Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu quế cinnamomum cassia nees ex blume và hồi (illicium verum hook, f ) tại việt nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu Quế Cinnamomum cassia Nees ex Blume và Hồi Illicium verum Hook, f.. T

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume)

và Hồi (Illicium verum Hook, f.) tại Việt Nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume)

và Hồi (Illicium verum Hook, f.) tại Việt Nam

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên tác giả luận văn:Trịnh Bích Hảo

Đề tài luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume) và Hồi (Illicium verum

Hook, f.) tại Việt Nam

Chuyên ngành: Hóa học

Mã số HV: CB180044

Tác giả, Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày 20 tháng

6 năm 2020 với các nội dung sau:

- Danh mục chữ viết tắt cần hiệu chỉnh lại, danh pháp cần chỉnh lại;

- Trích dẫn tài liệu tham khảo cần bổ sung

- Thêm lời mở đầu, bổ sung mục tiêu

- Chỉnh sửa lỗi in ấn, lỗi chính tả

Ngày tháng năm 2020

Giáo viên hướng dẫn 1

TS Nguyễn Văn Thông

Giáo viên hướng dẫn 2

ĐỀ TÀI LUẬN VĂN

Luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu

Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume) và Hồi (Illicium verum Hook, f.) tại

Việt Nam

Học viên: Trịnh Bích Hảo

Mã số HV: CB180044

Ngành: Hóa học

Giáo viên hướng dẫn 1

TS Nguyễn Văn Thông

Đơn vị: Viện Kỹ thuật Hóa học -

Đại học Bách khoa Hà Nội

Giáo viên hướng dẫn 2

PGS TS Đỗ Thị Thảo Đơn vị: Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

Lời cảm ơn

Trong quá trình học tập, nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume) và Hồi (Illicium verum Hook, f.) tại Việt Nam” tôi đã nhận được sự giúp

đỡ, chỉ bảo nhiệt tình của các thầy, cô giáo trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và các cán bộ hướng dẫn tại Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để hoàn thành luận văn này

Với tình cảm chân thành, tôi bày tỏ lòng biết ơn đối với Ban giám hiệu, phòng Sau Đại học, Viện Kỹ thuật Hóa Học đại học Bách Khoa Hà Nội, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các thầy giáo, cô giáo đã tham gia quản lý, giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ sự biết ơn đặc biệt đến TS Nguyễn Văn Thông và PGS.TS Đỗ Thị Thảo – người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ về kiến thức, tài liệu và phương pháp để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Trần Thu Hương, TS Lê Huyền Trâm, TS Nguyễn Ngọc Tuệ là người gợi mở cho tôi những con đường ứng dụng kết quả của luận văn này vào thực tiễn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, cổ vũ, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong suốt quá trình thực hiện đề tài, song có thể còn tồn tại những mặt hạn chế, thiếu sót Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp và sự chỉ dẫn của các thầy cô giáo và các bạn đồng nghiệp

HỌC VIÊN

Trịnh Bích Hảo

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume) 3

Thực vật học cây Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume) 3

Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume) 5

Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume) 14

1.2 Tổng quan về cây Hồi (Illicium verum Hook, f.) 15

Thực vật học cây Hồi (Illicium verum Hook, f.) 15

Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu Hồi (Illicium verum Hook, f.) 17

Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học tinh dầu Hồi (Illicium verum Hook, f.) 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Mẫu thực vật 25

2.2 Phương pháp thu nhận tinh dầu và xác định hàm lượng tinh dầu, chỉ số khúc xạ, tỉ trọng 25

Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu 25

Phương pháp thu nhận tinh dầu 27

Phương pháp xác định tỉ trọng, chỉ số khúc xạ tinh dầu 28

2.3 Phương pháp phân lập và xác định hợp chất hữu cơ trong tinh dầu 28

2.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 29

Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 29

Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 29

Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào in vitro 30

2.5 Bước đầu ứng dụng tinh dầu và bã sau chưng cất vào sản phẩm 30

Sản phẩm nhang thơm từ bã sau chưng cất 30

Sản phẩm diệt khuẩn 31

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 32

3.1 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 32

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất chưng cất thu tinh dầu và xác định

tỉ trọng, chỉ số khúc xạ của tinh dầu 32

Thiết bị phân lập và xác định hợp chất hữu cơ trong tinh dầu 33 Dụng cụ và thiết bị xác định hoạt tính sinh học 33

3.2 Thực nghiệm thu nhận tinh dầu và xác định hàm lượng tinh dầu, tỉ trọng, chỉ số khúc xạ 34

Xử lý mẫu 34

Xác định hàm lượng tinh dầu 34

Thu nhận tinh dầu 36

Xác định tỉ trọng, chỉ số khúc xạ của tinh dầu 37

3.3 Xác định thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ trong tinh dầu 37 3.4 Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu 38

Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 38

Xác định hoạt tính chống oxy hóa 38

Xác định hoạt tính gây độc tế bào in vitro 40

3.5 Thử nghiệm tạo sản phẩm từ tinh dầu và bã sau chưng cất 41

Thử nghiệm tạo sản phẩm nhang thơm từ bã sau chưng cất 41

Thử nghiệm tạo sản phẩm diệt khuẩn từ tinh dầu 41

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4.1 Hàm lượng và tỉ trọng, chỉ số khúc xạ của tinh dầu Quế, tinh dầu Hồi tại các vùng sinh thái 42

4.2 Thành phần tinh dầu Quế, tinh dầu Hồi tại các vùng sinh thái 44

4.3 Hoạt tính sinh học của tinh dầu Quế, tinh dầu Hồi 47

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 47

Hoạt tính chống oxy hóa 49

Hoạt tính gây độc tế bào 51

4.4 Kết quả thử nghiệm tạo sản phẩm từ tinh dầu và bã sau chưng cất 52

Sản phẩm nhang thơm 52

Sản phẩm nước rửa tay khô 53

KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 62

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 CFU Colony Forming Units Khuẩn lạc

2 DMEM Dulbecco's modified Eagle's

4 DPPH

5 EC50 Effective Concentration 50% Nồng độ 50% tác dụng tối đa

6 GC/MS Gas chromatography/ Mass

spectrometry Sắc ký khí ghép nối khối phổ

bạch huyết

STT Ký hiệu Chú giải

19 MIC Minimum Inhibitory

Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

28 TCA Tri-chloroacetic acid

30 TDI Toluene Di-isocyanate

32 WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vỏ, cành, lá Quế 3

Hình 1.2 Cành, lá, hoa, quả Quế [2] 3

Hình 1.3 Đặc điểm vi phẫu vỏ Quế [3] 4

Hình 1.4 Phân bố Quế tại Việt Nam [2] 4

Hình 1.6 Cành, lá, hoa, quả Hồi [2] 15

Hình 1.7 Đặc điểm vi phẫu quả Hồi [16] 16

Hình 1.8 Phân bố cây Hồi tại Việt Nam [2] 17

Hình 2.1 Mẫu vỏ Quế tại Văn Yên, Yên Bái 25

Hình 2.2 Mẫu vỏ Quế tại Thường Xuân – Thanh Hóa 25

Hình 2.3 Mẫu vỏ Quế tại Nam Trà My – Quảng Nam 25

Hình 2.4 Mẫu quả Hồi tại Văn Quan – Lạng Sơn 25

Hình 2.5 Mẫu cành lá Hồi tại Bắc Mê – Hà Giang 25

Hình 2.7 Dụng cụ xác định lượng tinh dầu theo TCVN 7039:2013 26

Hình 2.8 Dụng cụ xác định độ ẩm nguyên liệu theo TCVN 7040:2002 26

Hình 2.9 Dụng cụ chưng cất thu nhận tinh dầu Clavenger (a) Dụng cụ chưng cất thu tinh dầu nhẹ hơn nước; (b) Dụng cụ chưng cất thu tinh dầu nặng hơn nước 28 Hình 2.10 Sản phẩm nhang Quế trên thị trường 30

