ nông thôn cho đến

thànhthị từ trongnước cho đến ngoài nước, do nhu cầu sử dụng trà khá cao trong thời

gian vừa qua, do đó việc khảo sát hàm lượng flavonoid tổngtrong trà và điều kiện phatra cũng giúp ta xác định được hàm lượng flavonoid trong các loại trà là khác nhau

Khóa luận tôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 1

■ Đánh giáhàm lượng flavonoid tổng (TFCs) trongmột số loại tràkhô thành phẩmđược tron và sản xuất ở khu vực miền Nam và miền núi phía Bắc tại Việt Nam

dựa trên phươngpháp đãđược tham định;

■ Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian pha trà đến hàm lượng flavonoidtong so (TFCs) trongnước trà (tealiquor)

STT Nội dung công việc Kết quả cần đạt

1 Nội dung 1 Tìm kiếm, tông hợp tài

liệu và xây dựng đê cương nghiên

cứu

Báo cáo tông họp tàiliệu vàđề cương

nghiên cứu

2 Nội dung 2 Thu thập mẫu, bảo

quản mầu tại Phòngthí nghiệm và

tiền xử lý mẫu

Nội dung 2.1 Thu thập mẫu và bảo

quản mầu tại Phòngthí nghiệm

Nội dung 2.2 Thựchiện quy trình

tiền xửlý mẫu

Các mẫu trà được thuthập gồm: trà

xanh, trà pu’erh, trà trắng, trà đen(miên núi phía Băc)và trà xanh, trà

oolong (miênNam)Báo cáo vềđiều kiện bảo quản mẫu thích họp tạiPhòng thínghiệm

Báo cáo về quy trình tiền xử lýmẫu

vàcác mẫu trà đã qua bước tiền xử lý

3 Nội dung 3 Thâm địnhphương

pháp phân tích flavonoid tông trên

thiết bị UV-Vis Shimadzu 1800,

bao gồm:

■ Ước lượng giớihạn phát

hiện và giới hạn định lượng

■ Xây dựngđường chuẩn

■ Đánh giáđộ lặp, độ tái lặp

Các tiêuchi cho thấm định được

đánh giá theo Phụ lục F của AOAC

và số liệu tham chiếu của ISO

14502-1:2005

Báo cáo kết quả thấm định phương

pháp phân tích flavonoid tông trên thiêt bị ƯV-Vis Shimadzu 1800 gồm:giá trị giới hạn phát hiện, giới hạnđịnh lượngước lương, đường chuẩn,

đánh giá vê độ lặp và độ tái lặp (thông

qua biêu đô kiêm soát chât lượng)

4 Nội dung 4 Đánh giáhàm lượng

flavonoid tông trong các mầu trà

nhận xét, đánh giá của người làm

5 Nội dung 5 Đánh giá ảnh hưởng

của nhiệt độ pha trà đên hàm lượng

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt

độpha trà đên hàm lượng flavonoid

Khóa luận tôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 2

CHƯƠNG 1 TÓNG QUAN VỀ NGHIÊN cúư

1.1 Giới thiệu về trà

1.1.1 Nguồn gốc của trà và nơi phân bo

Cây trà có tên khoa học là Camellia sinesis (L.), thuộc họ Theaceae (Khan &

Mukhtar, 2013) Cây trà bao gồm hai giống chính là cây Trung Quốc lá nhỏ (Camellia

sinesis) và cây Assam lá lớn (C Sinesỉs assamica) (Einõther, 2016) Hoa trà thuộc họ

Theaceae (Họ thực vật có hoa) có nguồn gốc từ Đông Nam Á nhung hiện đang đượctrồng ởhơn 30 quốc gia trênthế giới, là một loại cây rừng mọc trong điều kiệnẩm ướt,

râm mát của vùng khí hậu cận nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á và chủ yếu đượctrồng tại các nước châu Á và châu Phi như TrungQuốc, Sri Lanka,Án Độ, Kenya, Zimbabwe

