Nghiên cứu tạo tế bào t biểu hiện thụ thể lai đặc hiệu CD20 (CD20 CAR t cell) và bước đầu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của chúng

Bên cạnh đó, các thuốc điều trị ung thư bằng tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu với CD20 CD20-CART-cell cũng đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2.

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGHIÊN CỨU TẠO TẾ BÀO T BIỂU HIỆN THỤ THỂ LAI ĐẶC HIỆU CD20 (CD20-CAR-T CELL) VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH GÂY

ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CHÚNG

Mã số: YD01/18-20

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Võ Nguyễn Thanh Thảo

Thành phố Hồ Chí Minh - 2021

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập-Tự do-Hạnh phúc

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 12 năm 2021

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu tạo tế bào T biểu hiện thụ thể lai đặc hiệu CD20

(CD20-CART-cell) và bước đầu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của chúng (Mã số: YD01/18-20)

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

Họ và tên: Võ Nguyễn Thanh Thảo

Ngày, tháng, năm sinh: 20/10/1984 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sĩ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên

Chức vụ: Phó trưởng phòng CNSH Y dược

Điện thoại: 0901450949 E-mail: vntthao.snn@tphcm.gov.vn

Tên tổ chức đang công tác: Trung tâm CNSH TP.HCM

Địa chỉ tổ chức: 2374 Quốc Lộ 1, P Trung Mỹ Tây, Q 12, Tp HCM

Địa chỉ nhà riêng: Số 39, Đường số 5, F.17, Q Gò Vấp

3 Tổ chức chủ trì nhiệm vụ:

Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM

Điện thoại: 028 37153792 Fax: 028 38916997

E-mail: ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn

Website: hcmbiotech.com.vn

Địa chỉ: 2374 Quốc Lộ 1, P Trung Mỹ Tây, Q 12, Tp HCM

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: TS Nguyễn Đăng Quân

ngày 28/10/2019 triển nông thôn về việc giao tiếp tục thực

hiện nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp cơ

sở chuyển tiếp từ năm 2016, 2017, 2018 sang năm 2019, 2020, 2021

7 Số 383/QĐ-SNN ngày

12/10/2020

Quyết định Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn về việc gia hạn thời gian thực hiện nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp cơ

sở, đơn vị Trung tâm Công nghệ Sinh học

4 Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú*

Chủ nhiệm đề tài, lên kế hoạch thí nghiệm, tổng kết kết quả, viết báo cáo

Thuyết minh đề cương, báo cáo tiến độ, báo cáo giám định, báo cáo nghiệm thu

Nghỉ thai sản

từ 07/2020 - 02/2021

Lên kế hoạch nghiên cứu, tổng kết kết quả

Báo cáo tổng hợp kết quả nghiên cứu

Lệ

Tham gia thực hiện thí ngiệm theo phân công

Báo cáo kết quả nghiên cứu được phân công

Nghỉ việc từ 02/2019

Tham gia thực hiện thí nghiệm theo phân công

Báo cáo kết quả nghiên cứu được phân công

Nghỉ việc từ 06/2020

Báo cáo kết quả nghiên cứu được phân công

Chuyển phòng CM từ tháng

04/2020 6

6

CN Ngô Lương Đăng Thức

Tham gia thực hiện thí nghiệm theo phân công

Báo cáo kết quả nghiên cứu được phân công

Tham gia đề tài từ tháng 03/2020

Tham gia thực hiện thí nghiệm theo phân công

Báo cáo kết quả nghiên cứu được phân công

Tham gia đề tài từ tháng 02/2021

- Lý do thay đổi (nếu có):

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí,

địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số

đoàn, số lượng người tham gia )

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1

Nội dung 1: Tạo cassette mã hóa

thụ thể kháng nguyên dạng khảm

(chimeric antigen receptor, CAR)

mang vùng biến động scFv của

kháng thể kháng CD20

(CD20-CAR)

02/2018 07/2018

04/2018 12/2018

-Võ Nguyễn Thanh Thảo- TTCNSH;

Nguyễn Đăng Quân - TTCNSH;

Lê Thị Thu

TTCNSH;

Xuân TTCNSH; Huỳnh Vũ-TTCNSH

Trúc-2 Nội dung 2: Tạo dòng CD20- CAR

vào vector pcDNA3.3

08/2018 01/2019

01/2019 06/2019

-Võ Nguyễn Thanh Thảo – TTCNSH; Nguyễn Đăng Quân- TTCNSH;

Lê Thị Thu

Lệ TTCNSH;

Xuân Trúc – TTCNSH; Huỳnh Vũ-TTCNSH

3 Nội dung 3: Biểu hiện CD20- CAR

trên tế bào Jurkat T

02/2019 06/2019

07/2019 12/2020

-Võ Nguyễn Thanh Thảo – TTCNSH; Nguyễn Đăng Quân- TTCNSH; Ngô Lương Đăng Thức-TTCNSH

4

Nội dung 4: Tạo tế bào T biểu hiện

CD20-CAR và đánh giá hoạt tính

tế bào

07/2019 12/2020

01/2021 12/2021

-Võ Nguyễn Thanh Thảo – TTCNSH; Nguyễn Đăng Quân- TTCNSH; Ngô Lương Đăng Thức-TTCNSH, Phùng Thị Việt Anh - TTCNSH

- Lý do thay đổi (nếu có): Nội dung 2 theo đề cương là “Chuẩn bị dịch virus mang cassette mã hóa CD20-CAR”, nhưng do không mua được bộ Kit Lentivirus nên chuyển thực hiện “Nội dung 2: Tạo dòng CD20-CAR vào vector pcDNA3.3” đề chuyển nạp CD20-CAR vào tế bào bằng phương pháp điện biến nạp (Đã được hội đồng thông qua vào đợt báo cáo tiến độ 2018)

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1 - Chủng vi khuẩn E.coli mang

plasmid biểu hiện CD20-CAR Chủng

Chủng

E.coli

mang plasmid biểu hiện CD20-CAR-SEQ01, SEQ02,

- Quy trình có thể áp dụng để chuyển nạp và biểu hiện thành công thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu CD20 (CD20-CAR) trên tế bào T

- Quy trình chuyển nạp và biểu hiện thành công CD20- CART vào tế bào Jurkat

- Quy trình có thể áp dụng để chọn lọc và tăng sinh tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu CD20

- Quy trình chọn lọc và tăng sinh tế bào T/CD4 +

- Lý do thay đổi (nếu có):

c) Sản phẩm Dạng III:

Số

TT

Tên sản phẩm

(Bài báo khoa học hoặc

báo cáo tại hội nghị)

Yêu cầu khoa học cần đạt

Số lượng, nơi công

2

Vai trò của hạt từ phủ kháng

thể CD3/CD28 và IL-2 lên

sự tăng sinh tế bào đơn nhân

máu ngoại vi người (PBMC)

Tạp chí Khoa học – Đại học Mở Tp HCM

 Đã được chấp nhận đăng

 Đã được chấp nhận đăng

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

Thực tế đạt được

1 chuẩn

bị báo cáo

01 Cao học (Phùng Thị Việt Anh) - Chuẩn bị báo cáo luận

văn Thạc sĩ

TN

- Nguyễn Ngọc Hồng Linh (ĐH Bách Khoa Đà Nẵng –

TN 2020)

- Ngô Hữu Phan Thanh (Viện NCĐT Việt Anh- Đà Nẵng) – Báo cáo thực tập

- Lý do thay đổi (nếu có):

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC HÌNH iii

MỞ ĐẦU 1

MỤC TIÊU NHIỆM VỤ 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặt vấn đề 3

