Nhận dạng hợp chất tiềm năng trong điều trị rối loạn lipid máu thông qua molecular docking

Nội dung tham gia chính Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú* 1 Nguyễn Thụy Việt Phương Nguyễn Thụy Việt Phương Thu thập tài liệu-chọn cấu trúc protein cho thụ thể liên quan đến quá trình

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

NHẬN DẠNG HỢP CHẤT TIỀM NĂNG TRONG ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU THÔNG QUA MOLECULAR DOCKING

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (Khoa, Trung tâm, …): DƯỢC

Chủ trì nhiệm vụ: TS Nguyễn Thụy Việt Phương

Thành phố Hồ Chí Minh - 2021

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: Nhận dạng hợp chất tiềm năng trong điều trị rối loạn lipid máu thông qua molecular docking

Thuộc lĩnh vực (tên lĩnh vực): Dược

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

- Họ và tên: Nguyễn Thụy Việt Phương

- Ngày, tháng, năm sinh: 06/05/1980 Nam/ Nữ: Nữ

- Học hàm, học vị: Tiến sĩ – Dược sĩ

- Chức danh khoa học: Tiến sĩ Chức vụ: Giảng viên

- Điện thoại: Tổ chức: Nhà riêng: Mobile: 0919520708

- Fax: E-mail: ntvphuong@ump.edu.vn

- Tên tổ chức đang công tác:.Bộ môn Công nghệ thông tin Dược

- Địa chỉ tổ chức: 41 Đinh Tiên Hoàng – P.Bến Nghé – Quận 1 – Tp.HCM

- Địa chỉ nhà riêng: 4.09 Chung cư 52 Chánh Hưng – đường 332 Phạm Hùng – P.5 –

Quận 8 – Tp.HCM

3 Tổ chức chủ trì nhiệm vụ (1) :

- Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược - Đại Học Y Dược Tp.HCM

- Điện thoại: 028 38295641 Fax:

- E-mail:

- Website: www.uphcm.edu.vn

- Địa chỉ: 41 Đinh Tiên Hoàng – P.Bến Nghé – Quận 1 – Tp.HCM

4 Tên cơ quan chủ quản đề tài: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 11 năm 2019 đến tháng 11 năm 2020

2 Kinh phí và sử dụng kinh phí:

a) Tổng số kinh phí thực hiện: 10 triệu đồng, trong đó:

+ Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học của nhà trường: 10 triệu đồng

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1 Nguyễn Thụy

Việt Phương Nguyễn Thụy Việt Phương Thu thập tài liệu-chọn cấu

trúc protein cho thụ thể liên quan đến quá trình điều trị rối loạn lipid máu và ligand, phân tích kết quả docking, động lực học phân

tử - viết báo

Tài liệu liên quan đến đề tài - cấu trúc protein, ligand - kết quả docking

- bài báo

2 Nguyễn Lê Trà

Giang

Nguyễn Lê Trà Giang

Thu thập tài liệu, thực hiện phần docking, động lực học phân tử - phân tích kết quả

Tài liệu liên quan đến đề tài - kết quả docking

3 Trần Thị Bích

Liên

Trần Thị Bích Liên

Thu thập tài liệu, tổng hợp kết quả

Tài liệu liên quan đến đề tài

- Lý do thay đổi ( nếu có):

5 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác,

số đoàn, số lượng người tham

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

6 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian,

7 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục của đề cương, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Số

TT

Các nội dung, công việc

chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu)

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Nội dung 1 Chọn lựa các thụ

thể quan trọng liên quan đến

quá trình hạ lipid máu

02/2020

02/2020

1/11/2019-Nguyễn Thụy Việt Phương – Nguyễn Lê Trà Giang – Trần Thị Bích Liên

2 Nội dung 2 Nghiên cứu khả

năng gắn kết thông qua

molecular docking các hợp chất

tự nhiên trên các thụ thể liên

quan đến hạ lipid máu – khảo

sát quá trình động lực học phân

tử độ ổn định của gắn kết

06/2020

06/2020

02/2020-Nguyễn Thụy Việt Phương – Nguyễn Lê Trà Giang – Trần Thị Bích Liên

3 Nội dung 3 Xác định hợp chất

tiềm năng cho thử nghiệm tác

động hạ lipid máu

08/2020

08/2020

06/2020-Nguyễn Thụy Việt Phương – Nguyễn Lê Trà Giang – Trần Thị Bích Liên

4 Nội dung 4 Tổng hợp – Phân

tích kết quả - Viết bài báo

10/2020

10/2020

08/2020-Nguyễn Thụy Việt Phương – Nguyễn Lê Trà Giang

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1

- Lý do thay đổi (nếu có):

- Lý do thay đổi (nếu có)

d) Kết quả đào tạo: Không có

Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp: Không có

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 HỘI CHỨNG CHUYỂN HÓA – RỐI LOẠN LIPID MÁU VÀ MỐI LIÊN QUAN HỌ THỤ THỂ PPARS 3

1.1.1 Giới thiệu 3

1.1.2 Vai trò của PPARs trong các rối loạn lipid máu 4

1.1.3 Điều trị 4

1.2 THỤ THỂ PPARS 5

1.2.1 Cấu tạo thụ thể PPARs 5

1.2.2 Cơ chế tác động thụ thể PPARs 8

1.2.3 Vai trò chính của từng loại thụ thể PPAR 9

1.3 HỢP CHẤT TỰ NHIÊN 11

1.3.1 Cấu trúc hóa học 11

1.3.2 Công dụng của các hợp chất tự nhiên trong rối loạn chuyển hóa 12

1.4 CÁC KỸ THUẬT IN SILICO 14

1.4.1 Gắn kết phân tử (Molecular docking) 14

1.4.2 Động lực học phân tử 17

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 21

1.5.1 Trên thế giới 21

1.5.2 Tại Việt Nam 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Protein mục tiêu 23

2.1.2 Ligand 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Trang thiết bị và phần mềm 27

2.2.2 Molecular docking 27

2.2.3 Mô phỏng động lực học phân tử 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 30

3.2 MÔ PHỎNG ĐỘNG LỰC HỌC PHÂN TỬ 48

3.2.1 RMSD 49

3.2.2 RMSF 51

3.2.3 Bán kính quay 52

3.2.4 Tần suất hiện diện của liên kết hydro 53

3.2.5 Diện tích tiếp xúc bề mặt dung môi 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60

4.1 KẾT LUẬN 60

4.1.1 Gắn kết phân tử 60

4.1.2 Mô phỏng động lực học phân tử 60

4.2 ĐỀ NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC

MetS Metabolic syndrome Hội chứng chuyển hóa

PPAR Peroxisome

proliferator-activated receptor

Thụ thể hoạt hóa bởi peroxisome

HDL-c High Density Lipoprotein

Cholesterol

Lipoprotein tỷ trọng cao LDL-c Low Density Lipoprotein

Cholesterol

Lipoprotein tỷ trọng thấp CVD Cardiovascular Disease Bệnh tim mạch

HMG-CoA Hydroxymethylglutaryl

coenzym A ADMET Absorption, distribution,

metabolism, excretion, and toxicity

Hấp thụ, phân bố, chuyển hóa, bài tiết

Rg Radius of Gyration Bán kính quay

RMSD Root Mean Square Deviation Độ lệch bình phương trung bình RMSF Root Mean Square Fluctuation Độ dao động bình phương trung bình

Rg Radius of Gyration Bán kính quay

SASA Solvent accessible surface area Diện tích bề mặt tiếp cận dung môi

ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic

IUPAC International Union of Pure and

Applied Chemistry

Liên minh Quốc tế về Hóa học thuần túy và Hóa học ứng dụng

Bảng 2.4 Danh sách các phần mềm được sử dụng trong đề tài 27 Bảng 2.5 Tọa độ Grid box vị trí khoang gắn kết ứng với các PPARs 28

không phụ thuộc phối tử, miền C tương ứng với miền gắn kết PPREs của ADN mục tiêu, miền D là miền bản lề kết nối miền C và miền E/F, miền E/F liên kết với phối

tử [39] 6

Hình 1.4 Điều hòa phiên mã bởi các PPARs PPAR hình thành phức hợp dimer với

các thụ thể retinoic acid α (RXRα) và sau đó liên kết với một chuỗi DNA tại

PPRE Sự liên kết của chất chủ vận hoặc chất đối kháng dẫn đến thay đổi cấu trúc, chất đồng hoạt hóa (co-activator: p300, CBP, SRC) hoặc chất đồng ức chế (co-repressor: NcoR, SMRT) [ 9

