Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode đánh giá di truyền 30 giống cây dược liệu pdf

Các loại cây dược liệu thu thập được trồng tại vườn dược liệu và nhà kính của Trung tâm Công nghệ sinh học 100% 2 Quy trình kỹ thuật cho việc thiết lập cơ sở dữ liệu DNA trên cây dược l

-oOo -

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA BARCODE ĐÁNH GIÁ

DI TRUYỀN 30 GIỐNG CÂY DƯỢC LIỆU

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Công nghệ Sinh học Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Trường Giang

Thành phố Hồ ChíMinh, năm 2021

TAM CdNG

xfr euA NurEwr vp NcnrtN ctlu KHoA Hoc c cdNc Ncnp

(Di chinh sria theo k6t luan cna H6i di,ng oghiam thu rgiy 20 thing 12 nnm 2021)

Chi nhi6m nhi6m vu

(Li t6n)

ThS NguySn Trudug Giaug

Cc quan chi rn chi trl trl uhiem yquhiQm vq

)

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tp Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2021

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN

I THÔNG TIN CHUNG VỀ NHIỆM VỤ

1 Tên nhiệm vụ: Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode đánh giá di truyền 30 giống cây dược liệu

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

- Họ và tên: Nguyễn Trường Giang

- Ngày tháng năm sinh: 1988 Giới tính: Nam

- Học hàm, Học vị: Thạc sỹ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Năm đạt học vị:

2018

- Chức danh khoa học: Năm được phong chức danh:

- Tên cơ quan đang công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM

- Chức vụ: Nhân viên - phòng Thực Nghiệm cây trồng

- Địa chỉ cơ quan: 2374 quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp HCM

- Điện thoại: 02837153792 Fax: 02838916997

- Địa chỉ nhà riêng: 38/16/2/8 đường 27, P Long Thạnh Mỹ, Quận 9, Tp HCM

- Điện thoại nhà riêng:

- Điện thoại di động: 0775 478 196

- E-mail: truonggiang07s3@gmail.com

3 Tổ chức chủ trì nhiệm vụ

- Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM

- Điện thoại: 028.37153792 Fax: 028.38916997

- E-mail: ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn Website: www.hcmbiotech.com.vn

- Địa chỉ: 2374 quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Q12, Tp.HCM

- Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Dương Hoa Xô

- Số tài khoản: 3713.0.1007645

- Tại kho bạc Nhà nước TP HCM

- Iheo Hqp ddng da ky k6t: tu thang 4 nam 2019 ddn thdng 12nrr,2O2l

- ThUc tC thUc hien: tu th6ng I I nim 2019 den th6ng 12 ndm 2021

- Ldn 1tu thrlng nim dCn th6ng nam

2 Kiub phi vi sri dqng kinh phi

a T6ngs5 kinh phi rhuc hidn: I.000.000.000 d6ngrrong do:

- Kini phi ho rro nr ngdr sach kioa hoc: 1.000.000.000 d6ng

- Kinh phi O cric ngudn klt6c: 0 d6ng

b TinI hinh c6p vi su dung kinh phi nr ngu6n ngdn sdch l-hoa hoc

- Li do thay doi (neu c6):

,$

TT

b(tn cia t6 ch*c ch tri nlti,m vu (don, ki€ r nghi di€u chinh nAu c6

I 72lQD-SNN ngdy 26/03 /2020 Quyet dinl thdnh lap h6i d6ng tu van

kloa hoc vd c6ng nghQ nim 2019

2 3s2lQD-SNN ngdy 291 t0/20r9

3 356/QD-SNN ngdy 3l/1012019

-Quydt

hgc vd cdng ngh6 cap co sd giai doq-n

2019-2021

4 Số 09/2019/HĐ-SNN ngày 31/10/2019 Hợp đồng thực hiện nhiệm vụ khoa học và công nghệ cấp cơ sở

5 Số 90/CNSH-TCKT ngày 07/02/2021

V/v chuyển kinh phí các hợp đồng thực hiện nhiệm vụ khoa học và công nghệ cấp cơ sở năm 2019 sáng năm

cơ sở từ năm 2019 sang năm 2020

4 Các tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ

TT Tên tổ chức đăng ký

theo thuyết minh

Tên tổ chức đã tham gia thực hiện

Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú

1

…

- Lý do thay đổi (nếu có):

5 Các cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp không quá

Ghi chú

1 ThS Nguyễn

Trường Giang

ThS Nguyễn Trường Giang

Chủ nhiệm đề tài, thực hiện và theo dõi chung các nội dung

Chủ nhiệm đề tài, thực hiện và theo dõi chung các nội dung

2 TS Huỳnh Hữu

Thực hiện một số nội dung chính trong phòng thí nghiệm

Tham gia thực các nội dung 1, 2, 3

3 TS Hà Thị Loan TS Hà Thị Loan Cố vấn khoa học Cố vấn khoa học

4 ThS Phan Quang

Hương

ThS Phan Quang Hương Thực các nội dung chính của nội dung 1, 3 Tham gia thực các nội dung 1, 3

5 KS Nguyễn

Hoàng Cẩm Tú KS Nguyễn Hoàng Cẩm Tú Thực các nội dung chính của nội dung 2,3,4 Tham gia thực hiện nội dung 2,3

- Lý do thay đổi (nếu có):

6 Tình hình hợp tác quốc tế

TT

Theo kế hoạch

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số

lượng người tham gia…)

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm,) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm) Thực tế đạt được

Ghi chú

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và ngoài nước)

TT

Các nội dung, công việc chủ

yếu cần được thực hiện

(Các mốc đánh giá chủ yếu)

Thời gian

(Bắt đầu, kết thức tháng/năm) Người, cơ quan thực

-hiện

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Xây dựng đề cương và bảo vệ đề

cương 04-05/2019 04-05/2019 Nguyễn Trường Giang Huỳnh Hữu Đức

2

Xây dựng bộ sưu tập một số loại

cây dược liệu làm nguồn nguyên

liệu đánh giá chỉ thị phân tử DNA

6/2019- 12/2019

5/2020

11/2019-Nguyễn Trường Giang Huỳnh Hữu Đức Phan Quang Hương

3

Xây dựng quy trình kỹ thuật cho

một số chỉ thị phân tử DNA cho các

giống cây trồng thu thập

07/2020

11/2019-11/2020

3/2020-Nguyễn Trường Giang Huỳnh Hữu Đức Nguyễn Hoàng Cẩm Tú

4

Đánh giá và sàng lọc một số chỉ thị

phân tử DNA nhằm mục tiêu đánh

giá đa dạng di truyền và xác định

giống

9/2021

9/2021

8/2020-Nguyễn Trường Giang Huỳnh Hữu Đức Nguyễn Hoàng Cẩm Tú

5

Ứng dụng một số chỉ thị phân tử

trong việc đánh giá đa dạng di

truyền và xác định giống cho một số

loại cây dược liệu

10/2021

10/2021

1/2021-Nguyễn Trường Giang Huỳnh Hữu Đức Phan Quang Hương Nguyễn Hoàng Cẩm Tú

6 Viết báo cáo và nghiệm thu đề tài

9/2021-12/2021

12/2021

9/2021-Nguyễn Trường Giang Huỳnh Hữu Đức

- Lý do thay đổi (nếu có):

III TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra

a Sản phẩm dạng I

TT Tên sản phẩm cụ thể và chỉ tiêu

chất lượng chủ yếu Đơn vị lượng Số Theo kế hoạch Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

b Sản phẩm dạng II

chú

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

1 Bộ sưu tập cây dược

liệu

- Đã được đánh giá về mặt di truyền

Đã thu thu thập 170 cây cho 30 loại cây dược liệu, số cây thu thập trên 1 loại cây dược liệu thấp nhất

là 3 cây và cao nhất là 24 cây ở các địa điểm khác nhau như các Trung tâm nghiên cứu, cơ sở kinh doanh cây dược liệu, vườn dược liệu và tại các địa phương khác nhau (Bảng 3.1) Các loại cây dược liệu thu thập được trồng tại vườn dược liệu và nhà kính của Trung tâm Công nghệ sinh học

100%

2

Quy trình kỹ thuật

cho việc thiết lập cơ

sở dữ liệu DNA trên

cây dược liệu

- Quy trình ly trích DNA tổng số và quy trinh thiết lập cơ sở dữ liệu DNA trên cây dược liệu

Quy trình ly trích DNA tổng số và đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị phân tử DNA barcode các loại cây dược liệu thu thập trên 3 nhóm cây dược liệu: nhóm cây chứa nhiều thành phần Polysaccharides, nhóm cây chứa nhiều polyphenol, nhóm cây chứa các hợp chất thứ cấp khác

Xác định được một số vùng gen thích hợp cho việc đánh giá mối quan hệ di truyền, xác định giống trên 30 loại cây dược liệu từ 07

vùng gen trên lục lạp (rbcL,

matK, trnH-psbA, rpoB1, rpoC1)

và 03 vùng gen trong nhân (ITS, ITS1, ITS2) với 16 cặp mồi khác nhau Xác định được vùng gen thích hợp cho việc xây dựng cơ sở

dữ liệu cho 30 loại cây dược liệu

từ 1 – 3 vùng gen (Phụ lục 4)

100%

4

Cở sở dữ liệu trình

tự DNA cho 30 loại

cây dược liệu

- Trình tự DNA của các barcode cho từng đối tượng cây dược liệu có thể truy xuất và phân tích

Đã giải trình tự DNA cho 30 loại cây dược liệu trên các vùng gen

rbcL, matK, rpoB1, rpoC1, ITS1,

ITS2, ITS, trnH-psbA (mỗi loại cây từ 1 – 3 vùng gen) vớitổng số

262 trình tự DNA trong đó loại cây có số trình tự DNA được giải trình tự thấp nhất là 3 trình tự DNA và cao nhất là 24 trình tự DNA (Phụ lục 4) Các trình tự được lưu ở dạng FASTA có thể truy xuất dữ liệu

- Xác định chính xác giống cây dược liệu dựa trên chỉ thị phân tử DNA barcode và so sánh trên Genbank

Xác định được mối quan hệ giữa các mẫu cây trong cùng 1 loại cây dược liệu, giữa các loài cây dược liệu trong cùng 1 họ

100%

- Lý do thay đổi (nếu có):

c Sản phẩm dạng III

TT Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học cần đạt

Số lượng, nơi công bố

(Tạp chí, nhà xuất bản)

Theo kế hoạch đạt được Thực tế

1 Bài báo khoa học

- Số lượng: 01

- Yêu cầu: Hội nghị khoa học/tạp chí chuyên ngành sinh học, công nghệ sinh học, nông nghiệp, y dược

- 01 Bài trong Tuyển tập báo cáo khoa học- NXB Đại học Thái Nguyên (Hội nghị CNSH toàn Quốc 2021)

- Lý do thay đổi (nếu có):

- Lti do thay doi (neu c6)i

a Hr*Au qud vd khoa hgc vri c6ng nghQ

]'lau rii danh ntuc t,d mtrc di niim viag, ldm chi, so sdnlt vdi trinh dA c6ng gll1 so

vdi khu \'*,-t-i thi gt,zt t

b Hiiu qua r e kinh le xa hoi

(NAu 16 ii€u qud ldm lqi bing tiin du hdn do nhi1nr tu tao ra so voi cdc sAn phAnl

cing laai t0t1 lhi lrtdng .)