Hình 4.1 (a) Xác định hàm ẩm; (b) Xác định lượng tinh dầu; (c) Tinh dầu vỏ Quế, tinh dầu quả Hồi, tinh dầu lá Hồi 42

Hình 4.1 Hợp chất chính trong tinh dầu vỏ Quế (trans- cinnamaldehyde) 45

Hình 4.2 Hợp chất chính trong tinh dầu lá Hồi và quả Hồi (trans- anethole) 47

Hình 4.4 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 50

Hình 4.5 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp MDA 51

Hình 4.6 Sản phẩm nhang thơm từ bã sau chưng cất 52

Hình 4.7 Sản phẩm nước rửa tay khô tinh dầu Quế 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả xác định hàm lượng tinh dầu tại các vùng sinh thái 43

Bảng 4.2 Bảng so sánh thành phần và hàm lượng các hợp chất có trong tinh dầu vỏ Quế tại Yên Bái, Thanh Hóa, Quảng Nam 44

Bảng 4.3 Bảng so sánh thành phần và hàm lượng các hợp chất có trong tinh dầu quả Hồi tại Lạng Sơn và tinh dầu lá Hồi tại Hà Giang 46

Bảng 4.4 Bảng kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu Quế, tinh dầu Hồi 48

Bảng 4.5 Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu thông qua trung hòa gốc tự do của DPPH 49

Bảng 4.6 Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu 50

Bảng 4.7 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của tinh dầu Hồi 51

Bảng 4.8 Kết quả thử nghiệm tạo nhang thơm từ bã Quế sau chưng cất 52

Bảng 4.9 Bảng tổng hợp phiếu đánh giá sản phẩm nhang thơm hương Quế 53 Bảng 4.10 Bảng tổng hợp phiếu đánh giá sản phẩm nước rửa tay tinh dầu Quế 54

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, có thảm thực vật đa dạng

và phong phú Nhờ có hệ thực vật đa dạng nên Việt Nam có nhiều loại cây có đặc tính quý báu, được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau Nhiều công trình khoa học đã đưa ra các kết luận về những đặc tính quý báu của hợp chất thiên nhiên trong thực vật như khả năng kháng vi sinh vật, chống oxy hóa, chống ung thư, kháng viêm, thư giãn thần kinh, … Việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên là nhu cầu ngày càng tăng của toàn xã hội; do đó, việc nghiên cứu và ứng dụng các thành phần có đặc tính quý báu từ thiên nhiên làm dược mỹ phẩm, thực phẩm chức năng đang được nhà nước và các doanh nghiệp đầu tư quan tâm

Trong tài nguyên thực vật đa dạng phong phú của Việt Nam, Quế và Hồi là hai loài thực vật được sử dụng phổ biến trong chế biến dược liệu, thực phẩm, chiếm

vị trí hàng đầu trong các sản phẩm lâm sản ngoài gỗ được tiêu thụ trên toàn thế giới Trong y dược, chúng được xem là một vị thuốc chính thức trong y học cổ truyền ở các nước châu Á và là một thành phần quan trọng trong công nghiệp bào chế dược phẩm ở các nước châu Âu

Trong Tây y, Quế và tinh dầu Quế được coi là vị thuốc có tác dụng kích thích làm tăng sự tuần hoàn máu, tăng hô hấp, có thể gây co bóp tử cung và tăng bài tiết tùy theo liều lượng sử dụng Đông y coi Quế là một vị thuốc bổ, có nhiều công dụng có khi chữa cả đau mắt, ho hen, bồi bổ cho phụ nữ sau sinh, đau bụng

đi tả, … Theo tài liệu cổ, Quế có vị cay, ngọt, tính đại nhiệt, hơi có độc, vào 2 kinh can và thận Có tác dụng chữa chân tay co quắp, lưng tê gối mỏi, bụng quặn đau, kinh nguyệt bế, tiểu tiện bất lợi, trên nóng dưới lạnh, ung thư Người âm hư dương thịnh hay phụ nữ có thai không dùng được [1]

Trong Tây y, Hồi dùng làm thuốc trung tiện, giúp tiêu hóa, lợi sữa Tác dụng trên hệ thống thần kinh và cơ (dịu đau, dịu co bóp) được dùng trong đau dạ dày và ruột co bóp quá mạnh Ngoài ra còn được dùng làm rượu khai vị, làm thơm thuốc đánh răng Theo tài liệu cổ, đại Hồi có vị cay, tính ôn, vào 4 kinh: can, thận,

tì và vị Có tác dụng đuổi hàn, kiện tỳ, khai vị, dùng chữa nôn mửa, đau bụng, bụng đầy chướng, giải độc của thịt cá Những người âm hư hỏa vượng không dùng được [1]

Trong ngành thực phẩm, hóa mỹ phẩm, tinh dầu Quế, tinh dầu Hồi được cho là một trong những thành phần gia vị quan trọng quyết định cảm quan mùi vị của sản phẩm Quế và Hồi cũng là những thành phần tạo hương được ưa chuộng trong ngành công nghiệp xà phòng và chất tẩy rửa

Tuy nhiên, tiềm năng từ Quế, Hồi Việt Nam mới chỉ ở mức xuất thô nên giá trị kinh tế chưa cao Việc so sánh đối chiếu thành phần, hoạt tính của Quế, Hồi

từ nhiều vùng khác nhau và bước đầu ứng dụng tạo sản phẩm từ Quế, Hồi là cơ sở

để góp phần nâng cao giá trị của Quế, Hồi Xuất phát từ thực tế nghiên cứu và sự cấp thiết trên, tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính

sinh học của tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume) và Hồi (Illicium verum Hook, f.) tại Việt Nam”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume)

Thực vật học cây Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume)

Tên Việt Nam : Quế

Tên Latin : Cinnamomum cassia Nees ex Blume

Lớp (nhóm) : Cây gỗ nhỏ

Hình 1.1 Vỏ, cành, lá Quế

Hình 1.2 Cành, lá, hoa, quả Quế [2]

Quế là cây gỗ, thường xanh, cao 10 - 20m, đường kính thân 25 - 40 (-70) cm; vỏ dày, nhẵn ở cây non, sần sùi ở cây già và có màu nâu xám Các chồi non

có lông màu nâu Lá mọc so le hoặc gần như đối; phiến lá đơn, nguyên, hình trái xoan thuôn, đầu nhọn, mặt trên màu xanh lục sẫm, nhẵn, bóng, mặt dưới màu xám tro, hơi có lông mịn lúc còn non; gân chính 3, hình cung, nổi rõ ở mặt dưới; gân phụ nhiều, song song; cuống lá to, dài 1,5 - 2cm, mặt trên có rãnh lòng máng [2]

Cụm hoa dạng chùy, mọc ở kẽ lá gần đầu cành, dài 7 - 15 (-18) cm Hoa nhỏ có lông mịn, màu trắng hoặc vàng nhạt Bao hoa gồm 6 thùy gần bằng nhau, màu trắng, mặt ngoài có lông mịn Quả hạch hình trái xoan hay hình trứng, dài 1 -1,5cm, được bao bọc bởi đài; khi chín có màu đen hoặc tía đậm Hạt hình trứng, dài 1 cm, màu nâu đậm và có những sọc nhạt [2]

Tinh dầu ở vỏ Quế được xuất hiện ở tế bào tiết

Hình 1.3 Đặc điểm vi phẫu vỏ Quế [3]

Một số khu vực tại miền Nam Trung Quốc đã đưa Quế vào trồng trọt từ rất lâu đời và hiện vẫn gọi là Quế “Rougui” (giao chỉ) Có thể nói, các khu rừng nhiệt đới ẩm ở nước ta là quê hương của loài Quế Song trên thị trường thế giới, các sản phẩm từ loài Quế lại mang tên gọi “Chinese cassia”, “Chinese cinnamon” hoặc Canellier de Chine”, vì người Trung Quốc đã đưa Quế vào sản xuất hàng hóa và bán ra thị trường từ rất sớm

