Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose để xử lý lá rụng trong rừng

DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu 1.2 Mô hình sự sắp xếp các chu i cellulose trong thành tế 1.3 Quá trình phân giải cellulose của cellulase 6 1.5 Hình ảnh cấu trúc phân tử của một số cellulase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

NGUYỄN VĂN TRUNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE ĐỂ XỬ LÝ LÁ RỤNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo

và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về

nội dung luận văn

Học viên

Nguyễn Văn Trung

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt Luận văn thạc sĩ này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Khoa học Tự nhiên, Bộ môn Sinh học ứng dụng và Nông nghiệp Trường Đại học Quy Nhơn đã tạo điều kiện Cảm ơn sự nhiệt tình giảng dạy của các thầy cô đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm thực tế để em hoàn thành tốt Luận văn này

Em đặc biệt gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp – Trưởng Bộ môn Sinh học ứng dụng và Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện Luận văn để em có thể hoàn thành Luận văn đúng tiến độ và trau dồi những kiến thức chuyên môn bổ ích phục vụ cho công việc sau này

Xin trân trọng cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn ủng

hộ, động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt Luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn!

Bình Định, ngày tháng năm 2022

Học viên

Nguyễn Văn Trung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

MỞ Đ U 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2

3 nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 nghĩa khoa học 2

3.2 nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tổng quan về cellulose và enzyme cellulase 3

1.1.1 Cellulose 3

1.1.2 Hệ enzyme cellulase 6

1.2 Sơ lược về các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 12

1.2.1 Vi khuẩn 12

1.2.2 Xạ khuẩn 13

1.2.3 Vi nấm 14

1.3 Một số nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong phân giải cellulose 15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 25

2.3.2 Phân lập vi sinh vật phân giải cellulose 26

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase bằng khuếch tán trên thạch 27

2.3.4 Phương pháp xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu cho chủng vi sinh vật phân giải cellulose 28

2.3.5 Phương pháp khả năng phân giải lá, cành cây khô của chủng vi sinh vật tuyển chọn 28

2.3.6 Phương pháp xử lý các số liệu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có trong đất 29

3.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc 29

3.1.2 Đặc điểm hình thái vi sinh vật dưới kính hiển vi 36

3.2 Khả năng phân giải cellulose của các chủng vi sinh vật phân lập 39

3.3 Điều kiện sinh trưởng tối ưu cho các chủng vi sinh vật phân giải cellulose 43

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật độ tế bào vi khuẩn 43

3.3.2 Ảnh hưởng của pH môi trường đến mật độ tế bào vi khuẩn 46

3.4 Khả năng phân giải lá cây khô của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 49

KẾT LUẬN 52

1 Kết luận 52

2 Kiến nghị 52

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO)

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

3.1 Số lượng, thành phần các chủng VSV phân giải

3.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật phân

3.3 Đặc điểm của các chủng vi sinh vật phân giải cellulose

3.4 Đường kính phân giải và mật độ của các chủng vi sinh

vật phân giải cellulose (sau 48 giờ nuôi cấy) 40

3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến mật độ tế bào

3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến mật độ tế

3.7 Phân giải lá rừng sau 30 ngày của các chủng vi khuẩn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

1.2 Mô hình sự sắp xếp các chu i cellulose trong thành tế

1.3 Quá trình phân giải cellulose của cellulase 6

1.5 Hình ảnh cấu trúc phân tử của một số cellulase 9

3.1 Các khuẩn lạc phân giải cellulose phát triển trên môi

3.2 Các chủng vi khuẩn phân giải Cellulose 35

3.3 Các chủng vi nấm phân giải Cellulose 35

3.4 Vòng phân giải cellulose của các chủng vi khuẩn 42

3.5 Vòng phân giải cellulose của các chủng vi nấm 43

3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến mật độ tế bào của

3.7 Sự phát triển của chủng vi sinh vật ở các nhiệt độ khác

Số hiệu

3.8 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến mật độ tế

3.9 Sự phát triển của chủng vi sinh vật ở các môi trường có

MỞ Đ U

1 Lý do chọn đề tài

Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật phân giải cellulose rất phong phú và

đa dạng Tuy nhiên nếu chỉ sử dụng các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong đất thì quá trình phân hủy thường diễn ra chậm Để thúc đẩy nhanh quá trình lên men phân giải các hợp chất hữu cơ, người ta thường bổ sung thêm các chủng

vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao Do vậy việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy cellulose cao để tạo chế phẩm nhằm phân hủy nhanh cellulose là rất quan trọng

