Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây mẫu đơn (paeonia suffruticosa andr ) (năm thứ hai)

33 3.3 Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro...37 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Growmore đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro ngoài vườ

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM

TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY MẪU ĐƠN (Paeonia suffruticosa Andr.)

(NĂM THỨ HAI)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2020

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM

TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY MẪU ĐƠN (Paeonia suffruticosa Andr.)

(NĂM THỨ HAI)

Nguyễn Văn Toàn

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2020

PHÓ GIÁM ĐỐC

Hoàng Anh Tuấn

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

TÓM TẮT vii

THÔNG TIN CHUNG ix

PHẦN MỞ ĐẨU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cây Mẫu đơn 3

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Mẫu đơn 3

1.1.2 Dược tính và giá trị dược tính của Mẫu đơn 4

1.1.3 Một số bài thuốc của cây Mẫu đơn 5

1.2 Những nghiên cứu liên quan đến cây Mẫu đơn và cây cùng chi 5

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 5

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6

1.3 Đánh giá hiện trạng các công trình nghiên cứu 10

1.4 Các kết quả đạt được trong năm thứ 1 11

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nội dung nghiên cứu 14

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

2.3 Vật liệu nghiên cứu 14

2.3.1 Nguồn giống 14

2.3.2 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Thí nghiệm 5: Khảo sát môi trường ra rễ và tạo cây Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh 15

2.4.2 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của cây Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh 16

2.4.3 Thí nghiệm 7.1: Khảo sát một số loại giá thể ảnh hưởng đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro 17

2.4.4 Thí nghiệm 7.2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ phân bón Growmore đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro ngoài vườn ươm 19

2.5 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và các chỉ tiêu theo dõi 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng tạo cây Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh 21

3.2 Ảnh hưởng của môi trường khoáng dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của cây Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh 33

3.3 Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro 37

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ phân bón Growmore đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro ngoài vườn ươm 42

ii

3.5 Sản phẩm của nhiệm vụ 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

Kết luận 50

Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 54

iii

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng tạo cây

Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh 15

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây Mẫu đơn 18

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của NAA và IBA đến tỷ lệ tạo rễ của cây Mẫu đơn 22

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của NAA và IBA đến số lượng và chiều dài rễ của

cây Mẫu đơn 26

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của NAA và IBA đến chiều cao cây và số lượng lá cây Mẫu đơn 31

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của môi trường khoáng dinh dưỡng đến sinh trưởng của cây Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh 34

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro sau 2 tuần 38

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro sau 4 tuần 39

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ Growmore đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro sau 4 tuần 43

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây và củ hoa Mẫu đơn 3

Hình 1.2 Hạt Mẫu đơn sau 2 tuần khử trùng trên môi trường MS 11

Hình 1.3 Cây Mẫu đơn in vitro sau 45 ngày nuôi cấy 12

Hình 1.4 Đoạn thân Mẫu đơn sau 45 ngày nuôi cấy 12

Hình 1.5 Cụm chồi Mẫu đơn sau 45 ngày nuôi cấy 13

Hình 2.1 Chồi và cụm chồi Mẫu đơn 14

Hình 2.2 Chồi Mẫu đơn sau khi cấy chuyền sang môi trường ra rễ 16

Hình 2.3 Cây Mẫu đơn sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường WPM 17

Hình 2.4 Cây Mẫu đơn phát triển trong giá thể sau 4 tuần 18

Hình 2.5 Cây Mẫu đơn được huấn luyện 2 tuần trước khi ra ngoài vườn ươm 19 Hình 2.6 Cây Mẫu đơn được chuyển sang chậu giá thể 20

Hình 3.1 Chồi Mẫu đơn trong môi trường tạo rễ sau 4 tuần 23

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa nồng độ của NAA và IBA đến tỷ lệ tạo rễ của cây Mẫu đơn 24

Hình 3.3 Biểu đồ bề mặt thể hiện sự tương quan giữa nồng độ của NAA và IBA đến tỷ lệ tạo rễ của cây Mẫu đơn 25

Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa nồng độ của NAA và IBA đến số lượng rễ cây Mẫu đơn 28

Hình 3.5 Biểu đồ bề mặt thể hiện sự tương quan giữa nồng độ của NAA và IBA đến số lượng rễ cây Mẫu đơn 28

Hình 3.6 Rễ cây Mẫu đơn sau 12 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật 29

Hình 3.7 Biểu đồ bề mặt thể hiện sự tương quan giữa nồng độ của NAA và IBA đến chiều dài rễ cây Mẫu đơn 30

Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện sự tương quan giữa nồng độ của NAA kết hợp IBA đến chiều dài rễ cây Mẫu đơn 30

Hình 3.9 Mẫu đơn sau 12 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật 32

Hình 3.10 Cây Mẫu đơn trên các môi trường khoáng dinh dưỡng sau 8 tuần nuôi cấy 36

Hình 3.11 Biểu đồ so sánh tỷ lệ sống của cây Mẫu đơn trên các nền giá thể sau 2 tuần và 4 tuần 40

v

Hình 3.12 Biểu đồ so sánh số lượng lá của cây Mẫu đơn trên các nền giá thể

sau 2 tuần và 4 tuần 41

Hình 3.13 Cây Mẫu đơn trên các công thức giá thể sau 4 tuần 42

Hình 3.14 Cây Mẫu đơn được chuyển sang chậu lớn chứa giá thể 42

Hình 3.15 Cây con sau 2 tuần ngoài vườn ươm 44

Hình 3.16 Cây Mẫu đơn sau 4 tuần tưới 0,5 mg/L Growmore 44

Hình 3.17 Cây Mẫu đơn Cây Mẫu đơn sau 4 tuần tưới 1 mg/L Growmore 45

Hình 3.18 Cây Mẫu đơn ex vitro 45

Hình 3.19 Hạt Mẫu đơn sau khử trùng 47

Hình 3.20 Cây mẫu đơn nảy mầm sau 45 ngày 47

Hình 3.21 Đoạn thân Mẫu đơn mang chồi 48

Hình 3.22 Cụm chồi Mẫu đơn 48

Hình 3.23 Cây mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh trong môi trường ra rễ 48

Hình 3.24 Cây Mẫu đơn trong môi trường WPM 49

Hình 3.25 Cây Mẫu đơn ex vitro 12 tuần 49

GA3 Gibberellic acid

IBA Indole-3-butyric acid

WPM Woody Plant Medium (Lloyd and McCown 1980) TDZ 1 – phenyl – 3 (1,2,3 thiadiazol – 5 – yl)