Hình 1.5 Các chất chủ vận trên thụ thể PPARα (fenofibrat, clofibrat, gemfibrozil),

PPARδ (GW501516), PPARγ (rosiglitazon, pioflitazon, troglitazon) 11

Hình 1.6 Một số hợp chất tự nhiên thuộc các nhóm alkaloid, terpenoid và

flavonoid 12

Hình 1.6 Các flavonoid thuộc khung (A) flavonol (rutin, kaempferol, eriodictyol,

quercetin), (B) flavon (luteolin, wogonin), (B) flavan (naringin, hesperidin), (D) flavanol (epigallocatechin gallate), (E) isoflavon (daizein, formononetin, genistein) 13

Hình 2.8 Ba thụ thể PPARα, PPARγ và PPARδ với các mã PDB là: 5HYK,

3NOA, 3GZ9 23

Hình 3.15 Các khung chính của flavonoid, trong đó C đại diện cho chalcon và

dihydrochalcon, O đại diện cho flavan, flavon, flavanol và flavonol, I đại diện cho isoflavon 34

Hình 3.16 Các flavonoid thuộc nhóm chalcon (F75, F44, F93, F96, F465) và

dihydrochalcon (F131) có ái lực gắn kết tốt sau khi docking vào PPARα (PDB: 5HYK) 34

Hình 3.17 Các flavonoid: F75 (màu xanh lá cây), F131 (màu vàng), F465 (màu đỏ)

trong khoang gắn PPARα (PDB: 5HYK) và tương tác 2D tương ứng sau docking Với nét xanh lá là liên kết hydro, nét tím, hồng, vàng là liên kết kỵ nước 36

Hình 3.18 Các hợp chất thuộc nhóm O với flavan (F168), flavon (F300, F325, F97,

F551, F553, F85, F282) có ái lực gắn kết tốt sau khi docking vào PPARα (PDB: 5HYK) 37

Hình 3.19 Các flavonoid: (A) F168 (màu xanh lá) và F97 (màu đỏ) có nằm trong

khoang gắn Y1 (B) ligand F85 (màu vàng) và F551 (màu tím) nằm trong cả khoang

kỵ nước (vòng màu trắng) và Y1 (vòng tròn đỏ) của PPARα (PDB: 5HYK) và

Với nét xanh lá là liên kết hydro, nét tím, hồng, vàng là liên kết kỵ nước 39

Hình 3.23 Các flavonoid: F99 (màu đỏ), F73 (màu xanh lá cây), F484 (màu vàng)

trong khoang gắn PPARγ (PDB: 3NOA) và tương tác 2D tương ứng sau docking Với nét xanh lá là liên kết hydro, nét tím, hồng, vàng là liên kết kỵ nước 42

Hình 3.24 Các flavonoid thuộc nhóm flavan (F510), flavonol (F363, F311) flavon

(F283, F369, F85) có ái lực gắn kết tốt với PPARγ (PDB: 3NOA) 42

Hình 3.25 Các flavonoid: F363 (màu xanh lá cây), F273 (màu đỏ), F85 (màu vàng)

trong khoang gắn PPARγ (PDB: 3NOA) và tương tác 2D tương ứng sau docking Với nét xanh lá là liên kết hydro, nét tím, hồng, vàng là liên kết kỵ nước 43

Hình 3.26 Các flavonoid có khung isoflavon (F440, F441, F413, F453, F442) có ái

lực gắn kết tốt với PPARγ (PDB: 3NOA) 44 45

Hình 3.27 Các flavonoid: F441 (màu xanh lá cây), F453 (màu đỏ), F413 (màu

vàng) trong khoang gắn PPARγ (PDB: 3NOA) và tương tác 2D tương ứng sau docking Với nét xanh lá là liên kết hydro, nét tím, hồng, vàng là liên kết kỵ nước 45

Hình 3.30 Chất F85 khi gắn kết với (A) PPARα (PDB: 5HYK), (B) PPARγ (PDB:

3NOA), (C) PPARδ (PDB: 3GZ9) vị trí trong khoang gắn và tương tác tương ứng48

Hình 3.31 Giá trị RMSD của protein dạng apoprotein và dạng phức hợp F85 của

PPARα (PDB: 5HYK), PPARγ (PDB: 3NOA), PPARδ (PDB: 3GZ9) và RMSD ligand F85 sau thời gian mô phỏng động lực học 20 ns 49

Hình 3.32 RMSF acid amin dạng apoprotein PPARα và trong phức hợp PPARα

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, hội chứng chuyển hóa (metabolic syndrome hay MetS) như rối loạn lipid

máu (thường là tăng lipid máu), bệnh béo phì, đái tháo đường, đang là một vấn đề sức khỏe được quan tâm và cũng là một thách thức lâm sàng trên toàn thế giới khi

mà hiện tượng đô thị hóa, ăn uống thừa năng lượng, béo phì, lối sống ít vận động thể lực gia tăng Những căn bệnh này có thể dẫn đến tỷ lệ mắc và tử vong cao ở cả nam và nữ cũng như gây gánh nặng kinh tế cho xã hội [1] Ngoài ra, tỷ lệ MetS đang tăng cao ở trẻ em và người trẻ tuổi sẽ là gánh nặng y tế toàn cầu trong tương lai Theo ước tính, tỷ lệ MetS ở người trưởng thành là 20-25% [2], ở trẻ em là 19,2% [3], và có thể lên tới 80% ở người mắc bệnh đái tháo đường tuýp 2 [4] Trong đó, rối loạn lipid máu là một bệnh điển hình Đặc trưng của bệnh rối loạn lipid máu là tăng nồng độ cholesterol toàn phần hay tăng LDL (low-density lipoprotein hoặc giảm HDL (high-density lipoprotein), tăng triglyceride huyết tương, hoặc cả hai [5] Bệnh này được xem là một yếu tố quan trọng, đóng góp lớn nhất vào sự phát triển của các bệnh về động mạch vành và xơ vữa động mạch – nguyên nhân tử vong hàng đầu ở cả các nước đã và đang phát triển [5] Theo Tổ chức Y tế thế giới, hiện có khoảng 50% bệnh nhân liên quan đến bệnh thiếu máu tim cục bộ kết hợp với rối loạn lipid máu và hơn 4 triệu ca tử vong hàng năm do các bệnh này [6]

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPARs) là siêu họ thụ thể nhân (lớp II) [7] bao gồm ba phân nhóm, PPARα, PPARβ hoặc δ, và PPARγ [8] Cả ba PPAR đều là chất điều hòa các con đường trao đổi chất, do đó có sự gia tăng đáng kể trong việc phát triển và sử dụng các chất chủ vận PPAR, đặc biệt là tác động của các chất chủ vận PPARα như là phương pháp điều trị chính của rối loạn lipid máu trong thập

kỷ qua [9] Trên thị trường, số lượng thuốc được bán trên thị trường hiện nay để điều trị rối loạn lipid máu nhắm vào các PPARs Ví dụ, thuốc fibrat là chất chủ vận hoạt hóa PPARα [10] để làm giảm triacylglycerol được sử dụng để điều trị rối loạn lipid máu và thiazolidinediones là chất hoạt hóa PPARγ để điều trị tăng đường

huyết ở bệnh tiểu đường loại 2 [11] Trong khi sự hoạt hóa PPARδ dẫn đến làm tăng mức độ oxy hóa acid béo [12]

Bên cạnh đó, có rất ít các hợp chất thuốc tác động trên những mục tiêu khác để chống rối loạn lipid máu như ức chế protein chuyển ester cholesteryl, hấp thu cholesterol bằng cách liên kết với protein vận chuyển cholesterol NPC1L1 (Niemann-pick C1-like1), enzym cholesterol O-acyltransferase tham gia vào quá trình tái ester hóa hấp thu cholesterol, [13] Vì vậy, các PPAR, đặc biệt là PPARα