Không chỉ đóng góp vai trò trong chu trình carbon tự nhiên, vi sinh vật phân giải cellulose còn có tiềm năng lớn trong việc phân hủy cellulose trong nước ô nhiễm, rác thải và chuyển hóa cellulose thành nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu hóa thạch, chuyển hóa sinh học cellulose thành nhiên liệu sinh học và các hóa chất mang lại các sản phẩm thiết yếu với năng suất cao dẫn đến lợi ích về kinh tế cũng như một giá thành thấp cho các sản phẩm này Chế phẩm sinh học đa chủng bao gồm vi sinh vật phân hủy cellulose sẽ

có nhiều ưu việt về cả mặt kinh tế, kỹ thuật và môi trường, giúp quá trình phân giải cellulose diễn ra nhanh hơn có khả năng phân giải cành khô lá rụng trên mặt đất, dưới tán rừng và phế phẩm nông nghiệp tạo ra nguồn hữu cơ tại

ch cho đất, làm tăng độ phì của đất, tăng sinh trưởng và phát triển của cây, làm giảm thiểu nguy cơ cháy rừng

Trước tiềm năng ứng dụng to lớn của vi sinh vật phân giải cellulose, chúng ta cần có những hiểu biết nhất định về chúng, bao gồm các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose cao, đặc biệt là các chủng vi khuẩn,

vi nấm có khả năng phân giải cellulose Xuất phát từ những lợi ích thực tế

trên nên tôi chọn thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi

sinh vật có khả năng phân giải cellulose để xử lý lá rụng trong rừng” nhằm

xác định được đặc điểm sinh học như điều kiện sinh trưởng và phát triển tối

ưu nhất cho các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy cellulose cao ứng dụng vào trong sản xuất chế phẩm sinh học phân hủy cellulose nhanh để ứng dụng trong phòng chống cháy rừng

2 Mục đích nghiên cứu của đề tài

 Mục đích nghiên cứu của đề tài là phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose để phân giải lá rụng trong rừng

3 Nhiệm vụ của nghiên cứu của đề tài:

 Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải cellulose trong đất bãi rác, đất

rừng và một số vùng đất canh tác nông nghiệp ở Phú yên

 Xác định hoạt tính enzyme cellulase của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

 Xác định điều kiện sinh trưởng tối ưu cho các chủng vi sinh vật phân giải cellulose

 Thử nghiệm khả năng phân giải lá cây khô của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

4 ngh a hoa học và thực tiễn của đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về cellulose và enzyme cellulase

1.1.1 Cellulose

Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong g , cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%) [23] Cellulose có cấu trúc mạch thẳng dạng sợi rất bền, khó bị phân hủy Cellulose không tan trong nước, chỉ tan trong dung dịch amoniac của hydroxyl đồng [23]

Hình 1.1 Cấu tạo Cellulose

Các sợi cellulose được bao bọc trong một ma trận polysaccharide để h trợ thành tế bào thực vật Thân cây và g được nâng đỡ bởi các sợi cellulose phân bố trong một ma trận lignin, nơi cellulose hoạt động giống như các thanh gia cố và lignin hoạt động giống như bê tông Dạng cellulose tự nhiên tinh khiết nhất là bông, bao gồm hơn 90% cellulose Ngược lại, g bao gồm 40-50% cellulose

Một số loại vi khuẩn tiết ra cellulose để tạo màng sinh học Màng sinh học cung cấp bề mặt gắn kết cho vi sinh vật và cho phép chúng tổ chức thành các khuẩn lạc

Trong khi động vật không thể sản xuất cellulose, điều quan trọng đối với sự tồn tại của chúng Một số loài côn trùng sử dụng cellulose làm vật liệu xây dựng và thức ăn Động vật nhai lại sử dụng vi sinh vật cộng sinh để tiêu hóa cellulose Con người không thể tiêu hóa cellulose, nhưng nó là nguồn chính của chất xơ không hòa tan, ảnh hưởng đến sự hấp thụ chất dinh dưỡng

Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chu i dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose Các chu i cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm M i chu i có nhiều nhóm -OH tự do, vì vậy giữa các sợi

ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm -OH của chúng Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose [32]

Bằng phương pháp phân tích sử dụng tia rơn-ghen (tia X), người ta đã tìm ra cấu trúc của cellulose trong tế bào thực vật có dạng sợi Đơn vị nhỏ nhất của cellulose có đường kính vào khoảng 3 nm Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi hay còn gọi là micelle M i micelle thường có khoảng 60 phân

tử cellulose, có đường kính từ 10 - 40 nm, dài 100 – 40 000 nm Các micelle này hợp lại thành từng bó sợi to hơn nằm đan xen vào nhau có thể

quan sát được dưới kính hiển vi quang học Các bó sợi cellulose liên kết với lớp polysaccharide trong thành tế bào thực vật tạo nên một phức hệ bền vững đóng vai trò như lớp kết dính sinh học trong thành tế bào thực vật (Hình 1.2) [28]

Hình 1.2 Mô hình sự sắp xếp c c chu i cellulose trong thành tế ào

Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase [6]

