Xây dựng quy trình phát hiện ctDNA bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới trong ung thư đại trực tràng giai đoạn sớm

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ

ỦY BAN NHÂN DÂN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN CtDNA BẰNG CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI

TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG GIAI ĐOẠN SỚM

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM

Chủ nhiệm nhiệm vụ: GS.TS.BS Trần Diệp Tuấn

Thành phố Hồ Chí Minh – 2021

ĐẠI HỌC Y DƯỢC CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021

BÁO CÁO THỐNG KÊ

KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ: Xây dựng qui trình phát hiện ctDNA bằng công nghệ

giải trình tự thế hệ mới trong ung thư đại trực tràng giai đoạn sớm

Thuộc: Chương trình/lĩnh vực: Công nghệ sinh học/Y Dược

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

2.1 Đồng chủ nhiệm nhiệm vụ

- Họ và tên: Trần Diệp Tuấn

- Ngày tháng năm sinh: 1967 Giới tính: Nam

- Học hàm, Học vị: Giáo sư, Tiến sĩ, Bác sĩ Chuyên ngành: Nhi

- Năm đạt học vị: 2003

- Chức danh khoa học: Giáo sư Năm được phong chức danh: 2021

- Tên cơ quan đang công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

- Chức vụ: hiệu trưởng

- Địa chỉ cơ quan: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, Tp HCM

- Điện thoại cơ quan: 028.38558441 Fax: 028.38552304

- E-mail: Website: http://www.yds.edu.vn

- Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, phường 11, quận 5, Tp HCM

- Họ và tên thủ trưởng tổ chức: NGUYỄN HOÀNG BẮC

- Số tài khoản: 3713.0.1057277.00000

- Tại ngân hàng: kho bạc Nhà nước: quận 5, Tp HCM

- Tên cơ quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học Công nghệ TP Hồ Chí Minh

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ:

- Theo Hợp đồng số 52/2019/HĐ-QPTKHCN đã ký kết: từ 12 tháng 08 năm

2019 đến 12 tháng 08 năm 2021

- Thực tế thực hiện: từ 31 tháng 7 năm 2019 đến 31 tháng 7 năm 2021

- Được gia hạn (nếu có): Không gia hạn

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr đ)

Đối với đề tài:

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quiết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Quyết định về việc phê duyệt nhiệm

vụ nghiên cứu khoa học và công nghệ

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú

TP.HCM

Nội dung 5: xác định ngưỡng

phát hiện của qui trình (tần suất đột biến (MAF) thấp nhất

có thể phát hiện được) và độ lặp của qui trình:

- Ngưỡng phát hiện đột biến của qui trình được phát hiện bằng cách trộn DNA mang đột biến

DNA không mang đột biến tại các nồng độ pha loãng: 1%, 0,1%, 0,05%

và 0,01%

Độ lặp của qui trình được xác

được ngưỡng phát hiện đột biến với tần

nhất là 0,1%

định bằng cách chuẩn bị mẫu

và giải trình tự 3 lần cho mỗi nồng độ pha loãng

Nội dung 6 Xác định độ nhạy

và độ đặc hiệu của qui trình

trình tự giữa mẫu máu và mô u tương ứng từ 50 bệnh nhân UTĐTT để khẳng định sự chính xác của qui trình trong phát hiện đột biến sinh dưỡng

Kết quả giải trình tự được ngoại kiểm bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên 10 mẫu mô u ngẫu nhiên

hiện ctDNA trong 50 bệnh nhân UTĐTT và nhóm đối chứng để xác định độ nhạy và

độ đặc hiệu của qui trình:

- Độ nhạy là tỉ lệ phát hiện ctDNA trong 50 mẫu UTĐTT

Độ đặc hiệu là tỉ lệ âm tính với ctDNA trong 100 người khoẻ

mạnh

Xác định độ nhạy của qui trình là 84%

và độ đặc

91,7%

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi

Điều hành chung

Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của qui trình

Thực hiện nội dung 5

và 6

Xác định ngưỡng phát hiện đột biến tối thiểu của qui trình

Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của qui trình sinh thiết lỏng

Thực hiện nội dung 1

Bộ mẫu UTĐTT và bộ mẫu nhóm người khoẻ mạnh theo yêu cầu của đề cương nghiên cứu

Phối hợp thực hiện nội dung 5

và 6

Xác định ngưỡng phát hiện đột biến tối thiểu của qui trình

Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của qui trình sinh thiết lỏng

TS Phan Minh Duy

đi công tác dài hạn

BS Ngô

Quốc

Đạt

BS Ngô Quốc Đạt

nội dung 1 nhóm người khoẻ mạnh theo yêu

cầu của đề cương nghiên cứu

Thực hiện nội dung 1

Bộ mẫu UTĐTT và bộ mẫu nhóm người khoẻ mạnh theo yêu cầu của đề cương nghiên cứu

Thực hiện nội dung 1

Bộ mẫu UTĐTT và bộ mẫu nhóm người khoẻ mạnh theo yêu cầu của đề cương nghiên cứu

Quốc Chương

hỗ trợ thực hiện

kĩ thuật

- Lý do thay đổi (nếu có):

+ TS Phan Minh Duy công tác nước ngoài dài hạn, được thay thế bổ sung là ThS Lương Bắc An tiếp tục công việc nghiên cứu của đề tài

+ Bổ sung CN Hồ Quốc Chương hỗ trợ kĩ thuật cho nghiên cứu

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số

đoàn, số lượng người tham gia )

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Nội dung 1 Tuyển

9/2019-Hoàn thành

-GS.TS.BS Trần Diệp Tuấn (ĐH Y Dược, TP HCM)

UTĐTT giai đoạn I, II,

III và chưa qua điều trị

- ThS BS Trần Đức Huy (ĐH Y Dược, TP HCM)

2 Nội dung 2 Tách chiết

cfDNA từ huyết tương

sử dụng kít MagMAX

(Thermo Scientific)