IAA Indole – 3 – acetic acid

MS Murashige và Skoog

giống cây Mẫu đơn (Paeonia suffruticosa Andr.) hoàn thiện từ giai đoạn vô mẫu

hạt đến giai đoạn cây giống ngoài vườn ươm đạt tiêu chuẩn

Trong năm 2019, nhiệm vụ đã xây dựng thành công quy trình vi nhân giống Mẫu đơn từ giai đoạn khử trùng mẫu hạt tạo nguồn mẫu ban đầu đến giai đoạn nhân nhanh cụm chồi và thu được các kết quả như sau: Để khử trùng hạt Mẫu đơn, vỏ hạt đã được loại bỏ, sau đó sử dụng dung dịch Sodium hypochlorite 2,5% trong 10 phút để khử trùng hạt cho kết quả mẫu nhiễm 32,5%, tỷ lệ mẫu sống đạt 67,5% Hạt được cấy chuyền qua môi trường MS có

bổ sung 1 mg/L BA + 1 mg/L GA3 cho tỷ lệ hình thành cây đạt 63,33% Đoạn

thân mang chồi ngủ ở vị trí đốt thân thứ nhất của cây Mẫu đơn in vitro khi nuôi

cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/L BA có tỷ lệ bật chồi 61,67% Chồi Mẫu đơn đã tạo cụm chồi trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L BA và 0,25 mg/L NAA cho kết quả hệ số nhân là 3,58

Trong năm 2020, nhóm tác giả tiến hành thực hiện 3 nội dung thí nghiệm tiếp theo: sử dụng các phương pháp nuôi cấy mô thường quy tạo rễ trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật, khảo sát môi trường

dưỡng cây in vitro và giá thể trồng cây, chế độ chăm sóc cây con ngoài vườn

ươm Kết quả cây Mẫu đơn ra rễ, tạo cây hoàn cỉnh trên môi trường MS + 1 mg/L IBA + 1 mg/L NAA với tỷ lệ tạo rễ 88,89% Cây phát triển tốt trong môi trường khoáng WPM Cây Mẫu đơn được trồng trong giá thể phối trộn đất/ tro trấu/ phân trùn/ xơ dừa với tỉ lệ 1:1:1:2 trong 4 tuần, sau đó chuyển ra chậu và chăm sóc với chế độ phân Growmore nồng độ 0,5 mg/L mỗi tuần 1 lần cho tỉ lệ cây sống cao, đạt mức 71,67% Từ đó, nghiên cứu đã hoàn chỉnh được quy trình

viii

nhân giống in vitro cây Mẫu đơn, cùng với đưa ra được chế độ chăm sóc cơ bản

cho cây Mẫu đơn thích nghi ngoài vườn ươm

Kết quả trong 2 năm 2019 và 2020, đã xây dựng thành công quy trình

nhân giống in vitro cây Mẫu đơn (Paeonia suffruticosa Andr.)” hoàn chỉnh từ

giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu đến giai đoạn hậu nuôi cấy mô với tỷ lệ cây con sống sót ngoài vườn ươm đạt 71,67%

ix

THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Mẫu đơn (Paeonia

suffruticosa Andr.) (năm thứ hai)

Chủ nhiệm

Họ và tên: Nguyễn Văn Toàn

Ngày tháng năm sinh: 02/03/1983 Giới tính: Nam

Học hàm, Học vị: Cử Nhân Chuyên ngành: Sinh học

Năm đạt học vị: 2006

Chức danh khoa học: Năm được phong chức danh:

Tên cơ quan đang công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

Chức vụ: Trưởng phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật

Địa chỉ cơ quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp Hồ Chí Minh

Điện thoại cơ quan: 028 62646103

Thời gian thực hiện: 12 tháng

Kinh phí được duyệt: 181.146.301 đồng

2 Kết quả giai đoạn 1 (2019)

Trong năm 2019, nhiệm vụ đã xây dựng thành công quy trình vi nhân giống Mẫu đơn từ giai đoạn khử trùng mẫu hạt tạo nguồn mẫu ban đầu đến giai đoạn nhân nhanh cụm chồi và thu được các kết quả như sau: Khử trùng hạt Mẫu đơn: Vỏ hạt đã được loại bỏ, sau đó sử dụng dung dịch Sodium hypochlorite

x

2,5% trong 10 phút để khử trùng hạt cho kết quả mẫu nhiễm 32,5%, tỷ lệ mẫu sống đạt 67,5% Môi trường tái sinh cây: Môi trường MS có bổ sung 1 mg/L BA + 1 mg/L GA3 cho tỷ lệ hình thành cây đạt 63,33% Môi trường tạo chồi: Đoạn

thân mang chồi ngủ ở vị trí đốt thân thứ nhất của cây Mẫu đơn in vitro khi nuôi

cấy trên môi trường MS bổ sung 1 mg/L BA có tỷ lệ bật chồi 61,67% Môi trường nhân nhanh chồi: Môi trường MS có bổ sung 1 mg/L BA và 0,25 mg/L NAA cho hệ số nhân là 3,58

50 bình chồi Mẫu đơn in vitro

3 Nội dung

Các nội dung đã nghiệm thu năm 2019 :

Nội dung 1: Nghiên cứu quy trình khử trùng mẫu tạo nguồn mẫu in vitro

cây Mẫu đơn từ hạt

Nội dung 2: Khảo sát môi trường thích hợp hình thành cây Mẫu đơn từ hạt Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA và vị trí của đoạn thân mang

chồi ngủ đến khả năng tạo chồi và cụm chồi của đoạn thân cây Mẫu đơn in vitro

Nội dung 4: Khảo sát môi trường thích hợp nhân nhanh cụm chồi cây Mẫu đơn

Các nội dung thực hiện trong năm 2020:

Nội dung 5: Khảo sát môi trường ra rễ và tạo cây Mẫu đơn hoàn chỉnh

Thời gian thực hiện: từ 01/2020 đến 04/2020

xi

Nội dung 6: Khảo sát các loại môi trường khác nhau ảnh hưởng tới sự

tăng trưởng của cây Mẫu đơn in vitro

Thời gian thực hiện: từ 05/2020 đến 07/2020

Nội dung 7: Nghiên cứu thành phần giá thể và nồng độ phân bón thích

hợp để đưa cây con Mẫu đơn in vitro ra vườn ươm

Thời gian thực hiện: từ 08/2020 đến 11/2020

4 Sản phẩm của nhiệm vụ

Báo cáo phân tích với các số liệu, hình ảnh được thu thập, đánh giá và xử

lý thống kê

Quy trình nhân giống cây Mẫu đơn in vitro từ giai đoạn hạt đến giai đoạn

cây ngoài vườn ươm với đầy đủ thông số kỹ thuật (Xem mục 3.5, Trang 46)