1.2 Giới thiệu về CD20 6

1.3 Giới thiệu về thụ thể kháng nguyên dạng khảm (Chimeric Antigen Receptor – CAR) 8

1.4 Các kháng nguyên mục tiêu trong thiết kế CARs 9

1.5 Liệu pháp điều trị bằng tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm (CAR T-cell therapy) 10

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.7 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

CHƯƠNG II VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật 18

2.2.2 Phương pháp tạo dòng casstte CD20-CAR 19

2.2.3 Phương pháp tách tế bào đơn nhân máu ngoại vi PBMC 22

2.2.4 Phương pháp phân lập tế bào T CD4+ 22

2.2.5 Phương pháp phân lập tế bào T CD8+ 23

2.2.6 Phương pháp khảo sát các nồng độ Interleukin-2 (IL-2) lên sự tăng sinh PBMC 23

2.2.7 Phương pháp kích hoạt PBMC, T CD4+, TC8+ bằng hạt từ phủ CD3/CD28 23

2.2.8 Phương pháp phân tích quần thể tế bào 24

2.2.9 Phương pháp điện biến nạp 24

2.2.10 Phương pháp kiểm tra biểu hiện protein CD20-CAR 24

2.2.11 Phương pháp kiểm tra biểu hiện CART trên bề mặt tế bào bằng flow cytometry 25

2.2.12 Phương pháp kiểm tra biểu hiện mRNA CD20-CAR 25

2.2.13 Phương pháp kiểm tra Interleukin-2 bằng Elisa 25

2.2.14 Phương pháp xử lý số liệu: 26

CHƯƠNG III KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ 27

3.1 Thiết kế thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu CD20 27

3.2 Tạo dòng CD20-CAR (SEQ01, SEQ02, SEQ03) vào vector pcDNA3.3 29

3.2.1 Tạo dòng CD20-CAR SEQ01 và SEQ02 vào vector pcDNA3.3 29

3.2.2 Tạo dòng CD20-CAR SEQ03 vào vector pcDNA3.3 31

3.3 Biểu hiện CD20-CAR trên tế bào Jurkat T 37

3.3.1 Khảo sát quy trình điện biến nạp để chuyển nạp CD20-CAR vào tế bào Jurkat 37

3.3.2 Kiểm tra biểu hiện mRNA của CD20-CAR trong tế bào Jurkat 38

3.3.3 Kiểm tra biểu hiện protein CD20-CAR trong tế bào Jurkat 39 3.3.4 Kiểm tra biểu hiện CD20-CAR trên bề mặt tế bào Jurkat 40

3.3.5 Đánh giá khả năng tăng tiết Interleukin-2 (IL-2) của tế bào Jurkat khi đồng nuôi cấy với tế bào Raji B biểu hiện CD20 41

3.4 Tạo tế bào T biểu hiện CD20-CAR và đánh giá hoạt tính tế bào 42

3.4.1 Tách và nuôi tăng sinh tế bào đơn nhân máu ngoại vi người (PBMC) 42

3.4.2 Chọn lọc và nuôi tăng sinh quần thể tế bào T CD3+ 45

3.4.3 Chuyển nạp CD20-CAR vào tế bào PBMC và T CD4+ 50

3.4.4 Đánh giá hoạt tính tế bào T biểu hiện CD20-CAR

54

3.4.4.1 Khả năng tăng tiết IL-2 của PBMC và T CD4+ biểu hiện CD20-CAR khi đồng nuôi cấy với tế bào Raji B 54

3.4.4.2 Khả năng gây độc tế bào Raji B của PBMC và T CD4+ biểu hiện CD20-CAR 55

CHƯƠNG IV THẢO LUẬN 57

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

5.1 Kết luận 62

5.2 Kiến nghị 62

CHƯƠNG VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALL Acute Lymphoblastic Leukemia

APC Antigen Presenting Cell

CAR Chimeric Antigen Receptor

CD Cluster of Differentiation

CCL Chronic Lymphocrytic Leukemia

CRS Cytokines Release Symdrome

DLBCL Diffuse Large B-cell Lymphoma

FDA Food and Drug Administration

GMB Glioblastoma multiforme

HLA Human Leukocyte Antigen

IL-2 Interleukin -2

MHC Major Histocompatibility Complex

MSCV Murine Stem Cell Virus

NSCLS non-small-cell lung cancer

ORR Overall Response Rate

PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell

scFv Single Chain antibody Variable Fragment

TIL Tumor-infiltrating Lymphocytes

TNF Tumor Necrosis Factor

TRUCK T-cell redirected for universal cytokine killing

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Bảng danh sách primer sử dụng 20 Bảng 2 Bảng so sánh các vùng trình tự của CD20-CAR (patent) và CD20-

CAR (tự thiết kế) 29

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Phân tử CD20 và vị trí gắn của rituximab và ofatumunab 7

Hình 2 Mô hình thể hiện 4 thế hệ CAR T-cell 9

Hình 3 Mô hình minh họa liệu pháp điều trị với CAR T-cells 11

Hình 4 Hình minh họa cấu trúc thụ thể dạng khảm đặc hiệu CD20 (CD20-CAR) 27

Hình 5 Tạo dòng SEQ01 và SEQ02 vào vector pcDNA3.3 31

Hình 6 Tạo dòng VL, VH vào vector pJET1.2 32

Hình 7 Tạo dòng VL-linker-VH vào vector pJET1.2 33

Hình 8 Tạo dòng hinge-TM vào vector pJET1.2 34

Hình 9 Tạo dòng đoạn 4-1BB vào vector pJET1.2 35

Hình 10 Tạo dòng CD3ζ vào vector pJET1.2 35

Hình 11 Tạo dòng 4-1BB - CD3ζ vào vector pJET1.2 36

Hình 12 Tạo dòng cassette CD20-CAR hoàn chỉnh vào vector pcDNA3.3 37 Hình 13 Quy trình điện biến nạp chuyển nạp CD20-CAR vào tế bào Jurkat 38 Hình 14 Kiểm tra biểu hiện mRNA CD20-CAR trong tế bào Jurkat 39

Hình 15 Kiểm tra biểu hiện protein CD20-CAR trong tế bào Jurkat 39

Hình 16 Kiểm tra biểu hiện protein CD20-CAR trên bề mặt tế bào Jurkat 41 Hình 17 Khả năng tăng tiết Interleukin-2 (IL-2) của tế bào Jurkat khi được cảm ứng bởi Raji B biểu hiện CD20 42

Hình 18 Ảnh hưởng của nồng độ Interleukin-2 lên sự tăng sinh tế bào PBMC 43

Hình 19 Sự tăng sinh tế bào PBMC sau khi kích hoạt với hạt từ phủ CD3/CD28 44

Hình 20 Hình chụp dưới kính hiển vi (20X) tế bào PBMC trước và sau khi bổ sung hạt từ phủ CD3/CD28 44

Hình 21 Đặc điểm quần thể tế bào PBMC sau kích hoạt và tăng sinh 45

Hình 22 Kết quả phân lập T CD4+ và T CD8+ từ PBMC 46

Hình 23 Sự tăng sinh tế bào T CD4+ sau khi kích hoạt với hạt từ phủ CD3/CD28 47

Hình 28 Kiểm tra biểu hiện mRNA và protein CD20-CAR trong PBMC và T

CD4+ sau điện biến nạp 52

Hình 29 Kiểm tra biểu hiện CD20-CAR trên bề mặt tế bào PBMC sau điện

MỞ ĐẦU

CD20 hiện đang là kháng nguyên mục tiêu hấp dẫn cho các hướng nghiên cứu điều trị ung thư máu bằng liệu pháp miễn dịch CD20 là đối tượng nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng CD20 như rituximab, ibritumonab,

và tositumomab, ngoài ra liệu pháp miễn dịch điều trị bằng CD20-CART cũng đang rất được quan tâm nghiên cứu Đề tài này được thực hiện nhằm nghiên cứu tạo tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu CD20 (CD20-Chimeric Antigen Receptor T cells, CD20- CART-cell) có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư biểu hiện CD20 Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo dòng được 03 plasmid mang gene mã hóa cho CD20-CAR, trong