1.1.2 Hệ enzyme cellulase

Hình 1.3 Quá trình phân giải cellulose của cellulase

Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo

ra sản phẩm đơn phân glucose cung cấp cho công nghiệp lên men Nguồn thu enzyme cellulase lớn nhất hiện nay là từ vi sinh vật

Quá trình phân giải cellulose bởi vi sinh vật là một trong những chu trình quan trọng nhất của tự nhiên Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp cellulase [24]

Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường β-glucose Theo nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân hủy dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm ba enzyme là Exo-β- (1,4)-glucanase hay enzyme C1, Endo-β-glucanase hay endocellulase còn gọi

là enzyme CMC–ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase:

Exo-1,4-gluconase giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên cellulose

và định hình hoặc cellulose đã bị phân giải một phần Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ ràng nhưng khi có một endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt, enzyme tác dụng mạnh lên cellodextrin Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose [32]

Hình 1.4 Cấu trúc hông gian của cellulase

β-1,4-glucosidase thủy phân cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của chu i tăng lên

Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase,

và β-glucosidase hay có các tài liệu nói đến hai enzyme chính của phức hệ enzyme này là enzyme Cl và enzyme Cx hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose

 Dạng 1 (Cx1): Endo-β-1,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4)

 Dạng 2 (Cx2): Exoglucanase, gồm 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91)

 Dạng 3 (E4) là β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) hay còn gọi là Cellobiase

 Enzyme Cx có hai loại: endo β-1,4-glucanase (Cx1) và exo β-1,4- glucanase (Cx2)

 Enzyme Cl có khả năng phân giải (thủy phân) sợi cellulose tự nhiên,

có tính đặc hiệu không rõ ràng do đó cũng chưa xác định được tên hệ thống của nó

Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chu i cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase) [23]

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulose trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Hình 1.5 Hình ảnh cấu trúc phân tử của một số cellulase

Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase

Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose

Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo

3 giai đoạn chủ yếu sau:

Trong giai đoạn thứ nhất, dưới tác dụng của tác nhân C1, cellulose bị thủy phân thành cellulose hòa tan

 Trong giai đoạn thứ hai, cellulose hòa tan sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose

 Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme ß-1,4-glucosidase (hay cellobiase, EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose

Ứng dụng của enzyme cellulase

Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng mạnh mẽ trong các ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất bia rượu, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp dệt, sản xuất bột giặt, sản xuất giấy, trong nông nghiệp,

Trong công nghiệp thực phẩm ứng dụng trước tiên của cellulase là dùng

nó để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo, gạo, chè, các loại tảo biển,…

Cà phê Việt Nam chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp khô, cho chất lượng cà phê không tốt Để nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượng thâm mâu, làm giảm bớt chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ Khi sử dụng chế phẩm

A niger có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy, lượng cà phê được bóc

vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme va hiệu suất bóc vỏ khá cao [5]

Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase sẽ làm tăng chất lượng Agar-Agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được phế phẩm có cellulase hoạt độ cao

Ngoài ra, cellulase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì,

bánh bisqui và thực phẩm chức năng Cellulase từ Humicola insolens được

ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ

Cellulase từ T reesei, A niger được ứng dụng trong sản xuất

fructooligosaccharide Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) được sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn Các phế phụ phẩm

nông nghiệp như: lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất các oligosaccharide Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc [38]

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâu nghiền bột, tẩy trắng có vai trò rất quan trọng Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượng cao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền để tách riêng các sợi g thành bột mịn gặp nhiều khó khăn

Glucanase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20 - 40% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Đồng thời xử lý glucanase trước khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ ngoài của g , làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong g , tăng hiệu quả khử lignin Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, glucanase được sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh [39] Trong công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất chế phẩm vi sinh Rác thải

là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả Enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng lượng khác

Sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các phế thải thành sản phẩm có ích là một hướng quan trọng trong xử

lý chống ô nhiễm môi trường Trong nhiều năm qua trên thế giới và cả ở Việt Nam, các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất

1.2 Sơ lƣợc về các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose

1.2.1 Vi khuẩn

Cellulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật Quá trình phân giải cellulose bởi vi sinh vật là một trong những chu trình quan trọng nhất của tự nhiên Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp cellulase

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải cellulose và khả năng phân giải cellulose của chúng Các vi sinh vật phân giải cellulose trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn chủ yếu được phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ như bò, cừu, dê, và côn trùng như bọ cánh cứng, mối Ngoài ra chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước thải [34]

Vi khuẩn phân giải cellulose gồm một số loại đã định danh như:

Clostridium sp., Bacteroides sucinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter

Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum Haematophilum, Kaistia adipata,

Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, và Pseudomonas nitroreducens Các loài

này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kỵ khí, chúng được phân lập chủ yếu từ ruột của những loài động vật sử dụng g làm nguồn thức ăn [34] Trong lòng đất người ta cũng phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí như

Brevibacllus, Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus [25].

Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã được nghiên cứu là có khả năng sinh

tổng hợp cellulase mạnh như Acidothemus cellulobuticus, Bacillus pumilis,

Cellulomonas flavigena, C udai, Pseudomonas fluoressens Không chỉ có các

vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp

cellulase mạnh như Clostridium

1.2.2 Xạ khuẩn

Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên ADN của xạ khuẩn rất giàu G+C chiếm 57 - 75 % [29] Chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô Xạ khuẩn còn được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại

kháng sinh như: streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin Ngoài

ra, xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng

như trong nông nghiệp Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây

cũng là vi sinh vật sản sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu Một số loài

đáng chú ý thuộc giống nay như: Streptomyces reticuli, Streptomyces

drozdowiczii, Streptomyces lividans, Streptomyces cellulosae, Streptomyces

Actimimyces coelicolor; Streptomyces flavochromogenes, Streptomyces Sulfureus [26]

Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương, Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khả năng phân

vi khuẩn Một số chủng nấm như: Acremonium spp., Chaetomium spp.,

Phanerochaete chrysosporium, Fusariumsolani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy

cellulose ở nhiều môi trường khác nhau [36]

Nấm mốc là một trong những đối tượng VSV có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhất Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi

Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã được nghiên cứu là

có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh như: Aspergillus

niger, A flavus, A fumigatus, A terreus [34]

Các loài nấm mốc có khả năng sinh nhiều cellulase thuộc các giống

Allernaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium Chúng

được tách ra từ đất xung quanh vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn

và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose Ngoài ra các

chủng nấm lớn thuộc lớp Basidomycetes cũng được đánh giá có khả năng sinh

cellulase mạnh [36]

1.3 Một số nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong phân giải cellulose

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về

vi sinh vật phân hủy cellulose và khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase phân hủy cellulose từ vi sinh vật Các nghiên cứu về vi sinh vật đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chế phẩm từ vi sinh vật có hiệu lực phân giải hợp chất hữu cơ cao, nhằm tạo ra các chế phẩm sinh học thân thiện với môi trường, mang lại nhiều lợi ích kinh

tế trong đời sống sản xuất [7]

Một số VSV đã được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều về khả năng phân giải cellulose được thể hiện bảng 1.1

Act.diastaticus Act roseus Act.griseus Act.melamocylas Act.coelicolor Act.candidus Act.chromogenes Act hygroscopicus Act.griseofulvin Act.ochroleucus Act.thermofulcus Act.xanthostrums Thermonospora curvata

Preudomonas Fluorescens B.megaterium B.mensenteroides Clostridium sp

Acetobacter xylinum

Vi khuẩn dạ cỏ Ruminoccus albus Ruminobacter parum Bacteroides

Amylophillus sp Clos.butiricum Clos.locheheadil Cellulosemonas

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải cellulose và khả năng phân giải cellulose của chúng Các vi sinh vật phân giải cellulose trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn chủ yếu được phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ như bò, cừu, dê, và côn trùng như bọ cánh cứng, mối [41] Ngoài ra chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước thải [18]

Trước đây có nhiều nhóm tác giả nghiên cứu về vi sinh vật phân giải cellulose như: Tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase và tính sạch, đánh giá tính chất lý hóa

của cellulase từ chủng penicillium sp [6]

Phạm Thị Ngọc Lan và cs, cũng đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn

được một số chủng xạ khuẩn ưa ẩm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh nhất [8]

Nguyễn Xuân Thành và cs, (2004) đã phân lập tuyển chọn được 5

chủng vi sinh vật (VK1, VK2, N1, N2, N3) có sức sống cao và khả năng cạnh tranh lớn, khả năng thích ứng pH rộng để làm giống sản xuất chế phẩm vi sinh vật phân hủy phế thải mùn mía [15]

Trần Thị Ngọc Sơn và cs, (2010) đã phân lập được 40 chủng nấm

Trichoderma sp từ các mẫu đất đại diện cho hệ thống canh tác lúa 2 vụ, lúa 3

vụ, lúa mía ở Đồng Bằng Sông Cửu Long bao gồm Cần Thơ, Hậu Giang, Kiên Giang và An Giang từ vụ đông xuân 2008 - 2009 để nghiên cứu khả năng phân hủy rơm rạ [14]

Phạm Quang Thu và Nguyễn Thị Thuý Nga (2009) đã phân lập được

30 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân và tuyển chọn được 15 chủng

có hiệu lực phân giải lân rất cao đường kính vòng phân giải lân cao nhất (>22mm) Trong đó có 3 chủng P1.1, P1.4, PGLRH3 sinh trưởng tốt nhất trên môi trường nước chiết khoai tây có bổ sung một số nguyên tố khoáng, có thể ứng dụng 3 chủng này để sản xuất phân bón vi sinh h n hợp [16]