Hình 1.4 Phân bố Quế tại Việt Nam [2]

Tại Việt Nam, Quế phân bố nhiều ở Quảng Ninh, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Lào Cai, Yên Bái, Hà Giang, Tuyên Quang, Hà Tây, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Bà Rịa-Vũng Tàu Trong đó có các vùng trồng Quế tập trung là Yên Bái, Quảng Ninh, Thanh Hóa – Nghệ An và Quảng Nam – Quảng Ngãi [2]

Trên thế giới, Quế được phân bố ở miền Nam Trung Quốc, Lào, Myanmar Quế cũng đã được gây trồng tại Indonesia, Ấn Độ, Sri Lanka, Nam Mỹ, miền Nam Hoa Kỳ và Hawaii [2]

Bột và tinh dầu Quế được dùng rất rộng rãi để chế biến thực phẩm trong công nghiệp cũng như trong gia đình Tây y coi vỏ Quế và tinh dầu Quế là loại thuốc có tác dụng kích thích tuần hoàn, lưu thông máu huyết, tăng hô hấp Quế còn gây co mạch, tăng bài tiết, gây co bóp tử cung và tăng nhu động ruột Tinh dầu Quế có tính sát trùng mạnh Trong y học ở nước ta và Trung Quốc, Quế có vị cay, ngọt, tính đại nhiệt, hơi có độc, có tác dụng bổ mệnh môn tướng hỏa, trị cố lãnh trầm hàn Quế được coi là một vị thuốc bổ, có nhiều công dụng như chữa ho hen, bồi bổ phụ nữ sau sinh, Quế được dùng làm thuốc cấp cứu bệnh do hàn, hôn mê, mạch chậm nhỏ, đau bụng, chữa chứng tiêu hóa kém, tả lỵ, tiểu tiện khó khăn, đau lưng, mỏi gối, chân tay co quắp, ho hen, bế kinh, ung thư, rắn cắn, … [1]

Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume)

cis-cinnamaldehyde (0-0,7%) [4]

Năm 2013, Nguyễn Thị Huỳnh Như (ĐH Kỹ thuật Công nghệ TPHCM) đã phân tích được 17 hợp chất trong tinh dầu vỏ Quế, hợp chất chính là cinnamaldehyde (77,9%), benzaldehyde (0,4%); linalool (0,1%); benzenpropanal

(0,5%); isosativene (0,5%); α-cubebene (5%); germacrene D (0,2%); isoledene (0,2%); α-amorphene (1,8%); δ- cadinene (2,3%); cinnamyl acetate (0,4%); ionene (0,6%); α-calacorene (0,1%); coumarine (3,4%); o-methoxy-cinnamaldehyde (3,8%); α-cadinol (0,9%); δ –cadinol (0,6%) [5]

Năm 2013, Lê Công Sơn cùng cộng sự đã phân tích thành phần hóa học của

tinh dầu vỏ, cành, lá, rễ loài Quế đơn (Cinnamomum cassia J.S Presl) ở vườn quốc

gia Bạch Mã được 37 hợp chất chiếm từ 93,57-100% tổng lượng tinh dầu Thành phần chính cho các mẫu tinh dầu ở các bộ phận nghiên cứu là cinnamic aldehyde (53,46-77,34%), (Z-)-9-octadecenamide (1,05 - 19,47%) và cinnamyl alcohol

(0,24-0,67%) 37 hợp chất được xác định trong tinh dầu Quế gồm α-pinene,

β-pinene, benzene, 1,8-cineol, benzoic aldehyde, 2-methylbenzophuran,

benzenepropanal, bomeol, α-terpineol, phenethyl acetate, cinnamic aldehyde, cinnamyl alcohol, bicycloelemene, eugenol, α-copanene, β-cubebene, α- benzopyrone, tetradecane, methyl eugenol, α-vinylbezyl alcohol, trans-cinnamyl acetate, α-humulene, bicyclogemacrene, β-bisabolene, o-methoxy cinnamic aldehyde, nerolidol, p-methoxy cinnamic aldehyde, spathulenol, hexadecane,

benzyl benzoate, 1,2-benzenedicarboxylic acid, tetradecanamide, elcosane, hexadecanamide, octadecenamide, (Z)-9-octadecenamide, (Z)-13-docosenamide

Tinh dầu từ vỏ Quế có 10 hợp chất được xác định chiếm 100% tổng lượng tinh dầu Thành phần chính của tinh dầu là cinnamic aldehyde (77,34%) và (Z-)-

9-octadecenamide (7,88%) Các cấu tử khác nhỏ hơn là trans-cinnamyl acetate (3,71%), p-methoxy cinnamic aldehyde (3,50%), o-methoxy cinnamic aldehyde

(2,54%), bicycloelemene (1,57%), hexadecanamide (1,33%), tetradecanamide (0,94%), 1,2-benzenedicarboxylic acid (0,68%) và cinnamyl alcohol (0,51%)

Tinh dầu từ lá Quế với 20 hợp chất được xác định chiếm 96,96% tổng hàm lượng tinh dầu Cinnamic aldehyde (53,45%) và (z-)-9-octadecenamide (19,47%)

là các thành phần chính trong tinh dầu từ lá Quế [6]

Theo Hoàng Thị Bích (2017), hàm lượng tinh dầu cành lá Quế, vỏ Quế thu được bằng chưng cất hơi nước tương ứng là 0,69 ± 0,02% và 2,87 ± 0,04% tinh dầu (tính theo nguyên liệu khô gió) Có khoảng 28 hợp chất được tìm thấy trong

tinh dầu cành lá Quế C cassia, trong đó trans-cinnamaldehyde là hợp chất chính

(69,74%), theo sau là cinnamyl acetate (17,2%), benzofuran (5,9%), benzaldehyde (1,62%), benzenepropanal (1,59%) Ngoài ra, một số các thành phần khác cũng được xác định với hàm lượng nhỏ hơn 1,00% Khoảng 38 hợp chất được phát hiện

trong tinh dầu vỏ Quế C cassia, trong đó trans- cinnamaldehyde là hợp chất chính

(53,99%), theo sau là copaene (13,86%), cadinene (7,69%), benzenpropanal (2,39%) Ngoài ra, một số các thành phần khác cũng được xác định với hàm lượng nhỏ hơn 1,00% - Phenylpropanoid là nhóm hợp chất chủ yếu trong tinh dầu cành

lá Quế và vỏ Quế C cassia thu từ Văn Yên, Yên Bái, trong đó

trans-cinnamaldehyde là thành phần chính Tổng của các hợp chất hydrocarbon, của các

hợp chất chứa oxy, của các phenylpropanoid và của các sesquiterpenoid có sự khác nhau rõ rệt giữa nguyên liệu cành lá Quế và vỏ Quế [7]

Có thể thấy, từ 2008 đến 2017, giới nghiên cứu khoa học trong nước phát hiện ngày càng nhiều các hợp chất có trong tinh dầu Quế, tuy nhiên vẫn còn một phần nhỏ các hợp chất trong tinh dầu Quế chưa được phát hiện Điều này vẫn đặt

ra một nhu cầu nghiên cứu nhằm phát hiện đầy đủ các thành phần có trong tinh dầu Quế tại Việt Nam

và thành phần chủ yếu của tinh dầu vỏ Quế là cinnamaldehyde (75%) [8]

Ross (1976) đã xác định được 75 hợp chất có trong tinh dầu Quế; trong đó

có 71 hợp chất có trong tinh dầu lá Quế và hợp chất chính trong tinh dầu lá Quế là eugenol (70,1%); xác định được 67 hợp chất có trong tinh dầu vỏ Quế và hợp chất chính trong tinh dầu vỏ Quế là cinnamic aldehyde (75,0%); xác định được 56 hợp chất có trong tinh dầu rễ Quế và thành phần chủ yếu của tinh dầu rễ Quế là camphor (56,2%) [8]