200 cây Mẫu đơn ex vitro

1

PHẦN MỞ ĐẨU Tính cấp thiết

Cây Mẫu đơn là một trong những loại thuốc cổ truyền lâu đời nhất và được sử dụng rộng rãi nhất ở Trung Quốc Vỏ của rễ Mẫu đơn có thành phần hoạt chất chính là paeonolum, là một chất kháng vi khuẩn, giảm áp, chống tụ máu và xơ vữa hiệu quả (Xu 2002) Hiện nay ở nước ta cũng đang được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc Đông y chuyên trị các bệnh như làm giảm huyết áp, viêm ruột thừa, thanh nhiệt lương huyết, hoạt huyết hóa ứ, kháng viêm Bên cạnh đó, cây Mẫu đơn có hoa đẹp, màu sắc rất phong phú nên rất được ưa chuộng để trồng làm các loại hoa kiểng Do hoa lớn, màu sắc đa dạng, hình dạng đẹp mắt và có hương thơm, hoa Mẫu đơn đã được sử dụng nhưng một loài hoa cắt cành với số lượng lớn trên thế giới (Beruto và cộng sự, 2004) Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hạt cây Mẫu đơn cho năng suất dầu cao đến mức nó đã được đề xuất như một loại cây mới để sản xuất dầu ăn

Cây Mẫu đơn chủ yếu được nhân giống bằng hạt, chia, cắt, ghép và xếp lớp Tuy nhiên, các phương pháp nhân giống này đòi hỏi một lượng lớn vật liệu nhân giống và chỉ có thể được thực hiện trong mùa sinh dưỡng Thêm vào đó, phương pháp nhân giống truyền thống gặp một số vấn đề như thời gian sinh sản lâu, khả năng sản xuất hạt giống thấp của một số giống cây trồng quý

và sự phát triển kém, trạng thái miên trạng của hạt giống (Li và cộng sự, 1984) Những vấn đề này hạn chế việc thương mại và sản xuất công nghiệp của hoa Mẫu đơn trong khi nhu cầu ngày càng tăng Ngoài ra, phương pháp nhân giống truyền thống gặp hạn chế trong việc bảo tồn nguồn gen và sự phát triển của các giống mới (Li, 2007) Hơn thế nữa, ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa có nguồn cung cấp ổn định cho nguồn dược liệu Mẫu đơn, chủ yếu thu mua từ Trung Quốc, do đó cần có một vùng chuyên canh cho cây thuốc này nhằm đảm bảo nguồn dược liệu ổn định và chất lượng cho thị trường

Với phương pháp nuôi cấy mô, một lượng lớn cây con được tạo ra trong thời gian ngắn, đồng đều về chất lượng cũng như số lượng Phương pháp nuôi

2

cấy mô có những ưu điểm do không giới hạn về môi trường địa lý, thời tiết, phẩm chất cây mẹ tốt được di truyền cho cây con, có thể hình thành một lượng lớn cây con có chất lượng tốt trong một thời gian ngắn Với phương pháp này giúp thiết lập hệ thống công nghệ nhân giống nhanh chóng có thể tạo ra được rất nhiều cây giống chất lượng trong một thời gian ngắn, đảm bảo đủ khả năng cung cấp nguồn cây giống Đồng thời trong năm 2019, tại Trung tâm Ươm tạo Doanh

nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao đã thực hiện quy trình nhân giống in vitro

cây Mẫu đơn từ giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu đến giai đoạn nhân chồi cây mẫu đơn Để tiếp nối nghiên cứu của năm 2019, nhóm tác giả tiến hành thực

hiện nhiệm vụ khoa học cấp cơ sở “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Mẫu đơn (Paeonia suffruticosa Andr.) năm thứ 2” nhằm xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây Mẫu đơn hoàn chỉnh

Mục tiêu nhiệm vụ

Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây Mẫu đơn (Paeonia

suffruticosa Andr.)” hoàn chỉnh từ giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu đến giai

đoạn hậu nuôi cấy mô

Giới hạn nhiệm vụ

Do giới hạn về mặt thời gian nên nhiệm vụ chưa khảo sát thêm về các chế

độ chăm sóc cũng như các công thức giá thể phù hợp hơn cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Mẫu đơn trong điều kiện thời tiết nhiệt đới ẩm gió mùa

3

1.1 Tổng quan về cây Mẫu đơn

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Mẫu đơn

(Nguồn: Wikimedia.org)

Hình 1.1 Cây và củ hoa Mẫu đơn

Cây hoa Mẫu đơn (Paeonia suffruticosa Andr.) là loài hoa có nguồn gốc

xuất xứ Trung Quốc, hoa Mẫu đơn được thuần hóa và trồng như một giống cây hoa kiểng vào năm 1600 (Jiang 2000)

Vị trí phân loại:

Giới (regnum): Plantae

Bộ (ordo): Saxifragales

Họ (familia): Paeoniaceae

Chi (genus): Paeonia

Loài (species): Paeonia suffruticosa

Cây Mẫu đơn được trồng rộng rãi ở Trung Quốc (Li, 2000) Các loài hoang dã được phân bố chủ yếu ở Sơn Tây, Cam Túc, Hà Nam, Tứ Xuyên, Vân Nam và Tây Tạng (Wang, 2001) Gần như tất cả tám loài bản địa của cây hoa mẫu đơn là từ Trung Quốc; hiện nay có bốn nhóm lớn và gần 1.000 giống (Hồng

và Pan, 1999)

Mẫu đơn có chiều cao từ 1 – 2 mét, có khi cao đến 3 mét, phân cành nhánh nhiều Rễ phát triển thành củ Lá rộng bản, mọc đối thẳng đứng, hình trứng tròn, đầu lá có từ 3 đến 5 khía, cuống lá dài, co bộ toàn lục, bề mặt lá

4

xanh lục, mặt trái màu tro lục, có phấn trắng, trơn nhẵn không lông hoặc có lông mịn nhỏ Hoa lưỡng tính mọc đơn trên đầu cành, đường kính từ 10 đến 30 cm, nhiều nhị đực, toàn bộ bị hoa bàn bao vây, cánh nụ 5 màu lục, cánh hoa nguyên bản có từ 5 đến 6 cánh, trải qua thời gian di thực trồng một bộ phận nhị đực biến thành cánh hoa, hoa trở thành cánh kép, có đến 3, 4 tầng Số cánh hoa ít gọi là

"đa diệp", hoa có các màu sắc từ trắng, vàng, đỏ, phấn, lục, tím, tím than, nhung Quả lớn có vỏ dày, khi chín nứt ra, gọi là loại quả "cốt đột" Quả đầy lông mềm mịn, đến lúc chín quả nứt ra có chừng 5 – 15 hạt giống lớn hình móp méo không tròn 1.000 hạt cân đuợc khoảng 250 – 300 gram Hạt nảy mầm từ 60 – 90% Hoa nở vào tháng 5 – 7, có quả vào tháng 7 – 8

Điều kiện sinh trưởng: Hoa mẫu đơn do trong thời gian sinh trưởng kéo dài từ mùa xuân đến hè thu Cây phát triển tốt ở điều kiện khí hậu ôn đới, nhiệt

