ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN cây THUỐC lá (nic

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ Nicotiana tabacum L.. TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG K

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

….  …

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED

WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.)

VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY

NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO

MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2002-2006

Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 09/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.)

VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY

NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO

MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN VĂN NGỌC DUNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006

iii

LỜI CẢM TẠ

Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã sinh thành, dưỡng dục để con có được ngày hôm nay Các em đã, đang và sẽ cùng chị chia sẻ những vui buồn trong cuộc sống

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo nhiều thuận lợi học tập cho em trong suốt bốn năm đại học

Em xin cám ơn Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh cùng các anh chị tại Trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp

Vô cùng biết ơn PGS TS Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em để em có thể hoàn tất khóa luận tốt nghiệp

Trân trọng cám ơn TS Bùi Minh Trí cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trường

đã hết lòng truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập

Xin chân thành cảm ơn chị Hưng, chị Hà, anh Vũ, anh Trường, chị Hạnh, chị Dương đã sẵn lòng giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này

Cảm ơn các bạn cùng lớp Công Nghệ Sinh Học K28, niên khóa 2002 – 2006, đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận

TP Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006

Văn Ngọc Dung

iv

TÓM TẮT

VĂN NGỌC DUNG Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh Tháng 09/ 2006

“ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ

(NICOTIANA TABACUM L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA L.)

TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR”

Hội đồng hướng dẫn PGS TS BÙI CÁCH TUYẾN

Đề tài được thực hiện tại các huyện Tân Biên, huyện Bến Cầu, huyện Dương Minh Châu của tỉnh Tây Ninh và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh, từ tháng 03/ 2006 đến tháng 08/ 2006

Nội dung tiến hành:

Tìm hiểu mức độ nhiễm TMV, CMV và TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng tại tỉnh Tây Ninh

Thu thập mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh tại địa bàn điều tra

Tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA nhằm xác định mẫu dương tính với TMV, CMV và TSWV

Chọn mẫu dương tính với TMV thực hiện RT – PCR, với mục đích xây dựng quy trình RT – PCR chẩn đoán TMV, nhằm khẳng định lại kết quả ELISA

Kết quả thu được:

Chưa phát hiện được TSWV trên thuốc lá và đậu phộng tại các huyện thu thập mẫu ở tỉnh Tây Ninh

Thuốc lá tại Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ khá cao (69,1%) Trong đó, huyện Tân Biên nhiễm TMV là chủ yếu (69,2%) và ở Bến Cầu là CMV (60,6%)

Kỹ thuật RT – PCR bước đầu đã khuếch đại được đoạn gen đặc trưng của TMV với kích thước 1000 bp Điều này đã cho thấy rằng dòng TMV gây bệnh trên thuốc lá tại Việt Nam đã biến đổi so với các dòng virus khác

v

MỤC LỤC

Trang tựa

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các hình xi

Danh sách các bảng xii

Danh sách các biểu đồ xiii

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích – Yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá 3

