Thiết lập công nghệ nuôi cấy tế bào 2d, 3d tự động dùng trong sàng lọc một số dược liệu có tác động gây độc tế bào hepg2, cd133⁺ hepg2

iii DANH MỤC HÌNH Hình 3: Sơ đồ những thí nghiệm chính của nghiên cứu sàng lọc cao chiết có khả năng kháng phân bào trên tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 6 Hình 8 : Giá trị IC50 của dox

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN TRƯỜNG SINH

THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO 2D, 3D TỰ ĐỘNG DÙNG TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ DƯỢC LIỆU CÓ TÁC ĐỘNG GÂY ĐỘC

Công trình được hoàn thành tại: Viện Tế Bào Gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

Người hướng dẫn khoa học:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM

2 Thư viện Đại học Quốc gia Tp.HCM

i

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT II DANH MỤC HÌNH III DANH MỤC BẢNG IV

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 U NG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ V IỆT N AM 3

1.1.1 Tình hình thế giới 3

1.1.2 Tình hình Việt Nam 3

1.2 C ÁCH TIẾP CẬN MỚI TRONG SÀNG LỌC PHÁT TRIỂN THUỐC 3

1.2.1 Mô hình tế bào gốc ung thư trong sàng lọc thuốc 3

1.2.2 Nuôi cấy tế bào 3D và những ưu điểm so với nuôi cấy 2D 4

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 5

2.1 T Ế BÀO 5

2.2 H OÁ CHẤT 5

2.2.1 Dung môi 5

2.2.2 Các hóa chất chính 5

2.3 P HƯƠNG PHÁP 6

2.3.1 Sơ đồ thí nghiệm và bố trí thí nghiệm 6

2.3.2 Các phương pháp chính 6

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 8

3.1 N GHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC CAO CHIẾT KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO 8

3.1.1 Thiết lập mô hình tế bào đối chứng trong sàng lọc 8

3.1.2 Thiết lập dòng tế bào gốc ung Sthư sử dụng trong sàng lọc 9

3.1.3 Xây dựng mô hình sàng lọc sử dụng tế bào ung thư gan và tế bào gốc ung thư gan ở dạng 2D và 3D 11

3.2 Á P DỤNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC ĐÃ THIẾT LẬP ĐỂ SÀNG LỌC CAO CHIẾT TRONG THƯ VIỆN 14

3.3 Đ ÁNH GIÁ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG KHÁNG PHÂN BÀO CỦA CÁC CAO CHIẾT TIỀM NĂNG 16

3.3.1 Kết quả chọn lọc các cao chiết tiềm năng 16

3.3.2 Các cao chiết top hit có thể cảm ứng sự chết tế bào theo con đường apoptosis 17

3.3.3 Tác động các hợp chất tinh khiết được phân lập từ cao chiết rễ cây Ngãi Bún B Panduratin 19

TỔNG HỢP DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 25

ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Việt

2D Two dimentional 2 chiều

3D Three dimentional 3 chiều

7-AAD 7- amino-actinomycin D

ABC transporter ATP-binding cassette

transporter

Kênh vận chuyển cần ATP

ADMETox

Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion and Toxicity

Hấp thu Phân bố

- Chuyển hoá – Thải trừ và Độc

tố ADSC Adipose-tissue derived

mesenchymal stem cell

Tế bào gốc trung

mô từ mô mỡ ALDH Aldehyde dehydrogenase

AMPK AMP-activated protein kinase

CI Cell index Chỉ số tế bào CSC Cancer stem cells Tế bào gốc ung thư DDR Drug Development Research Nghiên cứu phát

triển thuốc

HF Human fibroblast Nguyên bào sợi người SEI Selective effect index Chỉ số chọn lọc

tác dụng phụ IC50 The half-maximal inhibitory

concentration

Nồng độ ức chế một nửa MACS Magnetic Cell Separation Tách tế bào dựa

vào từ tính

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 3: Sơ đồ những thí nghiệm chính của nghiên cứu sàng lọc cao chiết có khả năng kháng phân bào trên tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 6 Hình 8 : Giá trị IC50 của doxorubicin là khác nhau giữa các lần cấy chuyền

Hình 9: Giá trị SEI của doxorubicin trên DF và ADSC ở các lần cấy chuyền khác nhau của chúng khi so sánh với tế bào HepG2 và MCF-7 9 Hình 13 Sự khác biệt của tế bào HepG2 trước và sau khi tách bằng kỹ thuật

Hình 16 Hình thái tế bào trước và sau khi xử lý DOX 10 Hình 17 Hình thái khối cầu sau khi cấy vào đĩa Hanging drop 10 Hình 18 Tỷ lệ phần trăm quần thể HepG2 biểu hiện marker CD133 sau khi phân tách bằng ba phương pháp 10 Hình 19 Biểu đồ thể hiện phần trăm tế bào HepG2 biểu hiện marker CD133 Enrich: lô xử lí thuốc doxorubicin 150 nM 11 Hình 23 Giá trị IC50 của doxorubicin trên dòng tế bào tham chiếu HepG2 sau 3 lần lặp lại thí nghiệm 12 Hình 24 Giá trị IC50 của doxorubicin trên dòng tế bào gốc ung thư CD133+ HepG2 sau 3 lần lặp lại thí nghiệm 12 Hình 29 Đường cong tăng trưởng của khối cầu tế bào HepG2 13 Hình 33: Nồng độ ức chế một nửa của tirapazamine lên tế bào ung thư HepG2

Hình 45 Biểu đồ giá trị trung bình IC50 của P trimera và doxorubicin trên

Hình 49 Biểu đồ ức chế đường cong tăng trưởng của cao chiết cây Ngãi Bún trên 2 dòng tế bào ADSC và HepG2 18