12/2019-

12/2020

Hoàn thành 100%

công việc

-PGS.TS.BS Đỗ Thị Thanh Thuỷ (ĐH Y Dược, TP HCM)

- TS Nguyễn Hoài Nghĩa (ĐH Y Dược, TP HCM)

- TS Trần Lê Sơn

- CN Hồ Quốc Chương (ĐH Y Dược, TP HCM)

12/2020

Hoàn thành 100%

công việc

- PGS.TS.BS Đỗ Thị Thanh Thuỷ (ĐH Y Dược, TP HCM)

- TS Nguyễn Hoài Nghĩa (ĐH Y Dược, TP HCM)

- TS Trần Lê Sơn (

- CN Hồ Quốc Chương (ĐH Y Dược, TP HCM)

4 Nội dung 4: Thực hiện

“lai-bắt giữ” để làm

giàu các phân mảnh

cfDNA của 20 gen mục

tiêu sử dụng kit

xGen-IDT

12/2019-

12/2020

Hoàn thành 100%

công việc

-PGS.TS.BS Đỗ Thị Thanh Thuỷ (ĐH Y Dược, TP HCM)

- TS Nguyễn Hoài Nghĩa (ĐH Y Dược, TP HCM)

- TS Trần Lê Sơn

- CN Hồ Quốc Chương (ĐH Y Dược, TP HCM)

12/2020

Hoàn thành 100%

công việc

-GS.TS.BS Trần Diệp Tuấn (ĐH Y Dược, TP HCM) -TS Giang Hoa

- ThS Lương Bắc An (ĐH

Y Dược, TP HCM)

mang đột biến chuẩn

không mang đột biến

giải trình tự giữa mẫu

máu và mô u tương ứng

Hoàn thành 100%

công việc

-GS.TS.BS Trần Diệp Tuấn (ĐH Y Dược, TP HCM) -TS Giang Hoa

- ThS Lương Bắc An (ĐH

Y Dược, TP HCM)

mô u ngẫu nhiên

lệ âm tính với ctDNA

trong 100 người khoẻ

mạnh

7 Nội dung 7: Phân tích

dữ liệu, viết báo cáo

nghiệm thu và bài báo

khoa học

7/2021

7/2020-100%

Công việc

-GS.TS.BS Trần Diệp Tuấn (ĐH Y Dược, TP HCM)

- PGS.TS.BS Đỗ Thị Thanh Thuỷ (ĐH Y Dược, TP HCM)

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

đạt được

- Thu mẫu: mẫu không bị tiêu huyết

- Tách chiết cfDNA: hàm lượng cfDNA không thấp hơn 5ng và kích thước trong khoảng 150-250bp

- Chuẩn bị thư viện: hàm lượng của sản phẩm không thấp hơn 100ng và kích thước trong khoảng 300-400bp

- Lai-bắt giữ: nồng độ của sản phẩm không thấp hơn 10nM

- Giải trình tự thế hệ mới: mật độ DNA trên flowcell trong khoảng 160-220k/mm2, chất lượng giải trình tự có Q30 đạt hơn 90%

Độ chính xác của qui trình phải đạt các tiêu chí sau:

Đạt 100%

kế hoạch

Độ nhạy: tối thiểu đạt 70%

Độ đặc hiệu: tối thiểu đạt 96%

Cơ sở dữ liệu về đột biến sinh dưỡng và MAF

từ 50 mẫu máu và 50 mẫu mô u tương ứng từ bệnh nhân UTĐTT

Đạt 100%

kế hoạch

bố

(Tạp chí, nhà xuất bản)

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

khoa học Hằng, Lê Gia Hoàng Linh, Hồ

Quốc Chương, Giang Hoa, Trần Đức Huy, Nguyễn Thị Quỳnh Thơ, Nguyễn Hoài Nghĩa, Ngô Quốc Đạt, Nguyễn Hoàng Bắc, Đỗ Thị Thanh Thuỷ, Trần Diệp Tuấn

(2021) So sánh kiểu đột biến gen

giữa mẫu sinh thiết lỏng và sinh thiết mô Y học Thành phố Hồ Chí

Minh, Tập 25, Số 1, Trang

112-118

trong nước

Lê Gia Hoàng Linh, Lương Bắc An,

Hồ Quốc Chương, Giang Hoa, Nguyễn Thị Quỳnh Thơ, Nguyễn Hoài Nghĩa, Ngô Quốc Đạt, Trần Diệp Tuấn, Đỗ Thị Thanh Thuỷ

(2021) Khảo sát phổ đột biến ở

bệnh nhân ưng thư đại trực tràng giai đoạn sớm bằng kĩ thuật giải trình tự thế hệ mới Y học Thành

phố Hồ Chí Minh, Tập 25, Số 1, Trang 118-126

Luong, Duc-Huy Chan, Trong-Hieu Nguyen, Quoc Dat Ngo, Gia Hoang Linh Le, Quoc Chuong Ho, Hue-Hanh Thi Nguyen, Cao Minh

quốc tế

Nguyen, Vu Uyen Chan, Truong Vinh Ngoc Pham, Minh Triet Le, Ngoc An Trinh Le, Trung Kien Le, Thanh Luan Nguyen, Hong-Anh Thi Pham, Hong Thuy Le, Hong Diep Thi Duong, Anh Vu Hoang, Kiet Truong Dinh, Minh-Duy Phan, Hoai-Nghia Nguyen, Thanh-Thuy Thi Do, Hoa Giang, Le Son Chan, Diep Tuan Tran (2021) Ultra-deep sequencing of plasma circulating DNA for detection of tumor-drived mutations in patients with early

stage colorectal cancer Submitted

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

tạo cấp thạc sĩ (số lượng: 2)

Đào tạo 2 học viên:

HV Lê Thị Hồng Thuỷ (ĐH Y Dược TP.HCM; Ngành: Khoa học

y sinh-Hoá sinh y học) Tên luận

2021

văn “Phân tích mối tương quan giữa hàm lượng ctDNA với các đặc điểm lâm sàng của ung thư đại trực tràng”

CBHD: GS.TS.BS Trần Diệp Tuấn

và TS Đường Thị Hồng Diệp

HV Nguyễn Thành Luân (ĐH

Khoa học Tự Nhiên TP.HCM;

Ngành: Di truyền) Tên luận văn:

“Xây dựng qui trình phát hiện biến thể gây bệnh trên cfDNA ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng giai đoạn sớm bằng kĩ thuật giải trình tự gen thế hệ mới”

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Số

TT

Tên kết quả

đã được ứng dụng

Thời gian Địa điểm

(Ghi rõ tên, địa chỉ nơi ứng dụng)

Kết quả

sơ bộ

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình

độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH 5 DANH MỤC BẢNG 6 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 10

I MỤC TIÊU, NỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN NHIỆM VỤ 10 1.1 Tổng quan về ung thư đại trực tràng 10 1.1.1 Dịch tễ của UTĐTT 10 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng 11 1.1.3 Các yếu tố nguy cơ gây UTĐTT 12 1.1.4 Phương pháp điều trị UTĐTT 13 1.1.5 Chẩn đoán sớm UTĐTT 14 1.2 Các phương pháp phát hiện UTĐTT giai đoạn sớm 15 1.2.1 Sinh thiết-đánh giá mô học 15 1.2.2 Phân tích các kháng nguyên trong phân 15 1.2.3 Phân tích vật liệu di truyền 16 1.3 DNA ngoại bào mang đột biến ung thư 19 1.3.1 Nhận dạng đột biến trên ctDNA phục vụ điều trị đích 20 1.3.2 Đánh giá hiệu quả điều trị bằng định lượng ctDNA 21 1.3.3 Tiên lượng khả năng tái phát ung thư 21 1.3.4 Phát hiện ung thư giai đoạn sớm 22 1.3.5 Các phương pháp phát hiện ctDNA 22 1.3.5.1 Phát hiện ctDNA dựa trên kỹ thuật PCR (qPCR và dPCR) 23

1.3.5.2 Phát hiện ctDNA dựa trên công nghệ giải trình tự thế hệ mới 23 1.3.6 Phát hiện UTĐTT giai đoạn sớm dựa trên ctDNA 26 1.4 Mục tiêu của nhiệm vụ 29 1.4.1 Mục tiêu tổng quát 29 1.4.2 Mục tiêu cụ thể 30 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Lưu đồ thực hiện nghiên cứu 31

2.1.1 Xác định ngưỡng phát hiện của qui trình (tần suất đột biến-MAF) 31 2.1.2 Xác định độ nhạy và đặc hiệu của qui trình 32 2.2 Chọn mẫu nghiên cứu 32 2.2.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu 33 2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ 33 2.2.3 Cỡ mẫu cho nghiên cứu 33 2.3 Thiết bị-dụng cụ-hoá chất 34 2.3.1 Thiết bị 34 2.3.2 Dụng cụ - vật liệu tiêu hao 34 2.3.3 Hoá chất 34 2.4 Qui trình thu và lưu trữ mẫu huyết tương 35

2.5 Qui trình tách chiết cfDNA từ huyết tương 35

2.6 Qui trình tách chiết gDNA từ mẫu FFPE và mẫu WBC 36

2.7 Phân mảnh DNA bằng enzyme fragmentase 36

2.8 Kiểm tra nồng độ DNA với hệ thống QFX Fluorometer 36

2.9 Tạo thư viện giải trình tự 37

2.9.1 Chuẩn bị thư viện có gắn mã MID cho mẫu sinh thiết lỏng và WBC 37

2.9.2 Chuẩn bị thư viện DNA từ mẫu FFPE 38 2.9.3 Xây dựng qui trình làm giàu cfDNA từ 20 gen có tần suất đột biến cao nhất trong UTĐTT 38 2.10 Giải trình tự trên hệ thống giải trình tự NextSeq 550 39 2.11 Phân tích dữ liệu giải trình tự 41 2.12 Ngoại kiểm đột biến bằng kĩ thuật giải trình tự Sanger 42 2.13 Xử lí số liệu 42 CHƯƠNG 3: NỘI DUNG KH & CN ĐÃ ĐĂNG KÍ THỰC HIỆN 44 CHƯƠNG 4: CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ BÀN LUẬN 48 4.1 Các sản phẩm ―Dạng II‖ 48 4.1.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 48 4.1.1.1 Đặc điểm giới tính 49 4.1.1.2 Độ tuổi nhóm tham gia nghiên cứu 49 4.1.1.3 Giai đoạn ung thư 50 4.1.1.4 Vị trí của khối u và độ biệt hoá 50 4.1.2 Nồng độ cfDNA tách chiết được từ mẫu huyết tương 50 4.1.3 Gắn mã xác định và tạo thư viện giải trình tự 57 4.1.4 Lai-bắt giữ làm giàu thư viện 20 gen mục tiêu 61 4.1.5 Xây dựng mẫu DNA chứng dương có tần suất khác nhau 65 4.1.6 Đa dạng đột biến ghi nhận trong mẫu sinh thiết lỏng 70 4.1.7 Xác định sự tương đồng kết quả giải trình tự giữa mẫu sinh thiết lỏng và mô u tương ứng 73 4.1.8 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của qui trình sinh thiết lỏng 75 4.1.9 Kiểm tra đột biến được phát hiện bằng phương pháp Sanger 84

4.2 Các sản phẩm ―Dạng III‖ 85

4.3 Các sản phẩm ―Dạng IV‖ 86

5.1 Kết luận 87 5.2 Kiến nghị 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 PHỤ LỤC 1 99 PHỤ LỤC 2 121 PHỤ LỤC 3 164 PHỤ LỤC 4 172