độ bình quân 15,7 oC, lượng mưa bình quân 610,2 mm; mùa đông không lạnh gắt, hè không nóng cháy, quanh năm mưa thuận gió hòa Đất thích hợp cho cây Mẫu đơn phải ở nơi có tầng đất sâu, dày, tơi xốp, màu mỡ, loại đất mềm thoát nước hoặc đất cát tốt; tầng đất mềm dẻo bên trên, dày độ 1 mét, bên duới tầng đất pha cát là loại đất phù hợp nhất Loại cây này không thích hợp với đất mặn, muối hoặc đất nóng

Do hoa lớn, màu sắc đa dạng, hình dạng đẹp mắt và có hương thơm, hoa Mẫu đơn đã được sử dụng nhưng một loài hoa cắt cành với số lượng lớn trên thế giới (Beruto và cộng sự, 2004) Cây Mẫu đơn được sử dụng trong lĩnh vực cây cảnh và y học

1.1.2 Dược tính và giá trị dược tính của Mẫu đơn

Vỏ rễ được gọi là "Đơn bì (Tiếng trung:danpi)", thường được sử dụng trong truyền thống Y học Trung Quốc với thành phần hoạt chất chính là paeonolum làm tan máu bầm, cải thiện mạch máu não cho người bị tai biến, giảm nguy cơ sơ hóa mạch máu não (Xu, 2002)

Thành phần chủ yếu trong Mẫu đơn tươi có một chất glucozit khi tiếp xúc với chất men có trong vỏ cây sẽ cho glucoza và paeonola là một chất phenola C-

9H10O3 Ngoài ra còn có acid benzoic, phytosterol Theo kết quả phân tích của

1.1.3 Một số bài thuốc của cây Mẫu đơn

Cây Mẫu đơn được biết đến với nhiều công dụng sử dụng trong các bài thuốc trị các bệnh như sốt, viêm ruột thừa cấp, huyết áp cao và xơ cứng mạch, trị chứng hư nhiệt, âm hư, sốt kèm xuất huyết, việm mũi dị ứng, một số trường hợp té ngã do chấn thương có tụ huyết dưới da hoặc nội tạng, các bệnh phụ khoa, mụn nhọt Cần chú ý khi sử dụng với liều dùng 6 – 16g, không nên dùng hoặc thận trọng đối với các trường hợp tỳ vị hư hàn, phụ nữ có thai, kinh nguyệt

ra nhiều

1.2 Những nghiên cứu liên quan đến cây Mẫu đơn và cây cùng chi

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào hoàn thiện quy trình nhân giống cây Mẫu đơn bằng phương pháp nuôi cấy mô Các cây giống được bày bán trên thị trường chủ yếu được nhân bằng phương pháp truyền thống

6

đạt 63,33% Đoạn thân mang chồi ngủ ở vị trí đốt thân thứ nhất của cây Mẫu

đơn in vitro được nuôi cấy trên môi trương MS có bổ sung BA 1 mg/L cho tỷ lệ

mẫu bật chồi đạt 61,67% Môi trường nhân nhanh cụm chồi mẫu đơn là môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/L và NAA 0,25 mg/L cho kết quả hệ số nhân chồi là 3,58 lần

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1965, nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Mẫu đơn được bắt đầu nghiên cứu bởi Partanen Đến năm 1969, Demoise và Partanen đã thành công tạo được

mô sẹo cây Mẫu đơn Dù vậy nhưng cho đến ngày nay các nghiên cứu về cây Mẫu đơn chỉ tập trung ở đánh giá khả năng kích thích tạo mô sẹo từ các cơ quan khác nhau của cây mẫu đơn (rễ, thân, hoa), bởi vì quá trình hình thành mô sẹo gặp khó khăn trong quá trình nuôi cấy dễ hóa nâu, khả năng nhiễm cao

Quy trình khử trùng được sử dụng phổ biến nhất là loại bỏ lớp vỏ sơ hóa bên ngoài của chồi hoặc nụ hoa sao đó rửa với vòi nước đang chảy tối thiểu 20 phút Sau đó chuyển đến một khay nhựa sạch có cồn 70% ngâm tiếp tục trong 30 giây sau đó rửa bằng nước cất vô trùng trong 2 phút Cách khác, ngâm mẫu chồi trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 8 phút và rửa bằng nước cất vô trùng trong 2 phút, lặp lại ba lần (Kong và Zhang, 1998; Li, 2004; Li và cộng sự, 1984)

Năm 2008, Wang công bố rằng khử trùng mẫu cây Mẫu đơn sử dụng HgCl2 0,1% ngâm trong thời gian 8 phút tốt hơn NaClO 5% được ngâm 6 – 14 phút, kết quả thu được tỉ lệ nhiễm 5,5% và tỉ lệ sống 88% Theo Wang (2007) cho rằng thời gian ngâm xử lý khử trùng của mẫu chồi (8 – 10 phút) lâu hơn thời gian khử trùng đối với thân cây (5 – 8 phút)

Nuôi cấy mô bằng phôi có thể tạo cây con trực tiếp do phôi sinh trưởng thành cây con trong ống nghiệm Cây con có thể tái sinh bằng 3 cách: cây con sinh trưởng trực tiếp từ phôi hợp tử, cảm ứng của cây con từ cụm chồi và cảm ứng của cây con từ somatic tế bào (He, 2006) Theo Raghavan (2003), nuôi cấy trực tiếp phôi tạo thành cây con giúp khắc phục tình trạng loạn sản, rút ngắn thời gian ngủ, cải thiện tỷ lệ nảy mầm và có thể khiến chồi nảy mầm sớm hơn Huang (1987), Zhou và cộng sự (2001) đã nuôi cấy phôi trưởng thành và thu

He và cộng sự (2006), cũng nhận thấy rằng môi trường khởi đầu, kiểu gen

và giai đoạn phát triển của phôi ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi trong môi trường thí nghiệm Phôi hình thành sau 65 ngày ra hoa của ba loài Mẫu đơn Nhật Bản (‘Lian He’, ‘Ba Qian Dai Chun’, và ‘Dao Jin’) cho tỷ lệ nảy mầm rất thấp (10%) Ngược lại, tủy lệ nảy mầm lên đến 71,6 % và 63,6% tương ứng với

phôi hình thành sau 90 ngày ra hoa (gần như trưởng thành) của Paeonia rockii

và Paeonia ostii (He, 2006)

Theo Kong và Zhang (1998) đã tái sinh chồi thành công, hình thành cây con trong điện kiện phòng thí nghiệm sử dụng môi trường MS có bổ sung thêm

BA 1 mg/L và Gibberellic acid (GA3) 0,5 mg/L dưới ánh sáng huỳnh quang trắng liên tục ( 1500 ~ 2000 µmol.m-2.s-1) tại 25 ± 2°C

Tian và cộng sự (2010) nghiên cứu sự hình thành chồi Paeonia lactiflora

trên nền môi trường MS bổ sung BA, TDZ, GA3 Kết quả thu được nồng độ BA

1 mg/L có hiệu quả hơn nồng độ 0,1 mg/L TDZ tạo chồi hiệu quả hơn BA, đạt 100% tạo chồi trên môi trường MS có bổ sung TDZ 0,1 – 3 mg/L Trong khi đó GA3 chỉ có tác dụng kéo dài thân