Nguyễn Thị Thuý Nga (2010) đã phân lập được 25 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose trong đó có 10 chủng hiệu lực mạnh đường kính vòng phân giải >15 mm và 5 chủng hiệu lực rất mạnh đường kính vòng phân giải > 20mm Trong 5 chủng đó có 2 chủng ĐT2 và ĐV2 đường kính >25 mm,

có thể ứng dụng 2 chủng này để sản xuất phân bón vi sinh h n hợp [10]

Theo Nguyễn Thị Thúy Nga và cs, (2015) đã phân lập được 24 chủng

vi khuẩn phân giải cellulose trong đó tuyển chọn 8 chủng có hiệu lực phân giải cellulose khá và mạnh với đường kính vòng thủy phân lớn hơn 25mm bao gồm các chủng M1.1, M5.2, M5.3, M5.4, X7, X3, X1, X10 chiếm khoảng 33,0% [9]

Theo Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp (2011) đã phân lập vi khuẩn phân giải cellulose trong đất trồng lúa và dạ cỏ bò nhằm sử dụng phân giải rơm rạ và rác hữu cơ thành phân hữu cơ Nhóm tác giả đã phân lập được

96 dòng vi khuẩn từ đất trồng lúa và 4 dòng vi khuẩn (Q4, Q5, Q8 và Q9) từ dịch dạ cỏ của bò Các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng thủy phân CMC [13]

Hoàng Quốc Khánh và cs, (2003), đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A niger NRRL-363 Qua nghiên cứu

tác giả đã tìm ra được một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và chất thải công nghiệp như mật rỉ đường [5]

Theo nghiên cứu của Nguyễn Danh (2009) đã phân lập từ vỏ cà phê ở Gia Lai kết quả thu được 115 chủng xạ khuẩn ưa nhiệt có khả năng phân giải cellulose với tỷ lệ chủng phân giải rất mạnh chiếm 55,7% trong đó tác giả đã

chọn được 02 chủng xạ khuẩn ưa nhiệt M48, M63 có khả năng phân giải cellulase mạnh với kích thước vòng phân giải 36,5 - 38,5 mm [2]

Theo Lê Việt Hà và Lê Văn Tri (2006) đã phân vi sinh vật phân hủy cellulose từ đất và bãi thải của các nhà máy đường kết quả thu được 02 chủng

vi khuẩn phân hủy cellulose chịu nhiệt (ký hiệu X1, Đ3), 03 chủng xạ khuẩn

ưa ẩm (kí hiệu XK1, XK13, XK18), 2 chủng nấm mốc (ký hiệu M5, M3) [3]

Lê Văn Nhượng và Nguyễn Lan Hương (2001), đã phân lập tuyển chọn được 11 chủng nấm sợi, 7 chủng vi khuẩn, 6 chủng xạ khuẩn có khả năng phân hủy cellulose cao [11]

Mai Thi, Nguyễn Hữu Hiệp và Dương Ngọc Thúy (2017) đã phân lập

và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy cellulose từ

ruột của sùng (Holotrichia parallela) và trùn đất (Lubricus terrestris) 51

dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose đã được phân lập, bao gồm 15 dòng phân lập từ tỉnh Hậu Giang và 36 dòng phân lập từ tỉnh Sóc Trăng Đa

số các dòng vi khuẩn phân lập có dạng hình que, có khả năng chuyển động, khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng bìa nguyên và độ nổi mô Khảo sát khả năng phân hủy cellulose của vi khuẩn cho thấy có 25 dòng vi khuẩn phân lập hoạt tính enzyme cellulase Đặc biệt, 3 dòng vi khuẩn CS2, CH8 và TS3 có

hoạt tính enzyme cellulase mạnh được nhận diện theo thứ tự là Bacillus

cereus strain L5, Bacillus flexus strain KJ1-5-910 và Bacillus subtilis strain

168 [17]

Trần Bảo Trâm và cs, (2015) đã phân lập được 05 vi khuẩn có hoạt

tính phân giải cellulose từ mẫu đất trồng sâm Ngọc Linh tại Quảng Nam (kí hiệu QN1, QN2, QN3, QN4, QN5 với kích thước vòng phân giải đo được trên môi trường chứa cơ chất CMC (0,1%) tương ứng đạt:10, 11, 22, 7, 22 mm), hoạt tính cellulase đạt lần lượt là 1,31; 1,23; 2,99; 0,99; 2,51 U/ml Kết hợp nghiên cứu một số đặc điểm nuôi cấy/sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rARN đã xác định vị trí phân loại của các vi khuẩn phân lập được như

sau: QN1 và QN4 thuộc chi Pseudomonas; QN2, QN3 thuộc chi Bacillus; QN5 thuộc chi Roseomonas [19]