2.1.1 Vị trí phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm di truyền 3

2.1.4 Đặc điểm hình thái 3

2.1.5 Đặc điểm trồng trọt 4

2.1.5.1 Yếu tố khí hậu 4

2.1.5.2 Yếu tố đất đai 4

2.1.5.3 Yếu tố sinh vật 4

2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng 4

2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng 7

2.2.1 Vị trí phân loại 7

2.2.2 Nguồn gốc và phân bố 7

vi

2.2.3 Đặc điểm di truyền 7

2.2.4 Đặc điểm hình thái 8

2.2.5 Đặc điểm trồng trọt 8

2.2.5.1 Yếu tố khí hậu 8

2.2.5.2 Yếu tố đất đai 8

2.2.5.3 Yếu tố sinh vật 8

2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng 9

2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra 11

2.3.1 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật 11

2.3.1.1 Đặc điểm chung 11

2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật 11

2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá 12

2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng 13

2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus 14

2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV 15

2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV 15

2.4.3 Phân loại TSWV 15

2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV 16

2.4.5 Con đường truyền bệnh 16

2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh 17

2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV 17

2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV 20

2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus 20

2.5.1 Nguồn gốc của TMV 20

2.5.2 Cấu trúc của virus TMV 21

2.5.3 Phân loại TMV 21

2.5.4 Dãy ký chủ của TMV 21

2.5.5 Con đường truyền bệnh 21

2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh 22

2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV 22

2.5.8 Khống chế bệnh do TMV 24

vii

2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus 24

2.6.1 Nguồn gốc của CMV 24

2.6.2 Cấu trúc của virus CMV 24

2.6.3 Phân loại CMV 24

2.6.4 Dãy ký chủ của CMV 25

2.6.5 Con đường truyền bệnh 25

2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh 26

2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV 27

2.6.8 Khống chế bệnh do CMV 27

2.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra 29

2.7.1 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 29

2.7.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị 29

2.7.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng 29

2.8 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 30

2.8.1 Nguyên lý ELISA 30

2.8.2 Phân loại ELISA 30

2.8.2.1 ELISA trực tiếp 30

2.8.2.2 ELISA gián tiếp 30

2.8.2.3 Sandwich ELISA 31

2.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong phản ứng ELISA 31

2.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA 31

2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) 31

2.9.1 Nguyên tắc 31

2.9.2 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR 33

2.10 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) 34

2.10.1 Nguyên tắc 34

2.10.2 Phương pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA 34

2.11 Một số kỹ thuật PCR khác 35

2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo 35

2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR 35

2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) 35

viii

2.12 Những nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh do TMV, CMV, TSWV

gây ra 36

2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới 36

2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam 36

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 37

3.2 Phương pháp lấy mẫu 37

3.3 Dụng cụ 37

3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV và TSWV bằng dDAS – ELISA 38

3.4.1 Hóa chất 38

3.4.2 Phương pháp thực hiện 38

3.4.2.1 Ly trích mẫu 38

3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA 38

3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV bằng RT – PCR 40

3.5.1 Hóa chất 40

3.5.2 Phương pháp thực hiện 41

3.5.2.1 Ly trích RNA 41

3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT – PCR 42

3.5.2.3 Đổ gel điện di 43

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA 45

4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu 45

4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu 46

4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu 47

4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu 48

4.1.5 Tỷ lệ chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập được 50

4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát được trên cây thuốc lá 51

4.2 Kết quả RT – PCR 55

ix

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

7 PHỤ LỤC 63

x

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Nicotiana tabacum L 3

Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L 6

Hình 2.3 Arachis hypogaea L 7

Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L 10

Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV 15

Hình 2.6 Bọ trĩ trưởng thành dài 1 mm 17

Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật 19

Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV 21

Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật 23

Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV 25

Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật 28

Hình 4.12 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu 53

Hình 4.13 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên 54

Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Tân Biên 56

Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Bến Cầu 57

xii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng 45 Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với TMV, CMV và TSWV trên số mẫu thuốc lá 46 Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá 47 Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá 48 Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV

và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV 50 Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát được trên lá 51

xiii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dương tính, âm tính với CMV, TMV, TSWV 46 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu 47 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu 48 Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các

mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV 50 Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng trên lá 51

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là hai

trong số các loại cây trồng công nghiệp khá quan trọng Chúng không những là mặt hàng tiêu dùng phục vụ cho đời sống con người mà còn là nguồn thu ngân sách đáng

kể của nhiều quốc gia trên thế giới Do lợi ích kinh tế đó, nên chúng đã được trồng tại nhiều nơi trên thế giới và không ngừng được mở rộng diện tích

Tại Việt Nam, việc trồng thuốc lá và đậu phộng cũng đem lại những giá trị nhất định, về phương diện sử dụng lẫn phương diện thương mại, đóng góp một phần không nhỏ vào tổng thu nhập quốc gia Tuy nhiên, các loại bệnh cây cũng theo đó mà không ngừng phát triển, tấn công cây trồng, và đã gây ra không ít tổn hại cho việc trồng trọt

và sử dụng, nhất là bệnh do virus gây nên Hiện nay, với khoa học tiên tiến, sinh học hiện đại đã phát hiện được trên 650 loài virus gây bệnh cho thực vật

Tỉnh Tây Ninh có diện tích trồng thuốc lá và đậu phộng khá lớn, sản lượng thu hoạch hàng năm khá cao và mang lại nhiều lợi nhuận Nhưng trong những năm gần đây, việc trồng trọt hai loại cây này đã gặp nhiều tổn thất vì bệnh do virus gây ra

Trong đó, Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) là ba loại virus mà tác hại của nó vô cùng nghiêm trọng, dẫn tới giảm năng suất và chất lượng nguyên liệu cây trồng Một khi bệnh đã phát triển thành dịch thì rất khó khống chế và có khi phải tiêu hủy tất cả diện tích đã trồng trọt