(Chang, 2015; Zhang et al., 2018) ớ Việt Nam, trà được trồng chù yếu ở Tây Bắc, Việt Bắc - Hoàng Liên Sơn, trung du Bắc Bộ, Bắc Trung Bộ, Tây Nguyên, duyên hải miềnTrung và cánh cung Đông Bắc,trà có 6 loại được tiêu thụ chính được phân loại dựa trên

các kĩ thuật oxy hoá và lên men khác nhau gồmbạch trà (white tea), lục trà (green tea),

trà đen (black tea), trà vàng (yellow tea), trà oolong (oolong tea) và trà phổ nhĩ (pu’erh

tea) (Chang, 2015) Các hợp chat polyphenol, amino acid, tannic acid haycácchatchongoxy hoá được tìm thấy nhiều trong trà Vì vậy, uống trà sẽ mang lại nhiều lới ích sức khỏe và phòng ngừarất nhiều loạibệnh như chứng Alzheimer, huyết áp cao,béo phì và

làm giảm nguy cơ ung thư (Hung et al.,2010) Ngoài ra, tronglá trà còn chứa các nguyên

tố thiết yếu như kali, mangan, selen, boron, kẽm, strontium, đồng giúp bổ dung các

nguyên tốvi lượng thiết yếu trong cơthể con người (Zhang et al., 2018)

Hình 1.1 Cây trà cổ thụ ở Suối Giàng, Yên Bái (Việt Nam)

Khóa luận tôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 7

1.1.2 Phân loại trà

Tất cả các loại trà đều có nguồn gốc từ lá của cây trà Camellia sinensis, nhưngcác phương pháp chế biến khác nhau sẽ tạo ra các loại trà khác nhau,loại trước đây có nguồn gốc từ Trung Quốc và thường được sử dụng đe làm trà trắng và xanh Loại thứ

hai có nguồn gốc từ vùng Assam của Án Độ, cũng như các vùng ở Đông Nam Á, và

thường được sử dụng để làm các loại trà đen, bao gồm cả trà pu’erh ở tỉnh Vân Nam,Trung Ọuốc (Einõther, 2016)

Tràtrắng được làm từ búp chưa mởvà lá non, được hấp hoặc nung để khử hoạttính polyphenol oxidase, sau đó sấy khô Dođó, do quátrình oxyhóa tốithiếu, trà trắng

vẫn giữ được nồng độ cao cùa catechin có trong lá trà tươi (Einõther, 2016)

Tràxanh được làmtừ những lá trà trưởng thành hơn trà trắng, látrà có thể bị héo

trước khi hấp hoặc nung, sau đó được cán và sấy khô Giống nhưtrà trắng, trà xanh có hàm lượngcatechin cao, nhưngtổnghàm lượng và thành phần của catechin có thể khácnhau tùy thuộc vào giống cây trồng và nguồn thương mại Lưu ý, trà xanh và trà trắng

đôi khi có thế chứa lượngcatechin tương tự nhau nhưng vần thế hiện khả năng chống

oxy hóa khác nhau; điều này là do sự hiện diện của các chất chống oxy hóa khôngcatechin khác trong trà (Einỏther, 2016)

Lá trà được mệnh danh là trà oolong được "làm nát" đểcho phépgiải phóng một

so polyphenol oxidase có trong lá Trà oolong được phép oxy hóa ở mức độ cao hơn so

với trà trắng hoặc trà xanh, nhưng trong thời gian ngắn hơn so với trà đen, trước khichúng được sấy khô Do đó, mức catechin, theaflavin và thearubigin trong trà oolong

thường nằm giữa mức của trà xanh và trà trắng chưa lên men và trà đen đã bị oxy hóa

hoàn toàn (Einõther, 2016)

Lá trà dùng làm trà đen được cuộn hoặc bẻ hoàn toàn đe tối đa hóa sự tương tác

giữa catechin và polyphenol oxidase Bởi vì chúng oxyhóa hoàn toàntrướckhi sấy khô,

hầu hết các loại trà đen có hàm lượng flavan-3-ols đơn chất tương đối thấp, như (-)

-epigallocatechin gallate (EGCG), và giàu theaflavins (2% - 6% chất rắn chiết xuất) và thearubigin (> 20% chat rắn chiết được) Một so theaflavins đã cho thấy các hoạt động

chống oxy hóa lớn hơn EGCG(Einõther, 2016)

Khóa luận tôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 8

Hầu hết trà pu’erh được sản xuất ở tỉnh Vân Nam, Trung Quốc từ những lá lớn hơn của giốnghoatrà Camellia sinensis. Quá trình sản xuất có thểbao gồm cả quá trìnhoxy hóa bang enzym và quá trình lên men do nấm Trong trường hợp "trà pu’erh thô (lâu năm)", cách chuẩn bị ban đầu giống với cáchpha trà xanh Lá được làm nóng, sấykhô, và sau đó làm ẩm trước khi được áp chảo và nén; sau đó, việc chuẩn bị được lưutrừ cẩn thận trong một môi trường được kiểm soát và để lâu trong nhiều thập kỷ Quá trình lãohóa nhanh hơn, kết hợp quá trình oxyhóa và lên men bởi nấm Aspergillus niger

trongvài tháng,cũng cóthể được sử dụng đe sản xuất "tràpu’erh chín"(Einõther, 2016)