Zhang và cộng sự (2001), môi trường hình thành cụm chồi sử dụng môi trường MS (Murashige và Skoog 1962) chứa BA 0,5 - 1 mg/L và NAA 0,1 - 0,2 mg/L

Li và cộng sự (1984) nuôi cấy được cụm chồi từ các chồi nách Các cụm chồi này tiếp tục được nuôi cấy ở môi trường ½ MS bổ sung IBA 0,1 - 2,0 mg/L

để tạo ra rễ, tỉ lệ hình thành cây con là 66% Nghiên cứu này cho thấy IBA kích thích rễ tốt hơn IAA và NAA

8

Franc (1996) công bố rằng hệ số nhân chồi phải lớn hơn 2 để đảm bảo

tính thương mại trong các hợp đồng đặt hàng nhân giống in vitro Mẫu đơn

Constantine (1986) đạt hệ số nhân 2,5 – 3 Erna và cộng sự (2001) nuôi cấy chồi trong môi trường MS bổ sung agar 7 g/L, nicotine acid 0,5 mg/L, thiamine 0,1 mg/L, pyridoxine 0,5 mg/L, glycine 2 mg/L, myoinositol 100 mg/L, sucrose 30 g/L, BA 1 mg/L, NAA 0,2 mg/L, hệ số nhân chồi đạt 4,75 sau 5 tuần

Chen (2005) nhân nhanh chồi Mẫu đơn trên môi trường ¼ MS bổ sung IAA 3,0 mg/L và IBA 3,0 mg/L, đường 30 g/L hoặc ½ MS và WPM bổ sung

Ca2+ và IAA 3,0 mg/L cùng với 40 g/L đường Ở giai đoạn ra rễ, sử dụng IBA từ 1,0 - 3,0 mg/L hoặc IAA 1,0 – 3,0 mg/L để kích thích ra rễ Tỷ lệ ra rễ cao nhất khi sử dụng đồng thời IBA và IAA ở cùng nồng độ 1,0 mg/L, có 83% mẫu ra rễ

Ở giai đoạn sau của sự phát triển rễ, đường saccarose là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chiều dài rễ Mức độ rễ cũng như số lượng và chiều dài rễ tốt hơn khi

bổ sung đường được áp dụng từ 20 đến 40g; rễ phát triển kém nếu bổ sung saccarose 10 g/L

Beruto và cộng sự (2004) đã kích thích chồi in vitro cây Mẫu đơn “Old Pink” ra rễ bằng cách bổ sung IBA, nuôi cấy trong 5 tháng Cây in vitro tiếp tục

được cấy chuyền sang môi trường MS bổ sung than hoạt tính 0,3 g/L Tỷ lệ ra rễ kém (hơn 50%) và số rễ trung bình thấp (1 – 2 rễ) Sự thích nghi của cây con

được thực hiện bằng cách chuyền cây in vitro vào bình thủy tinh 500 mL chứa

giá thể đã được tiệt trùng, điều kiện nuôi cấy được duy trì tương tự như phòng nuôi cấy trong 4 tuần Sau đó, các cây con được chuyển sang trồng trong điều kiện nhà kính (nhà kính không được sưởi ấm) với tỷ lệ sống sót là 80 ± 10% Hệ thống rễ phát triển tốt sau 4 tháng và sự phát sinh chồi mới được ghi nhận ở tháng thứ tám

Năm 2005, An đã khảo sát ảnh hưởng của BA và IAA đến chồi Kết quả thu được cho thấy BA và IAA đều có ảnh hưởng đáng kể đến các chồi non BA

ở nồng độ thấp (1 mg/L) có ảnh hưởng kéo dài thời gian sinh trưởng của chồi nhưng không có khả năng tái sinh chồi Nồng độ BA cao hơn đã được thử nghiệm cho một lần cấy chuyền, tuy nhiên, chồi non được hình thành cụm và

9

mất nhiều thời gian hơn để cụm này phát triển thành các chồi riêng lẻ IAA cũng

có ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ tái tạo; nồng độ tối ưu của IAA để tái tạo chồi

là từ 0,1 đến 0,4 mg/L Tỉ lệ tái sinh chồi tối ưu khi kết hợp hai chất BA 3 mg/L với IAA 0,2 mg/L, có sự tương tác giữa BA và IAA đến tỷ lệ tái sinh chồi Sử dụng nền môi trường ½ WPM, để nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh

trưởng đến rễ cây con trong điều kiện in vitro, thay đổi nồng độ NAA và IBA bổ

sung vào môi trường nuôi cấy cho thấy IBA và NAA tác động đến sự ra rễ IBA kích thích ra rễ sớm và tốt hơn so với NAA Nồng độ lý tưởng của IBA để kích thích rễ là 2,0 mg/L, tạo rễ ở 60% cây con Nồng độ tối ưu của NAA là 1,0 mg/L mặc dù tỷ lệ cảm ứng chỉ là 45% Mở bình nuôi cây trong 3 – 5 ngày trước khi chuyển sang trồng trong hỗn hợp giá thể gồm đất, đá trân châu, mùn cưa, phân chim và phân ngựa với tỷ lệ phối trộn 2: 2: 3: 2: 1, ở nhiệt độ 25 ± 1 oC, độ ẩm trên 80% Tỷ lệ cây con sống sót hơn 80%

Nghiên cứu của Kong và Zhang (1998) đã chỉ ra rằng mùn được sử dụng làm giá thể cho tỷ lệ sống cao hơn khi trồng trong vermiculite (tương ứng với 48% và 36%)

Xu (2002) đã trồng cây Mẫu đơn “Feng Dan” trong vermiculite và perlite (1: 2) vào tháng 9 – 11 Tỷ lệ sống đạt 71,43% sau hai tháng

Cây Mẫu đơn “Qing Long Wo Mo Chi” và “Zi Yao Tai” in vitro được

huấn luyện dưới màn chắn năng lượng mặt trời phân tán ánh sáng trong 15 – 20 ngày Sau đó cây được chuyển sang trồng trong giá thể Tỷ lệ sống sót của

“Qing Long Wo Mo Chi” trong vermiculite và đá trân châu (1: 1) là 66,7% trong khi tỷ lệ sống sót của ‘Zi Yao Tai’ ở vermiculite và perlite (1: 2) đạt 81,3% (Li, 2004)

Li và cộng sự (2006) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của thành phần giá thể

đến sự sống sót của cây Mẫu đơn in vitro trong hai loại giá thể: vermiculite và

đất cỏ (1:1) hoặc than bùn phối trộn với đá trân châu (1:1) Với điều kiện nhiệt

độ được duy trì khoảng 20oC, sau 30 ngày, tỷ lệ sống sót là không đáng kể ở cả hai nghiệm thức mặc dù chiều cao cây con lần lượt là 18,4 cm và 11,5 cm