đó, CD20-CAR SEQ1 (thụ thể CD20-CAR thế hệ thứ 1) có trình tự được tham khảo từ patent số WO 00/223573, hai trình tự CD20-CAR SEQ02 và CD20-CAR SEQ03 (thụ thể CD20-CAR thế hệ thứ hai) mang trình tự do nhóm tự thiết kế thực hiện với 2 phương pháp tổng hợp là đặt tổng hợp nhân tạo và tổng hợp bằng cách lắp ráp các vùng chức năng riêng lẻ lại với nhau bằng khuếch đại PCR và enzyme cắt giới hạn Kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của 03 trình tự trên sau khi chuyển nạp vào tế bào Jurkat đều nhận thấy có sự biểu hiện mRNA và protein CD20-CAR của cả 03 trình tự trên sau ít nhất 24 giờ chuyển nạp bằng phương pháp điện biến nạp Thụ thể kháng nguyên dạng khảm CD20-CART cũng được biểu hiện trên bề mặt màng tế bào Jurkat Trong điều kiện nuôi cấy cùng với tế bào ung thư Raji B biểu hiện kháng nguyên CD20, tế bào Jurkat biểu hiện CD20-CAR (CD20-CART) được cảm ứng tăng tiết Interleukin 2 (IL-2) ở cả 03 trình tự Bên cạnh đó, chúng tôi cũng thành công trong việc tách, phân lập và nuôi tăng sinh tế bào PBMC, tế bào T CD4+, T CD8+ từ máu người Chuyển nạp CD20-CAR SEQ01 (S1) vào

tế bào PBMC và T CD4+ bằng phương pháp điện biến nạp cho thấy có sự biểu hiện mRNA của CD20-CAR, và cũng ghi nhận thấy tín hiệu Fab-FITC chứng

tỏ CD20-CAR được biểu hiện trên bề mặt tế bào tuy hiệu suất điện biến nạp còn thấp Các thí nghiệm đánh giá hoạt tính của PBMC-CD20-CART và CD4+-CD20-CART khi đồng nuôi cấy với tế bào biểu hiện CD20 Raji B chưa cho thấy sự khác biệt giữa mẫu nghiên cứu và đối chứng Việc tối ưu hóa quy trình điện biến nạp để nâng hiệu suất chuyển nạp và xây dựng quy trình chọn lọc, tăng sinh các tế bào CD20-CART cần được nghiên cứu thêm

MỤC TIÊU NHIỆM VỤ

Mục tiêu tổng quát: Tạo được quần thể tế bào T biểu hiện thụ thể

kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu CD20 (CD20-Chimeric Antigen Receptor

T cells, CD20- CART-cell) có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư biểu hiện CD20

Mục tiêu cụ thể:

- Thiết kế và tạo dòng thành công chủng vi khuẩn E.coli chứa cassette

biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm (CAR) mang vùng biến đổi scFv của kháng thể kháng CD20 (CD20-CAR);

- Chuyển nạp và biểu hiện thành công thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu CD20 (CD20-CAR) trên bề mặt tế bào Jurkat T;

- Tạo tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu CD20 từ quần thể tế bào T phân lập từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PMBCs) từ mẫu máu người

- Bước đầu đánh giá hoạt tính của tế bào CD20-CART đối với các tế bào ung thư biểu hiện CD20 (Raji B, Daudi B)

Ngoài những phương pháp điều trị cũ như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị thì phương pháp miễn dịch trị liệu (immuno-therapy) là phương pháp mới đang được tập trung nghiên cứu trong những năm gần đây Ưu điểm vượt trội của phương pháp này là sử dụng chính hệ thống miễn dịch của người bệnh để tiêu diệt các tế bào ung thư của người bệnh đó, việc này sẽ đem đến hiệu quả điều trị đặc hiệu, an toàn cho người bệnh Các tế bào trong hệ miễn dịch, đặc biệt

là tế bào T sẽ được can thiệp bằng công nghệ gene nhằm biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm “Chimeric Receptor Antigen, CAR” trên bề mặt tế bào (CAR T cell), từ đó giúp tế bào T có thể tìm thấy chính xác và tiêu diệt tế bào ung thư thông qua các kháng nguyên ung thư (tumor-antigen) Hiện trên thế giới, phương pháp điều trị sử dụng “CAR T-cells” đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng và cho kết quả hết sức khả quan, kết quả thử nghiệm lâm sàng khi sử dụng CD19-CAR T-cell hay CD20-CAR T-cell trong điều trị bệnh nhân ung thư máu cho tỉ lệ khỏi bệnh hơn 90%

Protein CD19 và CD20 là phân tử mục tiêu chính trong các nghiên cứu tạo tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm do đặc tính biểu hiện quá mức trên tế bào ung thư nhưng lại không biểu hiện ở tế bào thường Hơn 70% các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng của CART-cell hiện tại đều tập

trung vào tế bào CART-cell biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu với CD19 và CD20 Tính đến thời điểm hiện tại, 2 loại thuốc CART-cell được FDA chấp thuận trong điều trị ung thư máu đều là dạng tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu với CD19 (CD19-CART-cell) Bên cạnh đó, các thuốc điều trị ung thư bằng tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu với CD20 (CD20-CART-cell) cũng đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2

CD20 hiện đang là kháng nguyên mục tiêu hấp dẫn cho các hướng nghiên cứu điều trị ung thư máu bằng liệu pháp miễn dịch CD20 là đối tượng nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng CD20 như rituximab, ibritumonab,

và tositumomab Nhiều loại kháng thể đơn dòng kháng CD20 hiện đang được nghiên cứu và được chỉ định là thuốc điều trị bệnh, tuy nhiên đã có ghi nhận

từ lâm sàng cho thấy rằng một số bệnh nhân bị tái phát bệnh và trở nên kháng với CD20 mAbs, mặc dù đa số các tế bào B từ bệnh nhân ung thư hạch thể không Hodgkin tái phát vẫn duy trì biểu hiện CD20 Do đó, liệu pháp điều trị bằng CART-cell được cho là liệu pháp thay thế mới đầy tiềm năng trong điều trị các bệnh về ung thư máu Số liệu từ các thử nghiệm lâm sàng sử dụng CD20-CART-cell đã được báo cáo cho thấy anti-CD20 CART-cell cho kết quả đáp ứng tốt, có hoạt tính kháng khối u và ít độc tính Trong các thử nghiệm lâm sàng với số lượng ít bệnh nhân, CD20-CART-cell thậm chí còn cho kết quả ngoài mong đợi (bệnh thuyên giảm hoàn toàn) Hơn thế nữa, các thử nghiệm lâm sàng pha IIa ở 11 bệnh nhân với bệnh ung thứ máu tái phát đã khẳng định tính khả thi và hiểu quả của liệu pháp điều trị bằng CD20-CARTcells

Ngoài ra, các kết quả thử nghiệm CD20-CART-cell trên bệnh nhân ở giai đoạn 2 cho thấy tỉ lệ đáp ứng điều trị là 9/11 bệnh nhân (81,8%), trong đó