( I hd etan kel lhuc)

Theo kE hoqch Thuc 1C dat duqc

- 01 KY su COng nghe Sinh

- 01 ndm 2020

- 0l nlm 2021

i (nCu cd):

- LV do

Ptan kel lhuc)

Theo k€ hoach Thuc tC dat dugc

TT r\-0i dung Thdi gian thrlc hiQn Ghi cht

(Tdm tit kiit qua, kiit luan chiDh, ngudi chti tri)

l Bdo crio giiim dinh

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Giới thiệu về cây dược liệu, tình hình nghiên cứu và bảo tồn cây ở Việt Nam 3

1.1.1.Giới thiệu về cây dược liệu 3

1.1.2.Một số chương trình dược liệu của cả nước 3

1.1.3.Một số nghiên cứu về bảo tồn và khai thác cây dược liệu tại Việt Nam 6

1.2.Một số chỉ thị phân tử được sử dụng trong nghiên cứu di truyền phân tử trên các giống cây trồng 7

1.2.1.Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA barcode 9

1.2.1.1.Quá trình phát triển của chỉ thị phân tử DNA barcode 9

1.2.1.2.Một số ứng dụng của kỹ thuật DNA barcode 13

1.2.1.3.Một số ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode thành công trên cây dược liệu 13

1.2.2.Một số chỉ thị phân tử ứng dụng để phân tích di truyền, xác định giống đối với cây dược liệu 15

1.2.3.Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode trong định danh, đánh giá di truyền cây dược liệu 17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng bộ sưu tập một số loài cây dược liệu làm nguồn nguyên liệu đánh giá chỉ thị phân tử DNA 23

2.2.2 Nội dung 2: Xây dựng quy trình kỹ thuật DNA barcode thực hiện trên các loài dược liệu thu thập 24

2.2.3 Nội dung 3: Đánh giá và sàng lọc một số vùng gen, primer dựa trên chỉ thị phân tử DNA barcode nhằm mục tiêu đánh giá đa dạng di truyền và xác định giống 25

2.2.4 Nội dung 4: Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode trong việc đánh giá đa dạng di truyền và xác định giống cho một số loài cây dược liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 28

3.1 Xây dựng bộ sưu tập một số loài cây dược liệu làm nguồn nguyên liệu đánh giá chỉ thị phân tử DNA 28

3.2 Xây dựng quy trình kỹ thuật DNA barcode thực hiện trên các loài dược liệu thu thập 51

3.2.1 Xây dựng quy trình tách chiết DNA tổng số 51

3.2.2 Thực hiện phản ứng PCR và giải trình tự 56

3.3 Nội dung 3: Đánh giá và sàng lọc một số vùng gen, primer dựa trên chỉ thị phân tử DNA barcode nhằm mục tiêu đánh giá đa dạng di truyền và xác định giống 57

3.4 Nội dung 4: Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode trong việc đánh giá đa

dạng di truyền và xác định giống cho một số loài cây dược liệu 84

3.4.1 Xác định mức độ tương đồng, mức độ bao phủ và vị trí sai khác giữa các trình tự trong cùng một loại cây dược liệu 89

3.4.2 Xây dựng cây phát sinh loài dựa trên trình tự DNA của một số vùng gen trong nhân và lục lạp 111

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 122

4.1 Kết luận 122

4.2 Đề nghị 122

TÀI LIỆU THAM KHẢO 123

PHỤ LỤC 1 1

PHỤ LỤC 2 2

PHỤ LỤC 3 4

PHỤ LỤC 4 7

PHỤ LỤC 5 8

PHỤ LỤC 6 52

PHỤ LỤC 7 59

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

FAO: Food and Agriculture Organization

SNP: Single Nucleotide Polymorphism-Kỹ thuật đa hình nucleotide đơn RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA

MABC: Molecular Assisted Backcrossing

MAS: Molecular Assisted Selection

ISSR: Inter-simple sequence repeats

ICUGI: International Cucurbit Genomics Initiative

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phân loại quá trình phát triển các chỉ thị 8

Hình 3.1 Hình ảnh một số giống gừng thu thập 30

Hình 3.2 Hình ảnh một số giống nghệ thu thập 31

Hình 3.3 Hình ảnh một số mẫu tràm thu thập 32

Hình 3.4 Hình ảnh một số loại lá đinh lăng 33

Hình 3.5 Mẫu giống lan thạch hộc tía và D.nobile 34

Hình 3.6 Hình ảnh một số mẫu giống lan kim tuyến thu thập 35

Hình 3.7 Hình ảnh mẫu giống cây bách bộ thu thập 35

Hình 3.8 Cây Hà thủ ô trắng 36

Hình 3.9 Ngải đen 37

Hình 3.10 Cây Húng chanh 37

Hình 3.11 Cây Râu mèo 38

Hình 3.12 Cây sâm Ngọc Linh 39

Hình 3.13 Cây sâm Bố chính 39

Hình 3.14 Cây Đảng sâm 40

Hình 3.15 Xạ đen 41

Hình 3.16 Tam thất nam 41

Hình 3.17 Cây Sâm cau 42

Hình 3.18 Cây Đương quy 42

Hình 3.19 Cây Ba kích tím 43

Hình 3.20 Cây Tam thất bắc, Tam thất hoang, Tam thất lá xẻ 44

Hình 3.21 Cây Mạch môn 45

Hình 3.22 Cây Ngà voi 45

Hình 3.23 Cây Giảo cổ lam 46

Hình 3.24 Cây Bạch hoa xà 47

Hình 3.25 Cây Hà thủ ô đỏ 47

Hình 3.26 Cây Khôi nhung 48

Hình 3.27 Cây Kim tiền thảo 49

Hình 3.28 Cây Ngũ gia bì gai 49

Hình 3.29 Cây Trinh nữ hoàng cung 50

Hình 3.30 Cây Xuyên tâm liên 51

Hình 3.31 Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 1% 52

Hình 3.32 Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 1% 53

Hình 3.33 Kết quả điện di DNA tổng số trên gel agarose 1% 54

Hình 3.34 Điện di sản phâm PCR của vùng gen rbcL trên gel agarose 1,2% 53

Hình 3.35 Trình tự DNA vùng gen rbcL dạng peak và FASTA mở trên phần mềm ATGC ver 6 56

Hình 3.36 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại 04 vùng gen trên gel agarose 1,2% của 19 mẫu gừng và 5 mẫu nghệ 58

Hình 3.37 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen ITS1 trên gel agarose 1,2% của 09 mẫu tràm 59

Hình 3.38 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 24 mẫu đinh lăng trên gel agarose 1,2%: A/ vùng matK; B/ vùng; C/ vùng ITS 61

Hình 3.39 Điện di sản phâm PCR của vùng gen rbcL, matK, ITS trên gel agarose

1,2% 61

Hình 3.40 Kết quả PCR của 03 vùng gen cho 6 mẫu lan kim tuyến trên gel agarose

1,2% 62

Hình 3.41 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK trên gel

agarose 1,2% của 03 mẫu Bách bộ 63

Hình 3.42 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK trên gel

agarose 1,2% của 03 mẫu Hà thủ ô trắng 64

Hình 3.43 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS1 trên

gel agarose 1,2% của 03 mẫu Húng chanh 65

Hình 3.44 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen trnH-psbA trên gel

agarose 1,2% của 03 mẫu Râu mèo 66

Hình 3.45 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS1, ITS2

trên gel agarose 1,2% của 04 mẫu sâm Ngọc Linh 67

Hình 3.46 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcLL, ITS1 trên gel

agarose 1,2% của 04 mẫu sâm Bố chính 68

Hình 3.47 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rpoC1, ITS1 trên gel

agarose 1,2% của 03 mẫu Đảng sâm 68

Hình 3.48 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS1 trên

gel agarose 1,2% của 03 mẫu tam thất nam 69

Hình 3.49 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS1 trên

gel agarose 1,2% của 04 Sâm cau 70

Hình 3.50 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS trên gel

agarose 1,2% của 04 mẫu Đương quy 71

Hình 3.51 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS trên gel

agarose 1,2% của 05 mẫu Ba kích tím 72

Hình 3.52 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen matK, rpoC1, ITS2 trên

gel agarose 1,2% của 08 mẫu tam thất 73

Hình 3.53 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS1 trên

gel agarose 1,2% của 06 mẫu Mạch môn 74

Hình 3.54 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK trên gel

agarose 1,2% của 03 mẫu Ngà voi 75

Hình 3.55 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen matK, ITS2 trên gel

agarose 1,2% của 08 mẫu Giảo cổ lam 76

Hình 3.56 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS1 trên

gel agarose 1,2% của 04 mẫu Bạch hoa xà 77

Hình 3.57 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS1 trên

gel agarose 1,2% của 06 mẫu Hà thủ ô đỏ 78

Hình 3.58 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS trên gel

agarose 1,2% của 06 mẫu Khôi nhung 79

Hình 3.59 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, ITS1 trên gel

agarose 1,2% của 03 mẫu Kim tiền thảo 80

Hình 3.60 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rpoB1 trên gel agarose

1,2% của 03 mẫu Ngũ gia bì gai 81

Hình 3.61 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, ITS trên gel

agarose 1,2% của 03 mẫu Trinh nữ hoàng cung 82

Hình 3.62 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rbcL, matK, rpoB1 trên

gel agarose 1,2% của 03 mẫu xuyên tâm liên 82

Hình 3.63 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen rpoB1, ITS1 trên gel

agarose 1,2% của 04 mẫu xạ đen 83

Hình 3.64 Kết quả kiểm tra kết quả khuếch đại vùng gen ITS1 trên gel agarose

1,2% của 03 mẫu Ngải đen 84

Hình 3.65 Cây phát sinh loài đối với một số loài đinh lăng dựa trên trình tự vùng

ITS 111

Hình 3.66 Cây phát sinh loài của 5 giống Dendrobium officinale và Dendrobium

nobile dựa trên trình tự rbcL, matK, ITS A/Trình tự nghiên cứu, B/Trình tự

nghiên cứu, trình tự khác và trình trên NCBI 112

Hình 3.67 Cây phát sinh loài của 6 mẫu Anoectochilus sp (2), Anoectochilus

formosanus (2), Ludisia discolor (2) dựa trên trình tự vùng gen ITS1, ITS2,

TS1+ITS2 và các trình tự tham chiếu đã công bố trên genbank 114

Hình 3.68 Cây phát sinh loài của 9 mẫu cây tràm dựa trên trình tự DNA vùng gen

ITS1 115

Hình 3.69 Cây phát sinh loài của 6 mẫu cây Mạch môn dựa trên trình tự DNA

vùng gen rbcL, matK A/vùng gen rbcL, B/vùng gen matK 116

Hình 3.70 Cây phát sinh loài của 8 mẫu cây Giảo cổ lam dựa trên trình tự DNA

vùng gen matK + ITS2 117

Hình 3.71 Cây phát sinh loài của 6 mẫu cây Hà thủ ô đỏ dựa trên trình tự DNA

vùng gen matK 118

Hình 3.72 Cây phát sinh loài của 6 mẫu cây Khôi nhung dựa trên trình tự DNA

vùng gen matK, ITS1 A/ Vùng gen matK, B/ Vùng gen ITS1 118

Hình 3.73 Cây phát sinh loài của các mẫu cây dược liệu thuộc họ Araliaceae dựa

trên trình tự DNA vùng gen matK, ITS2 A/ Vùng gen matK, B/ Vùng gen ITS1119

Hình 3.74 Cây phát sinh loài dựa trên vùng gen matK của các mẫu thuộc họ

Zingiberaceae 120

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh sự khác nhau của các loại chỉ thị phân tử 8

Bảng 1.2 Một số kết quả nghiên cứu dựa trên kỹ thuật DNA barcode cho một số cây dược liệu 14

Bảng 1.3 Một số chỉ thị phân tử được sử dụng để xác định cây dược liệu 15

Bảng 1.4 Điểm mạnh và điểm yếu của các phương pháp xác định khác nhau 16

Bảng 2.1 Một số loài dược liệu dự kiến được thu thập để đánh giá 23

Bảng 2.2.Thành phần phản ứng PCR (20 µL/phản ứng) 25

Bảng 2.3.Chu kỳ nhiệt 25

Bảng 3.1 Danh sách các loại cây dược liệu đã được thu thập và chọn lọc để sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 3.2 Danh sách một số giống gừng thu thập 30

Bảng 3.3 Danh sách các mẫu giống nghệ thu thập 31

Bảng 3.4 Danh sách các mẫu giống tràm thu thập 31

Bảng 3.5 Danh sách các mẫu giống đinh lăng thu thập 32

Bảng 3.6 Danh sách các mẫu giống lan thạch hộc tía và D.Nobile thu thập 33

Bảng 3.7 Danh sách các mẫu giống lan kim tuyến 34

Bảng 3.8 Danh sách các mẫu giống bách bộ thu thập 35

Bảng 3.9 Danh sách các mẫu giống Hà thủ ô trắng thu thập 36

Bảng 3.10 Danh sách các mẫu giống Ngải đen thu thập 36

Bảng 3.11 Danh sách các mẫu giống Húng chanh thu thập 37

Bảng 3.12 Danh sách các mẫu giống Húng chanh thu thập 38

Bảng 3.13 Danh sách các mẫu giống Húng chanh thu thập 38

Bảng 3.14 Danh sách các mẫu giống Sâm Bố chính thu thập 39

Bảng 3.15 Danh sách các mẫu giống Đảng sâm thu thập 40

Bảng 3.16 Danh sách các mẫu giống xạ đen thu thập 40

Bảng 3.17 Danh sách các mẫu giống xạ đen thu thập 41

Bảng 3.18 Danh sách các mẫu giống Sâm cau thu thập 41

Bảng 3.19 Danh sách các mẫu giống Sâm cau thu thập 42

Bảng 3.20 Danh sách các mẫu giống Ba kích tím thu thập 43

Bảng 3.21 Danh sách các mẫu giống tam thất hoang, tam thất lá xẻ, tam thất bắc thu thập 44