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Nguyên lí của phương pháp ―error correction‖ sử dụng các MID 26 Hình 2.1: Cấu trúc thư viện được chuẩn bị bằng kít Accel-NGS 2S Plus DNA 37 Hình 2.2: Lưu đồ chuẩn bị thư viện 37 Hình 2.3: Mô hình lai-bắt giữ làm giàu thư viện gen mục tiêu 39 Hình 4.1: Tương quan nồng độ cfDNA giữa nhóm bệnh và nhóm chứng 52 Hình 4.2: Mối liên hệ nồng độ cfDNA và giới tính ở nhóm UTĐTT 53 Hình 4.3: Mối liên hệ giới tính và nồng độ cfDNA ở nhóm khoẻ mạnh 53 Hình 4.4: Mối liên hệ giữa độ tuổi và nồng độ cfDNA ở nhóm UTĐTT 54 Hình 4.5: Mối liên hệ giữa độ tuổi và nồng độ cfDNA ở nhóm CRCC 56 Hình 4.6: Mối liên hệ giữa giai đoạn ung thư và nồng độ cfDNA 56 Hình 4.7: Phân bố nồng độ cfDNA của các mẫu sau bước chuẩn bị thư viện 59 Hình 4.8: Sự phân bố kích thước cfDNA sau bước chuẩn bị thư viện 59 Hình 4.9: Hiệu suất chuẩn bị thư viện giải trình tự 61 Hình 4.10: Nồng độ cfDNA sau bước PCR lần 2 của bước ―lai-bắt giữ‖ 63 Hình 4.11: Thay đổi giữa nồng độ cfDNA ban đầu và sau bước chuẩn bị thư viện

(PCR lần 1) và bước ―lai_bắt giữ‖ (PCR lần 2) 64 Hình 4.12: Kiểm tra kích thước hỗn hợp DNA chứng dương sau phân cắt 66 Hình 4.13: Chất lượng giải trình tự (Q-score) 69 Hình 4.14: Số lượng đột biến ghi nhận trên mẫu LB và WBC 71 Hình 4.15: Tỉ lệ chia sẻ đột biến giữa mẫu LB và WBC 72 Hình 4.16: Tương quan tần suất đột biến của đột biến trên mẫu LB và WBC 73 Hình 4.17: Tỉ lệ chia sẻ đột biến của mẫu LB và WBC với mẫu FFPE 75 Hình 4.18: Đột biến ghi nhận trên mẫu LB của bệnh nhân UTĐTT 76 Hình 4.19: Đột biến ghi nhận trên mẫu LB của nhóm người khoẻ mạnh 77 Hình 4.20: Phổ đột biến gen trên mẫu LB 80 Hình 4.21: Phổ đột biến gen trên mẫu FFPE 80

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Danh mục 20 gen có tần suất đột biến cao nhất trong các bệnh nhân ung thư đại trực tràng (COSMIC) .28 Bảng 4.1: Đặc tính lâm sàng của các nhóm tham gia nghiên cứu .48 Bảng 4.2: Nồng độ cfDNA tách chiết từ mẫu huyết tương 51 Bảng 4.3: Danh mục các gen mục tiêu và kích thước vùng mã hoá 62 Bảng 4.4: Xác định ngưỡng phát hiện tần suất đột biến tối thiểu (MAF) 67 Bảng 4.5: Tiêu chí đánh giá chất lượng quá trình giải trình tự 69 Bảng 4.6: Bảng 2x2 ghi nhận ctDNA ở nhóm UTĐTT và người lành 78 Bảng 4.7: Kết quả đột biến đối chiếu với phương pháp Sanger 84

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Frequency

nhất

Lowest of Detection

MỞ ĐẦU

Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng (UTĐTT) nằm trong nhóm 5 loại ung thư phổi biến nhất, đứng thứ 2 ở nữ giới (sau ung thư vú) và đứng thứ 4 trong 5 loại ung thư phổ biến ở nam giới UTĐTT là một trong số ít bệnh lý

ác tính có tiên lượng khá tốt nếu được phát hiện và điều trị sớm Nếu UTĐTT được phát hiện ở giai đoạn sớm, điều trị đúng phương pháp, tỷ lệ khỏi bệnh

có thể đạt từ 50 đến 100% Thời gian sống còn của bệnh nhân UTÐTT phụ thuộc chủ yếu vào giai đoạn bệnh ở thời điểm được chẩn đoán Chính vì vậy việc chẩn đoán sớm chính xác, tránh nhầm lẫn các bệnh khác rất quan trọng, giúp cải thiện tỉ lệ khỏi bệnh, thời gian sống còn cũng như chất lượng sống của bệnh nhân

Một số phương pháp phát hiện sớm UTĐTT như nội soi đại trực tràng vẫn được xem là phương pháp chuẩn vàng cho chẩn đoán UTĐTT với ưu điểm là độ chính xác cao và cho phép kết hợp tiến hành phẫu thuật loại bỏ khối u ngay khi phát hiện Tuy nhiên, do giá thành cao và có tính xâm lấn nên mức tiếp cận kỹ thuật này còn hạn chế và khó triển khai rộng rãi Các xét nghiệm phân tích kháng nguyên trong phân như phân tích máu hiện diện trong phân FOBT (faecal occult blood) và FIT (fecal immunochemical) Các phương pháp này không xâm lấn, nhưng độ đặc hiệu của cả hai kỹ thuật này thấp (6% -56%) và kết quả chẩn đoán có khả năng sai lệch do chảy máu ruột xảy ra do nhiều bệnh lý khác như bướu thịt, trĩ, viêm ruột hoặc do chế độ ăn uống của bệnh nhân