6 trường hợp đáp ứng hoàn toàn (complete remissions, CRs) và 3 trường hợp đáp ứng một phần (partial remissions) Tỉ lệ sống hiện đang kéo dài đến 46 tháng, và có 1 bệnh nhân có đáp ứng hoàn toàn (CR) trong 27 tháng liên tục Các kết quả này cùng với kết quả thử nghiệm ở giai đoạn 1 càng cho thấy tính khả quan của CD20 trong việc ứng dụng điều trị bệnh bằng liệu pháp CARTcell [1]

Mặc dù kết quả từ các thử nghiệm lâm sàng đối với liệu pháp điều trị ung thư máu ác tính bằng CD19-CART-cell cho thấy nhiều kết quả triển vọng, rất nhiều bệnh nhân tái phát bệnh có sự giảm biểu hiện, hoặc mất CD19

trên bề mặt tế bào B sau khi điều trị với CD19-CART-cell Để giải quyết vấn

đế này, thì CD20 hiện đang là chỉ thị phân tử được tập trung nghiên cứu trong các ứng dụng với liệu pháp CART-cells trong điều trị ung thư máu Hiện CD20 là phân tử mục tiêu trong các thử nghiệm lâm sàng ứng dụng liệu pháp CD20-CART-cell và cho kết quả đáp ứng hết sức khả quan, chỉ đứng sau phân tử CD19 [2] Ngoài ra, trong nghiên cứu của Yao và cộng sự, nhóm tác giả đã tạo CD20-CART-cell thế hệ thứ 2 trong đó có domain 4-1BB là vùng đồng kích thích nội bào Vùng nhận diện kháng nguyên sẽ là vùng biến động (single-chain variable fragment, svFv) từ 3 loại kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho CD20 đó là Leu16, Rituximab, Obinutumab, và Ofatumunab Leu16, Rituximab và Obinutumab thuộc nhóm kháng thể kháng CD20 loại 1 (nhận biết CD20 tại các vị trí epitope khác nhau trên vùng large-loop ngoại bào của CD20), trong khi đó Ofatumunab là kháng thể kháng CD20 dạng II (nhận diện các vùng kỵ nước trên vùng small-loop ngoại bào của CD20) Kết quả nghiên cứu trên 4 loại CD20-CART-cell này cho thấy rằng chúng đều có khả năng được kích hoạt bằng kháng nguyên (antigen-specific cell activation) và tăng tiết lượng lớn IFN-gamma khi được kích hoạt bởi CD20, trong đó, CART20-Ofatumunab cho thấy hiệu quả hoạt hóa tế bào cao hơn và lượng IFN-gamma tiết ra cũng tăng cao gấp 2 lần so với các dòng CD20-CART khác [3]

Phòng CNSH Y dược trong những năm qua cũng đã nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng CD20 qua đề tài “Nghiên cứu phát triển kháng thể đơn dòng dạng khảm chuột-người kháng CD20” (YD01/15-17) tương đương với thuốc biệt dược Rituximab [4], nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc tạo ra loại kháng thể này cũng như nắm được các thông tin trình tự chuỗi nặng

và chuỗi nhẹ của kháng thể kháng CD20

Tóm lại, xuất phát từ nhu cầu cấp bách trong điều trị và các kết quả khả quan của các thử nghiệm lâm sàng đối với phương pháp sử dụng CD20-CAR

T cell trên bệnh nhân ung thư máu đã được công bố trên thế giới Thêm vào

đó, kế thừa các các quả đạt được trên cơ sở thành công trong việc tạo kháng thể đơn dòng kháng CD20, phòng CNSH Y dược đề xuất thực hiện đề tài

“Nghiên cứu tạo tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu CD20 (CD20 CAR-T cell) và bước đầu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của chúng” Đề tài tiếp cận hướng nghiên cứu mới, nghiên cứu này sẽ

tạo tiền đề quan trọng để thiết lập công nghệ trị liệu ung thư bằng liệu pháp tế

bào (cell therapy) tại Việt Nam nói chung và thành phố HCM nói riêng Đây

là hướng nghiên cứu đang rất được chú ý trên thế giới và hứa hẹn sẽ là liệu pháp điều trị ung thư chính trong tương lai gần

1.2 Giới thiệu về CD20

CD20, ban đầu gọi là protein B1, được phát hiện lần đầu vào năm 1980 bởi Stashenko và cộng sự, người đặt giả thuyết rằng có một loại protein đặc trưng biểu hiện trên bề mặt tế bào B được sử dụng như một chỉ thị phân tử cho việc đếm, phân nhóm và phân tích chức năng tế bào B [5]

CD20 là một protein màng, biểu hiện ở tế bào tiền B (pre-B), tồn tại trong suốt quá trình trưởng thành của tế bào B, và mất khi tế bào B biệt hóa thành tương bào CD20 là một non-glycosylated protein thuộc họ protein membranespanning 4A (MS4A) bao gồm ít nhất 26 loại hiện diện ở chuột và người Nghiên cứu về trình tự cho thấy CD20 có 3 vùng kỵ nước tạo thành 1 phân tử với 4 vùng xuyên màng, 2 vùng ngoại bào và 2 đầu N và đầu C nằm phía bên trong tế bào Vùng trình tự nội bào của CD20 có nhiều vị trí phosphoryl hóa serine và threonine, từ đó tạo thành nhiều dạng isorform khác nhau có kích thước từ 33 đến 36 kDa khi điện di SDS-PAGE Việc phosphoryl hóa tại các vị trí serine và threonine nói trên thường xảy ra khi tế bào tăng trưởng và đáp ứng với các kích thích từ thụ thể (B cell antigen receptor- BCR) [6, 7]

Hình 1 Phân tử CD20 và vị trí gắn của rituximab và ofatumunab

CD20 được cho là hoạt động như một kênh trao đổi ion calcium giúp khuếch đại con đường truyền tín hiệu canxi với thụ thể trên tế bào B (B cell receptor – BCR) trong quá trình nhận biết kháng nguyên Tuy nhiên CD20 được quan tâm nhiều hơn nhờ đặc tính kháng nguyên của nó trong các nghiên cứu về kháng thể đơn dòng do đặc điểm biểu hiện cao ở các tế bào ung thư máu Vùng trình tự ngoại bào của CD20 mang tính quyết định kháng nguyên (epitope) có vị trí gần với bề mặt tế bào, điều này giúp cho các kháng thể ngoài việc nhận biết – gắn với kháng nguyên, và còn có thể kích hoạt cơ chế gây độc phụ thuộc vùng Fc của các tế bào thực thi (Fc-dependent effector mechanisms) [7] CD20 bình thường không phân tách khỏi màng tế bào, và không phát hiện được CD20 hòa tan có trong huyết thanh, ngoài ra CD20 cũng không bị nội bào hóa sau khi tương tác với kháng thể mà còn có khả năng kích hoạt các tế bào thực thi trong hệ thống miễn dịch CD20 biểu hiện mạnh trong tế bào ung thư máu nhưng lại không biểu hiện trong các tế bào lympho tiền thân cũng như trong tương bào, chính đặc điểm quan trọng này giúp CD20 trở thành một trong những phân tử được quan tâm nghiên cứu trong lĩnh vực tạo kháng thể đơn dòng cũng như các nghiên cứu điều trị ung thư nhắm đến CD20 làm mục tiêu [6, 8] Thêm vào đó, CD20 hiện đang là