Hình 1.2 Sáu loại trà chính 1.2 Thành phần hóa học của trà

Thành phần chính của lá trà là nước (75 - 82%), là chất quan trọng không thể

thiếu được để duy trìsự sống của cây Bên cạnhthànhphần chính lànước thì thành phần

vàhàm lượng các chất hòa tan trong trà là mộttrong những mối quan tâm hàng đầu đối

với các nhà nghiên cứuvề trà Trong đó nhóm chat flavonoidđược xem như thành phần

chính, chiếm khoảng 25 - 35% chất khô trong trà Ngoài các hợp chat polyphenol, tràcòn có nhiềuhợp chất khác, bao gồm alkaloid, amino acid, protein, glucid, chatbay hơi

và kim loại dạng vết Hơn nữa trongtràcòncómột số chất cóhàm lượng vết như calcium,manganese, chrome, flour Một so hợpchat bay hơi bao gom: alcohol, các hợp chất có nhóm carbonyl, ester, và các hợp chất vòng(Cabrera et al., 2006; Senanayake, 2013)

Polyphenol mang lại nhiều lợi ích sức khoẻ như: chống oxy hoá, kháng viêm và

chống ung thư, giúp động mạch cogiãn đeduy trì lưu lượngmáu vàgiữ cho động mạchkhông bị xơ vữa Các hợp chat polyphenol được coi là chất chuyển hóa thứ cấp đượctổng hợp bởi cây trồngtrong quá trình phát triển bình thường vàchống lại các điềukiện

như nhiễm trùng, tổn thương, tia cực tím Nhữnghợp chất này phổ biến và có nguồngốc từ phenylalanine và tyrosine

I«H.

|© — |.

Suberin* c Ulins

Hình 1.3 Các hợp chất sản phẩm Phenylalanine (Naczk & Shahidi, 2004)

Trà cũng làmột nguồn tốtcủamộtnhóm flavonoid khác được gọi làflavonols và

nó chịu vềmàusắc trong trà, các flavonols được tìmthấytrong trà bao gomkaempferol,quercetin và myricetin Hàm lượng flavonoltrong trà ít bị ảnh hưởng bởi quá trình chếbiến và flavonols có số lượng tương đương trong các loại trà bị oxyhóa và không bị oxy

hóa Không giống như flavan-3-ols, flavonols thường có trong trà dưới dạng glycoside,

tức là liên kết với mộtphân tử đường, mặc dù khả dụng sinh học kém, flavonoidđượccho là đóng góp đáng ke vào những lợi ích sức khỏe liên quan đến việc uống trà hàng

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 10

ngày Flavonoid là những hợp chất phenol phân bố rộng rãi nhất trong thực phẩm thực

vật và cũng là nhữnghợp chất được nghiên cứu nhiều nhất Theo mức độ hydroxyl hóa

và sựhiện diện của liên kếtđôi C2-C3 trong vòng pyrone dị vòng, flavonoid có theđượcchia thành 13 nhóm, quan trọng nhất được đại diện bởi flavonols, flavanol, flavone,isoflavone, anthocyanidins hoặc anthocyanins, và flavanones Trong các lớp này cónhiều biến the về cấu trúctheo mức độ hydro hóa và hydroxyl hóa của hệ ba vòng cùa

các hợp chất này Flavonoid cũng xuấthiện dưới dạng các dẫn xuất sulfat hóa và metylhóa, liên hợp với monosaccharide và disaccharide, và tạo phức với oligosaccharide, lipid,

amin, acid cacboxylic và acidhừu cơ, khoảng 8000 hợp chất đang được biết đến (Alan

Crozier, 2016)