Năm 1948, các DNA ngoại bào (cfDNA: cell-free DNA) trong máu ngoại biên lần đầu tiên được phát hiện Đây là những phân tử DNA được phóng thích từ tế bào vào dòng máu, có kích thước trung bình khoảng 170 bp Đến nay, nguồn gốc của cfDNA vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng, nhưng nhiều khả năng được phóng thích từ quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis), hoặc cũng có thể là quá trình hoại tử (necrosis), hoặc do sự tiết

DNA chủ động của tế bào Sau hơn 70 năm, lĩnh vực cfDNA đã có rất nhiều các nghiên cứu, mở ra nhiều ứng dụng và đạt thị trường khổng lồ Trong đó, DNA ngoại bào mang đột biến ung thư (circulating tumor DNA-ctDNA) là cfDNA được phóng thích từ tế bào ung thư, có mang các đột biến sinh dưỡng (somatic mutations) hoặc epigenetics (thường là sự methyl hóa trên DNA) gây ung thư, trở thành đối tượng đầy tiềm năng Thông qua đặc tính của ctDNA, chúng ta có thể xác định đặc điểm di truyền của khối u phục vụ điều trị đích, đánh giá hiệu quả điều trị, tiên lượng khả năng tái phát và phát hiện ung thư giai đoạn sớm Tuy nhiên, hàm lượng ctDNA trên tổng số cfDNA trong bệnh nhân ung thư rất biến động, có thể trên 25% nhưng cũng có thể xuống thấp đến 0,01% (nghĩa là cứ mỗi 10.000 phân tử cfDNA trong máu, chỉ

có 1 phân tử ctDNA được phóng thích từ tế bào ung thư) Thử thách lớn nhất khi sử dụng ctDNA là hàm lượng rất thấp tại giai đoạn sớm của ung thư hoặc sau điều trị Do đó, để khai thác hết tiềm năng ctDNA đòi hỏi những thách thức rất lớn về mặt công nghệ

Năm 2003, với sự ra đời của công nghệ giải trình tự thế hệ thứ 2 (giải trình tự song song hàng loạt – massive parralell sequencing) đã mở ra một kỉ nguyên mới giúp giải trình tự cả bộ gen người dễ dàng và hạ giá thành xuống

Sự kết hợp công nghệ giải trình tự thế hệ 2 và thuật toán phân tích mang tính đột phá trong lĩnh vực tin sinh học (bioinformatic) đã từng bước khai thác hiệu quả đặc tính của ctDNA trong máu để cho ra đời phương pháp sinh thiết lỏng

Vài năm gần đây, một số đơn vị tại Việt Nam đã bắt đầu nghiên cứu xây dựng qui trình sinh thiết lỏng phát hiện ctDNA ở bệnh nhân ung thư, hầu hết thuộc giai đoạn muộn (III và IV) Hiện chưa ghi nhận đơn vị nào nghiên cứu qui trình phát hiện ctDNA trong giai đoạn sớm của ung thư Do đó, chúng

tôi tiến hành nghiên cứu ―Xây dựng qui trình phát hiện ctDNA bằng công

nghệ giải trình tự thế hệ mới trong ung thư đại trực tràng giai đoạn sớm‖

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

I MỤC TIÊU, NỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN TỔ CHỨC THỰC HIỆN NHIỆM VỤ

1.1 Tổng quan về ung thư đại trực tràng

sẽ tăng lên đến 2,2 triệu ca mắc mới và 1,1 triệu ca tử vong vào năm 2030 Tỉ

lệ nam giới mắc UTĐTT cao hơn nữ giới UTĐTT có tỉ suất cao nhất ở các nước phát triển như Úc, New Zealand, châu Âu và bắc Mỹ, và tỉ suất thấp ở châu Phi, và Nam trung Á Tỉ suất mắc UTĐTT đang gia tăng ở một số quốc gia mà trước đây có nguy cơ thấp như vùng Tây Á (Kuwait và Israel) và Đông Âu (Cộng hòa Séc và Slovakia) Khuynh hướng các quốc gia giàu thì

có tỉ lệ mắc UTĐTT cao đã thay đổi trong 20 năm qua; ví dụ, tỷ lệ mắc bệnh tăng dần ở Phần Lan và Na Uy, ổn định ở Pháp và Úc, và giảm ở Hoa Kỳ Tỷ

lệ mắc ung thư đại trực tràng ở Hoa Kỳ giảm chủ yếu ở các đối tượng ≥ 50 tuổi, phản ánh việc gia tăng sàng lọc bệnh và loại bỏ u tuyến tiền ung thư Ngược lại, tỉ lệ bệnh lại gia tăng ở một số nước châu Á và Đông Âu, phản ánh

sự gia tăng các yếu tố nguy cơ của ung thư đại trực tràng như chế độ ăn uống không lành mạnh, béo phì và hút thuốc lá Ngược với chiều hướng gia tăng mắc bệnh thì tỷ lệ tử vong do ung thư đại trực tràng ở hầu hết các quốc gia trên toàn thế giới được quan sát thấy đang giảm dần, chủ yếu do chiến lược

tầm soát ung thư sớm, hạn chế các yếu tố nguy cơ cũng như cải thiện việc điều trị bệnh Tuy nhiên, tỷ lệ mắc bệnh mới cũng như tỉ lệ tử vong do UTĐTT vẫn còn cao và gia tăng ở nhiều quốc gia có thu nhập trung bình và thấp [56]