Raina và các đồng sự (2001) cũng đã nghiên cứu và báo cáo về các thành phần trong tinh dầu lá Quế được trồng ở Little Andaman (nằm ở nhóm quần đảo Andaman và Nicobar ở Ấn Độ Dương) Có khoảng 47 thành phần đã được xác định là cấu thành nên 99,96% lượng tinh dầu Các thành phần chính bao gồm eugenol (76,60%), linalool (8,50%), piperitone (3,31%), cinnamyl acetate (2,59%), eugenyl acetate (2,74%) và phellandrene (1,19%) Hàm lượng tinh dầu ở trong vỏ Quế được xác định dao động trong khoảng từ 0,4% đến 0,8% và trong rễ Quế là khoảng từ 0,9 đến 2,8% [8]

A Simie (2004), đã tiến hành phân tích thành phần tinh dầu Quế, và xác định được 27 hợp chất có trong tinh dầu (chiếm 94,79% tổng lượng tinh dầu),

thành phần chính của tinh dầu Quế là trans-cinnamaldehyde (62,79%) [9]

Yu-Nan Ma và cộng sự (2019) đã tiến hành phân tích thành phần tinh dầu

vỏ Quế khô, tinh dầu vỏ Quế tươi, và tinh dầu lá Quế tươi Kết quả cho thấy tinh dầu Quế có 63 hợp chất, trong đó tinh dầu vỏ Quế khô có 24 hợp chất với hợp chất

chính là trans-cinnamaldehyd (75,66%); tinh dầu vỏ Quế tươi có 43 hợp chất với

các hợp chất chính là trans-cinnamaldehyd (24,41%); α-cadinol (11,28%); methoxycinnamaldehyd (8,78%); (+)-δ-cadinen (3,57%); cadin-4-en-1β-o (7,53%); (–)-α-cadino (9,36%); α-bisabolol (3,85%); tinh dầu lá Quế tươi có 23 hợp chất với các hợp chất chính là cinnamyl acetate (42,78%); trans- cinnamaldehyd (28,44%), (E)-2-methoxycinnamaldehyd (5,09%) [10]

(E)-2-Có thể thấy rằng hàm lượng tinh dầu trong cây Quế là rất khác nhau tùy thuộc vào giống loài và độ tuổi của cây, cũng như phụ thuộc vào hàm lượng nước chứa trong thành phần và phương pháp chưng cất Cinnamic aldehyde là hợp chất chính có trong tinh dầu vỏ Quế; eugenol là hợp chất chính có trong tinh dầu lá Quế; và camphor là hợp chất chính có trong tinh dầu rễ Quế

1.1.2.3 Tóm tắt thành phần hóa học tinh dầu Quế

Thành phần các chất chính có trong tinh dầu Quế được mô tả tóm tắt như sau:

- Cinnamaldehyde

- Là thành phần chính của tinh dầu vỏ Quế, với đồng phân trans- chiếm 70-88%, đồng phân cis- chiếm 0-0,7%

- Trans- cinnamaldehyde (trans-3-phenyl propenal) là chất lỏng, màu trong suốt

hoặc vàng nhạt, có mùi Quế đặc trưng, vị cay ngọt Nhờ có đặc trưng về hương và

vị nên cinnamaldehyde được ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, nước hoa, hương liệu, tạo mùi cho các sản phẩm tẩy rửa

- Andehyt cinamic có hoạt tính sinh học mạnh (khử trùng, kháng nấm, tăng giãn

nở thành mạch) nên còn là thành phần trong một số loại thuốc

- Coumarine

- Hàm lượng coumarine trong tinh dầu Quế nằm trong khoảng từ 1,5 – 4% [4]

- Coumarine có dạng tinh thể không màu, dễ thăng hoa, phát huỳnh quang dưới

ánh sáng uv, có mùi ngọt, nhưng lại có vị đắng

- Coumarine có công dụng chống co thắt mạch, chống đông máu, kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, và được ứng dụng trong hương liệu, y học Coumarine với liều lượng ít có đặc tính ức chế sự thèm ăn ở động vật, tuy nhiên với hàm lượng cao hơn thì coumarine gây độc cho cơ thể (liều gây chết ở mức 275mg/kg); Viện

đánh giá rủi ro liên bang Đức đã thiết lập mức tiêu thụ hàng ngày chấp nhận được

là 0,1 mg coumarine mỗi kg trọng lượng cơ thể, nhưng cũng khuyên rằng lượng cao hơn trong một thời gian ngắn không nguy hiểm

- Cinnamyl alcohol

- Có hàm lượng từ 0 – 1% trong tinh dầu

- Cinnamyl alcohol tinh khiết có dạng tinh thể màu trắng, trong hỗn hợp nó có màu vàng

- Cinnamyl alcohol có mùi ngọt, vị cay mạnh Được sử dụng trong công nghiệp chăm sóc cơ thể như một chất khử mùi

- Cinnamyl alcohol trong tự nhiên rất ít, nên thường được tổng hợp hóa học để đáp ứng đủ nhu cầu trong công nghiệp nước hoa

- Cinamyl acetate

- Có hàm lượng từ 0 – 6%

- Chất lỏng có mùi hoa dạ hương

- Sử dụng pha chế nước hoa, xà phòng

- Styren

- Có hàm lượng từ 0 – 0,15%

- Thông thường ở dạng lỏng, dễ bốc hơi, dễ cháy

- Styrene còn dùng trong tổng hợp polystyrene, do đó sẽ xảy ra hiện tượng nhựa hóa tinh dầu Quế nếu tinh dầu bị tiếp xúc ánh sáng và không khí thời gian dài

- Aldehyde salixylic

- Chất lỏng nhờn, không màu, có mùi hạnh nhân

- Dùng để điều chế acid salixylic, thành phần của thuốc chống bài tiết bã nhờn, trị vảy nến

- Benzaldehyde

- Có hàm lượng từ 0,5 – 2%

- Chất lỏng không màu, để lâu có màu vàng, mùi hạnh nhân

- Trong không khí bị oxi hoá thành axit benzoic

- Benzandehyde được dùng điều chế chất thơm, phẩm nhuộm

- Acetophenone

- Có hàm lượng từ 0 – 0,1%

- α pinene

- Là một terpene

- Có tác dụng kháng khuẩn nên được sử dụng trong dược phẩm

- α -pinene còn là thành phần chính trong tinh dầu Thông (Pinaceae)

- Limonene

- Là monoterpene hydrocarbon có mùi cam chanh

- Là chất có nhiều trong tinh dầu Citrus

- Có khả năng kháng viêm

- Có khả năng chống oxy hóa

- Cũng có trong thành phần của tinh dầu cỏ Xạ hương (thyme)

- Muurolene

- Là một sesquiterpene hai vòng có tác dụng kháng khuẩn

- Cũng có mặt trong tinh dầu lá Trầu không (Piperaceae piper)

- Calamenene

- Là một sesquiterpene hai vòng có tác dụng kháng khuẩn

- Cũng có mặt trong tinh dầu Hoắc hương (Pogostemon cablin)

- Bisabolol

- Có hoạt tính chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa

- Được sử dụng làm hương liệu trong mỹ phẩm

- Nerolidol

- Có hoạt tính ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư

- Có tác dụng như một pheromone có khả năng dẫn dụ côn trùng

- Cũng có trong thành phần tinh dầu của nhiều loại như tinh dầu hoa Cam

(Bergamot) tinh dầu Pơ mu

Nhìn chung, tinh dầu Quế là hỗn hợp của các terpene và sesquiterpene cùng một vài nhóm chất hữu cơ khác Tinh dầu Quế còn là hỗn hợp của rất nhiều chất

có hoạt tính sinh học, đồng thời có mùi thơm dễ chịu nên tinh dầu Quế được ứng dụng rất nhiều trong dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm Việc nghiên cứu đơn lẻ từng hợp chất hoặc sự phối hợp hài hòa giữa các hợp chất trong tinh dầu sẽ giúp ta

sử dụng tối ưu nguồn “vàng lỏng” từ thiên nhiên này

Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học tinh dầu Quế (Cinnamomum cassia Nees ex Blume)