1.3 Các phưong pháp phân tích hàm lượng flavonoid trong trà

1.3.1 Phương pháp chiết các hợp chat polyphenol trong trà

Nhiều kỳ thuật được sử dụng đe chiết flavonoid bao gồm chiết bằng nước nóng,chiếtbằng dung môi hay là nhờsựhồ trợ của nhiệt độ, trongđónước được xem là dung môi chiết có khả năng hòa tan cao Theo tiêu chuẩn ISO 14502-1:2005 (ISO 14502-1,2005), hồn hợp dung môi bao gồm methanol với nướctheo tỷ lệ70:30 đã dược sửdụng,trong đó 70% là methanol được sử dụng làm dung môi chính, còn 30% là nước vì nước

cókhả nănghòatan tốt sẽ đi sâu vào cấu trúc của mẫuđe hòa tan các hợp chat flavonoidtot hơn so với methanol

1.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tông trong trà

Hàm lượng flavonoid được xác định theo phương pháp aluminum chloride

colorimetric (AICI3) Các thuốc thử được sử dụng bao gồm NaNƠ2 5%, AICI3 10%,NaOH 1 M được pha loãng bằng nước cất Sauđó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng

510 nm bằng thiết bị phân tích quang phổ phân tử (còn gọi là phương pháp phân tích

trắc quang hoặc ƯV-Vis) (Semiz et al., 2018)

Phương pháp trắc quang là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu ứnghấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạđiện từ Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóngkhoảng từ 200 đến 800 nm Hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ tuân theo định luật

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 11

Lambert - Beer, úng dụng phương pháp phổ đo quang, người ta có thể xác định nhiều hợp chất trongphạm vi nồngđộ khá rộng nhờ các cải tiến quan trọngtrong thủ tục phân tích Đây là phương pháp phân tích được phát triển mạnh vì nó đơn giản, đáng tin cậy

và được sử dụng nhiều trong kiểm tra sản xuấthoá học, luyện kim và trong nghiên cứuhoá sinh, môi trườngvà nhiều lĩnhvực khác (Scientific, 2018)

1.4 Tổng quan về tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài

Hiện nay việc nghiên cứu về trà đang thu hút nhiều sự quan tâm cùa các nhà

nghiên cứu và tầmquan trọng trên toàn thế giới không phảivì sự phố biến của nó mà là

do sự hiện diện của hàng trămhợp chất điều trị quan trọng và chất chống oxy hóa chù

yếu là flavonoid và polyflavonoid có khảnăng sinh học và tác dụng trực tiếp hơn so với

các cây thuốc khác (Chaturvedula et al 2011) Các hợp chat polyphenol và flavonoid

có trong lá trà có tác dụng chống oxy hóa mạnh hoạt động và phổ rộng của các hoạt động sinh học quan trọngkhác Tổng lượng flavonoid dao độngtrongkhoảng 23.17 mg

g"* đến 48.81 mg gHàm lượng flavonoid tối đa được tìm thấy trong dịch truyền tràđen Parichaya Golden (48.81 mg g '), flavonoid như là nguồn phong phú của các hợp

chất hoạt tính sinh học và nó biện minhcho việc sử dụng chúngvì lợi ích sức khỏe con

người, trong quá trình che biến trà đen và trà xanh đều đã được nghiên cứu rộng rãi do

tầm quan trọng của chúng đối với chất lượng trà (Balentine et.al 1997) Tuy nhiên, córất ítdữ liệu tài liệu về các loại trà riêng lẻthường được tiêu thụ ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới Trong một nghiên cứu gần đây về thành phần flavonoid của các loại trà

thường được tiêu thụ ở Vương quốc Anh đã báo cáo mức tong so flavonoid trong các loại trà sử dụng sắc ký lỏnghiệu suất cao phađảo ngược (Khokaret.al.2002)

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 12

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củư

2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.1.1 Hóa chất

• Quercetin 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-one (95%,

C15H10O7), Sigma-Alddrich, Germany

• Sodiumnitrite (97%, NaNCh), Sigma-Aldrich, Germany

• Aluminum chloride hexahydrate (99%, AICI3.6H2O), Sigma-Aldrich, Germany

• Sodium hydroxide (98%,NaOH), Sigma-Alddrich, Germany

2.1.2 Chuân bị hóa chat

• Chuan gocQuercetin (1000mgL_|): cân chính xác0.0100 (± 0.0001) g quercetincho vào bình định mức 10 mL, hòa tan và định mức đến vạch bang methanol, dung dịch sau khi phađược chứa trong ốngđựng chuẩn bằngthủytinh, bảo quản