Tại Việt Nam, cũng theo GLOBOCAN 2018, UTĐTT đứng thứ 5 trong

số các bệnh ung thư phổ biến nhất với số mắc mới 2018 lên đến 14.733 trường hợp Ở nam giới, UTĐTT đứng thứ 4 trong số 5 bệnh ung thư phổ biến, với 7.607 (8,4%) trường hợp mắc mới 2018 và ở nữ giới, UTĐTT đứng thứ 2 trong số 5 bệnh ung thư phổ biến, chỉ sau ung thư vú, với 7.126 (9,6%) trường hợp mắc mới 2018 Theo TS Nguyễn Tiến Quang, Phó giám đốc Bệnh viện K cho biết, năm 2000, số ca mắc mới ung thư đại trực tràng ở cả 2 giới là 5.400 ca, đến năm 2010 là hơn 13.000 ca và đến năm 2018 đã tăng lên gần 15.000 ca, gấp gần 3 lần trong vòng 18 năm, trong đó có gần 9.300 ca tử vong Tương tự, tỉ lệ mắc/dân số cũng tăng nhanh chóng, năm 2000, tỉ lệ là 11,4/100.000 dân, sau 10 năm, tỉ lệ này tăng gần gấp đôi lên mức 19/100.000 dân và đến 2018, tỉ lệ mắc ung thư đại trực tràng ở nước ta đã lên mức 26,3/100.000 dân [7]

1.1.2 Đặc điểm lâm sàng

Triệu chứng của UTĐTT phụ thuộc vào vị trí khối u, mức độ xâm lấn

và mức độ di căn Phần lớn triệu chứng của UTĐTT không đặc trưng nên thường bệnh nhân không nghĩ tới họ bị ung thư Triệu chứng xuất hiện có thể tại chỗ hay toàn thân Triệu chứng tại chỗ thường là thay đổi thói quen đại tiện, phân lúc lỏng, lúc táo bón không rõ nguyên nhân, khuôn phân thu nhỏ, thay đổi hình dạng Chảy máu đường tiêu hoá dưới biểu hiện phân nhày lẫn máu, hoặc phân đen khi có khối u xuất hiện ở đoạn đầu đại tràng Tắc ruột khi

u lớn bít lòng đại trực tràng với các biểu hiện như táo bón, đau bụng, đầy bụng và nôn Triệu chứng toàn thân bao gồm thiếu máu thiếu sắt, người mệt mỏi, xanh xao do phân máu lâu ngày, gầy sút cân, ăn kém, sốt không rõ

nguyên nhân Khi UTĐTT có di căn đến gan nhiều khi triệu chứng cũng mờ nhạt, tình trạng nặng giai đoạn muộn xuất hiện các triệu chứng vàng da, đau bụng do u xâm lấn gan và đường mật[8]

Trong UTĐTT, khoảng 70-75% có vị trí ở trực tràng và kết tràng Sigma, 15% ở đại tràng lên, 6-8% ở đại tràng ngang và 6-7% ở đại tràng xuống và chỉ 1% ở hậu môn Về đặc điểm vi thể, dạng ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng chiếm 95-98%, trong đó ung thư tuyến nhầy chiếm 10% Loại ung thư biểu mô biệt hóa cao chiếm 15-20%, biệt hóa vừa 60-70%, loại biệt hóa kém khoảng 15- 20% [8]

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ gây UTĐTT

 Lối sống cá nhân: có mối liên quan mạnh mẽ giữa chế độ ăn uống, cân

nặng và tình trạng tập thể dục với nguy cơ UTĐTT Chế độ ăn nhiều thịt đỏ (thịt gia súc như thịt bò, thịt heo…) và các loại thịt đã qua chế biến như thịt ướp muối, thịt xông khói hay chế biến ở nhiệt độ quá cao (chiên, nướng) tạo

ra các sản phẩm hóa học có thể làm tăng nguy cơ UTĐTT Theo kết luận công bố của nhóm nghiên cứu thuộc Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ năm 2013, khi nghiên cứu theo dõi trên 2.315 bệnh nhân được chẩn đoán ung thư đại trực tràng, nhóm tác giả thấy các bệnh nhân trước đây thường xuyên ăn nhiều thịt

đỏ, thịt chế biến có tỉ lệ và nguy cơ tử vong cao hơn 1,29 lần khi so sánh với những bệnh nhân có khẩu phần ăn ít thịt [2] Ngược lại, chế độ ăn nhiều rau quả và các loại chất xơ làm giảm nguy cơ UTĐTT Hút thuốc trong một thời gian dài là nguyên nhân rõ ràng của ung thư phổi, nhưng nó cũng liên quan đến các loại ung thư khác bao gồm cả UTĐTT Uống nhiều rượu cũng làm tăng nguy cơ UTĐTT

 Tuổi: nguy cơ UTĐTT tăng lên theo tuổi Bệnh có thể gặp ở người trẻ

nhưng thường gặp ở những người trên 50 tuổi Hơn 90% số người mắc bệnh này được chẩn đoán sau tuổi 50

 Tổn thương tiền ung thư: bao gồm các tổn thương sau

 Tiền căn bị polyp tuyến (các polyp lớn, nhiều polyp, hoặc polyp

có

loạn sản) nằm trong nhóm nguy cơ cao của UTĐTT Người có tiền căn bị UTĐTT, mặc dù đã được điều trị cắt bỏ hoàn toàn, tuy nhiên vẫn có khả năng phát triển các khối u mới ở những vùng khác của đại trực tràng, khả năng này cao khi bệnh nhân có tiền căn UTĐTT được chẩn đoán khi còn trẻ tuổi

 Tiền căn mắc viêm ruột: như viêm loét đại tràng hoặc bệnh Crohn, làm tăng nguy cơ UTĐTT Những người mắc viêm ruột trong nhiều năm, nếu không điều trị sẽ phát triển thành loạn sản Các tổn thương này có thể bị ung thư hóa theo thời gian

 Yếu tố di truyền: Yếu tố di truyền có vai trò quan trọng trong bệnh sinh

của UTĐTT Các hội chứng di truyền phổ biến nhất có liên quan đến UTĐTT

là hội chứng đa polyp tuyến gia đình (FAP) và hội chứng Lynch (UTĐTT di truyền không polyp), hội chứng Peutz-Jeghers, hội chứng Gardner Phần lớn UTĐTT là thể bệnh ngẫu nhiên đơn lẻ (sporadic), chỉ khoảng 25% bệnh nhân mắc UTĐTT có bệnh sử UTĐTT trong gia đình Các đột biến trên gen APC, MLH1, MSH2, MSH6, EPCAM và PMS2…đã được xác định là nguyên nhân gây ra nguy cơ ung thư di truyền ở một số gia đình UTĐTT