Bảng 3.22 Danh sách các mẫu giống Mạch môn thu thập 45

Bảng 3.23 Danh sách các mẫu giống Ngà voi thu thập 45

Bảng 3.24 Danh sách các mẫu giống Giảo cổ lam thu thập 46

Bảng 3.25 Danh sách các mẫu giống Ngà voi thu thập 47

Bảng 3.26 Danh sách các mẫu giống Hà thủ ô đỏ thu thập 47

Bảng 3.27 Danh sách các mẫu giống Khôi nhung thu thập 48

Bảng 3.28 Danh sách các mẫu giống Kim tiền thảo thu thập 48

Bảng 3.29 Danh sách các mẫu giống Ngũ gia bì gai thu thập 49

Bảng 3.30 Danh sách các mẫu giống Trinh nữ hoàng cung thu thập 50

Bảng 3.31 Danh sách các mẫu giống xuyên tâm liên thu thập 50

Bảng 3.32 Tỷ lệ OD260/280, hàm lượng DNA tổng số của mẫu Lan Thạch hộc tía dựa trên 4 phương pháp 52

Bảng 3.33 Tỷ lệ OD260/280, hàm lượng DNA tổng số của mẫu gừng dựa trên 03

trên 30 loại cây dược liệu 85

Bảng 3.64 Kết quả giải trình tự DNA của một số vùng gen trong nhân và lục lạp

cho 30 loại cây dược liệu 87

Bảng 3.65 Vị trí biến đổi các nu trên 7 trình tự DNA vùng gen matK của 09 mẫu

tràm 90

Bảng 3.66 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK của 6 mẫu gừng và 2 mẫu

nghệ trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 90

Bảng 3.67 Vị trí biến đổi các nu trên 9 trình tự DNA vùng gen ITS1 của 09 mẫu

tràm 90

Bảng 3.68 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen ITS1 của 09 mẫu tràm trong

nghiên cứu với cơ sở Genbank 91

Bảng 3.69 Vị trí biến đổi các nu trên 7 trình tự DNA vùng gen ITS của 07 mẫu

đinh lăng 92

Bảng 3.70 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen ITS của 07 mẫu đinh lăng trong

nghiên cứu với cơ sở Genbank 92

Bảng 3.71 Vị trí biến đổi các nu trên 07 trình tự DNA vùng gen ITS của 07 mẫu

thạch hộc tía 92

Bảng 3.72 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rbcL, matK, ITS của 07 mẫu

lan thạch hộc tía trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 93

Bảng 3.73 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen ITS1, ITS2 của 06

mẫu lan kim tuyến 94

Bảng 3.74 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen ITS1, ITS2 của 06 mẫu lan kim

tuyến trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 94

Bảng 3.75 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen rbcL, matK của 03

mẫu bách bộ 95

Bảng 3.76 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rbcL, matK của 03 mẫu bách

bộ trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 95

Bảng 3.77 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen rbcL của 03 mẫu Hà

thủ ô trắng 95

Bảng 3.78 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rbcL của 03 mẫu Hà thủ ô trắng

trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 96

Bảng 3.79 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rpoB1, ITS1 của 04 mẫu xạ đen

trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 96

Bảng 3.80 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen ITS1 của 03 mẫu

Húng chanh 96

Bảng 3.81 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen ITS1 của 03 mẫu Húng chanh

trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 96

Bảng 3.82 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen trnH-psbA của 03 mẫu Râu

mèo trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 97

Bảng 3.83 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen matK, ITS1, ITS2 của

04 mẫu Sâm Ngọc Linh 97

Bảng 3.84 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK, ITS1, ITS2 của 04 mẫu

lSâm Ngọc Linh trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 98

Bảng 3.85 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen rbcL, ITS1 của 04

mẫu sâm Bố chính 98

Bảng 3.86 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rbcL, ITS1 của 04 mẫu sâm Bố

chính trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 98

Bảng 3.87 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen rpoC1, ITS1 của 03

mẫu Đảng sâm 99

Bảng 3.88 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rpoC1, ITS1 của 03 mẫu Đảng

sâm trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 99

Bảng 3.89 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen ITS1 của 03 mẫu Ngải đen

trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 100

Bảng 3.90 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen matK của 03 mẫu tam

thất nam 100

Bảng 3.91 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK của 03 mẫu tam thất nam

trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 100

Bảng 3.92 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen matK của 04 mẫu

Sâm cau 100

Bảng 3.93 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK của 04 mẫu Sâm cau

trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 101

Bảng 3.94 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen matK, ITS của 04 mẫu

đưogn quy 101

Bảng 3.95 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK, ITS của 04 mẫu Đương

quy trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 101

Bảng 3.96 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK của 05 mẫu Ba kích tím

trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 102

Bảng 3.97 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen rpoC1, matK, ITS2

của 08 mẫu tam thất 102

Bảng 3.98 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rpoC1, matK, ITS2 của 08 mẫu

tam thất trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 103

Bảng 3.99 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen rbcL, matK của 06

mẫu Mạch môn 104

Bảng 3.100 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rbcL, matK của 06 mẫu Mạch

môn trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 104

Bảng 3.101 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen rbcL, matK của 03

mẫu Ngà voi 105

Bảng 3.102 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rbcL, matK của 03 mẫu Ngà

voi trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 105

Bảng 3.103 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen matK, ITS2 của 08

mẫu Giảo cổ lam 105

Bảng 3.104 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK, ITS2 của 08 mẫu Giảo

cổ lam trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 106

Bảng 3.105 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen matK, ITS1 của 04

mẫu Bạch hoa xà 106

Bảng 3.106 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK, ITS1 của 04 mẫu Bạch

hoa xà trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 107

Bảng 3.107 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK của 06 mẫu Hà thủ ô đỏ

trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 107

Bảng 3.108 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen matK, ITS của 06

mẫu Khôi nhung 107

Bảng 3.109 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK, ITS của 06 mẫu Khôi

nhung trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 108

Bảng 3.110 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen ITS1 của 03 mẫu Kim tiền

thảo trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 108

Bảng 3.111 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rpoB1của 03 mẫu Ngũ gia bì

gai trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 108

Bảng 3.112 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen matK, ITS của 03

mẫu Trinh nữ hoàng cung 109

Bảng 3.113 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen matK, ITS của 03 mẫu Trinh

nữ hoàng cung trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 109

Bảng 3.114 Vị trí biến đổi các nu trên trình tự DNA vùng gen rbcL, matK, rpoB1

của 03 mẫu xuyên tâm liên 109

Bảng 3.115 Kết quả BLAST trình tự DNA vùng gen rbcL, matK, rpoB1 của 03

mẫu xuyên tâm liên trong nghiên cứu với cơ sở Genbank 110

MỞ ĐẦU

Ngày nay, nhu cầu sử dụng cây dược liệu cao nên nhiều sản phẩm dược liệu có thể bị trộn lẫn với các thành phần khác nhằm thu lợi nhuận cao, một số trường hợp có thể gây độc nếu sản phẩm cây dược liệu bị trộn lẫn với các thành phần tương tự nhưng

có tính độc Do đó, việc cung cấp thông tin cơ sở dữ liệu về di truyền, hình thái một cách chính xác đối với nguyên vật liệu sử dụng sản xuất dược liệu và phát triển cây dược liệu một cách bền vững Từ tình hình trên cho thấy việc xác định và định danh chính xác cây dược liệu là một trong những yêu cầu bắt buộc và cực kỳ quan trọng trong công tác sản xuất cây giống, trồng và sử dụng trong dược liệu Trong đó, việc sử dụng các marker truyền thống dựa trên các đặc tính hình thái đang được sử dụng mang lại hiệu quả chưa cao, chưa đảm bảo tính chính xác và tốn nhiều thời gian và công sức Hiện nay, việc sử dụng các marker phân tử được sử dụng trong công tác đánh giá nguồn gen, đa dạng di truyền, định danh giống đang mang lại những kết quả khả quan và đầy triển vọng khi có tính chính xác cao và rút ngắn thời gian chờ cây phát triển hoàn chỉnh mới định danh bằng phương pháp truyền thống

Hiện nay, nhiều tỉnh đã và đang triển khai các chương trình liên quan đến việc quy hoạch và phát triển cây dược liệu theo Quyết định của Thủ tướng Chính phủ Các chương trình dược liệu của các tỉnh chủ yếu tập trung vào công tác sưu tập, bảo hộ, bảo tồn, quy hoạch vùng trồng, hướng đến sản xuất và khai thác cây dược liệu nhưng chưa tập trung vào công tác định danh, xác định cây dược liệu nhằm phục vụ các công tác trên có hiệu quả hơn Thành phố Hồ Chí Minh đang triển khai chương trình “Chương trình phát triển cây dược liệu tại thành phố giai đoạn 2018 - 2025, định hướng đến năm 2030” Với mục tiêu tạo được bộ sưu tập nguồn gen về cây dược liệu có giá trị cao hiện

có trong tự nhiên và trong dân gian Ứng dụng công nghệ sinh học (chỉ thị phân tử, công nghệ tế bào ) trong việc đánh giá, chọn lọc và bảo tồn nguồn gen cây dược liệu Nghiên cứu, xây dựng được các quy trình công nghệ nhân giống và tạo nguồn giống dược liệu sạch bệnh, có giá trị cao, sản xuất sinh khối dược liệu dựa trên một số cây dược liệu quý hiếm

Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đang thực hiện các chương trình dược liệu nhằm lưu trữ và nhân giống các giống cây dược liệu có giá trị kinh tế nhằm phục vụ nhu cầu giống của TP HCM, khu vực phía Nam nói riêng và cả nước nói chung Trong đó, Trung tâm đã xây dựng được một bộ sưu tập các giống cây dược liệu cho An Giang phục vụ công tác bảo tồn và phát triển du lịch Các bộ sưu tập cây dược liệu này chỉ được đánh giá bước đầu về hình thái mà chưa có những đánh giá, phân tích sâu hơn về mặt di truyền nhằm khai thác một cách có hiệu quả và đảm bảo tính chính xác trong xác định giống cây dược liệu Trên cơ sở đó, việc tiếp tục nghiên cứu, đánh giá di truyền các giống cây dược liệu ở mức độ phân tử nói chung mà cụ thể

là sử dụng các chỉ thị phân tử DNA trong công tác định giống cây trồng, xác định nguồn gốc của các giống phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen và khai thác, sản xuất giống cây trồng có giá trị là điều cần thiết

Trên cơ sở các vấn đề và giải pháp khả thi để phát triển dược liệu, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode đánh giá di truyền 30 giống

cây dược liệu” để đánh giá đa dạng di truyền và xác định giống cho một số giống cây

dược liệu nhằm phục vụ công tác lưu trữ, khai thác, phát triển cây dược liệu có hiệu quả

MỤC TIÊU NHIỆM VỤ

Mục tiêu tổng quát

Đánh giá được mối quan hệ di truyền cho một số giống cây dược liệu nhằm phục

vụ công tác lưu trữ, khai thác, phát triển cây dược liệu có hiệu quả

Mục tiêu cụ thể

Xây dựng được quy trình ly trích DNA tổng số

Thiết lập được bộ sưu tập một số giống cây dược liệu làm nguồn nguyên liệu đánh giá chỉ thị phân tử DNA

Chọn lọc được một số chỉ thị phân tử DNA nhằm mục tiêu đánh giá đa dạng di truyền và xác định giống

Xây dựng được cơ sở dữ liệu trình tự DNA, đánh giá được mối quan hệ di truyền giữa các loài trong cùng một họ dựa trên chỉ thị phân tử DNA barcode

và et al, 2008) Các sản phẩm chế biến từ cây dược liệu được sử dụng để điều trị các bệnh mạn tính như ung thư vú (Burstein, 2999), các bệnh về phổi (Strader, 2002), virut suy giảm miễn dịch ở người (HIV) (Kassler, 1991),…Trên thế giới tính đến nay vẫn còn nhiều người ưa dùng các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên để điều trị một số loại

Cây dược liệu có nhiều đặc điểm như: Đa dạng về hình thức sử dụng (sử dụng trực tiếp, bào chế trước khi sử dụng, chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học), đa dạng

về chu kỳ sống (Cây 1 năm, 2 năm, cây lâu năm), đa dạng về dạng cây (cây thân thảo, thân bụi, thân gỗ nhỏ, thân gỗ lớn), đa dạng về phân bố (vùng ven biển, đồng bằng, vùng giáp ranh đồng bằng và trung du, vùng trung du, vùng núi cao), đa dạng về bộ phận sử

dụng (Thân, cành, lá, rễ củ, nụ hoa quả) (Võ Văn Chi; 1991,1997)

1.1.2 Một số chương trình dược liệu của cả nước

Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến 2030, Việt Nam có 8 vùng sinh thái trên cả nước để trồng