10

Cây Mẫu đơn “Wu Long Peng Sheng” hoặc “Tai Ping Hong” trồng vào hỗn hợp rêu than bùn và vermiculite (3: 1), sau 30 ngày, tỷ lệ sống là 32,4% hoặc 10%, tương ứng, trong khi tỷ lệ sống sót của cây con trong đá trân châu và

vermiculite (3: 1) chỉ còn 10% sau 30 ngày (He, 2009) Khi màu sắc của lá in

vitro gần như xanh như cây trồng ngoài đồng ruộng, cây con in vitro sống sót dễ

dàng và thời gian nuôi cấy trong môi trường cảm ứng rễ càng dài thì khả năng sống sót của cây con càng cao

Tuy nhiên, một nghiên cứu được thực hiện bởi Wang (2008) chỉ ra rằng sau 50 ngày chỉ có 25% cây con sống sót sau khi chuyển Mẫu đơn “Wu Long Peng Feng” vào hỗn hợp cỏ, đá trân châu và vermiculite (1: 2: 1), mặc dù màu sắc của lá ở những cây sống sót vẫn bình thường

Năm 2016, Wen và cộng sự đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh trong môi trường bổ sung IBA Sau đó cây được chuyển sang môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng trong 2 tháng Số rễ thu được tăng lên 4 – 6 rễ/ cây,

mỗi rễ dài 4 – 6 cm Cây con được trồng thử nghiệm cây con in vitro hoàn chỉnh

trên nền giá thể vermiculite/ than bùn/ đá trân châu Tỷ lệ cây con sống sót chỉ đạt 40,1% sau 4 tháng

1.3 Đánh giá hiện trạng các công trình nghiên cứu

Tóm lại, cây Mẫu đơn chủ yếu được nhân giống bằng phương pháp truyền thống từ hạt và chiết cành Phương pháp nhân này gặp một số vấn đề như thời gian sinh sản lâu, khả năng sản xuất hạt giống thấp và cần phá vỡ miên trạng hạt mới có thể nảy mầm (Li và cộng sự, 1984) Những vấn đề này hạn chế việc thương mại và sản xuất công nghiệp của hoa Mẫu đơn trong khi nhu cầu ngày càng tăng Vì thế, đã có những nghiên cứu về vi nhân giống cây Mẫu đơn Ưu điểm của phương pháp nhân giống này là không giới hạn về môi trường địa lý, thời tiết, phẩm chất cây mẹ tốt được di truyền cho cây con, có thể hình thành một lượng lớn cây con có chất lượng tốt

Trong các quy trình nhân giống in vitro cây Mẫu đơn đã được công bố, ở

giai đoạn ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh, các tác giả sử dụng các môi trường MS, ½

MS, WPM, ½ WPM bổ sung thêm IBA hoặc NAA ở các nồng độ khác nhau

11

NAA thường được sử dụng ở nồng độ từ 0,2 – 3 mg/L và IBA được sử dụng ở các nồng độ từ 1 – 3 mg/L Tuy nhiên, không có sự đồng nhất giữa các nghiên cứu, do đó chưa xác định được môi trường và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng

thực vật phù hợp cho sự ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cây Mẫu đơn in vitro

Ở giai đoạn hậu nuôi cấy mô, cây được trồng trong giá thể ở điều kiện khí hậu ôn đới Nhưng chưa có một công trình nghiên cứu nào về sự sinh trưở ng

của cây con Mẫu đơn in vitro ngoài vườn ươm trong điều kiện khí hậu nhiệt

đới được công bố

Hướng đi của nghiên cứu này nhằm khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp NAA đến sự ra rễ, giá thể và nồng độ phân bón growmore thích hợp cho

sự sinh trưởng và phát triển trong điều kiện tự nhiên của thành phố Hồ Chí Minh

1.4 Các kết quả đạt được trong năm thứ 1

Khử trùng hạt Mẫu đơn

Chọn các hạt Mẫu đơn to, đều, thời gian thu hoạch không quá 6 tháng để khử trùng tạo nguồn mẫu ban đầu Hạt sau khi tách lớp vỏ ngoài được khử trùng bằng dung dịch Sodium hypochlorite 2,5% trong 10 phút cho kết quả khử trùng tốt nhất Tỷ lệ mẫu nhiễm 32,5%, tỷ lệ mẫu sống đạt 67,5%

Hình 1.2 Hạt Mẫu đơn sau 2 tuần khử trùng trên môi trường MS

Tạo cây Mẫu đơn in vitro từ hạt

Nuôi cấy hạt cây Mẫu đơn trên môi trường nuôi cấy bán rắn Môi trường nuôi cấy: môi trường MS + 1 mg/L GA3 + 1 mg/L BA + 30 g/L đường + 8 g/L agar, pH = 5,8 Tỷ lệ hình thành cây đạt 63,33%

Hình 1.4 Đoạn thân Mẫu đơn sau 45 ngày nuôi cấy

Nhân nhanh chồi Mẫu đơn in vitro

Những chồi khỏe mạnh đạt tiêu chuẩn được cấy chuyền qua môi trường nhân chồi để nhân nhanh số lượng chồi cây Mẫu đơn Môi trường nuôi cấy: môi trường MS + 1 mg/L BA + 0,25 mg/L NAA + 30g/L đường + 8 g/L agar, pH = 5,8 Hệ số nhân 3,58

13

Hình 1.5 Cụm chồi Mẫu đơn sau 45 ngày nuôi cấy

14

2.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật

NAA, IBA đến khả năng tạo cây Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh

Nội dung 6: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng dinh dưỡng cho sự

sinh trưởng của cây Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh

Nội dung 7: Khảo sát ảnh hưởng của một số loại giá thể và nồng độ

growmore đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro ngoài vườn ươm

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm thực hiện: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao - Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2020 đến tháng 12/2020

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Nguồn giống

Các mẫu chồi Mẫu đơn đạt chiều cao từ 1,5 – 2 cm, có từ 2 – 3 lá ở giai đoạn nhân nhanh cụm chồi năm thứ nhất

Hình 2.1 Chồi và cụm chồi Mẫu đơn 2.3.2 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị

Máy cất nước 1 lần

Máy đo pH cầm tay Hanna 90993

Cân phân tích – AUX-220g

Cân kỹ thuật – CPA 3202S

15

Tủ cấy vô trùng – SCBN 1200

Nồi hấp tiệt trùng – HV 110

Hóa chất và các dụng cụ sử dụng cho lĩnh vực Công nghệ Tế bào Thực vật

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thí nghiệm 5: Khảo sát môi trường ra rễ và tạo cây Mẫu đơn in vitro

hoàn chỉnh

Phương pháp tiến hành: Các mẫu chồi đạt chiều cao từ 1,5 – 2 cm, có từ 2 – 3

lá được cấy chuyền vào môi trường MS có bổ sung 30 g/L đường, 8 g/L agar, IBA và NAA với các nồng độ theo bố trí thí nghiệm (Bảng 2.1) Điều kiện nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 2 oC, thời gian chiếu sáng 12h/ ngày, cường độ chiếu sáng