1.1.3.1 Trong nước

Theo Vũ Thu Trang và Nguyễn Thị Hoa (2015), 10µl tinh dầu Quế có khả

năng kháng dịch vi khuẩn Staphylococcus aureus (có mật độ khuẩn lạc là 108

CFU/ml) với đường kính kháng khuẩn (48 ± 2 mm) [12]

Theo Liêu Thùy Linh (2017), tinh dầu Quế có hiệu quả kháng nấm tốt với

nồng độ ức chế tối thiểu là 5 μl/mL ở nấm mốc (Aspergillus niger) và nấm men (Saccharomyces cerevisiae) Hiệu quả kháng nấm của tinh dầu Quế tốt hơn hẳn so

với tinh dầu Sả chanh, tinh dầu húng Quế, tinh dầu Bạc hà [13]

Theo Hoàng Thị Bích (2017), tinh dầu Quế không có hoạt tính kháng

P.aeruginosa và F oxysporum, có hoạt tính kháng S aureus với MIC = 100 μg/ml,

A niger với MIC = 200 μg/ml trong khi E coli, B subtilis, S cerevisiae, C albicans là MIC = 400 μg/ml Trong số các vi sinh vật kiểm định, tinh dầu Quế có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đối với S aureus với MIC 100 µg/ml Tinh dầu

Quế có hoạt tính gây độc tế bào với nồng độ thử nghiệm ban đầu (40 μg/ml) Ở các nồng độ thử nghiệm tiếp theo, tinh dầu Quế biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào với 02 dòng tế bào ung thư gan và ung thư biểu mô liên kết (Hep-G2 và RD) với giá trị IC50 lần lượt là 29,25 và 6,01 μg/ml, trong khi tinh dầu Quế được chưng cất sau khi có tác động của enzyme biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với 3 dòng

tế bào ung thư (Hep-G2, LU-1 và RD) với giá trị IC50 lần lượt là 12,89, 25,95 và 2,34 μg/ml Đặc biệt, tinh dầu Quế được chưng cất sau khi có tác động của enzyme

có hoạt tính khá mạnh trên dòng ung thư biểu mô phổi với giá trị IC50 = 2,34 μg/ml Tinh dầu Quế có biểu hiện hoạt tính ức chế đại thực bào sản sinh NO ở các khoảng nồng độ từ 6,25 đến 100 μg/ml (P < 0,05 với LPS đối chứng âm) Tinh dầu Quế chưa thể hiện khả năng trung hòa gốc tự do của DPPH ở nồng độ nghiên cứu [7]

1.1.3.2 Ngoài nước

Theo Linda S M Ooi (2006) tinh dầu Quế và cinnamaldehyde có khả năng

ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn khác nhau bao gồm Gram dương (1

chủng, Staphylococcus aureus) và Gram âm (7 chủng, E coli, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Samonella typhymurium), và các loại nấm bao gồm nấm men (bốn loài Candida, C albicans, C tropicalis, C glabrata và C krusei) nấm mốc (3 chủng Aspergillus và một chủng Fusarium); khuẩn trên biểu bì da (3 chủng Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum và T mentagraphytes Nồng độ ức

chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu Quế và cinnamaldehyde đối với vi khuẩn dao

động từ 75 μg/ml đến 600 μg/ml, đối với nấm men từ 100 μg/ml đến 450 μg/ml, đối với nấm sợi từ 75 μg/ml đến 150 μg/ml, và cho tế bào da liễu từ 18,8 μg/ml đến 37,5 μg/ml Hiệu quả kháng khuẩn của tinh dầu Quế và thành phần chính của

nó là tương đương nhau, điều này cho thấy rằng các hoạt động kháng sinh phổ rộng của tinh dầu Quế là do cinnamaldehyde [14]

Theo Seenivasan Prabuseenivasan (2006), tinh dầu Quế có hiệu quả kháng

khuẩn các chủng vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) bao gồm P aeruginosa, P Vulgaris B subtilis, S aureus, E coli và K pneumoniae Trong đó, tinh dầu Quế cho thấy tác dụng ức chế đáng kể đối với P aeruginosa (đường kính kháng khuẩn 33,3 mm), B subtilis (đường kính kháng khuẩn 29,9 mm), P Vulgaris (đường kính kháng khuẩn 29,4 mm), K pneumoniae (đường kính kháng khuẩn 27,5 mm) và S aureus (đường kính kháng khuẩn 20,8 mm) [15]

Có thể thấy tinh dầu Quế có khả năng kháng khuẩn rộng, kháng được cả các

vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) cũng như nấm men, nấm mốc Các nghiên cứu về các hoạt tính khác như gây độc tế bào ung thư, hoạt tính chống oxy hóa những năm gần đây mới được thực hiện, tuy nhiên hoạt tính của tinh dầu Quế đặc trưng của Việt Nam mới chỉ được nghiên cứu tại luận án của Hoàng Thị Bích, chưa có thêm các căn cứ cơ sở khác để có thể tiến tới ứng dụng các kết quả nghiên cứu này 1.2 Tổng quan về cây Hồi (Illicium verum Hook, f.)

Thực vật học cây Hồi (Illicium verum Hook, f.)

Tên Việt Nam : Hồi, đại Hồi, bát giác hương, đại Hồi hương, Hồi sao, Hồi 8

cánh, mắc Hồi Tên Latin : Illicium verum Hook, f

Hồi là cây gỗ nhỏ, thường xanh, cao 6 - 15 m, đường kính thân 15 - 30 cm, thân mọc thẳng, tròn, vỏ ngoài màu nâu xám, cành non hơi mập, nhẵn, màu lục nhạt, sau chuyển thành màu nâu xám Lá mọc cách và thường tập trung ở đầu cành, trông tựa như mọc vòng; mỗi vòng thường có 3-5 lá Phiến lá nguyên, dày, cứng, giòn; hình trứng thuôn hay trái xoan thuôn; kích thước 6 – 12 x 2,5 – 5 cm; đầu lá nhọn hoặc tù, gốc lá hình nêm; mặt trên màu lục sẫm, nhẵn, mặt dưới xanh nhạt; gân dạng lông chim, gồm 9 - 12 đôi, không nổi rõ Cuống lá dài 7 - 10cm

Hoa lưỡng tính, mọc đơn độc hoặc 2 - 3 cái ở kẽ lá; cuống ngắn; đài 5 - 6

lá, màu lục, mép màu hồng, rụng ngay sau khi hoa nở; cánh hoa 16 - 20, hình bầu dục và thường nhỏ hơn các lá đài, mặt ngoài màu trắng, mặt trong màu hồng thẫm, càng vào giữa càng thẫm; nhị xếp 1 - 2 vòng, chỉ nhị ngắn; lá noãn 6 - 8 -13, hợp thành khối hình nón

Quả gồm 6 - 8 -13 đại, khi già các lá noãn sắp xếp toả tròn, hình sao; khi chín có màu nâu; mỗi đại chứa 1 hạt Hạt hình trứng thuôn hơi dẹt, nhẵn, màu nâu hoặc hung đỏ [2]

Tinh dầu Hồi có trong túi tiết của quả, thân non, lá Hồi

Hình 1.6 Đặc điểm vi phẫu quả Hồi [16]

Hồi là cây nguyên sản ở vùng Đông Bắc Việt Nam và Nam Trung Quốc Tại Việt Nam, Hồi được trồng chủ yếu ở Lạng Sơn (Văn Quan, Bình Gia, Cao Lộc, Bắc Sơn, Chi Lăng, Văn Lãng, Thị xã Lạng Sơn, Lộc Bình, Đình Lập, Tràng Định …) và Quảng Ninh (Bình Liêu) Gần đây Hồi đã được đưa trồng ở Cao Bằng (Đông Khê) và Bắc Kạn