Thụ thể kháng nguyên dạng khảm - CARs đặc biệt được quan tâm trong liệu pháp miễn dịch trị liệu vì CAR có thể dẫn đến sự hoạt hóa tế bào T thông qua cơ chế giống như cơ chế hoạt hóa tế bào T bằng kháng thể Hiện nay, thụ thể kháng nguyên dạng khảm CAR đã được nghiên cứu đến thế hệ thứ tư, chủ yếu khác nhau về các vùng kích thích nội bào và khả năng tiết cytokines Mặc dù các vùng nhận diện kháng nguyên tự nhiên (natural ligand)

và các phân đoạn Fabs được lựa chọn từ thư viện đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu, khả năng nhận diện kháng nguyên mục tiêu của CARs cơ bản là thông qua vùng biến đổi (single-chain variable fragment - scFv) của kháng thể [12, 17] Vùng nội bào bên trong bao gồm các motif hoạt hóa dạng tyrosine kinase như CD3ζ hặc FcRγ giúp hoạt hóa tế bào T Vùng nội bào này thường

kết hợp giữa chuỗi zeta CD3 (thế hệ 1) với một hoặc nhiều yếu tố đồng kích thích khác bao gồm CD27, CD28, CD134 và CD137 (thế hệ 2, 3) [18] Các yếu tố kích thích này ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh và tuổi thọ của tế bào

T biểu hiện CARs Thế hệ CARs thứ nhất chỉ đơn giản là sự thay đổi các trình

tự nhận diện kháng nguyên ngoại bào Thế hệ CARs thứ hai là sự kết hợp thêm yếu tố đồng kích thích nội bào, phân tử đồng kích thích đầu tiên được sử dụng trong CAR T-cell hế hệ thứ hai đó là CD28 Ngoài ra CD27, CD134 (OX-40), CD137 (4-1BB) cũng được nghiên cứu như là một yếu tố đồng kích thích [9, 18, 19] Thụ thể CARs thế hệ thứ ba thì giống như thế hệ thứ 2, và bao gồm hai yếu tố đồng kích thích thay vì chỉ một yếu tố như ở thế hệ thứ hai Thế hệ CARs thứ tư, hay còn gọi là tế bào thụ thể cảm ứng tăng tiết cytokines (T-cell redirected for universal cytokine killing – TRUCK) có sự kết hợp của nhân tố nuclear factor of activated T cell - NFAT giúp kích hoạt vùng promoter của gene IL-2 làm tăng sự biểu hiện IL-2 trong tế bào [12, 20] Mặc dù đã có những bằng chứng rất rõ ràng về hiệu quả hoạt động của CAR T-cell thế hệ thứ hai, hiệu quả của CAR T-cell thế hệ thứ ba và thứ tư thì lại rất khó phân biệt tính đến giai đoạn hiện nay

Hình 2 Mô hình thể hiện 4 thế hệ CAR T-cell Trong đó, OX-40 l2 CD134 và

4-1BB là CD137 trong thiết kế thế hệ thứ 3 CAR T-cell Mỗi thế hệ tăng độ phức tạp liên

quan đến các chức năng phiên mã và dịch mã phía sau

1.4 Các kháng nguyên mục tiêu trong thiết kế CARs

Các kháng nguyên mục tiêu cho liệu pháp CAR T-cells thường được thiết kế dựa vào sự phân bổ của chúng trên từng loại mô, tế bào, cũng như khả năng xảy ra các phản ứng chéo với các tế bào bình thường

Các kháng nguyên được lựa chọn thường là các kháng nguyên chỉ biểu hiện trên những vùng mô không thiết yếu, hoặc chỉ biểu hiện đặc trưng cho từng loại ung thư nhằm giảm thiểu rủi ro cho người bệnh Các kháng nguyên hướng đến trong CARs thường là: (1) kháng nguyên ít nguy cơ (low risk antigen); (2) kháng nguyên đặc hiệu chung cho ung thư (shared tuomor-specific antigen) ví dụ như epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) thường được tìm thấy ở ung thư thần kinh (glioblastoma multiforme – GBM), ung thư phổi (non-small-cell lung cancer NSCLS), ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú, ung thư đầu cổ, và ung thư buồng trứng; (3) kháng nguyên biểu hiện trên tế bào ung thư và tế bào bình thường không thiết yếu, ví dụ như tế bào B, tế bào tuyến tiền liệt, và tinh hoàn thường biểu hiện các kháng nguyên trên bề mặt và cũng chia sẽ các kháng nguyên này với một

số tế bào bình thường khác và các dạng kháng nguyên này có thể được dùng trong thiết kế CARs mà không gây nguy hiểm cho người bệnh CD19 là một chỉ thị phân tử được tìm thấy trong tế bào tiền B (pre-B) nhưng lại biểu hiện mạnh ở tế bào ung thư máu NHL, CLL và ALL Tương tự CD19, CD20 không biểu hiện ở tế bào B biệt hóa thành tương bào (plasma cells) nhưng lại biểu hiện rất mạnh trong các bệnh ung thư máu NHL, CLL, ALL và hiện là kháng nguyên mục tiêu của liệu pháp điều trị bằng CAR T-cell [14, 15]

1.5 Liệu pháp điều trị bằng tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm (CAR T-cell therapy)

Hiện nay, Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa kỳ (FDA) đã chấp nhận một số loại CAR T-cell dùng điều trị bệnh ung thư tại các bệnh viện đủ điều kiện Quy trình điều trị cơ bản như sau [21] :

- Thu nhận tế bào T từ người bệnh: tế bào T được thu nhận bằng

phương pháp apheresis, bằng cách lọc một số thành phần trong máu (huyết tương, tiểu cầu hoặc bạch cầu), phần máu còn lại sẽ được đưa trở lại người bệnh;

- Tế bào T được “biến đổi/huấn luyện” trong phòng thí nghiệm: Tế

bào T được đưa đến phòng nghiên cứu, tại đây chúng được biến đổi giúp chúng có khả năng biểu hiện các thụ thể kháng nguyên dạng khảm (chimeric antigen receptor - CARs) trên bề mặt tế bào của chúng; Sau khi được biến đổi, tế bào T lúc này được gọi là “tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm (CAR T-cell)” cho phép tế bào T nhận diện kháng nguyên mục tiêu trên tế bào ung thư;

- Các tế bào CAR T-cell được dòng hóa: Tế bào CAR T-cell sẽ được

nuôi tăng sinh trong phòng thí nghiệm cho đến khi đạt được số lượng mong muốn (vài triệu tế bào) Và khi đủ số lượng, các tế bào này sau đó sẽ được đông lạnh, chuyển đến bệnh viện và đưa vào người bệnh;

- Chuyển tế bào CAR T-cells vào người bệnh: Thông thường, bệnh

nhân sẽ được hóa trị một hoặc vài lần trước khi bệnh nhân được điều trị với CAR T-cells CAR T-cells sau khi trở lại hệ máu của người bệnh sẽ hoạt động như những “người lính” tìm và tiêu diệt các tế bào ung thư mà chúng biểu hiện kháng nguyên mà tế bào CAR T-cells đã được huấn luyện

Hình 3 Mô hình minh họa liệu pháp điều trị với CAR T-cells

Nguồn: http://www.thestiliyanpetrovfoundation.com/CARt-t-cell.html

Các tế bào CAR T-cells có thể tồn tại trong cơ thể trong thời gian dài sau khi kết thúc điều trị (đưa CAR T-cells vào cơ thể người bệnh) Chúng giúp bảo vệ cơ thể khỏi sự tái phát ung thư, vì thế liệu pháp này thường cho kết quả khỏi bệnh rất khả quan