Nguyễn Thị Thu Thủy, Nguyễn Tiến Long, Trần Thanh Đức (2018) đã phân lập được 18 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, tuyển chọn được chủng 6NH1 có khả năng phân giải cellulose mạnh nhất và được nhân sinh khối để sản xuất phân hữu cơ vi sinh Chủng 6NH1 phát triển tốt nhất khi được nuôi cấy ở 30°C và pH 6 – 7 Khi ủ rơm rạ với chủng vi khuẩn này, hàm lượng cellulose giảm 49,6 % so với đối chứng Phân tích di truyền phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA, chủng vi khuẩn 6NH1 đồng hình 99 % với loài

Bacillus amyloliquefaciens [18]

Nguyễn Lan Hương và Hoàng Đình Hòa (2003) đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày [4] Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam Nhiều chế phẩm

vi sinh trong đó chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã được nghiên cứu

và sản xuất để xử lý rác thải Trong đó, chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với đối chứng Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải được phối trộn

và bổ sung một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường [8]

Trần Thanh Phong và cs, (2021), đã phân lập được 28 chủng vi khuẩn

và 7 chủng nấm đều có khả năng phân giải CMC (carboxymethyl cellulose), trong đó các chủng có khả năng phân giải CMC đạt hiệu quả cao gồm 1BTL6

(61,7%), 3BTT6 (65,8%), 2BTNT5 (61,5%) và 1BTNT3 (60,4%) Thêm vào

đó, chủng 2BTNT5 có khả năng phân giải cellulose từ rơm tạo đường glucose (0,14 mg/L) sau 15 ngày [12]

3 2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ở Nga đã sử dụng nấm Trichoderma lignorum đã sấy khô đến độ ẩm

13% có chứa từ 1–50 đơn vị cellulase trên 1g để nuôi cấy một loại chế phẩm cellulase “Cellolignorin” Ngoài các enzyme C1, Cx còn có cả hemicellulase, pectinase và xylanase để phân hủy xylanase

Năm 2007, Hesham khi đi nghiên cứu về khả năng xử lý rơm rạ của 3

chủng xạ khuẩn thuộc chi: Micromonospora, Streptomyces và Nocardiodes

đã kết luận rằng việc bổ sung xạ khuẩn vào đống ủ đã giúp đẩy nhanh quá trình phân hủy rơm rạ làm giảm thể tích đống ủ; sau 3 tháng ở đống ủ có

bổ sung xạ khuẩn thể tích đống ủ giảm xuống 38,6-64% so với ban đầu, trong khi đó ở đống ủ đối chứng thể tích đống ủ chỉ giảm 13,6% so với trước khi ủ; việc bổ sung xạ khuẩn vào đống ủ còn làm tăng các chất hữu cơ (organic matter) lên 34,9% và hàm lượng nitơ lên 0,59 mg/g, trong khi ở đống

ủ đối chứng không bổ sung xạ khuẩn chất hữu cơ là 20% và hàm lượng nitơ chỉ đạt 0,21 mg/g [33]

Các chủng vi sinh vật phân giải hợp chất hữu cơ được bổ sung trong quá trình ủ đóng vai trò vi sinh vật khởi động để sản xuất nhanh phân hữu cơ

có từ nguồn phế thải giàu cellulose là Aspergillus, Trichoderma, Penicilium Cũng từ kết quả thực tiễn nghiên cứu và sản xuất [33], năm 1982 Gaus et al.,

đã đề xuất kỹ thuật bổ sung thêm quặng phosphat với liều lượng 5% và vi

sinh vật phân giải lân (Aspegillus, Bacillus….) với mật độ 106 – 108 CFU/gr

cùng với vi sinh vật cố định nitơ tự do Azotobacter nhằm nâng cao giá trị

dinh dưỡng của sản phẩm [21]

A Ulrich, G Klimke, S Wirth (2008), đã nghiên cứu khả năng phân

giải cellulose của các chủng phân lập rất khác nhau và không liên kết với phát sinh loài Mặc dù các nhóm RFLP phong phú được chỉ định cho các lớp

vi khuẩn khác nhau về mặt phát sinh loài (Actinobacteria,

Betaproteobacteria và Gammaproteobacteria), hoạt động phân giải

cellulolytic không thể được phân biệt một cách nhất quán Nói chung, khả năng phân giải cellulose của các chủng phân lập rất khác nhau và không liên kết với phát sinh loài [20]