ở -18 °C trong điều kiện tránh ánh sángvà sửdụng trong 1 tháng

• Dung dịch sodium nitrite 5% (w/v): cân chính xác 5.00 g NaNƠ2 cho vào bình

định mức 100 mL và định mức đến vạch bằng nước cất, dung dịch sau khi phađược chứa trong chai thủytinh kín, bảo quản ởnhiệt độ phòng và được sử dụng

trong 1 tuần

• Dung dịch aluminum chloride hexahydrate 10% (w/v): sử dụng AICI3.6H2O,cân chính xác 18.00 gAICI3.6H2O cho vào bình định mức 100 mL và định mứccho đến vạch bằng nước cất, dung dịch sau khi pha được chứa trong chai thủytinh kín, bảo quản ởnhiệt độ phòng và sử dụng trong 1 tuần

• Dung dịch sodium hydroxide 1 M: cân 40.00 g NaOH cho vào bình định mức

1 L vàđịnh mức chođếnvạchbằng nước cất, dungdịch sauphađược chứa trong chai thủy tinh kín và được bảo quản ở nhiệt độ phòng và pha mới trước khi sử

dụng

2.1.3 Dụng cụ

• Bìnhđịnh mức25 mL, 50 mL, 100 mL, 1 L (ISOLAB, Germany)

• Pipette 5 mL,10mL (ISOLAB, Germany)

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 13

• Micropipette 10 - 100 pL, 100- 1000 pL, 1000 - 5000 pL (ISOLAB, Germany).

• Ống ly tâmnhựa 15 mL, 50 mL (ISOLAB, Germany)

• Beaker 50 mL, 100 mL (ISOLAB, Germany)

• Pasteur pipette thủy tinh (Hirschmann, Germany)

• Ống đong 500 mL, 1 L (ISOLAB, Germany)

• Chai trung tính GL 45 100 mL(Germany)

2.1.4 Thiết bi

• Máy đo quang (Shimadzu UV-VIS 1800, Janpan)

• Be điều nhiệt (Biobase, China)

• Máy ly tâm (LC-04R CENTRIFUGE)

• TÙ say (Memmert, Germany)

2.2.1 Layman

Nghiên cứu đuợc tiến hành trên 18 mầu trà gồm 5 loại trà là trà xanh, trà trắng,

trà oolong, trà pu’erh và trà đen (Bảng 2.1) Các mầu được chúng tôi thu thập từ khuvực miền núi phía Bắc (12 mầu, 4 loại trà)và khu vực phíaNam (6 mẫu, 2 loạitrà) Tất

cả mầu sau khi thu thập được chuyển về phòng thí nghiệm xay và bảo quản trong điều kiện tránh ánh sángtrực tiếp và nhiệtđộ, độ ấm thích hợp

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu trà được thực hiện trong đề tài

Tràxanh 3 Green-1, Green-2, Green-3

Trà trắng 3 White-1, White-2, White-3

Khu vựcmiền núiphía BắcTràPu’erh 3 Pu’erh-1, Pu’erh-2, Pu’erh-3

Tràđen 3 Black-1, Black-2, Black-3

Tràxanh 3 Green-4, Green-5, Green-6

Tràoolong 3 Oolong-1, Oolong-2, Oolong-3 Khu vực phía Nam

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 14

2.2.2 Tiền xử lý mẫu và bảo quản mẫu

Mầu trà trước khi phân tíchcác chỉtiêu sè trải qua các công đoạn tiền xửlý mầu

như: xay nhuyễn bằng máy xay thành hồn hợp đồng nhất, mầu sau xay sè chuyển vào

túi zipper và bảo quản lạnh ở 25 °C, tránh ánh nắng theo TCVN 9738:2013

2.3 Quy trình chiết mẫu

Mầu trà sau khi trải qua quátrình tiền xửlấy mầu sè đượcchiết đe xác định hàm

lượng flavonoid tống Quytrình thực hiện đượctham khảo theo ISO 14502-1:2005 (ISO 14502-1, 2005)with some modifications được thêhiện ở Hình 2.1.

Hình 2.1 Quy trình chỉết/trích ly phân tích TFCs trong mẫu trà

2.4 Quy trình lên màu

Mầu trà sau khi được chiết cũng như được pha loãng xong sè được đem đi lên

màu theo quy trình như Hình 2.2.