Miễn dịch thích ứng (adoptive immunotherapy) từ lâu đã được nghiên cứu và có những phát minh rất quan trọng, đặc biệt là các nghiên cứu về miễn dịch thích ứng trong ung thư Những nghiên cứu đầu tiên chứng minh hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư của hệ miễn dịch xuất phát từ Willian Coley, người phát hiện ra sự thuyên giảm khối u sau khi người bệnh bị nhiễm khuẩn

trong một thời gian dài vào những năm 1890 [16] Thêm vào đó, các nghiên

cứu phân lập và hoạt hóa ex-vivo các tế bào lymphocytes tại vùng khối u

(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs) và đưa trở lại vào người bệnh đã được thử nghiệm lâm sàng và cho kết quả đáp ứng điều trị rất khả quan [16]

Liệu pháp miễn dịch (immunotherapy) là liệu pháp điều trị khá mới so với 3 phương pháp điều trị ung thư chủ yếu hiện nay đó là: hóa trị, xạ trị, và phẫu thuật [2] Miễn dịch trị liệu (immunotherapy) là phương pháp sử dụng chính hệ thống miễn dịch của người bệnh để điều trị bệnh ung thư, liệu pháp này giúp các tế bào miễn dịch đã qua “huấn luyện” tăng khả năng nhận biết và tiêu diệt các tế bào ung thư [12, 15] Sự phát triển của công nghệ hiện đại cũng như hàng loạt các nghiên cứu cơ bản về hệ thống miễn dịch giúp cho các nhà khoa học ngày càng hiểu rõ bản chất và cơ chế hoạt động của hệ thống phức tạp nhưng hết sức hiệu quả này, và làm thế nào tác động hoặc biến đổi

nó theo mong muốn của mình Liệu pháp miễn dịch có nhiều dạng khác nhau, như: vaccine ung thư, tế bào tua biến đổi gene (genetically modified dendritic cells), liệu pháp tế bào gốc (stem cell immunotherapy), liệu pháp tế bào miễn dịch thâm nhiễm khối u (tumor imfiltrating lymphocytic immunotherapy), liệu pháp miễn dịch tế bào giết tự nhiên (natural killer cell immunotherapy), liệu pháp kháng thể đơn dòng v.v….[15]

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm (chimeric antigen receptor CAR T-cells) đã đạt được những kết quả quan trọng trong nghiên cứu cơ bản, và đặc biệt là trong thử nghiệm lâm sàng Việc biến đổi/huấn luyện tế bào T giúp chúng có khả năng nhận diện chuyên biệt kháng nguyên ung thư thông qua các thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu với kháng nguyên ung thư đó, CARs đã cho thấy những kết quả bất ngờ trong hiệu quả điều trị thông qua việc nhận diện kháng nguyên mà không phụ thuộc vào HLA hay phụ thuộc vào phức hợp tương thích mô MHC [12, 22, 23]

Thực tế cho thấy, kết quả thử nghiệm lâm sàng sử dụng cells thế hệ thứ hai cho kết quả điều trị ngoài mong đợi đối với các bệnh ung thư hạch thể không Hodgkin (non Hodgkin’s lymphoma - NHL), ung thư máu dòng lympho mãn tính (chronic lymphocrytic leukemia – CLL), và ung thư máu thể nguyên bào lympho cấp (acute lymphoblastic leukemia – ALL) [22, 24] Các số liệu báo cáo tại Hội nghị thường niên lần thứ 56 của Hiệp hội khoa học Mỹ về các bệnh về máu (American Society of Hematology) tổ chức

vào tháng 12 năm 2014 cho thấy 55/65 (85%) bệnh nhi và 33/38 (87%) bệnh nhân trưởng thành có đáp ứng điều trị tốt đối với bệnh ALL, 10/16 (63%) bệnh nhân có đáp ứng tổng thể ORR đối với bệnh CLL, và 38/53 (72%) bệnh nhân có đáp ứng tổng thể ORR đối với bệnh NHL [16]

Tính đến cuối năm 2016, đã có 220 thử nghiệm lâm sàng sử dụng CAR T-cells trong điều trị ung thư được đăng ký tại http://ClinicalTrials.gov [2, 18] Trong đó, 58 thử nghiệm CAR T-cells nhắm đến nhóm ung thư máu và

33 thử nghiệm CAR T-cells trên các loại ung thư khác Đa số các thử nghiệm

là thử nghiệm giai đoạn 1 (128 thử nghiệm) nhằm đánh giá mức độ an toàn và liều lượng của CART-cells, các thử nghiệm ở giai đoạn 1/2 và giai đoạn 2 đánh giá hiệu quả trong điều trị, và hầu hết các thử nghiệm này tập trung vào CD19-CART-cells trong điều trị các bệnh ung thư máu [2] Các chỉ thị phân

tử (biomarkers) đã được ứng dụng trong thiết kế CARs, đã và đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có thể kể đến như CAIX, CD19, CD20, CD30, CD33, CD138, CD171, CEA, EGFR, ErbB, ErbB2, PSMA, … [12, 21]

Hai liệu pháp CAR T-cells đầu tiên được FDA chấp nhận trong điều trị ung thư [6]:

 Tisagenlecleucel (KymriahTM): được FDA chấp nhận vào 30 tháng

08 năm 2017 cho điều trị các bệnh nhân trên 25 tuổi với bệnh B-cell precursor acutre lymphoblastic leukemia (ALL) Đây là loại liệu pháp miễn dịch dựa trên tế bào CAR T-cells hướng đến antigen mục tiêu là CD19

 Axicabtagene ciloleucel (Yescarta™): được FDA chấp nhận vào 18 tháng 10 năm 2017 cho điều trị bệnh nhân trưởng thành có hiện tượng thiếu máu hoặc bị tái phát sau một vài liệu pháp điều trị khác bao gồm bệnh diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), primary mediastial large B-cell lymphoma, high-grade B-cell lymphoma Đây cũng là loại liệu pháp miễn dịch dựa trên tế bào CAR T-cells hướng đến antigen mục tiêu CD19

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư nhắm đến CD20 như là phân tử mục tiêu đã được nghiên cứu cách đây gần 20 năm Vào năm 1998, Michael Jensen và cộng sự đã nghiên cứu tạo tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm scFvFc: mang vùng biến động của kháng thể kháng CD20 ứng dụng trong điều trị bệnh u lympho B (B-cell lymphoma) Trình tự cDNA

mã hóa cho thụ thể dạng khảm CD20-specific scFvFc: này bao gồm trình tự

leader từ murine kappa, vùng biến động của kháng thể kháng CD20 (CD20- scFv), vùng bản lề hinge-CH2-CH3 của IgG1, vùng xuyên màng CD4, và vùng tín hiệu nội bào của CD3 được tổng hợp bằng phương pháp spliceoverlap-PCR Khi đồng nuôi cấy tế bào Jurkat biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm CD20-scFvFc: cùng với các tế bào lympho CD20+ cho thấy sự tăng tiết interleukin (IL-2) trong môi trường nuôi cấy Hoạt tính ly giải tế bào của tế bào T gây độc biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm scFvFc: (scFvFc:-expressing cytotoxic T lymphocytes, CTLs) cũng được ghi nhận khi đồng nuôi cấy với với các tế bào biểu hiện CD20, các kết quả này cho thấy CD20 có thể là kháng nguyên mục tiêu (target epitope) ứng dụng trong điều trị ung thư bằng liệu pháp miễn dịch CART-cells [11]