Thế giới: Cây cũng được trồng nhiều tại miền Nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam, đảo Hải Nam) Hồi đã được nhập trồng tại Nhật Bản,

Ấn Độ [2]

Hình 1.7 Phân bố cây Hồi tại Việt Nam [2]

Hồi đã được sử dụng làm gia vị và làm thuốc từ hàng ngàn năm trước đây

ở nước ta cũng như ở Trung Quốc Quả và tinh dầu Hồi là loại gia vị thơm, hấp dẫn trong chế biến thực phẩm Tinh dầu Hồi được sử dụng nhiều trong công nghệ chế biến rượu khai vị, rượu mùi, nước ngọt và bánh kẹo Hương vị hấp dẫn của Hồi vừa có tác dụng kích thích tiêu hoá, vừa gây cảm hứng ngon miệng [2]

Trong y học dân tộc ở nước ta cũng như tại Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ…, Hồi được dùng làm thuốc gây trung tiện, kích thích tiêu hoá, chữa đau bụng, giảm đau, giảm co bóp trong dạ dày và ruột, lợi sữa, chữa trị nôn mửa, đau, thấp khớp, đau lưng, ngộ độc thịt cá và chữa trị khi bị rắn độc cắn… Tây y coi tinh dầu Hồi có tính kích thích, tăng cường nhu động ruột, dùng chữa đau bụng, tăng tiết dịch đường hô hấp, giúp tiêu hoá, giảm đau, khử đờm Tinh dầu Hồi có tác dụng kháng khuẩn, ức chế sự phát triển của vi khuẩn lao và nhiều loại vi khuẩn khác, nên được dùng làm thuốc sát khuẩn, trị nấm ngoài da và ghẻ lở Hồi còn được dùng trong việc sản xuất, chế biến thuốc trừ sâu có nguồn gốc thảo mộc, diệt chấy, rận, rệp, và một số ngoại ký sinh trùng ở gia súc [1]

Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu Hồi (Illicium verum

Hook, f.)

1.2.2.1 Trong nước

Trong khoa học hiện đại, Hồi được nghiên cứu, phân tích thành phần và đưa vào tiêu chuẩn Việt Nam Theo TCVN 8853:2011 về tinh dầu Hồi thu được

bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước từ hoa và lá của cây đại Hồi

(Illicium verum Hook f.), tinh dầu Hồi gồm 13 thành phần chính, trong đó thành phần chiếm hàm lượng lớn nhất là trans-anethole (>86%) [17]

Khi tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu Hồi, Lã Đình Mỡi (2001) và cộng sự đã cho biết: hàm lượng tinh dầu chứa trong quả Hồi tươi Việt Nam đạt 3,0 – 3,5% Tinh dầu Hồi Việt Nam là chất lỏng, sánh không màu hoặc

có màu vàng nhạt, tỷ trọng ở 25oC là 0,978 – 0,988 g/ml, điểm đông từ 14,0 – 18,4oC, hòa tan trong 1,0 – 2,5 thể tích alcohol 90% Thành phần hóa học chủ yếu

của tinh dầu Hồi là trans-anethole (80 – 93%), ngoài ra còn có hơn 20 hợp chất khác, trong đó đáng chú ý là limonene, α-pinene, β-phellandrene, linalool, Δ-3- caren, methylchavicol, α- phellandrene, myrcene… Riêng hợp chất cis-anethole

chỉ có hàm lượng rất nhỏ, từ dạng vết đến 0,1 % Hạt Hồi chứa khoảng 50-58% dầu béo, với thành phần chính là acid oleic, stearic và myristic [18]

Trong thời gian 2 năm, 2005 - 2006, TS Ninh Khắc Bản, Lưu Đàm Cư và cộng sự, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tiến hành chưng cất, xác định một số tính chất và thành phần cơ bản của tinh dầu Hồi lấy ở 4 xã: Bình Phúc, Vân Mộng, Nam La và Hoàng Văn Thụ của 2 huyện Văn Quan và Văn Lãng thuộc tỉnh Lạng Sơn cho kết quả như sau: Hàm lượng tinh dầu dao động từ 1,90 – 3,96 % (so với qủa tươi), chỉ số chiết quang thay đổi trong phạm vi 1,5539 – 1,5461, tỷ trọng của tinh dầu ở 26oC từ 0,9291 – 0,9855 g/ml, nhiệt độ đông đặc

từ 15,5 – 19,5oC Khi phân tích tinh dầu trên máy sắc ký khí khối phổ liên hợp (GC-MS) HP 6890-Agilent 5973N, các chất được nhận biết khi so sánh với thư viện phổ Database/Wiley275.L và Database/Nist98.1 đã xác định được 15 hợp chất

khác nhau Hàm lượng cấu tử quan trọng nhất là trans-anethole của các mẫu tinh dầu đạt từ 84,42 – 98,86% Hàm lượng cis-anethole nhỏ hơn 0,1 % [19]

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự căn cứ theo Dược điển Pháp XI (2006), tinh dầu Hồi chứa 6 thành phần chính là linalool (0,1-1,5%), estragol (0,3-6%) terpineol

1,5%), cis-anethole < 0,5%, trans-anethole (84-93%), anis aldehyde

(0,1-3,5%) [20]

Kết quả phân tích của Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam (2009) cho thấy, các mẫu tinh dầu thuộc các nhóm hình thái khác nhau của cây Hồi tại Lạng

Sơn có chứa 22 hợp chất, và đều có hàm lượng trans-anethole rất cao, biến động

từ 93,16 đến 98,86% Đặc biệt hàm lượng cis-anethole trong tinh dầu có hàm lượng

không đáng kể, trong các mẫu phân tích chất này không xuất hiện ở độ phân giải 0,001% [21]

Đến 2017, Phan Nhựt Nam và cộng sự có nghiên cứu ảnh hưởng của chiết soxhlet đến thành phần hóa học của tinh dầu Hồi Nghiên cứu này xác định được

18 hợp chất có trong tinh dầu Hồi khi chưng cất lôi cuốn hơi nước thông thường;

và 14 hợp chất trong tinh dầu Hồi khi thực hiện chiết soxhlet Cả 2 phương pháp cho ta tổng số các thành phần xác định trong tinh dầu Hồi lên tới 24 thành phần và

thành phần chính trong tinh dầu Hồi là trans-anethole [22]

1.2.2.2 Ngoài nước

Khi phân tích các mẫu tinh dầu Hồi lấy từ tỉnh Vân Nam vào hai thời điểm khác nhau, Cu, Q và cộng sự (1988, 1990) cho biết, trong thành phần hóa học của tinh dầu Hồi có chứa gần 30 hợp chất khác nhau Giữa chúng không những chỉ có

sự biến động về hàm lượng của những chất chính (trans-anethol, cis-anethol) và

những hợp chất thường gặp (limonen, linalool, anisaldehyd, anisketon…), mà còn khác nhau cả về thành phần chất [23]

Yongfu Huang và các cộng sự (2010) đã phân tích xác định được 22 hợp chất trong tinh dầu Hồi, chiếm 94,6% tổng lượng tinh dầu Thành phần chính trong

tinh dầu Hồi là trans-anethole (89,5%) [24]

Luana Ferreira Matos và cộng sự (2020) đã phân tích xác định được 17 thành phần có trong tinh dầu Hồi, chiếm 99,86% lượng tinh dầu, thành phần chủ yếu của

tinh dầu Hồi là trans-anethole (88,85%) [25]