Yamane et al (2002) đã xác định được trong môi trường nuôi cấy ở trạng thái rắn của Aspergillus oryzae 4 enzym phân giải cellulose Ba enzyme

chính đã được tinh chế và được đặt tên lần lượt là Cel-1, Cel-2 và Cel-3 Trọng lượng phân tử được xác định lần lượt là 62, 120 và 34 kDa Nhiệt độ tối ưu của hoạt động Cel-3 cao hơn nhiệt độ của các enzym khác Độ pH có tính axit phù hợp với hoạt động của Cel-1 hơn là đối với các enzym khác và Cel-3 ổn định hơn trong điều kiện axit so với hai loại còn lại Những đặc tính này và kết quả tìm kiếm tương đồng protein đối với trình tự axit amin đầu N cho thấy rằng Cel-1 và Cel-3 tương ứng với CelB và CelA endo-1,4-β-glucanase được phân lập trước đó Phân tích tính đặc hiệu của cơ chất cho thấy Cel-2 có khả năng là β-glucosidase [45]

G Rastogi et al (2009) đã điều tra sự đa dạng vi khuẩn phân giải

xenluloza ưa nhiệt (37°C) và ưa nhiệt (60°C) trong một mẫu đất phong hóa được thu thập từ lớp đất dưới bề mặt sâu (độ sâu 1,5 km) của mỏ vàng Homestake ở Lead, South Dakota, Hoa Kỳ Đặc trưng hóa học của mẫu bằng quang phổ huỳnh quang tia X cho thấy một lượng lớn các kim loại nặng độc hại như Cu, Cr, Pb, Ni và Zn Các cấu trúc cộng đồng phân tử được xác định bằng phân tích phát sinh loài của trình tự gen 16S rRNA lấy từ các mẫu cấy làm giàu đang phát triển với sự hiện diện của cellulose vi tinh thể là nguồn cacbon duy nhất Tất cả các phylotype được lấy từ các nền văn hóa làm giàu

đều được liên kết với Firmicutes Các mẫu cấy thuần khiết ưa nhiệt và ưa

nhiệt phân huỷ cellulose thuộc các chi Brevibacillus, Paenibacillus, Bacillus,

và Geobacillus đã được phân lập từ các mẫu cấy làm giàu, và các mẫu cấy

được chọn lọc đã được nghiên cứu về các hoạt động của enzyme [25]

Ở Nhật Bản đã phân lập tuyển chọn ra một h n hợp vi sinh vật có ích thuộc nhóm kỵ khí và hiếu khí bao gồm: Nấm men, vi khuẩn quang hợp, xạ khuẩn, vi khuẩn lactic, nấm lên men và chế tạo ra được một chế phẩm vi sinh hữu hiệu (EM) đã được chứng minh có tác dụng tốt ở nhiều lĩnh vực của đời sống và sản xuất như: trong trồng trọt, trong chăn nuôi, trong bảo vệ môi trường góp phần nâng cao chất lượng của đống ủ

Gautam et al (2012) đã điều tra chất thải rắn đô thị có chứa một lượng

lớn cellulase, là chất thải hữu cơ lý tưởng cho sự phát triển của hầu hết các vi sinh vật cũng như quá trình ủ phân của các vi sinh vật tiềm ẩn Trong nghiên cứu này, thử nghiệm màu đỏ Congo được thực hiện để sàng lọc vi sinh vật,

và sau khi lựa chọn được các chủng tiềm năng, nó tiếp tục được sử dụng để phân hủy sinh học chất thải rắn đô thị hữu cơ [40]

Ở Trung Quốc có nhiều nghiên cứu về việc phân lập và ứng dụng

chúng trong việc phân giải cellulose Wen–Jing Lu et al (2005) đã phân lập

được 5 chủng vi khuẩn ưa ẩm phân giải cellulose cao từ phế thải rau quả và

thân lá hoa thuộc giống Bacillus, Halobacillus, Aeromicrobium,

Brevibacterium [44]

Theo Sivakumaran (2014) phân lập được 21 chủng từ các nguồn vật liệu khác nhau như mùn cưa, lá rụng… Trong đó lựa chọn loài nấm có khả năng phân giải cellulose bằng phương pháp giấy lọc và phương pháp dùng

thuốc thử DNS Kết quả cho thấy Helminthosporium sp và Cladosporium

sp là hai loài có khả năng phân giải mạnh nhất sau đó là Trichoderma sp và

Aspergillus sp Trong một nghiên cứu khác trên rơm rạ, thu được 25 loài

khác nhau thuộc ngành Ascomycetes và Basidiomycetes, trong đó loài

Trichoderma harzianum có khả năng phân giải cellulose tốt nhất [43]

Theo nghiên cứu của V Makeshkumar và P.U Mahalingam (2011) chỉ

ra 6 loại nấm bệnh có khả năng phân giải cellulose (Fusarium sp.,

Aspergillus fumigatus, Cladosporium sp., Aspergillus flavus, Pyricularia sp

và Nigrospora sp.) đã được phân lập và thử nghiệm các chủng nấm phân giải xenlulo chiếu qua tia UV kết quả cho thấy nấm Fusarium phát triển tốt nhất

và có quá trình phân giải cellulose hiệu quả nhất [35] Do đó nghiên cứu đã

đề xuất sử dụng dòng nấm đột biến này để ủ chất thải hữu cơ khác nhau Bên

cạnh đó một số nhóm nấm khác như Trichoderma koningii, Sporotrichum

thermophila, Myceliophthora thermophila cũng được nghiên cứu cho thấy có

khả năng phân giải cellulose tốt [42]