đã là mục tiêu chính để chống rối loạn lipid máu Tuy nhiên, các thuốc fibrate có thể gây ra một số tác dụng phụ như gan to hoặc rối loạn chức năng gan, rối loạn tiêu hóa, tăng nồng độ creatinin, [14] Vì vậy, cần phải khám phá các hợp chất mới cho tác dụng chống tăng lipid máu với ít độc tính hơn

Một số cây thuốc có các hợp chất có hoạt tính sinh học đã được báo cáo về tác dụng chống lipid máu chính là nguồn phong phú cho các loại thuốc mới hiệu quả và an

toàn [15-19] Chẳng hạn, các anthraquinon có trong Rheum officinale; ginsenosid, ginseng, và polysaccharid trong Radix ginseng; triterpen trong Rhizoma alismatis,

cho tác dụng giảm triglycerid và LDL [18] Một số hợp chất cũng đã được chứng minh là các chất chủ vận PPARα như picrasidin C (một alkaloid có trong rễ của

Picrasma quassioides); bixin (một carotenoid vỏ hạt cùa Bixa orellana); naringenin

(flavanon có trong quả khô của Citrus aurantium); secoiridoid excelside B và một

số chất chuyển hóa từ Fraxinus excelsior L., [19] Do đó, nghiên cứu này thực

hiện với các mục tiêu như sau:

Mục tiêu tổng quát: Khám phá các hợp chất tự nhiên tiềm năng có khả năng gắn

kết tốt với họ thụ thể PPARs, đặc biệt như là chất chủ vận PPARα ứng dụng trong nghiên cứu thuốc điều trị bệnh rối loạn chuyển hóa như rối loạn lipid máu

Mục tiêu cụ thể

1 Khảo sát gắn kết phân tử cho các hợp chất tự nhiên vào từng thụ thể trên PPARs

2 Thực hiện mô phỏng động lực học phân tử cho các gắn kết tốt để chọn lựa chất

tiềm năng gắn kết ổn định trên các thụ thể họ PPARs

được xem như trình trạng bị hội chứng chuyển hóa (metabolic syndrome hay MetS)

xảy ra phổ biến và đã trở thành vấn đề sức khỏe nghiêm trọng trên toàn cầu [20] Lipid máu bao gồm nhiều thành phần khác nhau như cholesterol toàn phần,

cholesterol xấu (LDL hay cholesterol tỷ trọng thấp- Low Density Lipoprotein

Cholesterol), cholesterol tốt (HDL hay cholesterol tỷ trọng cao - High Density Lipoprotein Cholesterol), triglycerid, [21] Có nhiều kiểu rối loạn lipid máu,

thường là tăng nhiều cholesterol hay vừa tăng LDL và giảm HDL, hay kèm theo tăng triglycerid,…[21] Theo Tổ chức Y tế Thế giới, có khoảng 50% bệnh nhân thiếu máu cơ tim liên quan đến rối loạn lipid máu và hơn 4 triệu ca tử vong hàng năm [22] Hơn một tỷ người hiện nay bị ảnh hưởng bởi hội chứng chuyển hóa [23]

MetS làm gia tăng tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường tuýp 2 (Type 2 Diabetes hay T2D)

và các bệnh tim mạch (Cardiovascular Disease hay CVD), là mối đe dọa lớn đối

với sức khỏe cộng đồng và toàn bộ nền kinh tế xã hội [23]

- MetS thường xảy ra ở những người hấp thụ quá nhiều chất dinh dưỡng và không hoạt động thể chất, hoặc sự nhạy cảm về chuyển hóa và di truyền cũng là những nguy cơ chính tiềm ẩn đối với MetS [24] Tích tụ mỡ bụng, điều hòa triglycerid

và glucose huyết, tăng huyết áp, rối loạn điều hòa lipoprotein tỷ trọng thấp và cao là những đặc điểm phổ biến nhất của MetS [25]

- Chẩn đoán MetS yêu cầu 3 tiêu chuẩn trở lên: (i) vòng bụng > 102 cm ở nam và

> 88 cm ở nữ; (ii) cholesterol có tỷ trọng cao HDL-c < 40 mg/ dL (< 1,04 mmol/ L) ở nam và < 50 mg/ dL (< 1,29 mmol/ L) ở nữ; (iii) Triglycerid ≥ 150 mg/ dL (≥ 1,7 mmol/ L); (iv) huyết áp ≥ 130/85 mmHg và (v) đường huyết lúc đói ≥ 110 mg/ dL (≥ 6,1 mmol/ L) [26]

1.1.2 Vai trò của PPARs trong các rối loạn lipid máu

Trong những biến đổi về chuyển hóa của MetS bao gồm rối loạn lipid máu, các thụ thể kích hoạt chất tăng sinh peroxisome PPARs đóng vai trò điều hòa cân bằng nội môi, chuyển hóa trong cơ thể Khi PPARs được kích hoạt bởi phối tử nội sinh như acid béo, acid eicosanoic; hay phối tử tổng hợp như fibrat trên PPARα, GW501516 trên PPARδ, hay glitazones trên PPARγ, các tác động có lợi được ghi nhận như sau:

- PPARα làm trung gian cho chức năng hạ natri máu của fibrat trong điều trị tăng triglycerid máu [27], đóng vai trò điều hòa chính chuyển hóa lipid trong và ngoài tế bào Hơn nữa, hoạt hóa PPARα làm tăng HDL-c huyết tương thông qua cảm ứng biểu hiện apolipoprotein A-II ở người [28]

- PPARγ khi được hoạt bởi glitazones có tác dụng hạ đường huyết và tăng biểu hiện insulin với tế bào [29] Ngoài ra, PPAR-γ liên kết trực tiếp với promoter của hầu hết tất cả các gen tạo mỡ, chẳng hạn như các yếu tố liên quan đến chuyển hóa glucose và acid béo, cho thấy vai trò quan trọng của thụ thể này đến việc kích hoạt các chu trình trao đổi chất trong quá trình tạo mỡ [30]

- Sự hoạt hóa PPARδ dẫn đến tăng mức độ oxy hóa acid béo [12] Ngoài ra PPARδ liên quan đến việc tăng sự phát triển của tế bào ung thư trong ống

nghiệm và in vivo, hỗ trợ sự sống sót của tế bào ung thư bằng con đường trao

đổi chất [31]

1.1.3 Điều trị

Việc điều trị MetS hay rối loạn lipid máu có thể bao gồm: (1) thực hiện các thay đổi lối sống và chế độ ăn uống để giảm cân, (2) điều trị bằng thuốc Hiện nay, có 2 loại thuốc trên thị trường được ghi nhận hiệu quả trong việc điều trị và có đích tác động trên PPARs

- Fibrat (clofibrat, benzafibrat, ciprofibrat, clofibrat, fenofibrat, gemfibrozil…): khi hoạt hóa PPARα, fibrat làm giảm TG tới 50% và tăng HDL-c lên đến 20% Tỷ lệ bệnh tim mạch giảm đã được báo cáo khi điều trị bằng fibrate ở nhóm bệnh nhân có mức HDL-c thấp và triglycerid (TG) tăng cao (ví dụ TG > 2,3 mmol/ L (200 mg/ dL) [32]

- Thiazolidinedion (glitazon, pioglitazon, rosiglitazon…): Thuốc làm tăng nhạy cảm của cơ và tổ chức mỡ với insulin bằng cách hoạt hoá PPAR vì vậy làm tăng thu nạp glucose từ máu Thuốc làm tăng nhạy cảm của insulin ở cơ vân, mô

mỡ đồng thời ngăn cản quá trình sản xuất glucose từ gan Thiazolidinedion còn

có hiệu quả trong ngăn ngừa đột quỵ hoặc một cơn thiếu máu cục bộ thoáng qua,

ổn định các mảng xơ vữa động mạch [33]

Ngoài ra còn có các loại thuốc khác điều trị MetS như:

- Statin ức chế 3-hydroxy-3-metyl-glutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) ảnh hưởng đến tốc độ sinh tổng hợp cholesterol giúp giảm cholestertol có tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein Cholesterol hay LDL-c) [34] Hay thuốc ức chế hấp thu cholesterol: Ezetimib; hoặc phối hợp statin và các niacin (acid nicotinic) tác động qua trung gian gan khi tổng hợp chất béo, giúp làm tăng HDL;…