1.1.4 Phương pháp điều trị UTĐTT

Điều trị UTĐTT hiện nay là điều trị đa mô thức, gồm: phẫu thuật, xạ trị, hóa trị và liệu pháp miễn dịch, trong đó phẫu thuật vẫn là phương pháp chính Các phương pháp điều trị tại chỗ bao gồm: i) phẫu thuật, ii) xạ trị và iii) gây tắc mạch Những liệu pháp điều trị này thích hợp khi ung thư ở giai đoạn sớm Các liệu pháp điều trị toàn thân bao gồm

 Hoá trị liệu bổ trợ: hóa trị có thể được sử dụng trước khi phẫu thuật để

làm giảm kích thước khối u và làm cho phẫu thuật dễ dàng hơn; hoặc hóa trị sau phẫu thuật với mục đích diệt các tế bào ung thư có thể còn sót lại sau mổ, giúp giảm nguy cơ ung thư tái phát

 Liệu pháp hóa trị kết hợp điều trị đích phân tử: sử dụng trong trường

hợp

UTĐTT di căn có hay không có khả năng cắt bỏ triệt để Thuốc có thể sử dụng như bevacizumab (yếu tố ức chế mạch, ngăn chặn VEGF hoạt động), cetuximab và panitumumab dùng trong trường hợp UTĐTT di căn mà gen KRAS và NRAS không có đột biến

 Liệu pháp miễn dịch: liệu pháp miễn dịch là việc sử dụng thuốc để giúp

hệ thống miễn dịch của người bệnh có thể nhận ra và phá huỷ các tế bào ung thư hiệu quả hơn Liệu pháp miễn dịch có thể được sử dụng để điều trị một số UTĐTT tiến triển

Tùy thuộc vào giai đoạn của bệnh ung thư và các yếu tố khác, các loại điều trị khác nhau có thể được kết hợp cùng lúc hoặc sử dụng tuần tự

1.1.5 Chẩn đoán sớm UTĐTT

Do hầu hết các triệu chứng sớm của UTÐTT thường không đặc hiệu,

dễ lầm lẫn với các bệnh khác của đường tiêu hóa như viêm đại tràng, trĩ… dẫn đến nhiều trường hợp UTÐTT được chẩn đoán muộn Theo một nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy 62% trường hợp UTÐTT bị chẩn đoán nhầm Riêng triệu chứng tiêu máu được điều trị như bệnh trĩ chiếm 44% Sự chậm trễ trong chẩn đoán UTÐTT có nhiều nguyên nhân liên quan đến cả bệnh nhân và thầy thuốc Các chẩn đoán ban đầu thường gặp ở bệnh nhân UTÐTT

là trĩ (35,4%), viêm đại tràng (20,9%), rối loạn tiêu hóa (25,7%) Theo Đỗ Đình Công, 83,8% bệnh nhân UTÐTT được chẩn đoán chậm trễ, trong đó 57,3% xảy ra tại các trung tâm y tế cơ sở, gần 20% xảy ra tại các bệnh viện chuyên khoa với lý do chẩn đoán là trĩ, viêm đại tràng [15] Chính vì vậy khi bệnh nhân được chẩn đoán UTĐTT thì hơn 50% bệnh nhân đã ở giai đoạn III, chỉ có chưa đến 5% bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn 1, chủ yếu do phát hiện qua nội soi đại tràng những trường hợp ung thư dạng polyp

UTĐTT là một trong số ít bệnh lý ác tính có tiên lượng khá tốt nếu được phát hiện và điều trị sớm Nếu UTĐTT được phát hiện ở giai đoạn sớm, điều trị đúng phương pháp, tỷ lệ khỏi bệnh có thể đạt từ 50 đến 100% Thời gian sống còn của bệnh nhân UTÐTT phụ thuộc chủ yếu vào giai đoạn bệnh ở thời điểm được chẩn đoán Ở giai đoạn I, hầu hết bệnh nhân có thể sống thêm sau 5 năm Tỷ lệ này chỉ còn 60% ở giai đoạn III và 5-15% đối với giai đoạn

IV [56] Tại Việt Nam, hiện nay có khoảng hơn 20% bệnh nhân UTĐTT được phát hiện ở giai đoạn IV, đã có di căn xa, nên tỉ lệ sống còn giảm mạnh Chính vì vậy việc chẩn đoán sớm chính xác, tránh nhầm lẫn các bệnh khác rất quan trọng, giúp cải thiện tỉ lệ khỏi bệnh, thời gian sống còn cũng như chất lượng sống của bệnh nhân

1.2 Các phương pháp phát hiện UTĐTT giai đoạn sớm

1.2.1 Sinh thiết-đánh giá mô học

Hiện nay, nội soi đại trực tràng vẫn được xem là phương pháp chuẩn vàng cho chẩn đoán UTĐTT với ưu điểm là độ chính xác cao và cho phép kết hợp tiến hành phẫu thuật loại bỏ khối u ngay khi phát hiện Tuy nhiên, do giá thành cao và tính xâm lấn nên mức tiếp cận kỹ thuật này còn hạn chế và khó

có thể triển khai thành một chương trình xét nghiệm sàng lọc ung thư [6]