Việc làm này sẽ gây nhiều khó khăn và đem lại tổn thất lớn cho người trực tiếp canh tác cũng như cho kinh tế đất nước

Chính vì lý do đó mà chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá tình trạng nhiễm Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus, Tomato Spotted Wilt Virus trên

cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) tại

tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật ELISA và chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”, nhằm đưa ra phương pháp phát hiện bệnh sớm nhất, từ đó có biện

pháp ngăn chặn kịp thời, với mong muốn giảm bớt được thiệt hại do các virus này gây

ra, góp phần ổn định được nguồn thu nhập từ thuốc lá và đậu phộng cho tỉnh Tây Ninh nói riêng và cả nước nói chung

1.2 Mục đích Yêu cầu 1.2.1 Mục đích

Chẩn đoán bệnh Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV)

và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) bằng kỹ thuật DAS – ELISA (Double Antibody

Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Phát hiện Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá 2.1.1 Vị trí phân loại

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây thuốc lá hoang dại đã có cách đây khoảng bốn ngàn năm, trùng với nền văn minh của người da đỏ vùng Trung và Nam Mỹ Hàng ngàn năm trước Công nguyên, người da đỏ đã trồng thuốc lá trên những vùng đất mênh mông ở Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico ở Bắc Mỹ, quần đảo Antille và một số nơi khác Họ dùng thuốc lá với mục đích nghi lễ và chữa bệnh

Năm 1492, trong chuyến thám hiểm tìm ra châu Mỹ, Christophe Columbus đã phát hiện thấy người bản xứ ở quần đảo Antille hút một loại lá cuốn tròn gọi là Tabaccos Không lâu sau đó, thuốc lá đã được phổ biến và gieo trồng khắp thế giới

Vào những năm 1530 – 1600, cây thuốc lá được các giáo sĩ người Pháp đưa vào Việt Nam

Rễ thường ăn sâu xuống đất từ 1,5 – 2 m

Thuốc lá là cây cỏ nhất niên, cây trưởng thành thường cao 1 – 2 m, chỉ phân nhánh ở ngọn Trên thân cây có nhiều lóng, được phân cách bởi những đốt

Hình 2.1 Nicotiana tabacum L

Lá cây thuốc lá rất to, đơn nguyên, hình bầu dục, đầu hơi nhọn, mọc cách, mềm, có lông dính ở hai mặt Số lá trên thân chính trung bình từ 20 – 35 lá

Hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, màu trắng hồng, hồng tươi, dài 1 – 2 cm

Quả nang, hai ngăn Mỗi cây có 100 – 150 quả trên một chùm hoa, có những cây (tùy giống) có tới 400 – 500 quả trên chùm hoa

Hạt thuốc lá rất nhỏ, rất cứng, bề mặt vỏ hạt sù sì, nhiều nếp nhăn

2.1.5 Đặc điểm trồng trọt 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu

Thuốc lá là cây ưa sáng trực tiếp

Cây có thể thích nghi với một phổ khí hậu rộng Nhiệt độ lý tưởng cho cây thuốc lá: 25oC – 28oC

Độ ẩm không khí thích hợp cho cây thuốc lá: 70% 80%

Độ ẩm đất thích hợp:

Giai đoạn đầu sinh trưởng: 60% 65%

Giai đoạn sinh trưởng mạnh: 80%

Giai đoạn già chín của lá: 60%

2.1.5.2 Yếu tố đất đai

Cây thích hợp với đất nhẹ (đất pha cát hoặc đất cát), tơi xốp, thông thoáng tốt, thoát nước dễ Độ pH tốt nhất cho đất trồng thuốc lá ở thời kỳ đầu là pH = 6, hơi kiềm ở thời kỳ sau là pH từ 7,5 đến 7,9

Lượng phân bón cơ bản là: N: 40 – 80kg/ ha, P: 30 – 90kg/ ha và K: 50 – 110kg/ ha

2.1.5.3 Yếu tố sinh vật

Cây dại, cây ký chủ, là thành phần gây hại đến sinh trưởng cây thuốc lá

Động vật gây hại (trực tiếp, gián tiếp) cho cây thuốc lá ở nước ta có rất nhiều

Tại miền Bắc Việt Nam, theo kết quả điều tra cho thấy có 40 loài sâu bệnh xuất hiện và gây hại ở các vùng trồng thuốc lá Trong đó có 9 loại bệnh do virus, 5 do vi khuẩn, 12 loại bệnh nấm và 16 loại sâu

2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng