Bài giảng thực hành phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm

Trong nội dung của môn thực hành này, sinh viên sẽ được làm quen với quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh như quy trình định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí, coliform tổng số, Staphy

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

  

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM

-GIỚI THIỆU

Trong xã hội ngày nay, đời sống của con người ngày càng được nâng cao và nhu cầu về ăn uống càng phải được cải thiện Tuy nhiên, cuộc sống của con người càng được nâng cao thì thời gian dành cho việc ăn uống càng giảm xuống Chính vì thế, những bữa ăn nhanh, những quán cơm vỉa hè là những lựa chọn thích hợp đối với những con người bận rộn Do đó, việc đánh giá và quản lý nguồn thực phẩm là điều hết sức cần thiết để có thể hạn chế tối đa khả năng ngộ độc thực phẩm

Đây chính là tiền đề để ra đời môn học Phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm, góp phần giúp cho sinh viên có cái nhìn khái quát về những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm đồng thời biết được các phương pháp phân tích, đánh giá chất lượng của nguồn thực phẩm Và nội dung thực hành của môn học này giúp cho sinh viên có thể tự tay mình có thể phân tích và đánh giá mức độ vệ sinh an toàn của thực phẩm đối với một số các chỉ tiêu vi sinh vật và một số các chỉ tiêu hóa lý thực phẩm

Trong nội dung của môn thực hành này, sinh viên sẽ được làm quen với quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh như quy trình định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí,

coliform tổng số, Staphylococcus aureus, quy trình định tính E Coli, Salmonella Các

quy trình phân tích này dựa trên tiêu chuẩn ngành và tiêu chuẩn Việt Nam và các quy trình này cũng được áp dụng rộng rãi ở khá nhiều phòng thí nghiệm vi sinh tại các cơ quan, công ty Thông thường, các quy định về vi sinh vật hiện diện trong mẫu thực

phẩm thông thường cho phép có sự hiện diện của TPC, coliform tổng số và S aureus với số lượng nhất định do đó phải tiến hành định lượng còn đối với hai chỉ tiêu E Coli

và Salmonella tuyệt đối không được phép hiện diện trong thực phẩm nên chỉ cần phân

tích định tính

Tôi hy vọng sau môn học thực hành này, sinh viên sẽ tích lũy được ít nhiều kiến thức thực tế về phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm và hy vong nó sẽ trở thành một phần trong hành trang để các bạn bước vào đời

MỤC LỤC PHẦN 1: KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

Bài số 1: Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC) trong thực phẩm Bài số 2: Định lượng tổng số Coliform trong thực phẩm

Bài số 3: Định tính E Coli trong thực phẩm Bài số 4: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm Bài số 5: Định tính Salmonella trong thực phẩm

PHẦN II: KIỂM NGHIỆM HÓA LÝ THỰC PHẨM

Bài số 6: Phương pháp phát hiện nhanh màu độc và không độc Bài số 7: Xác định hàm lượng chất béo trong sữa theo phương pháp Adam – Rose

PHẦN I

KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG THỰC PHẨM

CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG KIỂM NGHIỆM VI SINH

Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnh nên cần luôn luôn cẩn thận với tất cả các chủng đang thao tác.Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có các acid hoặc những hóa chất có độc tính Do vậy, cần tuân thủ một số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàn cho bản thân và cho những người khác trong phòng thí nghiệm như sau:

- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm Mang khẩu trang khi thao tác với vi sinh vật

- Mặc áo blouse trong thời gian làm việc

- Trước khi bắt đầu làm cần sát trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 700

hoặc dung dịch chất diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô Thực hiện tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn hoặc đèn Bunsen khi tay chưa khô cồn Lặp lại việc sát trùng này sau khi hoàn thành công việc

- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy

- Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại bàn làm việc

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài

- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút bằng miệng

- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả mảnh vỡ vào một túi rác riêng

- Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng

- Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùng trước khi thải bỏ vào các bãi rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng

- Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các hộp petri lên nhau

- Không mở hộp petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp

- Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí

- Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm

Bài số 1: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TPC)

- 1.1 Định nghĩa

Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng Sau

đó đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 450C

Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội  úp ngược  đem ủ ở

nhiệt độ 300C trong 72h

1.6 Thuyết minh quy trình

1.6.1 Chuẩn bị mẫu

Cân chính xác 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm vào 90

ml (hoặc 225 ml) dung dịch pha loãng mẫu Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 2,5 phút Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng Khi đó, ta sẽ

có được dung dịch pha loãng là 10-1 Dich pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette (pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng  đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2 Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết

1.6.2 Đổ đĩa

Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa từ 30 – 300 tế bào vi sinh vật

Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào giữa đĩa petri vô trùng Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2 – 3 đĩa Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường PCA đã nấu chảy và làm nguội đến 45 – 500C Trộn đều mẫu vào môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ

3 – 5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc

Hình 1: Tổng số vi sinh vật hiếu khí

Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ Chọn các đĩa có số đếm

từ 30 – 300 tế bào vi sinh vật để tính Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu được tính như sau:

N

A (CFU/g) =

n1Vf1 + … + niVfi

Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc) trong 1g mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường f: độ pha loãng tương ứng

Bài số 2: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORMS

- 2.1. Định nghĩa Coliforms

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ

Nhóm coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật

Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác

2.3 Môi trường sử dụng

- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)

- Violet Red Bile Agar (VRB)

- Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL)

Đổ môi trường VRB lên môi trường TSA

Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa petri vô trùng Sau đó đổ môi trường TSA đã được làm nguội đến 450C và chờ trong 30’

Chọn và đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h

2.6 Thuyết minh quy trình

2.6.1 Chuẩn bị mẫu

Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí

Nhưng quá trình pha loãng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng mẫu chứa khoảng <100 khuẩn lạc

2.6.2 Cấy mẫu

Cấy chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc

Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và làm nguội đến 450C, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để phục hồi

khả năng của Coliforms Đổ thêm 10 – 15ml môi trường VRB Chờ môi trường đông

đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 + 10C trong 24 giờ

2.6.3 Đọc kết quả

Chọn các đĩa có số đếm từ 10 – 100 khuẩn lạc Coliforms để tính Khuẩn lạc

Coliforms có màu đỏ đến đỏ đậm và đường kính >0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa muối mật

Hình 2: Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRB

2.6.4 Khẳng định

Quy trình khẳng định thực hiện như sau: chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa đã đếm được với các hình dạng khác nhau cấy chuyển sang môi trường canh BGBL và ủ

ở 370C trong 24 giờ Phản ứng dương tính khi vi sinh vật sinh khí trong ống Durnham

Tỷ lệ xác nhận là tỷ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khẩn lạc khẳng định

Hình 3: Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL

Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng v: thể tích cấy vào mỗi đĩa

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ xác nhận

Kết quả Coliforms được làm tròn chẵn chục và được biểu diễn ở dạng số mũ có cơ

số thập phân

Coliforms chịu nhiệt là coliforms có khả năng lên men lactose, sinh acid và sinh

hơi ở nhiệt độ 440C trong 24 – 48 giờ

Coliforms phân (feacal Coliform) là coliform nhiệt có thử nghiệm indol trong môi

trường tryptom dương tính

E.Coli là coliforms phân có nghiệm pháp IMViC lần lượt là + + - -

3.2 Nguyên tắc

Phương pháp này dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện

E.Coli trong một khối lượng mẫu xác định

Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh (BGBL), kiểm tra trên môi trường phân lập (EMB) và thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa phù hợp (nghiệm pháp IMViC)

3.5 Quy trình phân tích 25 g mẫu + 225 ml SPW, đồng nhất mẫu trong 30 giây

 độ pha loãng 10-1

Lấy 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào 10 ml môi trường BGBL

Ủ ở 440C + 0,5 trong 24 giờ

Chọn các ống sinh hơi cấy chuyển sang môi trường EMB

Mẫu không sinh hơi được coi là âm tính E Coli

Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ

Khuẩn lạc đặc trưng của E Coli trên EMB: tròn lồi, đường kính

<0,5mm, có ánh kim tím

Cấy chuyển sang TSA  Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ

Cấy vào môi trường 1 trypton, 2 MR-VP, 1 Simmons Citrate

Ủ ở 370C + 0,5 trong 24 giờ

Sử dụng các loại thuốc thử để test thử nghiệm IMViC

Kết luận

3.6 Thuyết minh quy trình

Các thử nghiệm sinh hóa được dùng để khẳng định E.Coli như sau:

Hình 5: Các thử nghiệm sinh hóa

(1): Thử nghiệm Indole (2): Thử nghiệm Methyl red

(3): Thử nghiệm Voges – Proskauer (4): Thử nghiệm Citrate

STT Thử nghiệm sinh hóa Kết quả

+ +

-

-

3.6.5 Báo cáo kết quả

Phát hiện hay không phát hiện E.Coli trong 10 g (25 g) mẫu

Bài số 4: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS

-

4.1 Nguyên tắc

Cấy trang một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch chọn lọc Sau khi