- Thuốc ức chế hệ thống angiotensin là thường được sử dụng để chống tăng huyết

áp liên quan đến bệnh chuyển hóa Thuốc ức chế men chuyển angiotensin hoặc angiotensin thuốc chẹn thụ thể không chỉ làm giảm huyết áp mà còn có thể giảm

sự tiến triển của bệnh tim và thận ở bệnh tiểu đường [35]

- Các tác nhân chống bệnh tiểu đường ngoài các chất kích hoạt PPARγ làm tăng nhạy cảm insulin còn có chất chủ vận thụ thể peptide-1 (GLP-1) giống glucagon, dipeptidyl chất ức chế peptidase-4 (DPP4) và chất ức chế natri-glucose cotransporter-2 (SGLT-2) Những chất chống tiểu đường này có hiệu quả trong việc hạ huyết áp nồng độ glucose và hemoglobin A1c (HbA1c) [36]

1.2 THỤ THỂ PPARS

Các thụ thể kích hoạt chất tăng sinh peroxisome (The peroxisome

proliferator-activated receptors hay PPAR) là các thụ thể nhân liên quan đến việc điều hòa cân

bằng nội môi chuyển hóa, trở thành mục tiêu hiệu quả trong điều trị MetS [37]

1.2.1 Cấu tạo thụ thể PPARs

Phân họ PPARs bao gồm ba thụ thể (isotype): PPARα (NR1C1), PPARβ/δ (NR1C2) và PPARγ (NR1C3), được mã hóa bởi các gen riêng biệt [38] Tương tự với các thụ thể nhân khác, PPARs gồm một số miền chính [39] (Hình 1.1) Đầu tận

cùng NH2, (miền A/B) có chức năng phiên mã độc lập với phối tử (AF-1) và chịu trách nhiệm phiên mã kiểu phụ của PPAR với gen đích khi không có phối tử Miền

liên kết với ADN (DNA Binding Domain hay DBD hay miền C) chứa 2 ion kẽm

được bảo tồn cao; vùng nhận diện chuyên biệt (ZinC finger) thúc đẩy thụ thể liên kết với vùng khởi động gen mục tiêu (peroxisome proliferator response element (PPRE)) Vùng bản lề (miền D) hoạt động như khoang gắn với chất đồng kích hoạt (co-activator) và cũng liên quan đến DBD gắn với miền liên kết phối tử (ligand-binding domain hay LBD) Miền tận cùng C (C-terminal) với miền E/F (hay LBD)

là miền lớn nhất trong thụ thể, và có cấu trúc được bảo tồn cao giữa cả ba thụ thể PPAR Sự khác biệt nhỏ là về tính năng khoang gắn kết giữa các thụ thể đóng vai trò quan trọng trong xác định độ chọn lọc của phối tử chủ vận [40] Phối tử sẽ liên kết với LBD để quyết định kích hoạt hay kìm hãm thụ thể Hơn nữa miền LBD rất quan trọng đối với quá trình dị hóa và tương tác với các yếu tố đồng phiên mã [41] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Các miền chính của thụ thể PPARs: miền A/B liên quan đến phiên mã

không phụ thuộc phối tử, miền C: miền gắn kết PPREs của ADN mục tiêu, miền D

là miền bản lề kết nối miền C và miền E/F, miền E/F liên kết với phối tử [42]

Ba loại thụ thể PPARα, PPARγ hay PPARδ có cấu trúc chung bao gồm 13 vòng xoắn và các nhánh β (β-sheet) Cấu trúc thứ cấp gồm ba lớp bánh sandwich xoắn α không song song, được đánh số H1-H12, vòng xoắn H2’ và β-sheet (S1-S4) (Hình 1.2) Ba vòng xoắn mở rộng (H3, H7 và H10/H11) tạo thành hai lớp bên ngoài, (H4,

H5, H8 và H9) tạo thành lớp trung tâm của bánh sandwich Khoang gắn kết lớn (~

1400 Å3) có hình chữ Y với ba nhánh có thể liên kết nhiều phối tử có chức năng khác nhau (Hình 1.3) [41]

- Nhánh I hay gọi là nhánh Y1, mở rộng về phía AF-2 trên xoắn H12 và nhánh II, nằm giữa chuỗi xoắn H3 và β-sheet (Hình 1.3) Mỗi nhánh có chiều dài khoảng

12 Å Nhánh Y1 về cơ bản là khoang PPAR duy nhất phân cực Bốn acid amin phân cực trong nhánh Y1 của PPAR được bảo tồn qua các loại thụ thể PPARs, với Thr289 (H3), His323 (H5), His449 (H11) và Tyr473 (H12) của PPARδ [43-45] (tương ứng là Ser280, Tyr314, His440 và Tyr464 củaPPARα và Ser289, His323, His449 và Tyr473 của PPARγ) Những acid amin này là một phần của mạng lưới liên kết hydro quan trọng liên quan đến tác dụng ủ vận của các thụ thể PPARs [46-47]

- Nhánh II và III hay gọi là nhánh Y2 và Y3 chủ yếu kỵ nước, phù hợp tính chất

kỵ nước của các phối tử tự nhiên [48-49] Ba mươi bốn acid amin được xác định tạo thành khoang liên kết, khoảng 80% acid amin này được bảo tồn qua ba isotypes (Hình 1.3) [45]

- Hình 1.2 Cấu trúc của PPARs và khoang gắn kết (A) Cấu trúc gồm 13 vòng

xoắn (H1 đến H12) và 4 β-sheet (S1 đến S4) (B) khoang gắn của PPARs [50]

Hình 1.3 Cấu trúc của PPARs và các acid amin quan trọng khoang gắn kết: (A)

khoang gắn kết chữ Y với 3 nhánh I (Arm I), II (Arm II), III (Arm III) của thụ thể

PPARs [51] (B) Tên các acid amin tạo thành khoang gắn kết của PPARs [41]

1.2.2 Cơ chế tác động thụ thể PPARs

- Khi không có phối tử (ức chế độc lập phối tử), PPARs gắn kết với vùng khởi động của gen mục tiêu và ngăn chặn quá trình phiên mã bằng cách thu nhận các phức chất đồng ức chế (NCoR và SMRT)

- Khi hoạt hóa bởi phối tử (hoạt hóa phụ thuộc phối tử), các PPAR thay đổi về cấu dạng, gây ra sự thay thế các chất đồng ức chế (co-repressor) và thu nhận các chất đồng kích hoạt như (p300/CBP và SRC) tạo ra sự phiên mã [52] Cụ thể là sau khi gắn với các chất chủ vận (PPARs agonists), gây ra những thay đổi cấu trúc của miền AF-2, cho phép thu nhận các chất đồng hoạt hóa (co-activator) quan trọng để kích hoạt phiên mã, do đó các chất chủ vận đóng vai trò như một công tắc để kích hoạt các PPAR tham gia phiên mã Để thực hiện các chức năng sinh học của chúng, các PPAR tạo thành phức hợp dị phân tử với thụ thể acid retinoic α (RXRα), một thành viên khác của họ thụ thể nhân, thông qua miền

dimerization Liên kết với RXRα là điều kiện tiên quyết để các PPAR liên kết với ADN tại PPRE có chứa trình tự ADN được bảo tồn AGGTCANAGGTCA (Hình 1.4)

- Ngược lại với kích hoạt và kìm hãm phiên mã, còn có cơ chế khác là biến nạp, liên quan đến ức chế gen theo cách thức phụ thuộc vào phối tử, can thiệp vào các con đường dẫn truyền tín hiệu khác, thông qua tương tác protein-protein với NFkB, AP1 và STAT [53-55] Sự biến nạp không liên quan đến gắn kết với PPREs nhưng đạt được thông qua việc thu gom và ổn định của các phức hợp đồng ức chế trên các vùng khởi động của các gen tiền viêm Cơ chế này có thể giải thích đặc tính chống viêm của các PPARs [55-56]