2000 lux, mẫu được theo dõi trong 12 tuần Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 20 phút Thời gian tiến hành thí nghiệm được thực hiện từ 01/2020 – 04/2020

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng tạo cây

Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh

Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên 2 yếu tố (yếu tố A là nồng độ Iba, yếu tố B là nồng độ NAA) với ba lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 5 bình, mỗi bình có 3 mẫu chồi, thể tích môi trường 65 mL, bình nuôi cấy 500 mL Tổng số mẫu của thí nghiệm là 405 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu hình thành rễ (%) = 𝑆ố 𝑚ẫ𝑢 𝑟𝑎 𝑟ễ

𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑚ẫ𝑢

Số rễ/cây (rễ)

Chiều dài rễ (cm) được đo từ cổ rễ đến chóp rễ

Chiều cao cây (cm) đo từ cổ rễ đến đỉnh chồi ngọn

16

Số lá/cây (lá)

Hình 2.2 Chồi Mẫu đơn sau khi cấy chuyền sang môi trường ra rễ

2.4.2 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng dinh

dưỡng cho sự sinh trưởng của cây Mẫu đơn in vitro hoàn chỉnh

Phương pháp tiến hành:

Cây Mẫu đơn in vitro đạt chiều cao từ 2,5 – 3 cm, có từ 3 – 4 lá, 2 – 3 rễ,

mỗi rễ dài 3,5 – 4 cm (ở thí nghiệm 5) được cấy chuyền vào 5 loại môi trường:

Medium), ½ WPM (Woody Plant Medium giảm ½ đa lượng); mỗi môi trường được bổ sung 30g/L đường, 8g/L agar Môi trường sau khi chuẩn bị, được phân chia vào các chai nước biển (500mL) và được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 20 phút

Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 25 ± 2oC

Điều kiện chiếu sáng: 12h Cường độ ánh sáng: 2000 lux Thời gian theo dõi: 8 tuần

Thời gian thực hiện: Từ 05/2020 – 07/2020

17

Hình 2.3 Cây Mẫu đơn sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường WPM

Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên (CRD) với ba lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 7 bình, mỗi bình

có 3 cây, thể tích môi trường 65 mL, bình nuôi cấy 500 mL Tổng số mẫu của thí nghiệm là 315 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Chiều dài rễ (cm) được đo từ cổ rễ đến chóp rễ

Số rễ/cây (rễ) Chiều cao cây (cm) đo từ cổ rễ đến đỉnh chồi ngọn

Số lá/cây (lá)

2.4.3 Thí nghiệm 7.1: Khảo sát một số loại giá thể ảnh hưởng đến sự phát

triển của cây Mẫu đơn in vitro

Phương pháp tiến hành:

Cây Mẫu đơn in vitro cao 5,5 – 6 cm, có 5 lá, có 5 rễ, mỗi rễ dài 5 – 5,5

cm ở thí nghiệm 6 được rửa sạch agar bằng nước cất vô trùng trong tủ cấy Sau

đó cây được chuyển sang giá thể chứa trong chai thủy tinh thể tích 500 mL Giá thể được phối trộn thành phần theo tỉ lệ thể tích (v/v) theo Bảng 2.3 và hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 30 phút Cây được duy trì trong điều kiện in

vitro trong 4 tuần để khảo sát sự thích nghi với giá thể Thí nghiệm được bố trí

từ 08/2020 đến 11/2020

Giá thể: Đất (Đất sử dụng ở vườn hậu nuôi cấy mô thuộc Trung tâm Ươm

tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao), mụn xơ dừa, tro trấu, phân trùn (Xưởng sản xuất phân trùn quế SFARM – Đặng Gia Trang Địa chỉ: 556 Nguyễn Thị Rành – Bàu Tròn – Củ Chi – Tp HCM) được xử lý và phối trộn

18

theo tỉ lệ thể tích (v/v) (bảng 2.2)

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến

sự sinh trưởng của cây Mẫu đơn

Ký hiệu

môi trường

Tỉ lệ giữa các thành phần giá thể (v:v:v:v) Đất Tro trấu Phân trùn Xơ dừa

Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên (CRD) với ba lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 20 cây Tổng số mẫu của thí nghiệm là 180 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống

Tổng số mẫu của nghiệm thứcChiều cao cây (cm) = đo từ cổ rễ đến đỉnh chồi ngọn

Số lá/cây (lá)

Hình 2.4 Cây Mẫu đơn phát triển trong giá thể sau 4 tuần

19

2.4.4 Thí nghiệm 7.2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ phân bón

Growmore đến sự phát triển của cây Mẫu đơn in vitro ngoài vườn

cây Mẫu đơn in vitro ra để ngoài môi trường tự nhiên 14 ngày, sau đó mở nắp

chai để 2 ngày trước khi đưa hẳn cây ra ngoài Sau đó cây được chuyển sang chậu chứa hỗn hợp giá thể đất, phân trùn, mụn dừa, tro trấu theo tỷ lệ 1:1:2:1 Các chậu cây được phủ bọc nilon trong 2 tuần đầu và đặt trong nhà hậu nuôi cấy

mô Tưới phun sương giữ ẩm trong tuần đầu tiên, các tuần kế tiếp tiến hành tưới nước sạch 3 - 4 lần/ ngày tùy theo điều kiện thời tiết Sau 2 tuần, tưới Growmore với nồng độ 0,5 g/L hoặc 1,0 g/L 1 lần/ 7 ngày Ridomil gold: phun 1 lần/ 14 ngày để phòng trừ nấm gây bệnh Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật: Ditacin có tác dụng phòng trừ bệnh virus trên lá Acsend đặc trị rầy rệp Ematin dùng để trừ sâu Cythala dùng để trị thán thư, vàng lá, khô vằn

Điều kiện vườn ươm: Độ ẩm không khí duy trì: 70 – 75%, cường độ ánh sáng được che chắn khoảng 60 – 65% (cường độ ánh sáng dao động trong

Phương pháp bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên (CRD) với ba lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 20 cây Tổng số mẫu của thí nghiệm là 120 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống

Tổng số mẫu của nghiệm thứcChiều cao cây (cm) = đo từ cổ rễ đến đỉnh chồi ngọn

21

3.1 Ảnh hưởng của NAA và IBA đến khả năng tạo cây Mẫu đơn in vitro

hoàn chỉnh

Rễ cây là một cơ quan sinh dưỡng của thực vật, có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của cây Rễ thực hiện các chức năng chính là hút nước, các chất khoáng cho quá trình sinh dưỡng của cây và chống đỡ giúp cây đứng vững Ngoài ra, rễ còn là cơ quan dự trữ các chất dinh dưỡng cho cây