Các loài nấm mốc có khả năng sinh nhiều cellulase thuộc các giống

Allernaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium Chúng

được tách ra từ đất xung quanh vùng rễ cây, từ các mẫu thực vật, từ than bùn

và các nguồn tự nhiên khác có quá trình phân hủy cellulose Ngoài ra các

chủng nấm lớn thuộc lớp Basidomycetes cũng được đánh giá có khả năng

sinh cellulose mạnh

Shengwei et al (2012) chỉ ra rằng ruột cua là nguồn hấp dẫn cho việc

nghiên cứu các vi sinh vật phân giải cellulase mới và các enzym hữu ích cho

quá trình phân hủy cellulase Ochrobactrum haematophilum, Kaistia adipata,

Devosia riboflavina, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii và Pseudomonas nitroreducens lần đầu

tiên được báo cáo là có tác dụng phân giải tế bào [27]

Behera et al (2014) phân lập vi khuẩn phân giải cellulose từ đất ngập

mặn của đồng bằng sông Mahanadi, Odisha, Ấn Độ và cũng để đánh giá khả năng sản xuất cellulase của chúng Kết quả cho thấy trong tổng số 15 vi khuẩn phân giải cellulose được phân lập dựa trên sự hình thành vùng hào quang của chúng trên môi trường thạch đông kết Khả năng thủy phân carboxymethylcellulose tối đa của chúng (giá trị HC) nằm trong khoảng từ

1,18 đến 2,5 cm Một thử nghiệm CMCase của mười lăm chủng phân lập này cho thấy hoạt tính enzym của chúng dao động từ 2,471 đến 98,253 U/ml /phút Từ đặc điểm hình thái và sinh hóa, các dòng phân lập được xác định là

Micrococcus spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp., Xanthomonas spp và Brucella spp [22]

Theo L Yang, et al (2014) đã cung cấp thêm thông tin về sự đa dạng

của vi khuẩn phân giải cellulose ở vùng cận nhiệt đới của Trung Quốc và

nhận thấy P terrae ME27-1 có khả năng phân giải cellulose cao Hoạt động

CMCase (2,08 U / mL) của ME27-1 đã được cải thiện gấp 12 lần trong điều kiện tối ưu để sản xuất CMCase Do đó, nghiên cứu này đã cung cấp thêm thông tin về sự đa dạng của vi khuẩn phân giải cellulose ở vùng cận nhiệt đới

của Trung Quốc và nhận thấy P terrae ME27-1 có khả năng phân giải

cellulose cao Hoạt động CMCase (2,08 U / mL) của ME27-1 đã được cải thiện gấp 12 lần trong điều kiện tối ưu để sản xuất CMCase [31]

Dantur et al (2015) cho thấy khả năng tìm ra các enzyme và vi sinh

vật phân giải cellulose hiệu quả từ ruột của ấu trùng côn trùng ăn mía và khả năng ứng dụng của chúng trong chế biến công nghiệp sinh khối mía như sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai Các nghiên cứu bằng kính hiển vi quét cho thấy sự gắn kết của các chủng cellulose với các chất nền mía khác nhau [30]

Chế phẩm “Biosin” của Mỹ được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy

bề mặt Aspergillus oryzae chứa 26 enzyme khác nhau trong đó có cellulase,

amylase, protease, pectinase

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Quy Nhơn

 Thời gian: Từ tháng 12/2021 - 6/2022

2.3 Phương ph p nghiên cứu

2.3 Phương pháp thu mẫu

Thu mẫu đất ở các bãi rác, đất rừng và một số vùng đất canh tác nông nghiệp khác nhau ở khu vực tại Phú Yên M i điểm thu 05 mẫu, sau đó trộn

05 mẫu thành 01 mẫu, ghi ký hiệu mẫu, ngày thu mẫu, nơi lấy mẫu, đặc điểm

của mẫu Độ sâu tầng đất thu mẫu là 0 – 15 cm Mẫu đất được lấy và bảo

quản theo phương pháp của Kim et al [37]

Bảng 2.1 Địa điểm hu vực thu mẫu

1 M1 Rừng phòng hộ Sơn Hòa (xã Sơn Hội, huyện

Sơn Hòa, Phú Yên) Đất rừng

2 M2 Hòa Quang Bắc, huyện Phú Hòa, Phú yên Đất rừng

3 M3 Thôn Phụng Tường, huyện Phú Hòa,

4 M4 Thôn Phú Thạnh, Xã Hòa Quang Nam, Phú

5 M5 Thôn Đại Phú, Xã Hòa Quang Nam, Phú Hòa,