Hình 1.4 Điều hòa phiên mã bởi các PPARs PPAR hình thành phức hợp dimer với

các thụ thể retinoic acid α (RXRα) và sau đó liên kết với một chuỗi DNA tại PPRE Sự liên kết của chất chủ vận hoặc chất đối kháng dẫn đến thay đổi cấu trúc, chất đồng hoạt hóa (co-activator: p300, CBP, SRC) hoặc chất đồng ức chế (co-

repressor: NcoR, SMRT) [57]

1.2.3 Vai trò chính của từng loại thụ thể PPAR

PPARs là các thụ thể cảm biến của acid béo và các dẫn xuất của acid béo[58] PPARs điều hòa hoạt động các gen đích giúp cân bằng năng lượng, nội môi

glucose, chuyển hóa triglycerid và lipoprotein, tổng hợp acid béo, oxy hóa, lưu trữ

và sản xuất, tăng sinh tế bào, viêm và chức năng mô mạch máu [50] Các thụ thể PPAR được mã hóa bởi các gen khác nhau [38] và đảm nhiệm các vai trò cụ thể chuyển biệt (Bảng1.1)

Bảng 1.1 Đặc điểm và vai trò PPARα, PPARδ và PPARγ

Phân bố Gan, tim, cơ xương,

mô mỡ nâu, ruột, thận [59]

Mô mỡ, cơ xương, đại thực bào, não và

da [60]

Mô mỡ trắng, gan, cơ xương, ruột, tế bào miễn dịch [61]

Vai trò Đóng vai trò trung

tâm trong chuyển hóa lipid và lipoprotein có thể làm giảm rối loạn lipid máu liên quan đến MetS Ngoài ra PPARα còn liên quan đến cơ chế kháng viêm [62]

Tham gia vào con đường chuyển hóa lipid tại các mô mỡ

PPAR-β / δ có liên quan đến việc tăng

sự phát triển của tế bào ung thư trong

ống nghiệm và in

vivo [63]

Cải thiện chuyển hóa lipid, đặc biệt tham gia kiểm soát đường huyết đái tháo đường tuýp 2, làm tăng độ nhạy của insulin lên tế bào [64]

Các hợp chất

chủ vận

Fenofibrat, clofibrat, gemfibrozil [65]

GW501516 [66] Rosiglitazon,

pioglitazon, troglitan, eiglitazon [67]

Hình 1.5 Các chất chủ vận trên thụ thể PPARα (fenofibrat, clofibrat, gemfibrozil), PPARδ

(GW501516), PPARγ (rosiglitazon, pioflitazon, troglitazon)

1.3 HỢP CHẤT TỰ NHIÊN

Các hợp chất tự nhiên như alkaloid, terpenoid, saponin,….đặc biệt là flavonoid có trong nhiều dược liệu đã được nghiên cứu với những tác dụng điều trị khác nhau, trong đó có điều trị rối loạn lipid máu thông qua các cơ chế khác nhau Đây chính là nguồn phong phú cho việc nghiên cứu các loại thuốc mới hay các chất khởi nguồn tiềm năng có hiệu quả và an toàn [15-19]

1.3.1 Cấu trúc hóa học

Cấu trúc của một số hợp chất tự nhiên như alkaloid, flavonoid, terpenoid, flavonoid được minh họa trong hình 1.6 Ví dụ, flavonoid có một flavan hạt nhân của 15 nguyên tử cacbon, được sắp xếp thành ba vòng, C6-C3-C6 (A-C-B), vòng giữa C là một vòng pyran dị vòng, liên kết đến vòng thơm A và B ở hai bên 1 (Hình 1.6) [68] Thông thường các nhóm thế hydroxy, metoxy, O-glycosyl hóa hoặc C-glycosyl hóa được tìm thấy trong vòng Một số biến đổi khác trên vòng C tạo các nhóm cấu trúc:

chalcon 8, dihydrochalcon 8a, auron 9 (Hình 1.6) [69]

Hình 1.6 Một số hợp chất tự nhiên thuộc các nhóm alkaloid, terpenoid và flavonoid

1.3.2 Công dụng của các hợp chất tự nhiên trong rối loạn chuyển hóa

Một số cây thuốc có các hợp chất có hoạt tính sinh học đã được báo cáo về tác dụng

hạ lipid máu thông qua các cơ chế khác nhau chính là nguồn phong phú cho các loại thuốc mới hiệu quả và an toàn [15-19] Chẳng hạn, các anthraquinon có trong

Rheum officinale; ginsenosid, ginseng, và polysaccharid trong Radix ginseng;

triterpen trong Rhizoma alismatis, cho tác dụng giảm triglycerid và LDL [18]

Một số hợp chất cũng đã được chứng minh là các chất chủ vận PPARα như

picrasidin C (một alkaloid có trong rễ của Picrasma quassioides); bixin (một carotenoid vỏ hạt cùa Bixa orellana); naringenin (flavanon có trong quả khô của

Citrus aurantium); secoiridoid excelside B và một số chất chuyển hóa từ Fraxinus excelsior L., [19] Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra vai trò của flavonoids trong việc

điều hòa nội môi cơ thể, và có mối liên hệ với thụ thể PPARs [70-72] Chẳng hạn:

- Tác động trên PPARα: wogonin hoạt hóa PPARα với lợi ích giảm lipid máu qua thí nghiệm trên chuột [73]

- Tác động trên PPARγ: rutin hoạt hóa thụ thể làm cải thiện sự hấp thu glucose và

sự kháng insulin trên chuột [74]; kaempferol giảm sự biểu hiện PPARγ thông qua kích hoạt AMPK trên chuột [75], luteolin hoạt hóa PPARγ với những gen

đích là adiponectin, leptin và GLUT4 [76], epigallocatechin gallate hoạt hóa trên PPARγ thí nghiệm trên chuột [77]

- Phần lớn là các chất đồng tác động trên PPARα và PPARγ: eriodictyol tăng sự hoạt động của PPARγ, tăng sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình oxy hóa acid béo CPT và PPARα, trong gan của chuột béo phì [75] Naringin giảm mức độ FFAs lipotoxic trong huyết tương bằng cách tăng mức độ biểu hiện của các gen PPARα, giảm tích tụ lipid ở gan thông qua kích hoạt AMPK liên quan PPARγ trên chuột [71] Hesperidin cải thiện biểu hiện PPARγ ở gan và tế bào mỡ liên quan đến tổng hợp TG

và cholesterol và tăng biểu hiện của PPARα [74] Daidzein giúp chuột giảm đáng kể khối lượng lipid trong các mô mỡ và gan bằng cách tăng hoạt hóa PPARα và PPARγ

để giảm FFAs [78] Formononetin cải thiện độ nhạy insulin trong tổng hợp glycogen và khối lượng gan nhiễm mỡ bằng cách hoạt hóa PPARα và PPARγ trên chuột [79] Genistein giúp chuột giảm đáng kể khối lượng lipid trong các mô mỡ do tác động lên PPARα và PPARγ để giảm FFAs [78] (Hình 1.6)

- Hình 1.6 Các flavonoid thuộc khung (A) flavonol (rutin, kaempferol, eriodictyol,

quercetin), (B) flavon (luteolin, wogonin), (B) flavan (naringin, hesperidin), (D) flavanol (epigallocatechin gallate), (E) isoflavon (daizein, formononetin, genistein)

1.4 CÁC KỸ THUẬT IN SILICO

Trong những năm gần đây, các kỹ thuật khảo sát sự gắn kết in silico (phương pháp

dựa trên sự trợ giúp của máy tính) với các kỹ thuật như: gắn kết phân tử, động lực học phân tử,… đã trở thành một hướng đi mới đầy tiềm năng trong nghiên cứu thuốc Nhờ sự cải tiến nhanh chóng của khả năng tính toán và sự phát triển của hóa học và tính toán sinh học, các kỹ thuật này đã được áp dụng thành công trong hầu hết các giai đoạn của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc để đẩy nhanh quá trình, định hướng cho tổng hợp, giảm chi phí và rủi ro liên quan đến các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng

1.4.1 Gắn kết phân tử (Molecular docking)

1.4.1.1 Khái niệm

Gắn kết phân tử (molecular docking) là phương pháp mô phỏng quá trình gắn kết của phân tử này vào phân tử khác, hay nói cách khác dùng để tìm kiếm phối tử phù hợp với các vị trí liên kết của protein nhằm đạt được cấu trúc tối ưu hóa cho cả protein và phối tử, sao cho năng lượng gắn kết của phức hợp là nhỏ nhất [80] Mục tiêu của gắn kết phối tử - protein (protein - ligand) là khám phá khả năng gắn kết, phương thức gắn và ái lực gắn kết của ligand

1.4.1.2 Yêu cầu thực hiện gắn kết phân tử

- Cấu trúc 3D của protein mục tiêu: Thường là các đại phân tử như (protein,

ADN, ARN…) [81] Cấu trúc ba chiều của các đại phân tử thu được từ thực nghiệm có thể được tìm kiếm từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB) [82] Tuy nhiên nếu không có cấu trúc có sẵn có thể sử dụng phương pháp mô hình hoá cấu trúc tương đồng để dự đoán cấu trúc protein mục tiêu [83]

- Vị trí gắn kết: Thông thường, vị trí gắn kết của các ligand trên protein mục tiêu

phải được xác định từ các cấu trúc thực nghiệm Trong trường hợp thiếu thông tin về vị trí gắn, có thể dự đoán thông qua các chương trình dự đoán hay sử dụng docking mù trên cả cấu trúc protein để tìm kiếm các vị trí gắn tiềm năng [84]

- Cấu trúc ligand: ligand có thể là các chất có sẵn trong các cơ sở dữ liệu phân tử

nhỏ như ZinC [85], Pubchem [86], ChemSpider [87]… Những ngân hàng dữ

liệu trực tuyến này chứa một lượng lớn các phối tử cho sàng lọc ảo Cấu trúc 3D của ligand cũng có thể được xây dựng từ cấu trúc 2D bằng cách sử dụng các phần mềm như ChemSketch, ChemDraw, Avogadro…

1.4.1.3 Các giai đoạn quan trọng

Thông thường một quá trình mô phỏng gắn kết giữa ligand và protein sẽ gồm 2 bước cơ bản: tìm cấu dạng ligand (sampling) và đánh giá kết quả phức hợp (scoring):

Tìm kiếm cấu dạng ligand

Việc chọn cấu dạng ligand phù hợp nhất với khoang gắn kết sẽ được thực hiện bởi

nhiều thuật toán khác nhau Thuật toán tìm kiếm (search algorithms) với các chiến

lược tìm kiếm thường được phân làm 3 loại cơ bản

- Tìm kiếm có hệ thống (systematic searches): Thuật toán có thể chia làm thuật

toán tìm kiếm toàn diện và phân mảnh các thuật toán Thuật toán này cố gắng khám phá tất cả các mức độ tự do trong phân tử được quy định bởi sự quay các liên kết, góc độ và kích thước gia số Tìm kiếm toàn diện khám phá một cách có

hệ thống các giá trị của từng bậc tự do theo cách tổ hợp [88]

- Tìm kiếm ngẫu nhiên (random or stochastic method): tạo những thay đổi ngẫu

nhiên đối với một phối tử hoặc một tập hợp phối tử được đánh giá bằng một hàm xác suất xác định trước Chiến lược này tăng xác suất tìm thấy mức tối thiểu toàn cục [89]

- Tìm kiếm quyết định hay mô hình hóa (deterministic or simulation searches):

không chứa các biến ngẫu nhiên và không có mức độ ngẫu nhiên, bao gồm hầu hết các phương trình sai phân Những phương trình này có đầu vào đã biết và dẫn đến một tập hợp các đầu ra duy nhất Các mô hình quyết định thường được thiết kế để để nắm bắt một số cơ chế cơ bản hoặc quá trình tự nhiên [90]

Chấm điểm (scoring functions)

Sau khi tạo ra các cấu dạng khác nhau của phối tử, các chức năng tính điểm được sử dụng để xếp hạng và chọn cấu dạng phù hợp nhất cho quá trình gắn protein vào mục tiêu Quá trình này có thể dựa trên năng lượng gắn kết [91]

Trước đây chức năng tính điểm được phân làm ba loại: chấm điểm dựa trên trường lực (force field-based scoring functions) , dựa vào kinh nghiệm ( empirical-based) và dựa theo kiến thức (knowledge-based) [88] Ngày nay, với sự cải thiện trong nghiên cứu các hàm chấm điểm, đặc biệt là tương tác protein – ligand, có 4 dạng chấm

điểm: dựa trên vật lý (physics - based), dựa trên kinh nghiệm (empirical -based), dựa trên kiến thức (knowledge – based) và học máy (machine learning – based)

- Dựa trên vật lý (physics – based): tính toán dựa trên trường lực cổ điển tính năng lượng liên kết bằng tổng năng lượng liên kết van der Waals và tương tác tĩnh điện giữa các cặp nguyên tử của protein – phối tử, trong đó có xét đến sự đóng góp enthalpy vào năng lượng và bỏ qua hiệu ứng của entropy và dung môi [92]

- Dựa trên kinh nghiệm (empirical): ước tính ái lực gắn kết của phức hợp bằng cách tổng hợp các yếu tố năng lượng quan trọng để liên kết protein – phối tử, chẳng hạn: liên kết hydro, liên kết kỵ nước, xung đột điện tử (steric)…Bởi vì thuật ngữ năng lượng đơn giản, phép tính này có thể dự đoán mối liên quan gắn kết, vị trí phối tử [93]

- Dựa trên kiến thức (knowledge – based): lấy từng cặp mong muốn tiềm năng từ các cấu trúc ba chiều của một tập hợp lớn phức protein-phối tử dựa trên nguyên tắc thống kê Boltzmann nghịch đảo Giả định rằng tần số của các cặp nguyên tử khác nhau trong các khoảng cách khác nhau có liên quan đến tương tác của hai nguyên tử và chuyển đổi tần số thành thế năng phụ thuộc khoảng cách của lực trung bình [94]

- Học máy (machine leaning – based): với hàm toán học giả định dựa trên dựa trên máy học sử dụng một loạt các thuật toán học máy, chẳng hạn như hỗ trợ vector máy (support vector machine), dữ liệu ngẫu nhiên (random forest), mạng nơ-ron (neural network), học sâu (deep-learning)… [94]

1.4.1.4 Các phần mềm molecular docking

Những năm qua, rất nhiều công cụ và chương trình gắn kết phân tử ra đời (Bảng 1.2) Mỗi phần mềm có tính năng riêng, việc lựa chọn phần mềm phụ thuộc vào protein mục tiêu và sở thích của người nghiên cứu

Bảng 1.2 Các phần mềm gắn kết phân tử

Tài liệu tham khảo

Bán kinh

Glide Tìm kiếm có hệ thống

FlexX Dựa trên phân mảnh,

MOE Thuật toán lan truyền Kinh nghiệm

và dung môi [100]

1.4.2.2 Yêu cầu thực hiện

- Biết được vị trí và chuyển động của mọi nguyên tử tại mọi thời điểm

- Các điều kiện mô phỏng được biết chính xác và có thể được kiểm soát cẩn thận: cấu trúc ban đầu của một protein, những phối tử nào được liên kết với nó, cho

dù nó có bất kỳ đột biến hoặc sửa đổi sau dịch mã hay không, những phân tử nào khác có trong môi trường của nó, proton hóa của nó trạng thái, nhiệt độ, điện áp trên màng… [101]

Sự chuyển động của hệ thống theo thời gian có thể được mô phỏng bằng tập hợp các phương trình chuyển động trên cơ sở định luật II Newton của cơ học cổ điển cho tất cả các nguyên tử trong hệ thống (công thức 4) [102]

Với i là số thứ tự của nguyên tử, m là khối lượng, a là gia tốc, F là lực tác động

1.4.2.3 Các giai đoạn quan trọng

Quá trình mô phỏng động lực học phân tử bao gồm các giai đoạn sau:

- Tạo hộp mô phỏng như hộp lập phương, hộp đa diện hay hình cầu,… cho cấu trúc với các nguyên tử trong hệ, sau đó bổ sung dung môi Dung môi có thể là bên trong (implicit) hoặc bên ngoài (explicit) solvat hóa protein và bắt chước môi trường sinh lý trong cơ thể Sau đó trung hòa điện tích tổng thể của hệ thống, sử dụng ion Na+ hoặc Cl- [103]