54 loài dược liệu tự nhiên phù hợp với điều kiện sinh trưởng và phát triển đáp ứng 60% đến năm 2020 và đạt 80% đến năm 2030 tổng nhu cầu sử dụng cây dược liệu Quy hoạch các vùng rừng, các vùng có dược liệu tự nhiên ở 8 vùng dược liệu trọng điểm bao gồm Tây Bắc, Đông Bắc, đồng bằng sông Hồng, Bắc Trung Bộ, duyên hải Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ để lựa chọn và khai thác hợp lý 24 loài dược liệu Xây dựng 05 vườn bảo tồn và phát triển cây thuốc quốc gia đại diện cho các vùng sinh thái, là nơi tập trung, bảo tồn và trồng mới nhiều loài cây thuốc được thu thập

ở các địa phương khác nhau, đại diện cho vùng khí hậu đặc trưng để phục vụ công tác nghiên cứu khoa học và phát triển dược liệu Tập trung bảo hộ, bảo tồn nguồn gen đặc hữu, bản địa, có giá trị và có nguy cơ bị tuyệt chủng cao Từng bước bảo vệ an toàn số loài cây thuốc đang có nguy cơ tuyệt chủng để phát triển bền vững trong tự nhiên nhằm

bảo tồn và khai thác dược liệu tự nhiên Phát triển trồng cây dược liệu: Quy hoạch phát triển 54 loài dược liệu thế mạnh của 8 vùng sinh thái phù hợp với điều kiện sinh trưởng

và phát triển của cây thuốc, xây dựng các vùng trồng dược liệu tập trung phù hợp với từng vùng sinh thái Phát triển nguồn giống dược liệu: Phấn đấu cung cấp đủ giống dược liệu cho nhu cầu trồng và phát triển dược liệu ở quy mô lớn, phục tráng, nhập nội, di thực, thuần hóa và phát triển các giống dược liệu có nguồn gốc là vị thuốc bắc sử dụng nhiều trong y học cổ truyền Nghiên cứu chọn, tạo các giống dược liệu mới có năng suất

và chất lượng cao, đặc tính tốt, phù hợp với từng vùng sinh thái phục vụ sản xuất dược liệu và một số mục tiêu khác (Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30 tháng 10 năm 2013

về Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 vá định hướng đến năm 2030)

Theo quyết định sẽ quy hoạch các vùng khai thác các loài dược liệu tự nhiên đã xác định theo 08 vùng sinh thái: vùng Tây Bắc (Bình vôi, Đảng sâm, Hà thủ ô đỏ, Tục đoạn, Actisô, Đỗ trọng, Độc hoạt, Đương quy, Hoàng bá, Mộc hương, Ô đầu, Tam thất, Xuyên), vùng Đông Bắc (Ba kích, Đinh lăng, Địa liền, Gấc, Giảo cổ lam, Ích mẫu, Kim tiền thảo, Hồi, Quế, Sả, Sa nhân tím, Thanh hao hoa vàng, Ý dĩ, Bạch chỉ, Bạch truật, Địa hoàng), vùng đồng bằng sông Hồng (Cúc hoa, Diệp hạ châu đắng, Địa liền, Đinh lăng, Gấc, Hòe, Củ mài, Hương nhu trắng, Râu mèo, ích mẫu, Thanh hao hoa vàng, Mã

đề, Bạc hà, Bạch chỉ, Bạch truật, Cát cánh, Địa hoàng, Đương quy, Ngưu tất, Trạch tả), vùng Bắc Trung Bộ (Ba kích, Diệp hạ châu đắng, Đinh lăng, Củ mài, Hòe, Hương nhu trắng, Ích mẫu, Nghệ vàng, Quế, Sả), vùng duyên hải Nam Trung Bộ (Bụp giấm, Diệp

hạ châu đắng, Dừa cạn, Đậu ván trắng, Củ mài, Nghệ vàng, Quế, Râu mèo, Sa nhân tím, Sâm Ngọc Linh), vùng Tây Nguyên (Gấc, Gừng, Hương nhu trắng, Đảng sâm, Nghệ vàng, Sa nhân tím, Sả, Sâm Ngọc Linh, Trinh nữ hoàng cung, Ý), vùng Đông Nam Bộ

và vùng Tây Nam Bộ (Gừng, Trinh nữ hoàng cung, Nghệ vàng, Nhàu, Rau đắng biển, Hoàn ngọc, Tràm, Xuyên tâm liên, Râu mèo và Kim tiền thảo)

Bên cạnh việc triển khai sản xuất các giống dược liệu bản địa và được nhập nội, việc nâng cấp, cải tạo về cơ sở hạ tầng cũng đang được chú trọng như đảm bảo mỗi vùng

có ít nhất 1 nhà máy chế biến, chiết xuất cao dược liệu đạt tiêu chuẩn, phát triển hệ thống các nhà máy sản xuất nguồn dược liệu cung cấp cho công nghiệp dược hay chế biến thuốc phục vụ cho công tác khám chữa bệnh

Tỉnh Yên Bái đã thực hiện kế hoạch Phát triển cây dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2025 nhằm định hướng phát triển và quy hoạch các loại cây dược liệu phù hợp với khí hậu vùng gồm 29 loại điển hình như Ba kích, Đinh lăng, Địa liền, Ích mẫu, Kim tiền thảo, Sa nhân tím, Hà thủ ô đỏ, Sâm cau, Sâm Ngọc Linh, Bách bộ, Đương quy…đảm bảo phù hợp với định hướng quy hoạch tổng thể của tỉnh và tạo được

sự liên kết chặt chẽ với tiêu thụ để đảm bảo cho các loài dược liệu phát triển có hiệu quả (Kế hoạch số 206/KH-UBND, ngày 08 tháng 12 năm 2017 về phát triển cây dược liệu tỉnh Yên Bái đến năm 2020 và định hướng đến năm 2025)

Tỉnh Nghệ An đã phê duyệt quy hoạch và phát triển tổng thể dược liệu đến năm

2025, định hướng đến năm 2030 để bào tồn và phát triển nguồn gen dược liệu có giá trị

và gần như tuyệt chủng, tăng cường bảo tồn các vùng rừng có cây dược liệu mọc tự nhiên tại 3 vùng sinh thái để tập trung khai thác các loài dược liệu có tiềm năng tạo được nguồn dược liệu làm thuốc Việc quy hoạch cơ sở sản xuất tại các huyện để có giống dược liệu sạch bệnh, có năng suất và chất lượng cao đảm bảo đến năm 2025 cung ứng được 60% và đến năm 2030 là 80% Bên cạnh đó, địa bàn tỉnh đang lên kế hoạch cho mục tiêu xây dựng nhà máy chiết xuất dược liệu cho toàn tỉnh và xây dựng các cơ sở sơ

chế, đóng gói và bảo quản sản phẩm từ cây dược liệu ở các huyện và đưa vào quy hoạch trồng cây thuốc (Quyết định số 1187/QĐ-UBND ngày 03 tháng 04 năm 2018, quyết định về việc quy hoạch phát triển tổng thể dược liệu tỉnh Nghệ An đến năm 2025, định hướng đến năm 2030)

Tỉnh Lào Cai đã phê duyệt quy hoạch phát triển dược liệu tỉnh đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030 về ưu tiên phát triển 10 chủng loài cây dược liệu có thế mạnh

về thị trường tiêu thụ tùy thuộc vào điều kiện khí hậu của từng vùng đảm bảo 60% diện tích, sản lượng cây dược liệu quy hoạch đảm bảo đúng tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới đến năm 2020 và phát triển lên 22 chủng loài và đạt 100% diện tích đảm bảo đúng tiêu chuẩn đến năm 2030 (Quyết định số 4478/QĐ-UBND ngày 14 tháng 12 năm 2016, quyết định về việc quy hoạch phát triển dược liệu tỉnh Lào Cai đến năm 2020, định hướng đến năm 2030)

Nghị quyết số 09/2018 của Tỉnh Kon Tum về đề án đầu tư, phát triển và chế biến dược liệu trên địa bàn tỉnh đến năm 2020, định hướng đến năm 2030 về tập trung phát triển vùng nuôi trồng dược liệu đối với các loài có giá trị kinh tế và tiêu thụ mạnh trên thị trường, đầu tư ít nhất 10 cơ sở sản xuất, chế biến dược liệu phục vụ nhu cầu trong nước và hướng đến xuất khẩu đến năm 2020 và nâng cao hình thành ít nhất 5 cơ sở sản xuất giống dược liệu trên địa bàn toàn tỉnh đóng góp khoảng 10% tổng giá trị sản xuất ngành nông nghiệp của tỉnh đến năm 2030

Hà Giang đã triển khai công tác lập quy hoạch và xây dựng dự án phát triển cây dược liệu trên địa bàn cũng nhằm phát triển các loài cây dược liệu hiện có phù hợp với khí hậu và điều kiện tự nhiên trên địa bàn tỉnh, song song bảo tồn các loại cây dược liệu quý hiếm, qua đó thành lập được bản đồ phân bố các loại cây dược liệu chủ lực, phân hạng thích nghi đất đai đối với các loài cây dược liệu để phát triển và thực hiện quản lý theo hướng bền vững với phát triển kinh tế - xã hội của địa phương(Kế hoạch số 109/KH-UBND ngày 03 tháng 06 năm 2013, về việc triển khai công tác lập quy hoạch và xây dựng dự án phát triển cây dược liệu trên đại bàn tỉnh)

Tỉnh Quảng Nam đã phê duyệt quy hoạch bảo tồn và phát triển cây dược liệu giai đoạn 2018 – 2025, định hướng đến năm 2030 về việc phát triển và ổn định 9 loại cây dược liệu ở giai đoạn 2018 – 2025 như Đảng sâm, Ba kích tím, Sa nhân, Đương quy, Lan kim tuyến, Giảo cổ lam, Nghệ, Cà gai leo, Đinh lăng chiếm 60% diện tích và sản lượng cây dược liệu vùng quy hoạch phải đảm bảo tiêu chuẩn của Tổ chức y tế Thế giới Bên cạnh đó, địa bàn tỉnh thiết lập hệ thống Vườn bảo tồn và phát triển dược liệu Quốc gia và hình thành các sản phẩm theo chuỗi từ sản xuất đến tiêu thụ cho 9 loài cây dược liệu kể trên Phấn đấu đến giai đoạn 2026 – 2030 đạt 100% diện tích, sản lượng cây dược liệu quy hoạch và hoàn thiện hệ thống Vườn bảo tồn kết hợp sản xuất giống (Quyết định số 301/QĐ-UBND ngày 22 tháng 01 năm 2018, quyết định về việc quy bảo tồn và phát triển cây dược liệu trên địa bàn tỉnh Quảng Nam giai đoạn 2018-2025 định hướng đến năm 2030)

Tỉnh An Giang triển khai quy hoạch bảo tồn và phát triển cây dược liệu ứng dụng công nghệ cao đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030 Trong thời gian 2015 và

2016, Sở Khoa học Công nghệ tỉnh An Giang xét tuyển 12 đề tài cấp tỉnh, 2 đề tài cấp

cơ sở tập trung để tái điều tra hiện trạng cây dược liệu; Bảo tồn và phát triển cây dược liệu; Xây dựng phần mềm tra cứu cây thuốc trên điện thoại; Phát triển dược liệu có nguồn gốc trên địa bàn tỉnh; Xây dựng 2 vườn gieo ươm cây giống tại huyện Tri Tôn và Tịnh Biên, với quy mô sản xuất tử 2 - 4 triệu cây/năm, trong đó, có nhiều cây dược liệu

Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh An Giang đã phối hợp với Trường Đại học

An Giang triển khai mô hình bảo tồn 50 loài cây thuốc họ vừng, trong đó có nhiều loài đặc hữu của An Giang, vừa có giá trị làm thuốc chữa bệnh, vừa có giá trị về kinh tế và chế biến cây dược liệu thành các sản phẩm rượu Ngải đen, bột ngải đen, Ngải đen sấy khô, bột nghệ xà cừ

An Giang là tỉnh vừa có đồng bằng vừa có đồi núi với độ cao trên 700 mét so với mặt nước biển, có nhiều loại cây thuốc quí có giá trị nằm trong sách đỏ Tỉnh đã triển khai chương trình phát triển cây dược liệu ứng dụng công nghệ cao, thực hiện hiệu quả được gây trồng trên diện tích hơn 276 ha với phong phú loài cây dược liệu quí như cây

dó bầu (cây trầm hương), cây huyền, đinh lăng, Ngải đen, sâm Bố chính, chùm ngây, cây gấc, nghệ đen, sâm cóc, sa nhân tím, tam thất nam, nghệ xà cừ Sở Y tế và Ủy ban khoa học – Kỹ thuật An Giang kết hợp với PTS Võ Văn Chi đã xây dựng cuốn sách

“Cây dược liệu An Giang” nhằm phục vụ công tác bảo tồn và nghiên cứu

Qua các chương trình của các tỉnh cho thấy chủ yếu tập trung vào sưu tập bảo tồn khai thác và phát triển cây dược liệu, chưa tập trung sâu vào việc phân tích xác định chính xác nguồn cây dược liệu nhằm phục vụ công tác thương mại và nghiên cứu một cách hiệu quả hơn