1.2.2 Phân tích các kháng nguyên trong phân

Bệnh nhân có khối u (polyp) đại trực tràng thường có hiện tượng xuất huyết và có thể phát hiện thông qua một số phương pháp phân tích máu hiện diện trong phân như FOBT (faecal occult blood) và FIT (fecal immunochemical) [45] Phương pháp FOBT phát hiện máu ẩn trong phân gián tiếp thông qua đánh giá phản ứng oxi hoá của chất nhựa guaiac Do đó, kết quả của kỹ thuật FOBT lệ thuộc rất nhiều vào chế độ ăn uống của người tham gia xét nghiệm và bệnh nhân được yêu cầu lấy mẫu và thử nghiệm nhiều lần khác nhau [45] FIT là phương pháp xét nghiệm sinh hoá miễn dịch phát hiện trực tiếp máu trong phân dựa trên phản ứng đặc hiệu của kháng thế

kháng hemoglobin trong máu, do đó FIT có độ đặc hiệu và độ nhạy tốt hơn FOBT [25] Chẳng hạn, bộ xét nghiệm OC FIT-CHEK (Polymedco) được triển khai sử dụng ở Hoa Kỳ cho chẩn đoán UTĐTT ở giai đoạn sớm với hiệu quả phát hiện tốt hơn các phương pháp FOBT (khoảng 30%) và giúp xác định nhanh các trường hợp cần tiến hành nội soi ruột [25] Nghiên cứu lâm sàng trên nhiều quần thể khác nhau cho thấy việc sử dụng các thử nghiệm máu trong phân đã giảm đáng kể tỉ lệ tử vong do UTĐTT Hơn nữa, do giá thành thấp và không xâm lấn nên các phương pháp này hiện được triển khai cho tầm soát UTĐTT ở nhiều quốc gia, đặc biệt ở những nước mà việc tiếp cận kỹ thuật nội soi ruột còn hạn chế [60] Tuy nhiên, độ đặc hiệu của cả hai kỹ thuật này thấp (6% -56%) và kết quả chẩn đoán có khả năng sai lệch do chảy máu ruột có thể xảy ra ở nhiều bệnh lý khác như bướu thịt, trĩ hoặc viêm ruột [6]

1.2.3 Phân tích vật liệu di truyền

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy UTĐTT có liên quan đến biến đổi

di truyền biểu sinh (epigenetics) trên một số gen và thường xảy ra ở giai đoạn sớm trong diễn tiến ung thư [12] Nhóm nghiên cứu của Imperiale và cộng sự

đề xuất một phương pháp (multitarget stool DNA test) dựa trên định lượng mức methyl hoá của 3 gen liên quan đến UTĐTT (BMP3, NFRG4 và KRAS) với 1 gen chứng nội (ACTB) từ mẫu DNA bài tiết trong phân [27] Khảo sát trên cùng một nhóm mẫu cho thấy phương pháp này có thể phát hiện ung thư

ở giai đoạn I-III và tiền ung thư với độ nhạy cao hơn so với thử nghiệm FIT lần lượt là 27% và 78% Tuy nhiên, phương pháp DNA stool test lại có mức dương tính giả cao hơn FIT (10,2%-13.4% so với 3.6%-5.1%) Do đó, việc kết hợp cả hai thử nghiệm được đề xuất nhằm tăng hiệu quả phát hiện UTĐTT [27] Cụ thể, bộ thử nghiệm Cologuard dựa trên kết hợp hai phương pháp này được thương mại hoá bởi công ty Exact Sciences (Hoa Kỳ) và được

tổ chức Thực Phẩm và Thuốc của Hoa Kỳ (FDA: Food and Drug Administration) chấp nhận cho sử dụng phát hiện sớm UTĐTT [27] Tuy

nhiên, khả năng ứng dụng phương pháp này cho một chương trình tầm soát UTĐTT cần được đánh giá bởi nhiều nghiên cứu lâm sàng

Xu hướng nghiên cứu hiện nay tập trung phát triển các phương pháp chẩn đoán không xâm lấn dựa trên các chỉ thị phân tử có nguồn gốc từ máu,

có thể chia làm 2 nhóm sau:

 Kháng nguyên ung thư: protein kháng nguyên phôi thai liên quan đến

ung thư (Carcinoembryonic antigen, CEA) là một chỉ thị phân tử cho nhiều loại ung thư, trong đó có UTĐTT [41] CEA là protein gắn đường được tạo ra

ở giai đoạn phôi thai nhưng giảm mạnh đến mức không phát hiện được sau khi sinh [37] Nồng độ CEA tăng cao trong máu ngoại vi liên quan đến diễn tiến xấu của UTĐTT và giảm khi khối u được cắt bỏ [26] Vì vậy, CEA được

sử dụng trong lâm sàng như là một phân tử chỉ thị cho quá trình điều trị ung thư Tuy nhiên, nồng độ CEA cũng tăng cao trong các bệnh lý khác như: viêm ruột, viêm tụy hay các bệnh về gan Vì vậy chỉ số CEA không mang tính đặc trưng cho UTĐTT và được chứng minh không hiệu quả khi sử dụng là chỉ thị phân tử cho chẩn đoán sớm [23] Ngoài ra, kháng nguyên carbohydrate 19-9 (CA 19-9) cũng được đề xuất nhưng cho độ nhạy và độ đặc hiệu kém hơn cả CEA [23] Do độ nhạy và độ đặc hiệu không cao, các phương pháp xét nghiệm dựa trên các chỉ thị sinh hoá này hiện hỗ trợ các phương pháp xét nghiệm máu trong phân và khó có thể sử dụng cho mục đích sàng lọc

 DNA ngoại bào trong máu (cfDNA: cell-free DNA): là những DNA

được

phóng thích từ tế bào vào trong dòng máu do sự chết theo chương trình, hoặc hoại tử hoặc do sự phóng thích DNA chủ động của tế bào [58] cfDNA được

sử dụng để chẩn đoán sớm UTĐTT dựa trên các đặc tính sau:

 Nồng độ cfDNA: một số nghiên cứu gần đây chứng minh nồng độ

cfDNA trong máu và huyết tương tăng mạnh ở bệnh nhân UTĐTT đặc biệt trong giai đoạn tái phát và xâm lấn so với người khoẻ mạnh Tuy nhiên, nồng