- Tối thiểu hóa năng lượng để đưa cấu hình bắt đầu gần với trạng thái cân bằng Bước này được thực hiện dựa trên thuật toán gradient descent nhằm tìm ra cực tiểu của hàm số năng lượng [103]

- Cân bằng: với điều kiện NVT (số hạt N, thể tích V và nhiệt độ T) và NPT (số hạt

N, áp suất P và nhiệt độ T) để tránh biến dạng không cần thiết của protein Bể nhiệt Berendsen được sử dụng để duy trì nhiệt độ và bể áp Parrinello-Rahman duy trì áp suất Thuật toán Particle Mesh Ewald dùng để mô phỏng tương tác tĩnh điện học và thuật toán Velvet được dùng để tìm các nguyên tử xung quanh

và biến thiên hệ theo thời gian [103]

- Mô phỏng động lực học phân tử cho hệ thống phụ thuộc thời gian Sau khi hệ trải qua khoảng thời gian [103]

1.4.2.4 Đánh giá kết quả chạy MDs

Sau khi kết thúc quá trình mô phỏng động lực học phân tử, phức hợp protein - ligand sẽ được đánh giá qua các đại lượng sau [102]:

- RMSD (Root - Mean - Square Deviation)

Là căn bậc hai độ lệch bình phương trung bình của protein hoặc ligand so với vị trí ban đầu đầu và được sử dụng để xem xét protein có ổn định với cấu trúc thí nghiệm hay không (công thức 5) [104]:

Với ri(t1) là vị trí của nguyên tử i tại thời điểm t1, ri(t2) là vị trí của nguyên tử i tại thời điểm t2 = 0, N là tổng số nguyên tử trong hệ

Thông thường, giá trị RMSD được tính trên mạch chính (backbone) của protein, bao gồm những nguyên tử N, Cα, và C của protein Cấu trúc được xem ổn định và

có ý nghĩa khi RMSD < 2.0 Å [105]

- RMSF (Root - Mean - Square Fluctuation)

Là căn bậc hai độ dao động trung bình bình phương để khảo sát dao động của các acid amin của protein so với giá trị trung bình, thể hiện độ linh động của mỗi acid amin (công thức 6) [106]

Với ri (tj) là vị trí của nguyên tử i tại thời điểm tj, riref là vị trí của i đối chiếu

Từ kết quả của RMSF, ta có thể thấy được vùng nào của protein là ổn định hoặc không Thông thường các vùng có cấu trúc xoắn α hoặc β sẽ có RMSF thấp do có mạng lưới liên kết hydro ổn định [107]

- Tần suất của liên kết hydro (Hbond occupancy)

Đánh giá tần suất biểu hiện của liên kết hydro, xem xét protein có được ổn định bởi các liên kết hydro giữa các acid amin hay giữa acid amin với ligand hay không, quá trình dao động bao nhiêu trong mô phỏng Liên kết hydro sẽ được tính dựa trên kết quả động lực học bằng phần mềm VMD 1.9.4 [108]

- Bán kính quay (Radius of Gyration - Rg)

Rg đo độ nén của protein Nếu một protein giữ vững cấu trúc trong quá trình mô phỏng động lực học thì giá trị Rg tương đối ổn định Nếu một protein mở ra (không

ổn định), Rg không tăng hoặc có xu hướng giảm (công thức 7) [104]:

Với ri là vị trí của nguyên tử i; mi là khối lượng nguyên tử i

- Diện tích bề mặt tiếp xúc với dung môi (Solvent - accessible surface area - SASA)

môi, xác định độ hòa tan của protein trong nước, cách protein tương tác với các phân tử khác và tạo thành một dạng hoạt động ổn định Trong quá trình đó, nếu cấu trúc protein gấp ổn định thì diện tích bề mặt nhỏ, SASA ổn định Nếu protein không

ổn định, không còn cấu trúc gấp làm diện tích bề mặt lớn, SASA tăng [109]

1.4.2.5 Các phần mềm chạy động học

Hiện nay, nhiều gói phần mềm đã được thiết kế sẵn để phục vụ cho việc mô phỏng động lực học phân tử Bảng, chức năng cốt lõi của chúng là tương tự, bao gồm AMBER, NAMD, GROMACS, QWIKMD cùng với phần mềm chiếm ưu thế để hiển thị kết quả mô phỏng là VMD Ba trường lực chính được sử dụng cho MDs là CHARMM, AMBER, OPLS - AA

GROMACS

GROMACS, viết tắt của GROningen MAchine for Chemical Simulation, là một chương trình MDs linh hoạt và hiệu quả, đặc biệt hướng tới mô phỏng các phân tử sinh học (vĩ mô) trong môi trường nước và màng, và có thể chạy trên các bộ xử lý đơn cũng như trên các hệ thống máy tính song song [110] Để thực hiện một mô phỏng động lực bằng GROMACS, cần chuẩn bị các file chính như tệp hệ thống gro, tệp thông số mdp, tệp tpr chứa ngôn ngữ lập trình GROMACS có lợi thế là một nguồn mở và bao gồm rất nhiều công cụ phân tích, từ phân tích quỹ đạo đồ họa

mở rộng đến chế độ bình thường và phân tích thành phần chính của cấu trúc [110]

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

Nhiều thành tựu đạt được trong lĩnh vực phát triển thuốc như sự thành công của hai loại thuốc fibrate và TZD tác dụng chủ vận lần lượt trên PPARα và PPARγ, các

công trình nghiên cứu qua phương pháp xét nghiệm tế bào học, in vitro cũng được

thực hiện cho kết quả triển vọng

1.5.1 Trên thế giới

Fibrat là chất chủ vận PPARα được sử dụng làm giảm lipid, đặc biệt giảm TG, có vai trò giảm tình trạng xơ vữa động mạch và rối loạn chuyển hóa Các chất chủ vận PPARγ tổng hợp từ dẫn xuất thiazolidinediones (TZDs), là các chất làm giảm glucose mạnh, cải thiện độ nhạy insulin trong mô mỡ và cơ xương Cho đến nay vẫn

chưa có phối tử chủ vận nào trên PPARδ được chấp nhận trên lâm sàng [111, 112]

Các nghiên cứu gần đây hướng đến chất đối kháng hay chủ vận đồng thời trên cả 2 thụ thể (dual-agonist) PPARα và PPARγ hay 3 thụ thể (pan-agonist) PPARs nhằm tìm ra thuốc có tác dụng hiệu quả điều trị kép [112, 113] Với sự hỗ trợ của máy tính, nhiều kết quả nghiên cứu được tạo ra cho kết quả khả quan và làm tiền đề để thiết kế thuốc mới chủ vận đồng thời trên PPARs (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Các nghiên cứu trên thế giới về các chất chủ vận đồng thời trên PPARs

với sự hỗ trợ của máy tính

cứu

1 LY465608

Thuật toán dịch chuyển

và glide docking

7 hợp chất mới được tạo ra từ chất chủ vận kép trên PPARs (LY465608) đều có tiềm năng chủ vận toàn phần trên 3 thụ thể

[113]

2 LYSO-7 Docking, xét

nghiệm gen

Hợp chất tổng hợp chủ vận toàn phần trên cả ba thụ thể PPARα, PPARγ và PPARδ

[114]

3 Sodelglitazar

Docking, mô phỏng động lực học phân

tử

Sodelglitazar có thể hình thành liên kết hydro với chuỗi xoắn AF-

2 của PPARs để ổn định chuỗi xoắn AF-2 trong một cấu trúc hoạt động, chủ vận kép PPARs

[116]

[117]

6 AL29-26

Sàng lọc ảo dấu vân tay, docking

AL29-26 chủ vận toàn phần trên PPARα và chủ vận một phần trên PPARγ

[118]

7 Rosiglitazon

Thuật toán dịch chuyển

và docking

Hợp chất 1 được tạo ra từ rosiglitazon hoạt động như một chất chủ vận kép PPARα/γ/δ