Vì vậy, có thể nói giai đoạn ra rễ là một trong những giai đoạn quan trọng trong quy trình vi nhân giống, có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển

của cây giống in vitro cũng như tỷ lệ sống sót khi cây bước sang giai đoạn hậu

nuôi cấy mô Trong đó, các chỉ tiêu về tỷ lệ ra rễ, số lượng rễ và chiều dài rễ là những tiêu chí quan trọng đánh giá hiệu quả tác động của các yếu tố lý hóa đến

sự ra rễ của mẫu cấy

Các chồi Mẫu đơn được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA (0; 1,0; 2,0 mg/L) và NAA (0; 0,5; 1,0 mg/L) với các nồng độ khác nhau Phân tích thống kê các kết quả thu được cho thấy sự

tác động trực tiếp của hai chất này đến khả năng ra rễ và tạo cây in vitro hoàn

chỉnh của chồi Mẫu đơn Ở các nồng độ IBA và NAA khác nhau, tỷ lệ mẫu hình thành rễ, số rễ phát sinh/ cây, chiều dài rễ, số lá và chiều cao cây có sự khác biệt, khác biệt này có ý nghĩa thống kê (phân tích ANOVA, P<0,05) Tỷ lệ mẫu chồi tạo rễ, số lượng và chiều dài rễ tốt nhất (tương ứng là 81,93%; 3,05 rễ; 3,5 cm) khi chồi được nuôi cấy trên nền môi trường MS bổ sung 1 mg/L IBA kết hợp với 1 mg/L NAA trong 12 tuần, ngược lại chồi không phát sinh rễ khi nuôi cấy chồi trên môi trường MS cơ bản (Bảng 3.1)

Kết quả thống kê ở Bảng 3.1 thể hiện sự ảnh hưởng của NAA và IBA đến

tỷ lệ hình thành rễ của cây Mẫu đơn Kết quả thống kê cho thấy các nghiệm thức

có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Việc bổ sung IBA và NAA vào môi trường nuôi cấy có tác động rõ rệt đến tỷ lệ hình thành rễ với tỷ lệ mẫu chồi tạo rễ cao nhất là 81,93% khi bổ sung vào môi trường IBA kết hợp với NAA ở cùng nồng độ 1 mg/L

* Số liệu đã được chuyển đổi sang arcsin(x) ½ trước khi xử lý thống kê

Sau 4 tuần nuôi cấy trên các môi trường thí nghiệm, chồi Mẫu đơn bắt đầu cảm ứng tạo rễ (Hình 3.1) Sau 12 tuần, các chồi được cấy trong môi trường không bổ sung auxin không phát sinh rễ (nghiệm thức HM1 – nghiệm thức đối chứng) Ở các nghiệm thức bổ sung riêng lẻ IBA và NAA, có sự biến thiên tỷ lệ hình thành rễ theo nồng độ IBA và NAA Theo đó, IBA và NAA đã tác động lên khả năng tạo rễ của chồi Mẫu đơn theo chiều hướng tích cực Tức là khi tăng nồng độ IBA hoặc NAA trong môi trường thì tỷ lệ hình thành rễ cũng tăng lên Không có sự ra rễ ở chồi khi không có mặt IBA trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ

ra rễ tăng lên 55,56%; 77,78% khi nồng độ IBA lần lượt là 1 và 2 mg/L Có thể thấy khả năng tạo rễ của Mẫu đơn tỷ lệ thuận với nồng độ IBA được bổ sung vào môi trường Ở các nghiệm thức chỉ bổ sung NAA, tỷ lệ mẫu tạo rễ tăng từ 20% lên 42,22% khi nồng độ NAA bổ sung vào môi trường là 0,5 và 1 mg/L Cũng giống như IBA, khả năng tạo rễ của Mẫu đơn tỷ lệ thuận với nồng độ NAA bổ sung vào môi trường Đồng thời trong phạm vi nghiên cứu này, kết quả ghi nhận cho thấy khi bổ sung riêng lẻ hai loại auxin này, IBA ở nồng độ 2 mg/L

và NAA nồng độ 1 mg/L kích thích ra rễ tốt hơn các nồng độ khác Điều này phù hợp với nghiên cứu của An (2005) IBA kích thích rễ tốt hơn NAA, khi bổ sung riêng rẽ ở cùng 1 nồng độ (1 mg/L), tỷ lệ tạo rễ ở nghiệm thức chứa IBA cao hơn 1,31 lần nghiệm thức chứa NAA (Bảng 3.1), phù hợp với kết quả nghiên cứu của Li và cộng sự (1984)

23

Hình 3.1 Chồi Mẫu đơn trong môi trường tạo rễ sau 4 tuần

Phân tích phương sai ANOVA 2 yếu tố cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy 95% giữa các nghiệm thức bổ sung đồng thời IBA và NAA Vì vậy, có sự tương tác giữ IBA và NAA trong việc kích thích tạo

rễ Mẫu đơn Mối liên hệ tương tác này được kiểm chứng thông qua sự biến động của tỷ lệ tạo rễ khi có sự góp mặt của IBA và NAA Tại các nghiệm thức bổ sung IBA với nồng độ 1 mg/L, khi tăng nồng độ NAA từ 0,5 đến 1 mg/L, tỷ lệ tạo rễ cũng tăng lên từ 75,56% lên 88,89% Khi tăng nồng độ IBA lên 2 mg/L, tiếp tục thêm NAA (0,5; 1 mg/L) vào môi trường, kết quả ghi nhận cho thấy tỷ

lệ tạo rễ giảm từ 77,78% (2 mg/L IBA, 0 mg/L NAA) xuống còn 64,44% khi nồng độ NAA trong môi trường là 0,5 mg/L Tỷ lệ này tiếp tục giảm xuống 62,22% khi nồng độ NAA tăng lên 1 mg/L Như vậy, ở nồng độ IBA 1 mg/L, tỷ

lệ tạo rễ tỷ lệ thuận với nồng độ NAA được bổ sung vào môi trường IBA và NAA có mối tương quan cộng gộp, kích thhích sự ra rễ của Mẫu đơn Khi nồng

độ IBA tăng lên 2 mg/L, tỷ lệ tạo rễ tỷ lệ nghịch với nồng độ NAA được bổ sung vào môi trường Việc bổ sung NAA có xu hướng làm giảm tỷ lệ mẫu tạo rễ Mẫu đơn

Các nghiệm thức cố định nồng độ NAA ở các mức 0,5; 1 mg/L, sau đó bổ sung lần lượt 1 và 2 mg/L IBA, tỷ lệ hình thành rễ tăng khi có sự xuất hiện của IBA Cụ thể, khi không có IBA trong môi trường nuôi cấy, với nồng độ NAA là 0,5 mg/L, tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 20% Sau khi bổ sung thêm IBA 1mg/L, tỷ lệ tạo

rễ tăng lên 75,56% và 64,44% khi nồng độ IBA là 2 mg/L Tương tự, khi môi trường chỉ chứa NAA 1 mg/L, tỷ lệ mẫu tạo rễ là 42,22% Sau khi bổ sung IBA