1.1.3 Một số nghiên cứu về bảo tồn và khai thác cây dược liệu tại Việt Nam

Năm 2012, Nguyễn Trung Thành và cộng sự đã nghiên cứu cho thấy thực trạng các loài cây thuốc quý hiếm tại tỉnh Thái Nguyên thống kê được 25 cây dược liệu cần được ưu tiên bảo tồn thuộc 18 họ, 21 chi theo các tài liệu như Danh mục đỏ cây thuốc Việt Nam trong Cẩm nang cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam (Nguyễn Tập, 2007), Nghị định 32/2006/NĐ-CP về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp, quý, hiếm và Sách đỏ Việt Nam (Phần II Thực vật, 2007)

Năm 2015, kết quả nghiên cứu tính đa dạng nguồn cây thuốc được sử dụng trong cộng đồng các dân tộc ở tỉnh Thái nguyên nhằm bảo tồn và phát triền bền vững của Lê Thị Thanh Hương đã xác định được và xây dựng bản đồ phân bố điểm của 32 cây thuốc dược liệu cần bảo tồn ở tỉnh Thái Nguyên, xây dựng danh mục gồm 41 loài cây dược liệu mọc tự nhiên có tiềm năng khai thác với 22 loài có tiềm năng về trữ lượng và giá trị kinh tế (Lê Thị Thanh Hương , 2015)

Năm 2015, Hồ Thị Thu Phương cũng đưa ra kết luận về tình hình khai thác và đề xuất giải pháp bảo tồn, phát triền một số loài cây thuốc quý tại khu bảo tồn thiên nhiên

Bà Nà Núi Chúa xác định được 280 loài cây thuốc thuộc 236 chi, 103 họ và 4 ngành và xây dựng được bản đồ phân bố điểm của 27 loài cây dược liệu thuộc diện cần bảo tồn ở khu bảo tồn thiên nhiên Bà Nà thuộc tỉnh Đà Nẵng Các loài cây quý hiếm thuộc diện cần bảo tồn chiếm tỷ lệ khá cao, các loài được người dân khai thác thường xuyên chiếm

19 loài trong tổng số loài

Năm 2016, Nguyễn Văn Hiếu đã đánh giá hiện trạng và tiềm năng khai thác cây dược liệu vùng rừng ngập mặn huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu qua điều tra bước đầu xác định được 132 loài thuộc 119 chi, 65 họ thực vật có giá trị làm thuốc Các loài cây dược liệu này được sử dụng chữa trị cho 24 nhóm bệnh khác nhau Bên cạnh đó, tại khu vực nghiên cứu cho thấy có 16 loài nằm trong danh mục cây thuốc mẫu, 9 loài có tiềm năng phát triển đối chiếu với Quyết định số 1976/QĐ về Việc phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030 bao gồm Đinh lăng,

Cỏ nhân trần, Mã đề, Gừng, Dừa cạn, Nghệ vàng, Nhàu, Sả và Trinh nữ hoàng cung

Năm 2017, Trần Thị Thu Hà đã hoàn thành các mục tiêu và nội dung cho dự án

“Hoàn thiện công nghệ nhân giống in vitro và nuôi trồng một số cây thuốc quý có giá trị kinh tế cao (Lan Kim Tuyến, Đinh lăng và Gừng gió) do Viện Nghiên cứu và phát

triển lâm nghiệp chủ trì sau gần 2 năm triển khai (2015 – 2016) góp phần quan trọng vào việc bảo tồn và phát triển một số loài dược liệu quý theo hướng sản xuất hàng hóa cho các tỉnh miền núi phía Bắc, góp phần bảo tồn nguồn gen dược liệu quý có giá trị kinh tế cao nhưng ngày càng khan hiếm do khai thác không bền vững.

1.2 Một số chỉ thị phân tử được sử dụng trong nghiên cứu di truyền phân tử trên các giống cây trồng

Các chỉ thị di truyền là các chỉ thị thể hiện sự khác biệt giữa các cơ thể hoặc các loài khác nhau Các chỉ thị này không thể hiện cho các gen mục tiêu mà chỉ là dấu hiệu hoặc như là “cờ đánh dấu” Chỉ thị di truyền bao gồm cả chỉ thị hình thái và chỉ thị phân

tử (isozyme, protein, DNA) Tất cả chỉ thị di truyền đều chiếm một vị trí đặc biệt trong nhiễm sắc thể (NST) và được gọi là locus Các chỉ thị di truyền thường liên kết với gen

và được di truyền theo quy luật di truyền Chỉ thị phân tử thường được hiểu là chỉ thị DNA, các chỉ thị này chỉ nằm gần hay liên kết với gen và không có hoặc ít ảnh hưởng đến kiểu hình (Nguyễn Đức Thành, 2015)

Chỉ thị di truyền có thể chia thành hai loại: chỉ thị truyền thống và chỉ thị DNA Chỉ thị truyền thống gồm chỉ thị hình thái (đây là những tính trạng hoặc đặc điểm hình thái như màu hoa, kiểu hình hạt, đặc điểm sinh trưởng, sự biến đổi sắc tố v.v.), chỉ thị tế bào (đặc trưng cấu trúc của nhiễm sắc thể) và chỉ thị sinh hóa (các isozyme, protein và các chất trao đổi chất) Chỉ thị DNA là những thay đổi trong phân tử DNA và được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau về phương pháp và kỹ thuật xác định sự đa hình Các chỉ thị DNA được sử dụng rộng rãi nhất do số lượng chỉ thị không hạn chế Chỉ thị DNA được hình thành từ các loại đột biến DNA khác nhau như thay thế (đột biến điểm), sắp xếp lại (thêm vào hoặc bớt đi nucleotide) hoặc các sai sót trong sao chép các đoạn DNA lặp lại liền kề Các chỉ thị DNA thường nằm ở các vùng không phiên mã Khác với các chỉ thị hình thái và sinh hóa, chỉ thị DNA không giới hạn về số lượng, không ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và giai đoạn phát triển của cây Chỉ thị DNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen và trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, năng suất và phẩm chất giống (Madhumati, 2014)

Chỉ thị hình thái được sử dụng để phân tích di truyền bởi các nhà di truyền học Gregor mendel và Thomas Hunt Morgan Tuy nhiên, tiềm năng thấp, vì vậy một ít ví dụ thực tế đã tồn tại Chỉ thị protein như isozymes phát triển sau có thể phân biệt cá thể thực vật Nhờ vào các phương pháp này có thể giảm chi phí trong phân tích mẫu Tuy nhiên mối liên hệ số lượng nhỏ của isozyme giới hạn biến đổi có lợi Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được phát triển và sử dụng vào năm 1980,

kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) làm tăng lên nhiều loại chỉ thị phân tử (Yang

et al., 2015)

Bảng 1.1 So sánh sự khác nhau của các loại chỉ thị phân tử

Chỉ thị hình

thái

Dễ đánh giá Chi phí thấp

Phụ thuộc cao vào yếu tố môi trường

Khó khăn để phân tích định lượng tính trạng

Khó khăn để xác định dị hợp tử Hiệu lực giới hạn

Màu, hình dạng…

Chỉ thị protein

Chi phí thấp Co-dominant

Ít phụ thuộc yếu tố môi trường

Mẫu phân tích phải có điều kiện tốt

Hiệu quả giới hạn Vật liệu không ổn định

Chi phí cao và mất thời gian

Sử dụng đồng vị phóng xạ Yêu cầu chất lượng DNA cao Khó khăn để tự động hóa

Chi phí thiết bị cao

Cần biết trước thông tin trình

tự

SSR AFLP RAPD SNP

Theo thống kê từ một cuộc khảo sát các công trình ứng dụng kỹ thuật phân tử vào nghiên cứu sinh học quần thể, từ năm 1979 đến nay đã có hàng ngàn nghiêncứu về

di truyền quần thể trên nhiều đối tượng khác nhau, trong đó có hơn 300 nghiên cứu đã

sử dụng các chỉ thị phân tử như RFLP, RAPD, DAF,SSR, ISSR, AFLP… làm công cụ nghiên cứu Sự gia tăng sử dụng các kỹ thuật này vào đầu thập niên 90 đã chứng minh vai trò to lớn của chúng trong việc cung cấp những thông tin hữu ích về cấu trúc di truyền quần thể

Hình 1.1 Phân loại quá trình phát triển các chỉ thị (Barcaccia, 2010; Sarwat et al., 2012)

Dựa trên RNA

1.2.1 Giới thiệu về chỉ thị phân tử DNA barcode

1.2.1.1 Quá trình phát triển của chỉ thị phân tử DNA barcode

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa) Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển, những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài

và dưới loài Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen (Schindel and Miller, 2005; Park, 2007; Kress and Erickson, 2012; Paula, 2013)

Để thúc đẩy việc sử dụng DNA barcode cho tất cả sinh vật nhân chuẩn sống trên hành tinh này, CBOL (Consortium for the Barcode of Life ) đã được thành lập vào tháng

5 năm 2004, gồm hơn 120 tổ chức từ 45 quốc gia Với mục tiêu ban đầu là xây dựng một thư viện trực tuyến trình tự barcode cho tất cả các loài chưa được biết đến, có thể làm tiêu chuẩn phân loại cho bất kỳ mẫu DNA nào Với sự hỗ trợ của CBOL, chỉ thị phân tử DNA barcode ngày càng phát triển và trở thành một phương pháp phân loại và định danh loài mới

Vùng gen CO1 (còn được gọi là cox1) được sử dụng như một hệ thống DNA

barcode để xác định trên động vật được đề xuất bởi Hebert (Hebert et al., 2003) Vùng

CO1 có kích thước khoảng 600bp kress 2007 Vùng này được ứng dụng thành công trong nghiên cứu DNA barcode để phân biệt giữa các loài đạt 95% của các trường hợp Năm 2004, đã thành công trong việc sử dụng DNA barcode trên động vật đã dẫn đến việc thành lập hiệp hội Consortium for the Barcode of Life (CBOL) để phát triển và phát

huy DNA barcode (Group et al., 2009) Trên cơ sở đó đã thành lập các nhóm nghiên

cứu DNA barcode như Plant Worrking Group (PWG) trên thực vật (Štorchová and Olson, 2007)

Năm 2003, Paul Hebert nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada,

đề nghị " DNA barcode" như một cách để xác định loài DNA barcode sử dụng một chuỗi gen rất ngắn từ một phần của bộ gen và mang ý nghĩa nhận dạng như mã vạch của các sản phẩm hàng hóa với các sọc màu đen đang được sử dụng rộng rãi tại các siêu thị

Về nguyên tắc, hai mặt hàng có thể trông rất giống nhau nhưng nguồn gốc xuất xứ hay

có thành phần khác nhau sẽ mang các mã vạch khác biệt Phương pháp DNA barcode nhằm hiện đại hóa việc phân loại theo truyền thống và dùng tính đa dạng của các phân

tử DNA như một phương tiện để nhận biết và xác định các sinh vật

Lựa chọn các DNA barcode trên thực vật được tập trung lựa chọn trên lục lạp và

vùng trong nhân (Group et al., 2009) những việc tìm kiếm các vùng mã vạch phổ quát

là rất phức tạp và phải có sự khác biệt giữa các loài, tỷ lệ đột biến thấp ở thực vật, được chấp thuận là vùng được sử dụng như DNA barcode phổ quát Nhóm đã đề xuất vùng

rbcL và matK như vùng mã vạch phổ biến ở thực vật

Trong nghiên cứu cây phát sinh loài các vùng gen phổ biến có thể được sử dụng

trong mã vạch Các vùng gen phổ biến trong thực vật như là rbcL, vùng

trnL-F, matK, nhdF và atpB Hai vùng rbcL và atpB được sử dụng trong nghiên cứu

cây phát sinh loài ở mức độ chi và trên chi Các vùng matK và ndhF có nhiều biến đổi

để sử dụng trong xây dựng cây phát sinh loài ở mức độ khác loài, tuy nhiên chỉ những

trình tự có chiều dài lớn hơn 1000 bp mới đủ vùng biến đổi cho sự phân loại (Kress et

al., 2005)

Một số vùng được kiểm tra cho việc sử dụng như là vùng mã vạch: các vùng lạp

thể không mã hóa như trnH-psbA, trnL intron, trnL-F, atpF-atpH, psbK-psbI, vùng

rps4; các vùng lạp thể mã hóa như accD, ndhJ, rpoB, rpoC1 và ycf5,

ribulose-bisphosphate carboxylase (rbcL), maturase K (matK), ndhF, 23S rDNA và atpB, vùng

trong nhân không mã hóa như Internal Transcribed Spacer (ITS bao gồm ITS1 và ITS2)