MCFAs chủ vận chọn lọc trên PPARγ và chủ vận kép một phần trên PPARs

Hình 1.7 Các hợp chất gần đây được nghiên cứu trên thế giới có tác động chủ vận

đồng thời trên 2 hay cả 3 thụ thể PPARα, PPARγ và PPARδ

1.5.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến họ thụ thể PPARs cũng được quan tâm

Các nghiên cứu thường tập trung vai trò dược lý của PPARs, các thử nghiệm in

vitro, vai trò của các thuốc chủ vận fibrat, thiazolidinedion… [122-124] Tuy nhiên,

các nghiên cứu về các thụ thể PPARs, đặc biệt là hợp chất tự nhiên vẫn chưa được thực hiện

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Protein mục tiêu

Được lấy từ nguồn dữ liệu Protein Data Bank (http://www.rcsb.org), với các tiêu chí (1) độ phân giải, (2) sự đầy đủ của acid amin trên protein, (3) có hay không cấu trúc (ligand) đồng kết tinh, (4) vai trò của ligand đồng kết tinh phù hợp với mục tiêu nghiên cứu Dựa vào những tiêu chí này, đề tài chọn ra cấu trúc với mã PDB: 5HYK (PPARα), 3NOA (PPARγ) và 3GZ9 (PPARδ) (Hình 2.8) trích dẫn

Hình 2.8 Ba thụ thể PPARα, PPARγ và PPARδ với các mã PDB là: 5HYK, 3NOA, 3GZ9 2.1.2 Ligand

Thư viện sàng lọc gồm 2 phần:

- Các hợp chất tự nhiên (142 chất) thu thập từ 29 dược liệu khác nhau Các hợp chất có hoạt tính sinh học hạ lipid máu đa dạng thuộc bốn nhóm chính, flavonoid, terpenoid, alkaloid và saponin, được lựa chọn cho nghiên cứu Để hỗ trợ việc phát hiện thuốc trong bước tiếp theo, các cây thuốc sau đó được tìm kiếm có chứa các hợp chất Tổng cộng, có 142 hợp chất tự nhiên từ 29 cây thuốc bao gồm alkaloid (51 hợp chất), flavonoid (36 hợp chất), terpenoid (33 hợp chất)

và saponin (22 hợp chất) được lựa chọn [125-132]

- Cơ sở dữ liệu Pubchem (3848 flavonoid) với các từ khóa: anthocyanin,

isoflavon, flavanol, flavanone, flavonol, flavon, auron, dihydrochalcon, chalcon

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Trang thiết bị và phần mềm

Nghiên cứu sử dụng các phần mềm được trình bày ở Bảng trên máy tính HP có hệ điều hành Windows 10 với chip Intel(R) Core(TM) i56400, RAM 4,00 GB 2.2.2 Quá trình mô phỏng động lực học phân tử thực hiện trên hệ điều hành Ubuntu 18.04, 64 bit, NVIDIA GTX 1050

Bảng 2.4 Danh sách các phần mềm được sử dụng trong đề tài

Phần mềm và

công cụ

Bản quyền

Phiên bản

Nhà sản xuất

Mục đích

Chem Draw 3D

Cambridge Soft

Chuẩn bị ligand và tối thiểu hóa năng lượng ligand

Discovery Studio

AutoDock Tool Mở 1.5.6 AutoDock Chuẩn bị thông số gắn kết

Xây dựng và đánh giá mô hình pharmacophore

2.2.2.1 Chuẩn bị protein cho docking

Protein được tải về từ ngân hàng dữ liệu PDB, tách ra phần protein và ligand kết

tinh bằng phần mềm Discovery studio 2021 lưu dưới file pdb, protein sau đó được chuẩn bị bằng phần mềm AutoDock tool 1.5.6 Đầu tiên, loại nước và các dung môi

khác, thêm hydro Xác định khoang gắn kết, xác định tọa độ Grid box (Bảng 2.5) Lưu tọa độ grid box dưới dạng txt Cuối cùng lưu protein dưới dạng pdbqt

Bảng 2.5 Tọa độ Grid box vị trí khoang gắn kết ứng với các PPARs

- Ligand được vẽ bằng phần mềm Chemdraw 2D hoặc tải về từ ngân hàng dữ liệu

Pubchem Tối thiểu hóa năng lượng cho ligand bằng phần mềm Chem3D 20.0

- Chuyển thành tệp pdbqt bằng AutodockTools 1.5.6

2.2.2.3 Gắn kết phân tử

Tiến hành docking bằng AutoDock Vina, sử dụng Command prompt, với câu lệnh

dir /B >ligand.txt để tập hợp các tên ligand có trong thư mục Lệnh perl mdock_vina.pl để chạy bằng chương trình perl Câu lệnh ligand.txt để chương trình

nhận diện tệp ligand Quá trình docking các hợp chất có trong thư mục vào protein

đã chuẩn bị và sẽ thực hiện tự đồng lần lượt

2.2.3 Mô phỏng động lực học phân tử

Sau khi chuẩn bị xong protein và ligand, các bước tiếp theo được thực hiện như sau

- Chuẩn bị topology: Cấu trúc liên kết (topol.top theo mặc định) chứa tất cả

thông tin cần thiết để xác định phân tử trong mô phỏng Thông tin này bao gồm các thông số không liên kết (loại nguyên tử và điện tích) cũng như các thông số

ngoại quan (liên kết, góc và khối nhị diện) Thực hiện bằng câu lệnh gmx

pdb2gmx Trường lực Charmm36 được sử dụng

- Tạo hộp mô phỏng và thêm dung môi: thực hiện xác định kích thước hộp bằng module editconf và đổ đầy nước vào hộp bằng cách sử dụng module solvate

Hộp lập phương (cubic) được tạo ra với độ dài mỗi cạnh 1 nm Solvate hóa với

số phân tử nước thêm vào của apoprotein các loại 5HYK, 3NOA và 3GZ9 và trong phức hợp với F85 và F97 (đối với trường hợp 5HYK): 16481, 17952,

17182, 16457, 17952, 17183, 16481

- Thêm ion: hệ được thêm ion Na+ hoặc ion Cl- để đảm bảo hệ thống được cân bằng điện tích Công cụ để thêm các ion trong GROMACS được gọi là genion Ion hóa với số phân tử Na+ hay Cl- thêm vào của apoprotein các loại 5HYK, 3NOA và 3GZ9 và trong phức hợp với F85 và F97 (đối với trường hợp 5HYK):

4 Na+, 5 Na+, 2 Cl+, 4 Na+, 5 Na+, 2 Cl+, 4 Na+

- Tối thiểu hóa năng lượng (Energy minimization): Trước khi có thể bắt đầu động

lực học, phải đảm bảo rằng hệ thống không có xung đột điện tử hoặc hình dạng không phù hợp Cấu trúc được nới lỏng thông qua một quá trình được gọi là

giảm thiểu năng lượng Sử dụng câu lệnh gmx make_ndx để tạo file tọa độ

index.ndx chứa hệ thống hoàn chỉnh Protein Water_and_ions để chạy cân bằng

- Cân bằng (Equilibration): Để bắt đầu động lực học thực sự, phải cân bằng dung

môi và các ion xung quanh protein Cần được đưa đến nhiệt độ mà chúng ta mong muốn để mô phỏng và thiết lập định hướng thích hợp về chất tan (protein) Sau khi quá trình đến nhiệt độ chính xác (dựa trên động năng), tạo áp suất lên hệ thống cho đến khi nó đạt đến mật độ thích hợp Bước tiếp theo là cân bằng áp suất Nhiệt độ 300K, áp suất 1 bar trong khoảng thời gian 100 ps

- Mô phỏng động lực học (MDs): hệ được chạy mô phỏng động lực học với thời gian 20 ns Các thông số được quy định trong file md.mpd, tại nhiệt độ 300K, áp

suất 1 bar Bước chuẩn bị MD được thực hiện sử dụng các file được xuất ở bước trước và câu lệnh gmx mdrun để mô phỏng quá trình động lực học phân tử Kết

quả phần mềm xuất được dưới dạng *.xtc để phân tích

Phân tích và trích xuất dữ liệu

- Kết quả được lưu mỗi 0,01 ns và được đánh giá qua RMSD, RMSF, tần suất của

liên kết hydro (Hydrogen bond occupancy), Rg và SASA