Thành phần hóa học của tinh dầu Hồi theo các nghiên cứu tại Việt Nam và Trung Quốc có số lượng thành phần đa dạng hơn các nghiên cứu từ các phòng thí nghiệm khác Điều này có thể do Hồi là cây nguyên sản tại vùng Đông Bắc Việt Nam, và Đông Nam Trung Quốc nên các mẫu thu hái được phân tích ngay tai Việt Nam và Trung Quốc, còn các mẫu được chuyển đến phòng thí nghiệm xa hơn sẽ biến đổi về chất trong thời gian vận chuyển và bảo quản

1.2.2.3 Tóm tắt thành phần hóa học tinh dầu Hồi

Thành phần các chất chính có trong tinh dầu Hồi được tóm tắt mô tả như

dưới đây:

- Trans- anethole

- Là thành phần chính của tinh dầu Hồi, tạo ra mùi Hồi đặc trưng

- Có vị ngọt và độ ngọt gấp 13 lần đường nhưng cho cảm giác dễ chịu thậm chí ở nồng độ cao

- Xuất hiện dưới dạng các tinh thể màu trắng ở nhiệt độ phòng Điểm nóng chảy là

21oC và điểm sôi là 234oC

- Có tác dụng kháng khuẩn, trị ho cảm, đau bụng hoặc các bệnh tiêu hóa

- Là nguồn để sản xuất tamiflu trị cúm

- α- pinene

- Là một terpene

- Có tác dụng kháng khuẩn nên được sử dụng trong dược phẩm

- α- pinen còn là thành phần chính trong tinh dầu Thông (Pinaceae)

- Là monoterpene hydrocarbon có mùi Cam Chanh

- Là chất có nhiều trong tinh dầu Citrus

- Có tính khảng khuẩn

- 1,8-cineol

- Là monoterpene có mùi thơm tươi mát giống như Long não tươi, hơi cay và tạo cảm giác mát lạnh

- Không tan trong nước nhưng tan hoàn toàn trong ete, ethanol

- Cũng là thành phần chính của tinh dầu Bạch đàn (Eucalyptus)

- Linalool

- Là monoterpene alcohol [11]

- Có mùi thơm ngọt nhẹ và có hoạt tính sinh học mạnh, được sử dụng trong mỹ phẩm

- Linalool có mặt trong nhiều loại tinh dầu, trong đó có tinh dầu rau Mùi

(Coriandrum sativum) tinh dầu Bạc hà (Lamiaceae)

- Có mặt trong thành phần nhiều loại tinh dầu Trong đó đáng kể nhất là tinh dầu

Ngải dấm (Artemisia dracunculus), tinh dầu Thông và nhựa Thông

- Có tác dụng như một pheromone có khả năng dẫn dụ côn trùng

- Cũng có trong thành phần tinh dầu của nhiều loại như tinh dầu hoa Cam

(Bergamot) tinh dầu Pơ mu

- Delta cardinene

- Là một sesquiterpene hai vòng có khả năng kháng khuẩn, giảm đau mỏi

- Cũng là thành phần chính trong tinh dầu Ngải cứu (Artemisia vulgaris)

Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học tinh dầu Hồi (Illicium verum

thiểu 1:500), ức chế tụ cầu khuẩn vàng ở nồng độ tối thiểu 1:250, ức chế

Shigella flexneri (ở nồng độ tối thiểu 1:100), ức chế Bacillus mycoides ( ở nồng độ

tối thiểu 1:100) [20]

Tinh dầu Hồi còn là thành phần trong thuốc viên opizoic có tác dụng làm giảm nhu động ruột và các dịch tiết ruột nhằm chữa trị các triệu chứng ỉa chảy, đau bụng, đầy hơi [26]

Cho đến nay, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong nước về hoạt tính sinh học của tinh dầu Hồi

1.2.3.2 Ngoài nước

Kyu-Sik Chang và Young-Joon Ahn (2001) đã thử nghiệm và xác định được tinh dầu Hồi có khả năng gây tỉ lệ tử vong 80,3% đối với gián Đức trưởng thành với nồng độ tinh dầu 0,159mg/cm2 Tác giả cũng gợi ý việc sử dụng tinh dầu Hồi làm tác nhân kiểm soát số lượng quần thể gián Đức [27]

Ana Dzamic và cộng sự (2009) đã thử nghiệm và xác định được rằng tinh dầu Hồi có khả năng ức chế 19 loài nấm mốc và nấm men với giá trị MIC từ 2,5 –

20 µg/ml [28]

Yazdani D và cộng sự (2009) đã thử nghiệm và xác định được dịch chiết ethanol của quả Hồi có khả năng ức chế các vi nấm và nấm sợi gây hại trong nông

nghiệp, cụ thể là Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis và Aspergillus niger với nồng độ dịch chiết từ 2-256 mg/ml [29]

Yongfu Huang và các cộng sự (2010) đã thử nghiệm và xác định được rằng tinh dầu Hồi với giá trị IC50 trong khoảng 0,07 – 0,25 mg/ml có khả năng ức chế

rõ ràng đối với 11 loại nấm trong thử nghiệm, trong đó nhạy nhất là A solani, B maydis, F graminearum, P aphanidermatum and R solani với IC50 trong khoảng 0,07 – 0,09 mg/ml [24]

Yamina Benmalek và cộng sự (2013) đã thử nghiệm và xác định tinh dầu Hồi có hoạt tính chống oxy hóa với giá trị IC50 = 28,9 µg/ml [30]

Theo Soher E Aly và cộng sự (2014) đã thử nghiệm và xác định được tinh dầu Hồi có khả năng chống oxy hóa thấp ở nồng độ 55,6 mg/mL, có khả năng ức

chế sự phát triển của nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Fusarium verticillioides ở MIC = 100 µg/ml [31]

Muhammad Asif và cộng sự (2016) đã thử nghiệm và xác định được tinh dầu Hồi có IC50 là 50,34 µg/ml đối với tế bào gây ung thư đại tràng [32]

Nhìn chung, tinh dầu Hồi là hỗn hợp của rất nhiều chất có hoạt tính sinh học, đồng thời có mùi thơm dễ chịu nên tinh dầu Hồi được ứng dụng rất nhiều trong dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm Việc nghiên cứu đơn lẻ từng hợp chất hoặc sự phối hợp hài hòa giữa các hợp chất trong tinh dầu sẽ giúp ta sử dụng tối

ưu nguồn “vàng lỏng” từ thiên nhiên này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mẫu thực vật

Các mẫu vỏ Quế được thu thập tại Văn Yên – Yên Bái; Thường Xuân – Thanh Hóa; Nam Trà My – Quảng Nam trong tháng 3 năm 2019, và được giám

định tên khoa học là Cinnamomum cassia Nees ex Blume

Hình 2.1 Mẫu vỏ Quế tại

Văn Yên, Yên Bái

Hình 2.2 Mẫu vỏ Quế tại Thường Xuân – Thanh Hóa

Hình 2.3 Mẫu vỏ Quế tại Nam Trà My – Quảng Nam

Mẫu quả Hồi được thu thập tại Văn Quan – Lạng Sơn và mẫu lá Hồi được thu thập tại Bắc Mê - Hà Giang trong tháng 4 năm 2019 và được giám định tên

khoa học là Illicium verum Hook, f

Hình 2.4 Mẫu quả Hồi tại Văn Quan –

Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu

2.2.1.1 Xác định lượng tinh dầu có trong nguyên liệu theo TCVN 7039:2013

Xác định lượng tinh dầu thông qua phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Nguyên liệu Quế, Hồi chứa tinh dầu được ngâm ngập trong nước; đun sôi dung dịch, hơi nước sẽ cuốn theo hơi tinh dầu bay lên, đi qua sinh hàn hỗn hợp hơi

sẽ được làm lạnh và ngưng tụ thành dạng lỏng rơi xuống ống gạn Tại ống gạn, tinh dầu nhẹ sẽ nổi trên mặt nước, còn nước nặng hơn tinh dầu sẽ theo nhánh Hồi lưu quay về bình đun Thể tích tinh dầu được xác định bằng cách đọc thể tích ngay trên ống gạn sau khi quá trình chưng cất kết thúc