Trên gen lục lạp có nhiều lợi thế như là không thông qua di truyền trong nhân, thực tế là không có sự tái tổ hợp và có cấu trúc ổn định và các gen này dễ dàng nghiên cứu hơn trong xây dựng cây phát sinh loài so với gen trong nhân Các vùng chính của

DNA barcode thực vật là matK, rbcL, trnH-psbA và vùng ITS trong nhân (Kress et al.,

trong xác định loài bằng phương pháp DNA barcode (Vijayan and Tsou, 2010; Yao et

al., 2010)

Theo Pires và Marinoni (2010), vì các chuỗi DNA là duy nhất cho từng loài, chúng có thể được xem như di truyền "mã vạch" và có tiềm năng để giải quyết những vấn đề cố hữu đối với việc phân loại thực hành cho đến nay Với một biến thể của bốn nucleotide (A, T, C, G) tại mỗi điểm, như vậy có đến 4n (trong đó "n" tương ứng với số lượng nucleotide được khảo sát) mã có thể đối với bất kỳ cho một đoạn trình tự DNA nhất định, làm cho nó có thể để xác định mỗi đơn vị phân loại Ví dụ, với việc khảo sát

15 vị trí nucleotide khác nhau cho một đoạn DNA có thể xác định được 1 tỷ (415) loài Việc nhận dạng này ở bước đầu (đánh giá sơ bộ ban đầu) có thể được thực hiện một cách nhanh chóng và với chi phí thấp mà không cần một chuyên gia phân loại trong nhóm nghiên cứu (mặc dù việc xác định sau cùng cần sự đánh giá của chuyên gia) Ngoài ra, một lợi thế của phương pháp này là có khả năng nhận dạng cá thể tại bất kỳ giai đoạn phát triển và khả năng phân biệt giữa các loài có hình thái giống hệt nhau

Cho đến nay, các mẫu sinh học đã được xác định bằng cách sử dụng đặc tính hình thái giống như hình dạng, kích thước và màu sắc của các bộ phận cơ thể Mặc dù trong một số trường hợp, một kỹ thuật viên qua đào tạo về định danh có thể nhận dạng các mẫu vật thuộc loài nào trên hệ thống phân loại dựa trên bộ tiêu chuẩn về hình thái, nhưng trong hầu hết các trường hợp, một nhà phân loại chuyên nghiệp giàu kinh nghiệm là cần thiết Trong trường hợp mẫu vật bị hư hỏng hoặc đang trong giai đoạn chưa trưởng thành, thậm chí các chuyên gia có thể không thể thực hiện nhận dạng một cách chính xác Mã vạch giải quyết những vấn đề này bởi vì ngay cả những người không chuyên

có thể có được mã vạch từ một lượng nhỏ mô Ở đây, chúng ta không phủ nhận vai trò của các nhà phân loại truyền thống mà nhằm nhấn mạnh tính tiện lợi và khả năng thu nhận thông tin ban đầu một cách chính xác trước khi có sự tham gia của một chuyên gia phân loại Do đó, chỉ thị phân tử DNA barcode có thể đóng vai trò kép như một công cụ

mới trong phân loại cho những người không chuyên môn bên cạnh việc đóng góp một nguồn thông tin hữu ích ở mức độ phân tử cho các nhà nghiên cứu

DNA barcode (DNA barcode) dựa trên một vùng ngắn, có độ biến động nhất định

ở một số trình tự của bộ gen Hai vùng gen phổ biến được dùng trong nghiên cứu DNA

barcode là rbcL ở lục lạp và COI ở ti thể Với hàng nghìn bản sao cho mỗi tế bào, ty thể

và lục lạp dễ dàng được khuếch đại bằng phản ứng PCR, thậm chí từ các mẫu vật rất

nhỏ hoặc bị suy thoái Đoạn DNA rbcL nằm trên bộ gen lục lạp, là một phần của gen

mã hóa cho ribusco tiểu đơn vị lớn Enzyme Ribusco (ribulose-1,5-bisphosphate

carboxylase oxygenase) xúc tác bước đầu tiên của 1 carbon cố định Đoạn DNA COI

nằm trên bộ gen ti thể, là một phần của gen mã hóa tiểu đơn vị 1 của cytochrome C

oxidase Enzym cytochrome C oxidase này tham gia vào quá trình vận chuyển điện tử

của hô hấp ở sinh vật Như vậy, các gen được sử dụng cho mã vạch đều tham gia vào các phản ứng quan trọng của cuộc sống như: lưu trữ năng lượng carbohydrates và tham gia quá trình tạo thành ATP Ngoài ra, nhiều đoạn DNA của các gen khác nhau hay thuộc các đoạn intron không mã hóa đã được phát hiện và phát triển như những mã vạch

mới trong nghiên cứu như: matK, atpF-atpHIGS, psbK-psbI, rpoB, rpoC1, ITS,

.(CBOL, 2009) Theo phương pháp dựa trên DNA barcode, các trình tự của các đoạn DNA barcode được sử dụng để tìm kiếm và so sánh trên một cơ sở dữ liệu trình tự DNA (ví dụ như trên NCBI) Dựa trên kết quả so sánh với các trình tự sẵn có trên cơ sở dữ liệu, việc nhận dạng một loài nhanh chóng được xác định Ngoài ra, việc so sánh trình

tự DNA giữa các loài khác nhau còn giúp xác định mối liên hệ về mặt di truyền giữa chúng và nếu thực hiện phân tích một số trình tự DNA của các đoạn DNA chuyên biệt khác có thể giúp dự đoán được nguồn gốc của các loài lai tạo

DNA barcode là một công cụ sử dụng quy trình được quốc tế công nhận và các vùng DNA để xác định loài và xây dựng cơ sở dữ liệu chung cho sinh vật sống Xây dựng DNA barcode được dự kiến thực hiện trên thế giới cho tất cả các loài sinh vật sống

và xây dựng cơ sử dữ liệu công khai để giúp cho việc tìm hiểu, bảo tồn và sử dụng đa dạng sinh học của thế giới Đối với cây trồng, hai vùng DNA được chọn trong lục lạp là

một phần gen, rbcL và matK để xác định DNA barcode Mỗi DNA barcode của mỗi loài thực vật phải có một tiêu bản đi kèm với các trình tự rbcL và matK để có một cơ sở dữ

liệu có chất lượng tốt Chất lượng của các trình tự DNA, primer sử dụng và có các file

để có thể sử dụng cơ sở dữ liệu Nên có một mã vạch riêng cho từng cá thể trong loài để xác định sự sai khác và thay đổi trong cùng một loài Trên nhiều quốc gia đã sử dụng DNA barcode để đánh giá đa dạng sinh học và xây dựng cơ sở dữ liệu công khai cho việc sử dụng chung (Natasha de Vere T.C.G.R., 2015)

DNA barcode ở động vật: DNA barcode locus gen CO1 ở động vật thường được

dùng rộng rãi do có các tiêu chí: đây là một gen đơn bội, được di truyền từ mẹ, gen này cho mức độ phân biệt cao Đó là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào Ở động vật, nó có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ, hoặc thường xuyên lặp đi lặp lại đơn nucleotide Những đặc điểm này kết hợp với cặp

primer được thiết kế tốt, hiệu quả sử dụng gen CO1 để phân biệt nhiều mẫu động vật có

cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao ngay với các mẫu đã được

lưu giữ qua thời gian dài Nhiều nghiên cứu cho thấy CO1 giúp phân biệt được khoảng

98% các loài với nhau Trong phần còn lại, nó xác định đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các loài có mối quan hệ gần gũi, nói chung là các loài chỉ vừa mới tách ra hoặc các loài lai thường xuyên Ngoài locus gen CO1, các đoạn gen ti thể Cytb (cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như DNA mã vạch trong nhận dạng ở động vật

DNA barcode ở thực vật: Nếu như các gen ti thể như CO1 và Cytb được dùng

rộng rãi cho động vật và một số loài tảo, thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính bảo thủ cao và vì vậy không phù hợp làm DNA mã vạch Thay vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu

phát sinh loài (như các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng intron của các gen trnL và trnL-F) Một vùng trình tự thông thường khác cho nghiên cứu phát

sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn DNA ribosome) Tính đến năm 2009, đã có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm DNA barcode ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp

* Một số vùng DNA barcode phổ biến

cứu và kết quả cho thấy các chuỗi rbcL phải dịch mã và các acid amin được thể hiện trên cây phát sinh loài Vùng rbcL dễ dàng khuếch đại và trình tự trên vùng phổ quát

của đơn vị phân loại và được đề xuất làm vùng DNA barcode Không thể sử dụng để

phân biệt ở mức độ loài (Renner, 1999; Kumar et al., 2018; Paula, 2013)

Vùng matK:

Vùng matK giữa vùng trnK trên gen lục lạp, ngoại trừ một số loài dương xỉ Ở cây một lá mầm vùng matK có chiều dài khoảng 1535 bp (Gao et al., 2011) Chỉ có vùng

matK có kích thước 600 – 800 bp được sử dụng cho DNA barcode Các gen matK tiến

hóa nhanh (nhanh gấp ba lần so với vùng rbcL và atpB) và một số nghiên cứu cho thấy

có hiệu quả trong phân biệt giữa các loài trong thực vật hạt kín

Vùng ITS trong nhân:

Vùng internal transcribed spacer (ITS) của nuclear ribosomal cistron đã được sử dụng rộng rãi trên eukaryote trong cây phát sinh loài có nhiều thay đổi hơn so với gen lục lạp DNA trong nhân (nrDNA) được chuyển thông qua phấn hoa và hạt giống của thực vật, so với các DNA di truyền từ mẹ chỉ thông qua hạt giống Hạt thường phân tán kém so với phân hoa điều này có thể nói tại sao vùng ITS giải quyết tốt hơn marker

DNA ngoài nhân trong DNA barcode (Kumar et al., 2016; Paula, 2013)

* Giới thiệu một số DNA barcode được sử dụng trong nghiên cứu di truyền

Vùng rpoB và rpoC:

Hai vùng gen mã hóa ngoài nhân là một phần của gen mã hóa cho tiểu đơn vị của

RNA polymerase, có nhiệm vụ trong quang hợp của thực vật bậc cao Các gen rpoB chịu trách nhiệm mã hóa tiểu đơn vị beta RNA polymerase và mã hóa rpoC cho tiểu đơn

vị beta’ RNA polymerase (Kumar et al., 2016; Paula, 2013)

Vùng atpH-atpI:

Vùng nằm giữa các gen mã hoá atpH và atpI trong vùng Large Single Copy

Mặc dù vùng này chưa được nghiên cứu rộng rãi cho mã vạch

Vùng trnH-psbA: được sử dụng trong nghiên cứu DNA barcode cho các loài có biến

động cao, dễ dàng khuếch đại giữa các loài khác nhau (Kress et al., 2005) và vùng này

có trình tự có thể khuếch đại với 1 cặp primer trong nhiều loài, do sự dễ dàng thiết lập một trình tự đầy đủ

Gen trnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi từ 296 đến 1120 bp, trnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài cao Locus trnH-

psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần Tuy nhiên,

trong nhiều thực vật hạt kín trnH-psbA lại có kích thước rất ngắn (~ 300 bp), kích thước

của gen này thay đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng

gen của hai gen trnH và psbA Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng

trnH-psbA như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK CBOL thấy

rằng khả năng phân biệt loài của trnH-psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như là chỉ thị barode bổ sung trnH-psbA có thể sử dụng

trong hệ thống barcode ba locus khi hệ thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ

khả năng phân tích (Štorchová and Olson, 2007; Wu et al., 2009)

Trình tự gen ycf5:

ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids Gen này được bảo tồn trên

tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù hợp với DNA barcode của một vài nhóm Tuy nhiên, gen này chưa được công nhận và sử dụng nhiều trong vai trò

của một mã DNA (Van De Wiel et al., 2009; Vijayan and Tsou, 2010)

1.2.1.2 Một số ứng dụng của kỹ thuật DNA barcode

Xác định mối quan hệ họ hàng (tiến hóa) giữa các giống, loài trong hệ thống phân loại

Định danh và xác định chính xác các giống, cá thể có hình thái tương tự nhau nhưng bản chất di truyền lại khác biệt

Xác định mức độ khác biệt (đa dạng) giữa các giống trong cùng một loài hay giữa các loài khác nhau

Xác định nguồn gốc bố mẹ của các giống lai tạo

Góp phần xác định mối liên hệ giữa di truyền giữa các loài, ứng dụng trong bảo tồn và lai tạo giống

1.2.1.3 Một số ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode thành công trên cây dược

liệu

Nhiều nghiên cứu từ năm 2003 đến 2016, kết quả cho thấy DNA barcode xác định chính xác nhiều cây dược liệu không cần đến mô tả hình thái DNA barcode đã được ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau như pháp y, an toàn sinh học, tìm nguồn gốc của sinh vật, dược phẩm, công nghiệp dược liệu và nhiều lĩnh vực khác DNA barcode giúp xác định trên các lĩnh vực khác nhau và cho kết quả chính xác từ việc xác định cây dược liệu Các dữ liệu DNA barcode khác nhau trên cây dược liệu được mô tả theo bảng 2.2