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 15

Hình 2.2 Quy trình lên màu các hợp chất flavonoid tổng

Hàm lượng flavonoid tống chứa trong mầu đượctính theo công thức:

CcaL X PF XV

mx 1000Trong đó:

o CĐ/c: Nồng độ tính được từ đườngchuẩn (mg QE L1)

o DF: Hệ số pha loãng

o mcân: khối lượng mẫu phân tích (g)

o Vchiết: thể tích dịch chiết (mL)

Khi thực hiện thêm 2 mL NaOH IM (4) cần định mức nhanh lên 10 mL bằng

nước cất (5) và đo quang ngay

2.5 Thẩm định phưcmg pháp

Trongnghiên cứu này chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp với các giátrịgiới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, độ lặp lại

(RSDr) và độ tái lặp (RSDr)

Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng trong trà được thẩm định trên

thiết bị UV-Vis 1800 Shimadzu tại Phòng thí nghiệm Hóa phân tích, Khoa Kỳ thuật

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 16

Thực phẩm và Môitrường,củaTrường Đại học NguyềnTất Thành (cơ sở An Phú Đông,

Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh) Máy quang phổ tử ngoại 1800 Shimadzu dùng đeđịnhtínhvàđịnh lượngcác chất cầnphântích trong các nềnmầu thực phẩm, dược phấm

vàmôi trường, phòngthí nghiệm sinh hóa

Hình 2.3 Thiết bị UV-Vis 1800 Shimadzu tại Phòng thí nghiệm Hóa Phân tích, Khoa

Kỹ thuật Thực phẩm và Môi trường

2.5.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện và giớihạn định lượng của phương pháp đượctiến hành trên

mầu blank Giá trị LOD và LOỌ được tính toán dựa trên giá trị độ lệch chuẩn (SD sau

10 lần thực hiện lặp lại theo công thức:

LOD =3xSD

Đánh giá kết quả LOD đã tính được thông qua giá trị R và R được tính theo

công thức:

SDTrong đó:

Xtb là giá trị trung bình tì lệ của 10 mầu song song

SD là độ lệch chuẩn của 10 mầu song song

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 17

Neu giá trị R tính đượcnằm trong khoảng 4 - 10thì giá trị LOD chấp nhận được Sau đó giátrị LOQ được tính gián tiếp từ LOD theo công thức:

LOQ=3.3xLOD

2.5.2 Đường chuấn và khoảng tuyến tính

Chúng tôi tiến hành xây dựng một đường chuấn với 11 điểm có nồng độ từ50

đến 1000 mg L-1, mồi điếm chuẩn được thực hiện lặp lại 3 lần Khoảng tuyến tính

thỏa mãn đe xây dựng đườngchuẩn khi có hệ số tuyến tính R2 >0.995 và độ chệch các

diêm chuân không lớn hơn 15%

2.5.3 Độ lặp lại và độ tải lặp

Độ lặp lại được tiến hành trên mầu Green-3 với 6 lần thực hiện lặp lại và tính

toán giá trị RSDr Đối với độ tái lặp, thực hiện lặp lại 6 lần mầu Green-3 trong 3 ngày khác nhau, sử dụng ANOVA một yếu to đe tính toán giá trị RSDr So sánh các giá trịRSD thu được với quyđịnh đượctrình bài trong phụ lục F AOAC

Biếu đồ kiểmsoátchất lượng (control chart) được xây dựngtrong 21 ngày nhằmkiếm soát độ ổn định của thiết bị qua từng ngày làm việc

2.6.1 Phân tích hàm lượng flavonoid tông trong các mẫu trà

Các mầu nghiên cứu sau khi thu thập sẽ được xử lý theo quy trình xử lý mầu

được quy định ở TCVN 9738:2013 Sau đó mẫu trà được tiếnhành xử lý theo quy trình

chiếtmẫuđược thực hiệnởHình 2.1 Ket thúc quy trình chiết,dung dịch đượctiến hành

pha loãng đến hệ số thích hợp và thực hiện quy trình lên màu (Hình 2.2) Mồi mầu sẽđược thực hiện lặp lại 3 lần, tính toán các giá trị độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương

đoi, sosánh với quy định cùa phụ lục F AOACđối với mức nồng độ tương ứng

2.6.2 Phán tích hàm lượng flavonoid tông trong nước trà ở các nhiệt độ và

thời gian pha trà

Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng bởi nhiệt độ và thời gian truyền trà được mô

phỏng theo quy trinh truyền trà với dung môi sử dụng là nước Thời gian và nhiệt độ

khảo sát được thực hiện ở (Bảng 2.2) Khi khảo sátnhiệt độ thì chúng tôi tiến hành cố

Khóa luậntôt nghiệp đại học-SV: Thạch Thị Na Uy-1611540902 Trang 18