Brian G Till và cộng sự đã nghiên cứu tạo tế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm kháng CD20 với vùng tín hiệu nội bào là sự kết hợp giữa CD28 và 4-1BB và thử nghiệm điều trị lâm sàng cho các bệnh nhân u lympho tái phát (relapsed indolent B-cell) và u lympho tế bào vỏ (mantle cell lymphomas) Kết quả phân tích kiểu hình miễn dịch các tế bào T được điện biến nạp với cDNA mã hoá cho CD20-CAR cho thấy các tế bào này giống với CD8 effector T cell và có hoạt tính gây độc đặc hiệu đối với các tế bào CD20+ in vitro Kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy 2 trong 7 bệnh nhân được điều trị có đáp ứng hoàn toàn, 1 bệnh nhân có đáp ứng 1 phần và 4 bệnh nhân thì giữ được trạng thái bệnh như trước khi điều trị Ngoài ra, các tế bào CART này được phát hiện tại vị trí khối u cũng như trong máu bệnh nhân trong khoảng thời gian 1 năm, mặc dù ở mức độ thấp, và không phát hiện các dấu hiệu phản ứng với tế bào CART trong hệ miễn dịch của người bệnh Các kết quả này cho thấy tính an toàn, khả thi, và tiềm năng khi sử dụng hệ thống miễn dịch thích nghi trong điều trị ung thư máu nhắm đến phân tử mục tiêu là CD20 [9, 10] Yao Wang và cộng sự cũng nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng với CD20-CART kết hợp vùng tín hiệu nội bào của CD137 cùng với chuỗi ζ của CD3 trên các bệnh nhân bị u lympho dòng tế bào B lớn lan tỏa (diffuse large B cell lymphomas, DLBCL) và ghi nhận được kết quả khả quan, 2 trong

7 bệnh nhân cho đáp ứng hoàn toàn khi điều trị và 5 trong 7 bệnh nhân cho đáp ứng một phần Các kết quả này lần đầu tiên cho thấy liệu pháp điều trị bằng CD20-CART-cell có thể giúp làm chậm thời gian tái phát bệnh ở các bệnh nhân DLBCL [25]

Trong liệu pháp trị liệu bằng CART-cell, việc lựa chọn kháng nguyên mục tiêu là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị cũng như sự xuất hiện của các tác dụng phụ nếu có Tuy nhiên, mức độ nhận diện kháng nguyên của các tế bào CART-cell cũng như hoạt tính gây độc tế bào của chúng như thế nào hiện vẫn chưa được hiểu rõ Trong nghiên cứu của Watanabe và cộng sự năm 2013, khi thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của

tế bào T biểu hiện CD20-CAR mang vùng biến động của kháng thể kháng CD20 kết hợp với chuỗi ζ của CD3, cùng với vùng đồng kích hoạt của CD28 cho thấy CD20- CART-cell có khả năng gây độc/ ly giải tế bào ở mức độ bằng nhau đối với 2 dòng tế bào biểu hiện CD20 ở các mức độ khác nhau CD20-MFI (126-6.924 phân tử/ tế bào) và CD20-ABC (240-230.546 phân tử/

tế bào), mức ly giải đạt 40-60% ở tỉ lệ E:T là 10:1, và hoạt tính ly giải tế bào cũng xảy ra thậm chí trên các dòng tế bào biểu hiện rất thấp CD20 (126/240 phân tử/ tế bào, đạt 22,8%) Trong khi đó, khi điều trị bằng rituximab thì lượng kháng nguyên đòi hỏi nhiều hơn mới đủ để kích hoạt con đường gây độc tế bào CDC (600 phân tử/ tế bào đối với CD20-MFI và 65.000 phân tử/ tế bào đối với CD20-ABC) Từ đó, cho thấy rằng CD20-CART-cell có khả năng nhận kháng nguyên CD20 ở mức biểu hiện thấp, tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh ung thư máu kháng rituximab hoặc ofatumunab [26] Tuy nhiên, các thế hệ CART-cell thế hệ thứ hai hoặc sau này cho thấy chúng có khả năng kích hoạt một cách liên tục các tín hiệu nội bào sau khi được hoạt hóa, điều này có thể dẫn đến hệ quả rất xấu là chúng có khả năng nhận diện kháng nguyên mục tiêu ở mức độ rất thấp hiện diện bên ngoài khu vực khối u hoặc ở các tế bào bình thường Do đó, giới hạn ngưỡng kháng nguyên đủ để kích hoạt hoạt tính ly giải tế bào của CD20-CART-cell cũng như các kích hoạt khác như việc tăng tiết cytokines vẫn cần được nghiên cứu cụ thể hơn Kết quả nghiên cứu của Watanabe và cộng sự cho thấy đối với trường hợp CD20-CART-cell với vùng tín hiệu nội bào của CD28 thì ngưỡng kháng nguyên đủ cho CART-cell được hoạt hóa là khoảng 200 phân tử cho một tế bào, và lượng kháng nguyên cần để kích hoạt sự tăng tiết cytokines của CART-cell thì cao hơn gấp 19 lần, khoảng vài ngàn phân tử kháng nguyên cho một tế bào Kết quả nghiên cứu trên đề nghị rằng mật độ kháng nguyên dưới ngưỡng sẽ không gây ra các tác dụng phụ, và ngược lại, nếu lượng kháng nguyên vượt ngưỡng thì sẽ gây ra các hiệu ứng phụ nặng nề, do đó, việc xác định được ngưỡng giới hạn kháng nguyên trong điều trị bằng liệu pháp CART-cell là hết sức quan trọng [27]

Việc kiểm soát được hoạt tính chức năng của CART-cell tránh gây các tác dụng phụ quá mức cũng là vấn đề được quan tâm nghiên cứu Nghiên cứu của nhóm tác giả Budde LE và cộng sự trên loại CD20-CART-cell gồm CD137 và CD3 là hai yếu tố đồng kích hoạt trong vùng nội bào, kết hợp với một gene điều hòa “suicide gene” cảm ứng biểu hiện caspase 9 (iC9) đóng vai trò như một “công tắc” giúp bật/tắt hoạt tính chức năng của các tế bào CD20-CART, kết quả nghiên cứu cho thấy tính khả thi và tiềm năng trong ứng dụng điều trị cho các bệnh nhân ung thư máu ác tính CD20+ một cách an toàn và hiệu quả hơn Hiện các thử nghiệm giai đoạn 1 đối với loại CD20-CART-cell này đang được tiến hành [28]

Kết quả từ các thử nghiệm lâm sàng bằng liệu pháp điều trị với CD19- CART-cells trong điều trị các bệnh ung thư máu ác tính đã chứng minh tính hiệu quả của liệu pháp này, tuy nhiên vẫn có nhiều các thử nghiệm báo cáo rằng bệnh nhân vẫn tái phát bệnh do sự xuất hiện của các tế bào ung thư âm tính với CD19 Một số các nghiên cứu để cải thiện vấn đề trên hiện đang được ngiên cứu như tạo tế bào T mang thụ thể kháng nguyên dạng khảm biểu hiện đồng thời CD19 và CD20 nhằm hạn chế khả năng bỏ sót các tế bào ung thư

do sự thiếu biểu hiện kháng nguyên mục tiêu trên bề mặt tế bào của chúng [20, 29, 30]

Việc tiên lượng sẽ rất khó đối với các bệnh nhân bệnh ung thư hạch dạng không Hodgkin CD20+ bị tái phát, do đó, cần phải cải tiến các liệu pháp điều trị mới đối với các trường hợp tái phát CD20+/B-NHL Trong nghiên cứu của Chu Y và cộng sự, nhóm tác giả nghiên cứu một dạng biến đổi CD20-CAR biểu hiện trong tế bào NK (expanded peripheral blood NK cells, exPBNK) Kết quả cho thấy CAR(+)exPBNK tăng đáng kể hoạt tính gây độc

tế bào in vitro khi so sánh với CAR(-)exPBNK Thêm vào đó, chuột thử

nghiệm với CARexPBNK kéo dài thời gian sống và giảm kích thước khối u khi so sánh với nhóm đối chứng không được điều trị với CARexPBNK Các kết quả tiền lâm sàng trên cho thấy sự thay đổi các tế bào NK biểu hiện CD20-CAR rất có tiềm năng là liệu pháp điều trị cho các bệnh nhân ung thư máu có tiên lượng xấu [31]