Hình 2.6 Dụng cụ xác định lượng tinh dầu theo TCVN 7039:2013

2.2.1.2 Xác định hàm lượng nước có trong nguyên liệu theo TCVN 7040:2002

Xác định lượng nước có trong nguyên liệu thông qua phương pháp chưng cất lôi cuốn bằng dung môi Nguyên liệu Quế, Hồi chứa được ngâm ngập trong dung môi; đun sôi dung dịch, hơi dung môi và hơi nước có trong nguyên liệu bay lên, đi qua sinh hàn hỗn hợp hơi sẽ được làm lạnh và ngưng tụ thành dạng lỏng rơi xuống ống gạn Tại ống gạn, dung môi nhẹ sẽ nổi trên, còn nước chìm phía dưới Đọc lượng nước ở phía dưới ta có thể xác định được lượng ẩm có trong nguyên liệu

Hình 2.7 Dụng cụ xác định độ ẩm nguyên liệu theo TCVN 7040:2002

2.2.1.3 Tính xác định hàm lượng tinh dầu có trong nguyên liệu khô tuyệt đối

Hàm lượng tinh dầu, wVO, tính bằng mililít trên 100 g sản phẩm khô, theo công thức sau:

Vo là thể tích xylen đo được (ml);

V1 là tổng thể tích dầu dễ bay hơi và xylen (ml);

M là khối lượng phần mẫu thử (g);

O

H

w

2 là độ ẩm xác định được (%)

Phương pháp thu nhận tinh dầu

Yêu cầu sản phẩm tinh dầu

- Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu

- Quy trình khai thác phải phù hợp nguyên liệu

- Tinh dầu phải được lấy triệt để khỏi nguyên liệu, với chi phí thấp nhất Đối với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước để thu nhận tinh dầu: Chưng cất là sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp nhiều chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng Phương pháp chưng cất dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao

Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu

bị vỡ và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi Phần lớn tinh dầu còn lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm thấu

Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, cần làm cho lớp nguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp này đồng đều và dễ dàng Vì các cấu tử trong tinh dầu được chưng cất hơi nước theo nguyên tắc nói trên cho nên thông thường những hợp chất nào dễ hòa tan trong nước sẽ được lôi cuốn trước

Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước quá nhiệt (trên 100oC) nên thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của

sự chưng cất, sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết Thực ra, hầu hết các tinh dầu đều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độ cao của tinh dầu càng ngắn càng tốt

Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thì chúng

có liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ Khi tăng nhiệt độ, sự khuếch tán thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng sự phân hủy cũng tăng theo

Hỗn hợp hơi nước lôi cuốn tinh dầu sau khi đi ra khỏi thiết bị chưng cất sẽ đến bộ phận làm lạnh Tại đây hỗn hợp hơi tinh dầu – nước sẽ bị ngưng tụ thành dạng lỏng và được chảy sang bình phân ly Bình phân ly có tác dụng lắng tĩnh hỗn hợp chất lỏng, tách phần tan trong nước và phần không tan trong nước (tinh dầu)

Hình 2.8 Dụng cụ chưng cất thu nhận tinh dầu Clavenger (a) Dụng cụ chưng cất thu tinh dầu nhẹ hơn nước; (b) Dụng cụ chưng cất thu tinh dầu nặng hơn nước

Để thu nhận tinh dầu từ mẫu thực vật, sử dụng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước trên dụng cụ chưng cất thu nhận tinh dầu Clavenger Nguyên liệu Quế, Hồi chứa tinh dầu được đặt trong bình cầu và được ngâm ngập trong nước Gia nhiệt cho bình cầu để đun sôi dung dịch, hơi nước sôi sẽ cuốn theo hơi tinh dầu bay lên, đi qua sinh hàn hỗn hợp hơi sẽ được làm lạnh và ngưng tụ thành dạng lỏng rơi xuống ống gạn Tại ống gạn dạng (a) dùng cho chưng cất thu tinh dầu nhẹ, tinh dầu Hồi nhẹ sẽ nổi trên mặt nước, còn nước nặng hơn tinh dầu sẽ theo nhánh hồi lưu quay về bình đun Tại ống gạn dạng (b) dùng cho chưng cất thu tinh dầu nặng, tinh dầu Quế nặng sẽ chìm phía dưới ống gạn, còn nước nhẹ hơn tinh dầu sẽ theo nhánh hồi lưu quay về bình đun Sau khi kết thúc quá trình chưng cất, mở khóa ống gạn ta thu được tinh dầu

Phương pháp xác định tỉ trọng, chỉ số khúc xạ tinh dầu

Xác định tỉ trọng tinh dầu bằng tỉ trọng kế điện tử DA-130 (Nhật) có khả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ buồng cân về 20oC;

Xác định chỉ số khúc xạ của tinh dầu bằng khúc xạ kế điện tử Kruss DR6000-TF (Đức) có khả năng tự động điều chỉnh nhiệt độ khoang đo về 20oC 2.3 Phương pháp phân lập và xác định hợp chất hữu cơ trong tinh dầu

Việc tách và phân lập hợp chất hữu cơ từ tinh dầu được thực hiện chủ yếu bằng phương pháp sắc ký khí (GC) với pha động là một khí mang, thường là một khí trơ như Heli; pha tĩnh là một vi lớp chất lỏng hoặc polyme được phủ trên một lớp rắn đặt trong một ống thủy tinh hoặc kim loại được gọi là cột Hầu hết các phương pháp sắc ký khí phân tích sử dụng cột mao quản, nơi các lớp pha tĩnh được tráng lên thành một ống có đường kính nhỏ trực tiếp (tức 0,25 µm phim trong một ống 0,32 mm)

Các hợp chất ở dạng khí cần phân tích sẽ tương tác với thành cột – được phủ bởi pha tĩnh, dẫn đến từng hợp chất được tách ra tại những thời điểm khác

nhau – gọi là thời gian lưu của hợp chất Khi các chất hóa học đi ra ở cuối cột, sẽ được phát hiện và xác định bằng điện tử Ngoài ra, một số thông số khác có thể được sử dụng để thay đổi thứ tự hoặc khoảng thời gian lưu: tốc độ dòng khí mang, chiều dài cột và nhiệt độ Phân tích bằng sắc ký khí dựa trên việc so sánh thời gian lưu này

Hợp chất sau khi phân lập qua cột sắc ký khí được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ khối lượng Nguyên tắc của phương pháp phổ MS là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất cần nghiên cứu dưới sự bắn phá của một chùm ion

từ bên ngoài Phổ MS cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hóa học các hợp chất 2.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học

Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và McKane & Kandel (1996) Các chủng vi sinh vật kiểm định được hoạt hóa và pha loãng theo tiêu chuẩn McFarland 0,5 rồi tiến hành thí nghiệm với 01 đối chứng âm tính; 01 đối chứng dương tính, và các nồng độ mẫu thử nghiệm Các phiến thí nghiệm được giữ trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ cho vi khuẩn và 30oC trong 48 giờ đối với nấm sợi và nấm men Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thể hiện qua nồng độ

ức chế tối thiểu của mẫu mà ở nồng độ đó vi sinh vật bị ức chế gần như hoàn toàn [33] [34] [35]

Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

2.4.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH

Được tiến hành theo phương pháp của P Yuvaraj và cộng sự (2013) có chỉnh sửa cho phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phản ứng với 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) DPPH

là một gốc tự do có màu tím, có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm Khi có mặt chất chống oxi hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxi hóa Kết quả sự khử màu tỷ lệ đối với lượng hydrua tương đương được giữ lại Trolox được sử dụng làm chất chuẩn đối chứng [36] [37] [38]

2.4.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid

Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa thông qua ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào (thử nghiệm MDA) được thực hiện theo phương

pháp của Stroev EA, Makarova VG (1998), Jelili A Badmus et al., (2011) và của