ủ và đếm những khuẩn lạc có các đặc điểm đặc trưng và không đặc trưng của S

aureus Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các đặc trưng khác Kết quả được xác định bằng số khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, nồng độ pha loãng và hệ số xác nhận

Cấy chuyển vào ống nghiệm chứa 0,2 ml huyết tương thỏ

25g mẫu + 225ml SPW  đồng nhất trong 30 giây  độ

pha loãng 10-1

Ủ ở nhiệt độ 370C trong 48h

Lấy 1 ml mẫu ở độ pha loãng 10-1 cho vào đĩa môi trường

BP có bổ sung egg yolk  cấy trang

KL đặc trưng của S.aureus trên BP: tròn, lồi, có tâm đen và

có quầng sáng bao quanh

Chọn 5 KL đặc trưng cấy chuyển trên môi trường TSA

4.4 Thuyết minh quy trình

4.4.3 Đọc kết quả

Sau 48 giờ, trên môi trường Baird Parker khuẩn lạc S aureus có đường kính

khoảng 0,5 – 1 mm, lồi, đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2 mm bao quanh

Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa có các khuẩn lạc có các đặc điểm trên và tiếp tục ủ đến

48 giờ Sau 48 giờ, các khuẩn lạc S aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5 mm, vòng sáng rộng khoảng 2 – 4 mm Có một số dòng S aureus không tạo các khuẩn lạc có các

đặc điểm trên Cần đếm và đánh dấu cả 2 dạng khuẩn lạc

Hình 6: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường BP

4.4.4 Khẳng định

Ủ ở 370C và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ Nếu không có biểu hiện ngưng

kết sẽ ủ tiếp tục đến 24 giờ Xác định tỷ lệ ngưng kết R

T ổng số S aureus (cfu/g)

N

S = - nVf

Trên môi trường BP: Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng

từ môi trường BP cấy vào môi trường TSA Ủ ở 370C trong 24 giờ Cấy sinh khối vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường huyết tương thỏ Ủ ở 370C Theo dõi phản ứng đông tụ huyết tương trong 2, 4, 6, 8, 24 giờ Tính tỷ lệ khẳng định trên các khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng

Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng

Số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng ĐHT dương tính

- Môi trường TSA

- Môi trường TSI

- Môi trường Mannitol Phenol Red both

- Môi trường Urea broth

5.4 Thuyết minh quy trình

5.4.1 Tiền tăng sinh

Ủ ở 370C trong 24 giờ

Cấy chuyển vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: môi trường TSI,

Mannitol phenol red broth, Urea broth, LDC both

Ủ ở 370C trong 24 giờ

Biểu hiện đặc trưng của Salmonella: Trên TSI: đỏ/vàng/ H2S (+)/ gas

(+); Mannitol (+); Urea (-), LDC (+)

Kết luận: Phát hiện hay không phát hiện Salmonella trong 25 g mẫu

Cấy chuyển trên môi trường XLD và ủ ở nhiệt độ 370C, 24h

Cấy chuyển sang môi trường TSA

KL đặc trưng của Salmonella trên XLD: tròn, lồi, trong suốt, có tâm

đen đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm của khuẩn lạc, môi trường quanh

chuyển sang màu đỏ

Tiền tăng sinh các loại mẫu thông thường: cân 25g mẫu cho vào túi vô trùng Thêm 225ml dung dịch pepton đệm và đồng nhất mẫu Thời gian đồng nhất mẫu có thể là 15 hoặc 30 giây tùy theo từng loại mẫu Ủ 370C trong 24 giờ

5.4.2 Tăng sinh chọn lọc

Trộn môi trường canh sau khi đã ủ 24 giờ trước khi cấy chuyển 0,1ml sang môi trường tăng sinh chọn lọc RV Sau đó, ủ mẫu ở nhiệt độ 420C trong thời gian 24 giờ

5.4.3 Phân lập

Dùng que cấy vòng lấy một vòng sinh khối vi sinh vật từ môi trường tăng sinh

chọn lọc RV cấy ria lên môi trường chọn lọc cho Salmonella như: XLD, BPLS, BSA,

HE … Cường độ chọn lọc, mức độ đặc trưng và hình thái biểu hiện của khuẩn lạc

Salmonella trên từng môi trương khác nhau Để nhận dạng và chọn lọc được tất cả các

dòng Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau:

- Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có tâm đen

Một số dòng có thể có tâm đen rất lớn bao trùm cả khuẩn lạc Môi trường XLD chuyển sang màu hồng

Hình 7: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD

- Môi trường BPLS: các khuẩn lạc Salmonella có màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển thành đỏ