1.7 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về ung thư ở nước ta hiện nay cũng còn khá khiêm tốn

cả về các nghiên cứu cơ bản và thử nghiệm lâm sàng, đặc biệt đối với lĩnh vực miễn dịch trị liệu (immunotherapy) trong ung thư vẫn còn quá mới

Hiện chúng tôi không tìm thấy được bất cứ nghiên cứu nào về việc tạo thế bào T biểu hiện thụ thể kháng nguyên dạng khảm đặc hiệu (CAR T-cells) hướng đến điều trị các bệnh về ung thư máu Hướng nghiên cứu của đề tài là hướng nghiên cứu hoàn toàn mới, lần đầu được đề xuất và triển khai nghiên cứu thực hiện

CHƯƠNG II VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

*Tế bào, chủng vi khuẩn:

- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α sử dụng để tạo dòng

- Dòng tế bào T: Jurkat T cell, tế bào đơn nhân máu ngoại vi người (PBMC), tế bào T CD4+, T CD8+ phân lập từ PBMC

* Môi trường nuôi cấy tế bào, vi khuẩn

- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α được nuôi trong môi trường LB

có/không có bổ sung kháng sinh ampicilin (100 µg/mL)

- Môi trường nuôi tế bào Jurkat, Raji B: môi trường RPMI 1640 (Gibco), bổ sung 10% Fetal Bovince Serum (FBS, Sigma), 100 units/mL penicillin/ streptomycin (Sigma)

- Môi trường nuôi tế bào PBMC, T CD4+, T CD8+ : môi trường CTS AIM V bổ sung 5% Immune Cell SR (Gibco), 100 units/mL penicillin/ streptomycin (Sigma)

*Tế bào PBMC, T CD4+, T CD8+ từ máu người:

05 tình nguyện viên khỏe mạnh được kêu gọi trong nghiên cứu này Tất

cả các tình nguyện viên tham gia đều ký vào “Giấy xác nhận tự nguyện hiến máu cho mục đích nghiên cứu khoa học” được Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh đồng ý và xác nhận Mỗi người hiến máu sẽ được bác sĩ chuyên môn thu nhận khoảng 15 - 20 mL máu và đựng trong ống chống đông chứa EDTA Các mẫu máu sau đó được pha loãng và tiến hành tách tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMCs) sử dụng Ficoll-Paque (Sigma)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật

Các dòng tế bào Jurkat, Raji B, PBMC, T CD4+, T CD8+ được nuôi cấy trong môi trường đặc trưng cho từng loại tế bào như mô tả ở trên Tế bào được nuôi trong tủ ủ ở 37oC, 5% CO2 và tiến hành cấy truyền khi tế bào đạt hơn 90% không gian nuôi cấy (tế bào huyền phù) hoặc khi môi trường chuyển màu

2.2.2 Phương pháp tạo dòng casstte CD20-CAR

Như đã trình bày ở trên, thử nghiệm lâm sàng (clinical trial) được FDA lần đầu tiên cấp phép sử dụng đối với CD19-CART-cell là dạng CART-cells thế hệ thứ 2 Ngoài ra, đối với các thử nghiệm lâm sàng đang được tiến hành trên CD20-CART-cells cũng là dạng CART-cell thế hệ thứ 2 Trong nghiên cứu này, vì là nghiên cứu đầu tiên thực hiện, chúng tôi thiết kế loại CD20-CART-cell thế hệ thứ 2 bao gồm sự kết hợp của 2 yếu tố đồng kích thích (co-stimulators) trong vùng domain nội bào (intracellular domain) là domain 4-1BB (CD137) và doamin CD3ζ

Mục tiêu của nội dung này là thiết kế thành công cassette mã hóa thụ thể kháng nguyên dạng khảm (chimeric antigen receptor, CAR) mang vùng biến động scFv của kháng thể kháng CD20 (CD20-CAR), và dòng hóa vào vi

khuẩn E.coli DH5α

Cấu trúc cơ bản của CD20-CART cell sẽ bao gồm 4 vùng: (1) vùng nhận diện kháng nguyên scFv (variable light chain region và variable heavy chain region liên kết với nhau bởi trình tự nối 15 aa (Gly4Ser)3) – (2) vùng bản lề (hinge region) – (3) vùng xuyên màng (Transmembrance Domain) – (4) vùng hoạt tính nội bào (T-cell activation domain) Trong đó:

(1) Vùng nhận diện kháng nguyên scFv là vùng biến động chuỗi nặng

và chuỗi nhẹ của kháng thể kháng CD20 (variable light chain region và variable heavy chain region) được liên kết với nhau bởi trình tự nối 15 aa (Gly4Ser)3) VL-linker-VH [32] Trình tự gene mã hóa vùng biến động của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được tham khảo từ trình tự đã được công bố của Rituximab và patent số 7381560 B2, và đề tài tạo kháng thể đơn dòng kháng CD20 đang được triển khai trong phòng

(2) Vùng bản lề (hinge region) là vùng nối giữa vùng nhận diện kháng nguyên đặc hiệu CD20 với màng plasma của tế bào T, chúng tôi sử dụng trình

tự “short hinge 12 amino acid có nguồn gốc từ domain CH3-CH2 của

IgG4-Fc (Immunoglobulin heavy constant gamma 4) theo bài báo của Hudecek et

al [1] (Uniprot Database: P01861, aa 99-110)

(3) Vùng xuyên màng (Transmembrance Domain, TM) sẽ là đoạn peptide 27 amino acid vùng xuyên màng CD28, trình tự vùng này được lấy trên ngân hàng dữ liệu (Uniprot Database: P10747, aa 153- 179) [1]

+ Trình tự domain CD3ζ đoạn 112 amino acid của vùng nội bào , human CD3ζ (isoform 3) (Uniprot Database: P20963, aa52-164)

Các trình tự (1) (2) (3) (4) sẽ được kết hợp theo thứ tự để tạo thành trình tự gene hoàn chỉnh cho cassette CD20-CAR

Các trình tự (1) vùng nhận diện kháng nguyên scFv – (2) vùng bản lề – (3) vùng xuyên màng– (4) vùng hoạt tính nội bào sẽ được kết hợp theo thứ tự

để tạo thành trình tự gene hoàn chình cho cassette CD20-CAR, tiến hành tối

ưu codon (codon optimized), và gửi tổng hợp gene bởi công ty IDT Trình tự này có gắn trình tự cắt của EcoRI ở đầu (1) và XhoI ở đầu (4)

Một cách ngắn gọn, các trình tự (1) (2) (3) (4) sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi tương ứng trên nền template là plasmid có sẵn hoặc cDNA được phiên mã ngược từ mRNA tách chiết từ tế bào Jurkat Đoạn

PCR khuếch đại sẽ được tạo dòng trong tế bào E.coli DH5α và được sàng lọc

bằng môi trường LB có chứa ampicillin (100 µg/ml) Các khuẩn lạc thu được trên môi trường chọn lọc sẽ được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu, và

với phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn Chọn dòng E.coli có mang

plasmid mong muốn và plasmid này được đem giải trình tự để kiểm tra trình

tự gene Plasmid có trình tự gene tương đồng 100% với trình tự lý thuyết sẽ được sử dụng cho các bước tiếp theo