Bảng 1.2 Một số kết quả nghiên cứu dựa trên kỹ thuật DNA barcode cho một số cây

dược liệu

4 Araceae Acori Tatarinowii Rhizoma ITS2

5 Acanthaceae Andrographis paniculata rbcL

6 Acanthaceae Andrographispaniculata ITS2, rpoC1, trnH-psbA

17 Acanthaceae Clinacanthus nutans ITS2, rpoC1, trnH-psbA

20 Apocynaceae Cynanchumauriculatum trnL-F

21 Asclepiadace Cynanchum wilfordii trnL-F

22 Fabaceae Dalbergiae Odoriferae Lignum ITS2

26 Araliaceae Ginseng genus matK, rbcL, ITS, psbA-trnH, rpoB, rpoC1, ITS2

28 Rubiaceae Hedyotis diffusa Willd ITS

32 Acanthaceae Justicia gendarussa ITS2, rpoC1, trnH-psbA

33 Caprifoliaceae Lonicera spp matK, rbcL, ITS, psbA-trnH, trnL-F

34 Caprifoliaceae Lonicerae japonicae Flos ITS2

36 Lamiaceae Mentha aquatica L rbcL, matK, trnH-psbA, rpoB

41 Lamiaceae Ocimum gratissimum rbcL, matK, trnH-psbA, rpoB

42 Lamiaceae Ocimum basilicum L rbcL, matK, trnH-psbA, rpoB

Nguồn: (Srivastava et al., 2016)

1.2.2 Một số chỉ thị phân tử ứng dụng để phân tích di truyền, xác định giống đối

với cây dược liệu

Kỹ thuật dựa trên DNA được sử dụng rộng để xác định cây dược liệu nhập khẩu

và xuất khẩu Sinh học phân tử cung cấp và thiết lập kỹ thuật sử dụng cho việc xác định cây dược liệu Điều này rất hữu ích cho việc phân biệt những loài khó phân biệt với loài khác hoặc giống về mặt hình thái và thành phần hóa học

Chỉ thị phân tử DNA barcode: Việc sử dụng chỉ thị phân tử DNA barcode cho

hiệu quả tốt trong việc xác định cây Crocus sativus trong quá trình xuất khẩu và nhập

khẩu sản phẩm cây dược liệu trên thế giới Bởi vì chúng có giá trị cao nên cây dược liệu thường bị pha trộn với một số loài khác Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy việc sử dụng vùng ITS2 có hiệu quả trong việc mô tả ở mức độ loài và quần thể Một số vùng

khác được sử dụng như trnH-psbA, rpoC1, rbcL, matK là các vùng mã hóa và hai vùng

không mã hóa ITS1, ITS2 được sử dụng để so sánh giữa 319 loài dược liệu

Chỉ thị phân tử SSR: Nhiều công bố của một số tác giả cho thấy đã sử dụng chỉ

thị phân tử SSR để xác định và định danh cây dược liệu Như Hon và cộng sự đã sử dụng 16 SSR để phân tích 150 và 40 cây nhân sâm Mỹ và nhân sâm Oriental Kết quả cho thấy 9 mẫu khác nhau của Trung Quốc có nguồn gốc từ nhân sâm Mỹ

Chỉ thị phân tử AFLP: Một số công bố đã sử dụng chỉ thị phân tử AFLP để xác

định cây dược liệu Labra và cộng sự đã đánh giá chi Ocimum khoảng 150 loài bằng chỉ thị phân tử AFLP và nhiều nghiên cứu khác trên các đối tượng như: Rosa damascene,

Lolium…

Chỉ thị phân tử RAPD: Chỉ thị phân tử RAPD được sử dụng để xác định một số

giống cây dược liệu như Glycyrrhiza glabra, Astragalus microcephalus, Podophyllum

2 AFLP Zanthoxylum acanthopodium và Zantho xylum oxyphyllum Toàn bộ cây

9 DNA barcode Indirubin (Isatis tinctoria, Polygonum tinctorium, và

Bảng 1.4 Điểm mạnh và điểm yếu của các phương pháp xác định khác nhau

Cơ sở xác định

gDNA, biến đổi đặc trưng (đa hình) của trình

tự nucleotide

gDNA, biến đổi đặc trưng (đa hình) của trình tự nucleotide

gDNA, biến đổi đặc trưng (đa hình) của trình

tự nucleotide

Loci đặc trưng

biobarcodeMức độ xác định Mức độ quần thể Mức độ quần thể Mức độ quần thể Loài Hiệu quả trong việc

đánh giá mối quan

hệ btw

Đoạn DNA khuếch đại không phân biệt đồng hợp tử (một bản copy) hay dị hợp tử (2 bản copy)

Null alleles

Nguồn: (Hao et al., 2010; Pourmohammad, 2013; Ganie et al., 2015)

Cúc mâm xôi (Chrysanthemum morifolium) thuộc họ Asteraceae là cây hoang

dại có số lượng lớn và có giá trị thương mại, dược liệu cao Hiện nay, được trồng để sử dụng cho sản xuất dược liệu Trong thời gian dài cây mâm xôi đã cải thiện đặc điểm di truyền do quá trình trồng, mức độ dị hợp tử cao Để việc lai tạo có hiệu quả thì việc biết được mức độ đa dạng di ruyền là rất quan trọng Theo đó, Feng và cộng sự đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của cây cúc mâm xôi dựa trên 55 SSR cho 32 giống Kết quả cho thấy chỉ số PIC trung bình đạt 0.972 với mức độ đã dạng di truyền cao Dựa trên cây phân nhóm cho thấy chia làm hai nhóm chính Dựa trên đó tiến hành chọn lựa

để tiến hành lai tạo giống (Feng et al., 2016)

Để xác định nguồn gốc cây Bauhinia strychnifolia nhóm tác giả đã sử dụng chỉ

thị phân tử DNA barcode để định danh và xác định Sử dụng 42 SSR để xác định và đánh giá đa dạng di truyền của 15 mẫu giống từ 11 tỉnh của Thái Lan bao gồm Bangkok Kết quả cho thấy từ 42 cặp mồi, có 35 cặp mồi được khuếch đại thành công, trong đó có

14 cặp mồi cho tính đa hình và 13 cặp mồi có tính đồng hình Đánh giá đa dạng di truyền dựa trên 14 SSR cho thấy chỉ số PIC từ 0.335 đến 0.91 với giá trị trung bình là 0.672

(Sraphet et al., 2018)

Cây rau má (Centella asiatica) là loài có giá trị dược liệu cao được sử dụng trong

sản xuất thuốc Việc đánh giá đa dạng di truyền và xác định giống là rất quan trọng trong

việc phát triển giống cây Từ đó nhóm nghiên cứu đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của giống rau má từ thư viện genomic Kết quả cho thấy 75% của 768 dòng trong thư viện genomic chứa SSR 90 trình tự chứa SSR bao gồm từ 96 dòng được cung câp Trên cơ sở đó thiết kế 20 SSR thì có 17 SSR thể hiện tính đa hình khi sàng lọc trên 17 giống rau má với giá trị allen trên mỗi locus là 4.3 và giá trị dị hợp là 0.114 và 0.379

(Rakotondralambo et al., 2012)

Ứng dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền của cây bảy lá một hoa Đối tượng trên có giá trị dược liệu cao và được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc Tuy nhiên, do khai thác quá mức và đang có nguy cơ tuyệt chủng nên việc đánh giá nguồn gen để lai tạo giống rất cần thiết Do đó nhóm tác giả Zheng và cộng sự đã tiến hành chọn 12 SSR từ thư viện gen nomic của cây bảy lá một hoa để đánh giá 30 cá thể tự nhiên Kết quả cho thấy giá trị dị hợp tử từ 0.000 đến 0.467 với giá trị trung bình là 0.247 và đã xác định được 6 locus đáng kể từ Hardy-Weinberg cân bằng điều này cho

thấy có thể do quần thể đánh giá nhỏ, lai tạo giống, alen null (Zheng et al., 2012).

Khan và cộng sự đã sử dụng chỉ thị phân tử để xác định loài Cuscuta reflexa với loài gần khác là Cuscuta chinensis Cuscuta reflexa đã được xác định chính xác và sử dụng làm đối chứng và mẫu thuộc Cuscuta chinensis được thu thập trên thị trường để

xác định Sử dụng 32 primer để đánh giá, kết quả cho thấy có 14 primer không khuếch đại được, 11 primer cho band sản phẩm mờ và không tạo sản phẩm, có 7 primer cho sản phẩm PCR xuất hiện các band đa hình và đồng hình Kết quả phân tích cho thấy có thể

phân biệt hai loài trên mặc dù có sự giống nhau về mặt hình thái (Khan et al., 2010)

Paramanik và cộng sự đã tiến hành đánh giá mối quan hệ di truyền của cây dược liệu sử dụng chỉ thị phân tử RAPD 18 cây dược liệu khác nhau được tiến hành ly trích DNA tổng số và khuếch đại dựa trên phản ứng PCR với 13 primer Kết quả cho thấy với primer OPD-13 cho tổng số band là 172 band tuy nhiên đối với các cây dược liệu như

Artemisia vulgaris, Artemisia pallen, Menthan piparita, Mentha citrate, Bacopa moninieri và Stevia rebaudiana cho 9 band Đối với primer OPD-13 cho số lượng band

từ 8-9 band trên mỗi cây dược liệu kích thước sản phẩm nằm trong khoảng 300-5000 bp

và các primer khác cũng cho kết quả khuếch đại trên mỗi cây dược liệu là khác nhau Kết quả phân tích cho thấy có 3 loài có thể tách rời riêng một nhóm của cây dược liệu

(Paramanik and Chikkaswamy, 2014)

1.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA barcode trong định danh,

đánh giá di truyền cây dược liệu

* Trên thế giới

Hiện nay nhu cầu sử dụng cây dược liệu cao do vậy việc xác định nguồn vật liệu rất quan trọng để cung cấp cơ sở dữ liệu chứa các thông tin xác định vật liệu và khả năng trộn lẫn với các loài khác Cơ sở dữ liệu DNA barcode cung cấp dữ liệu để truy xuất và

so sánh sự giống nhau Hiện nay, có nhiều chỉ thị phân tử được phát phiển đã được ứng dụng để xác định và định danh vật liệu cây dược liệu Trên cơ sở đó nhóm tác giả Techen

đã chọn lựa, đánh giá một số vùng gen và phương pháp để xác định mã vạch dựa trên

cơ sở dữ liệu có sẵn và tiền năng tương lai của DNA barcode cho cây dược liệu Hiệu quả của các phương pháp trên giúp giảm thiểu sự trộn lẫn với các vật liệu không phải

dược liệu và một số trường hợp khác (Techen et al., 2014)

Tình trạng trộn lẫn các thành phần khác với sản phẩm cây dược liệu trên thị trường là vấn đề quan tâm chính Vì thế, việc xác định và tối ưu hóa là điều kiện cần thiết để giảm thiểu sự mất công bằng trên thị trường Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) tổng số kinh phí cho dược liệu làm thuốc là 62 tỷ đôla và dự đoán tới năm 2050 là 5

triệu tỷ đôla Hiện tại dữ liệu DNA barcode có sẵn 363.584 trình tự từ 50.039 loài Trong tháng 1 năm 2019 iBOL bắt đầu với mục tiêu chọn lọc mã vạch cho 5 triệu loài trong 5 năm Các nhà khoa học của 25 nước đã thực hiện dự án này Tuy nhiên rất ít báo cáo liên quan đến mã vạch cây dược liệu Một số báo cáo dựa trên kỹ thuật DNA barcode trên cây dược liệu ở Ấn Độ đã công bố Do tầm quan trọng và nhu cầu cây dược liệu và sản phẩm của nó, dược liệu công nghiệp thay thế và trộn lẫn các loài gần với cây dược liệu Sự lai tạp và trộn lẫn có thể là thay đổi chính trong quá trình hình thành Hiệu quả của thuốc hay dược liệu sẽ bị giảm khi bị trộn lẫn, một số có thể gây chết người nếu thành phần trộn lẫn có độc tính.Xây dựng thông tin chính xác là rất quan trọng để sử dụng hiệu quả cây dược liệu Nguồn thu thập chính của các nhà thảo dược học đối với cây dược liệu là trên thị trường Sự hạn chế về kinh tế là động lực để các nhà thảo dược học thay thế các thành phần rẻ hơn Do buôn bán cây dược liệu trái phép quá mức, nhiều loài có thể trở nên tuyệt chủng ở Ấn Độ Vì thế để tránh các vấn đề trên, mục tiêu xác định là chính xác cây dược liệu là vấn đề cần thiết DNA barcode là công cụ xác định

nguyên vật liệu của cây dược liệu (Srivastava et al., 2016)

Nhóm tác giả của Liu đã sử dụng chỉ thị phân tử DNA barcode cho các loài mới

gần đây trong chi Gentiana tại Trung Quốc Đánh giá 79 mẫu từ 30 loài từ Trung Quốc, mỗi loài chọn từ 1-8 cá thể dựa trên 4 vùng DNA barcode rbcL, matK, trnH-psbA và ITS Kết quả PCR cho thấy vùng rbcL cho tỷ lệ khuếch đại 100%, matK (96.2%), trnH-

psbA (96.2%), ITS (68.35 %) với kích thước tương ứng là 554 bp, 743 bp, 636 bp, 227

bp, 698 bp Tiến hành giải trình tự DNA của 5 vùng trên và tiến hành phân tích kết quả cho thấy vùng ITS phân biệt cao (60%-74,42%), khi kết hợp vùng matK+ITS cho khả năng phân biệt cao hơn 71,43 – 88,24%) và được khuyến cáo sử dụng để xác định, nhận

dạng loài trong chi Gentian (Liu et al., 2016)

DNA barcode là một công cụ dựa trên gen để xác định các cây dược liệu hoặc các sản phẩm sản xuất từ nó Nên việc chọn vùng DNA barcode nào để xác định, định danh cho từng cây cụ thể là rất cần thiết Hiện tại, các nhà nghiên cứu đang sử dụng hai vùng chính là trong nhân và ty thể để định danh và xác định loài Đối với mỗi loài khác nhau việc sử dụng vùng DNA barcode sẽ khác nhau và cho hiệu quả cho từng đối tượng cần xác định Dữ liệu DNA barcode được phát triển cho vật liệu cây dược liệu như httt://www.cuhk.edu.hk/icm/mmdbd.htm, tại đây được công bố các vùng gen DNA barcode hoặc http://137.189.42.34/mherbsdb/index.php là trang web chứa các trình tự DNA của cây dược liệu, thông tin, tài liệu tham khảo quan trọng (Sundari, 2015)

Nhu cầu sử dụng cây dược liệu tăng theo từng ngày, do đó việc xây dựng cơ sở

dữ liệu để xác định và định danh là điều cần thiết và loại bỏ việc trộn lẫn các loài khác, dựa trên cơ sở dữ liệu DNA barcode này có thể so sánh sự giống nhau Tác giả đã tổng hợp các nghiên cứu về kỹ thuật, cũng như dữ liệu về DNA barcode để xác định cây dược liệu nhằm cung cấp mã vạch, dữ liệu có sẵn và DNA barcode cho tương lai Tác giả đã giới thiệu một số trang web về dữ liệu DNA barcode và việc ứng dụng vùng DNA barcode trên một số đối tượng cụ thể (Ladani and Parabia, 2014)

Lee và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật DNA barcode để đánh giá đa dạng di truyền

và định danh giống cây quế Vùng ITS2 bao gồm đoạn 26S được khuếch đại với cặp mồi BEL-1 và BEL-3 và giải trình tự, trình tự DNA sau khi hiệu chỉnh được so sánh với các cá thể khác Kết quả cho thấy mức độ tương đồng giữa các trình tự là 100% Cho thấy vùng ITS2 có thể sử dụng để xây dựng mã vạch từ các loài khác nhau của

Cinnamomum osmophloeum (Lee et al., 2010)

Ford và cộng sự đã tiến hành đánh giá sàng lọc vùng DNA barcode cho thực vật Tiến hành sàng lọc 41 vùng mã hóa dựa trên bộ genomics của Nicotiana để đánh giá trên 98 mẫu thực vật Kết quả PCR cho tỷ lệ khuếch đại đạt từ 85-94% và tiến hành giải

trình tự Từ kết quả phân tích nhóm tác giả đã khuyến cáo sử dụng 6 vùng là matK,

rpoB, rpoC1, ndhJ, ycf5 và accD (Ford et al., 2009)

Vùng ITS2 được sử dụng để xác định cây dược liệu có hiệu quả Tiến hành so

sánh 7 vùng DNA barcode khác nhau (rbcL, matK, trnH-psbK, rpoC1, ycf5, ITS2, ITS

trên cây dược liệu Kết quả phân tích dựa trên vùng ITS2, trnH-psbK cho 400 mẫu cây dược liệu trên 326 loài của 98 họ như dicots, monocots, gymnosperms … Tỷ lệ khuếch

đại vùng trnH-psbK, ITS2 là 92,8% và 93,8%, trong khi đó vùng ITS chỉ khuếch đại

được 42,3% trên các mẫu nghiên cứu (Chen et al., 2010)

Hou và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật DNA barcode để đánh giá tính chính xác và

ổn định trong việc xác định các vật liệu dược liệu truyền thống đối với cây Kim Ngân Hoa Đánh giá trên 45 cá thể của 7 loài được chọn lọc ở các tỉnh tại Trung Quố Tất cả các mẫu đều đã được xác định bởi Giáo sư Yulin lin ở Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences Sử dụng vùng ITS2,

trnH-psbK để đánh giá hiệu quả xác định giống theo phương pháp truyền thống Tỷ lệ

khuếch đại trên hai vùng DNA barcode ITS2, trnH-psbK là 100% Giải trình tự DNA

vùng ITS2 cho thấy chiều dài của 24 mẫu Kim Ngân Hoa có kích thước 228bp chứa trung bình 75,4% hàm lượng GC, chỉ xác định được một vị trí thứ 27 có sự biến đổi là

C/T Nghiên cứu cho thấy vùng ITS2, trnH-psbK trnH-psbK xác định chính xác và hiệu quả trong việc xác định và định danh loài (Hou et al., 2013)

Ghorbani và cộng sự đã xác định vật liệu thực vật thu từ thị trường ở nIran bằng

kỹ thuật DNA barcode Các mẫu được thu thập từ 17 cửa hàng bán cây dược liệu từ sáu thành phố trong tỉnh Northern Khorasan và một phần dự án cây dược liệu Tiến hành sử

dụng vùng ITS và trnL để đánh giá và xác định trên 229 mẫu cây dược liệu được chọn

lọc Kết quả khuếch đại các mẫu thu thập từ thị trường đối với vùng ITS là 96% (65 mẫu) trong đó 17 mẫu cho kết quả là của mẫu nấm Tiến hành giải trình tự DNA của các

mẫu đạt 71% (sau khi đã trừ các mẫu bị nhiễm nấm) Đối với vùng trnL cho tỷ lệ khuếch

đại đạt 96% (65 mẫu), giải trình tự thành công là 88% (60 mẫu) Kết quả cho thấy các

DNA barcode trên cho hiệu quả xác định thành công ở mức độ loài (Ghorbani et al.,

2017)

Zhang và cộng sự đã tiến hành đánh giá và sử dụng kỹ thuật DNA barcode để đánh giá mối quan hệ di truyền của cây Kim tiền thảo Đánh giá trên 4 vùng DNA barcode là rbcL, matK, trnH-psbK và ITS cho 97 mẫu từ bốn thế hệ tương ứng 34 loài Kim tiền thảo giả định Kết quả cho thấy vùng ITS cho khả năng phân biệt cao đối với

cây Kim tiền thảo (ZHANG et al., 2012)

Mahadani và cộng sự đã sử dụng vùng DNA barcode matK và trnH-psbA để mô

tả phân loại cây thuộc họ Trúc Đào Kết qyar khuếch đại cho thấy vùng matK có kích thước khoảng 758 bp và khi phân tích các trình tự cho thấy cóa 189 vị trí biến đổi Kết quả cho thấy vùng matK cho thông tin để xác định loài cây dược liệu chính xác

(Mahadani et al., 2013)

Jiao và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật DNA barcode để xác định cây dược liệu Ngọc Trúc một cách có hiệu quả và chính xác Các mẫu được thu thập từ các vùng khác nhau trong 11 tỉnh của Trung Quốc với 39 mẫu Tiến hành khuếch đại với vùng ITS2,

psbA-trnH cho các mẫu đã được chọn lọc Kết quả cho thấy vùng ITS2 có nhiều band

đa hình nên không được chọn để xác định cây dược liệu Vùng , psbA-trnH có các band

đơn nên được chọn để giải trình tự cho kích thước là 650 bp Sau khi hiệu chỉnh trình tự

chiều dài vùng psbA-trnH có kích thước từ 529-603 bp hàm lượng G+C chứa 34,8 -

35,6%, A+T chứa 64,4 – 65,2% với 13 vị trí biến đổi Khi so sánh trên ngân hàng NCBI

cho tỷ lệ tương đồng từ 99-100% Kết quả nghiên cứu cho thấy vùng psbA-trnH có hiệu quả trong việc xác định loài đối với cây Ngọc Trúc (Jiao et al., 2018)

Ragupathy và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật DNA barcode để nhận dạng một loài

cỏ mới từ đồi núi phía bắc của Ấn Độ trong nghiên cứu thực vật học Hai loài có tên Irulas và Malaasars được tiến hành đánh giá sựa khác nhau giữa hai hệ thống khác nhau

là SK và TK để xác định loài cỏ của chi Tripogon và dựa trên DNA barcode để xác định

loài Tripogon cope Vùng DNA barcode matK và trnH-psbK cho thấy sự khác biệt trình

tự giữa hai loài tuy nhiên vùng rbcL không có sự khác biệt giữa hai loài (Ragupathy et

al., 2009)

Nhóm tác giả Udhayasankar đã sử dụng vùng matK để phân tích, đánh giá, xác định cây Thì là Kích thước của vùng matK tương ứng 900 bp khi kiểm tra trên gel

agarose Sản phẩm PCR được tiến hành giải trình tự với kích thước khoảng 1050 bp và

có sự tương đồng 100% với Anethum graveolens L trên Genbank (Udhayasankar M,

2017)

* Tại Việt Nam

Đinh lăng (Polyscias) là nhóm cây dược liệu, có nhiều dược tính giá trị và được sử

dụng trong nhiều bài thuốc điều trị bệnh Ở Việt Nam, nhiều giống đinh lăng khác nhau đang được trồng và khai thác nguyên liệu dược trên quy mô lớn Tuy nhiên, nhiều giống Đinh lăng khác nhau hiện đang được trồng ở các vùng địa lý, khí hậu khác nhau và các giống này có sự thay đổi nhất định về hình thái nên việc đánh giá và xác định chính xác các giống Đinh lăng dựa trên đặc tính hình thái thường gặp những khó khăn nhất định Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử DNA barcode nhằm phân tích

và đánh giá mối quan hệ di truyền của 24 mẫu giống Đinh lăng dựa trên 3 vùng matK,

rbcL và ITS với các cặp mồi đặc hiệu Kết quả phân tích khả năng khuếch đại các vùng

DNA barcode của các mẫu giống Đinh lăng cho thấy có sự khác nhau về khả năng khuếch đại thành công giữa các mẫu giống Đinh lăng cũng như giữa các vùng trình tự,

cụ thể rbcL (62,5%), matK (37,5%), ITS1, ITS2 (66.7%) và ITS (a) (70,8%), ITS (b, c)

(45.8%) Kết quả phân tích trình tự DNA của vùng ITS từ 7 mẫu giống Đinh lăng cho thấy có 729/740 vị trí bảo tồn và 11/740 vị trí biến đổi Kết quả phân tích cây phát sinh loài cho thấy các loài Đinh lăng có thể phân tách nhau, và được chia làm hai nhóm Nhóm I gồm đinh lăng lá tròn, đinh lăng lá dĩa, nhóm II gồm đinh lăng lá nhỏ, lá ráng

và lá rí, và có sự khác biệt thấp giữa các loài trong cùng một nhóm Từ các kết quả trên cho thấy khả năng ứng dụng chỉ thị DNA barcode trong đánh giá và xác định các mẫu giống Đinh lăng ở mức độ loài cũng như tiềm năng ứng dụng trong đánh giá di truyền các giống dược liệu nói chung (Huỳnh Hữu Đức, 2018)

Một số loài lan thuộc chi Anoectochilus và Ludisia được thu thập và chọn lọc để

định danh và phân tích di truyền nhằm mục tiêu bảo tồn, khai thác một cách hợp lý nguồn gen này Hiện nay, kỹ thuật DNA barcode đã được ứng dụng thành công trong việc định danh và xác định loài, có ưu thế hơn khi sử dụng phương pháp hình thái và

sinh hóa Trong nghiên cứu này, 06 mẫu giống lan thuộc chi Anoectochilus và Ludisia

được sử dụng để phân tích di truyền và xác định loài dựa trên các vùng gen trong lục lạp

và trong nhân như: rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2, ITS1, ITS2, ITS Kết quả

phân tích DNA của các mẫu giống cho tỷ lệ khuếch đại thành công từ 50-100% cho các