Hình 56 Kiểu hình của tế bào khối cầu spheroid HepG2 sau 2 ngày xử lý bằng các hợp chất tách chiết từ cây Ngãi Bún B pandurata 20 Hình 58 Các tế bào trải qua quá trình apoptosis khi được điều trị bằng isopanduratin A ở nồng độ mức 500 nM 21

DANH MỤC BẢNG

Bảng 6 Tổng hợp IC50 của cao chiết thực vật trên các dòng tế bào trên 2 dòng tế bào HepG2 và CD133+HepG2 14

MỞ ĐẦU

Hiện nay hầu hết các hoạt động sàng lọc hoạt tính sinh học chủ yếu thực hiện trên mô hình nuôi cấy tế bào ung thư ở dạng 2D Mô hình sàng lọc này đã được nhiều nghiên cứu cho rằng không cung cấp đầy đủ thông tin cần thiết để chọn

lọc những cao chiết trong giai đoạn chuyển tiếp thử nghiệm từ in vitro sang in vivo

trong quá trình nghiên cứu khám phá thuốc Điều này dẫn đến tỉ lệ thất bại cao khi đánh giá các hợp chất tiềm năng ở các giai đoạn thử nghiệm ứng cử viên thuốc ở trên động vật Để tiết kiệm thời gian và kinh phí, cần phát triển những mô hình sàng lọc mới có thể cung cấp đầy đủ thông tin hơn để giúp đưa ra những lựa chọn

cao chiết chuẩn xác hơn ở giai đoạn nghiên cứu in vitro

Mục tiêu của nghiên cứu này là thiết lập quy trình kĩ thuật nuôi cấy 2D và 3D trên tế bào ung thư và tế bào gốc ung thư HepG2 với thông lượng trung bình bằng hệ thống máy chia dịch tự động

Tiếp theo, nghiên cứu áp dụng sàng lọc hoạt tính kháng phân bào của 35 cao chiết thực vật lên tế bào HepG2 và tế bào gốc ung thư HepG2 trên các mô hình

đã thiết lập

Cuối cùng, nghiên cứu tìm kiếm cao chiết có khả năng gây độc HepG2 tiềm năng để tách hợp chất, dựa trên những khác biệt trong tác động kháng phân bào của cao chiết thô lên trên tế bào ung thư HepG2 và tế bào gốc ung thư HepG2 khi nuôi cấy ở điều kiện 2D và 3D

Để thực hiện được mục tiêu trên, trong nội dung đầu nghiên cứu đã hợp tác với khoa Hóa, trường Đại học Tự nhiên ĐHQG Tp HCM để tạo cao chiết thô

từ các loại thực vật thu thập từ các khu rừng ở khu vực miền Nam Việt Nam Kết quả của nội dung này đã tạo được 35 cao chiết

Trong nội dung tiếp theo, nghiên cứu tiến hành khảo sát 2 loại tế bào gốc

mô mỡ và tế bào da người thường để chọn ra loại tế bào dùng làm tế bào đối chứng trong các thí nghiệm sàng lọc tiếp theo Nghiên cứu cũng đã tiến hành khảo sát và

so sánh nồng độ của các loại dung môi để tìm ra dung môi thích hợp cho thí nghiệm sàng lọc

Trong nội dung tiếp theo, nghiên cứu tiến hành xây dựng mô hình và quy trình sàng lọc trên đối tượng tế bào ung thư gan Quần thể tế bào gốc ung thư gan được phân lập từ quần thể tế bào ung thư gan HepG2 Cả 2 quần thể tế bào ung thư gan và tế bào gốc ung thư gan được sử dụng để thiết lập quy trình sàng lọc dạng nuôi cấy lớp đơn (mononuclear cell-thường gọi là nuôi cấy 2 chiều hay 2D) và dạng nuôi cấy khối cầu (sphere culture hay 3D) Trong bước đầu tiên, quần thể tế bào ung thư gan HepG2 được sử dụng để phân lập tế bào gốc ung thư gan dựa vào

sự biểu hiện của protein CD133 trên bề mặt tế bào Bước tiếp theo, cả hai dòng tế bào ung thư gan HepG2 và CD133+ HepG2 được sử dụng để nuôi cấy dạng 2D và 3D để xây dựng mô hình sàng lọc Về việc xây dựng quy trình sàng lọc dạng 2D, nhóm nghiên cứu đã khảo sát mật độ tế bào ban đầu nuôi cấy, xây dựng đường cong tăng trưởng của tế bào để xác định giá trị IC50 Trong quá trình xây dựng mô hình sàng lọc dạng 3D, nghiên cứu đã tạo các khối cầu sử dụng kĩ thuật giọt treo (hanging drop) sử dụng hệ thống robot trên đĩa 96 well hanging drop Sử dụng hệ thống robot với kĩ thuật giọt treo, quy trình này đạt thông lượng trung bình hay cao (medium/high throughput) Nghiên cứu đã khảo sát mật độ tế bào thích hợp để tạo khối cầu Đường cong tăng trưởng của khối cầu cũng được khảo sát Để khẳng định khối tế bào thu được là khối cầu tế bào ung thư (chứ không phải là cụm tế bào), nghiên cứu đã đánh giá cấu trúc của khối cầu, đánh giá sự biểu hiện các protein liên kết giữa các tế bào trong khối cầu Cuối cùng, nghiên cứu đã sử dụng 4 quy trình nuôi cấy đã thiết lập: (1) tế bào ung thư gan nuôi dạng 2D, (2) tế bào ung thư gan nuôi dạng 3D, (3) tế bào gốc ung thư gan nuôi dạng 2D, (4) tế bào gốc ung thư gan nuôi dạng 3D để sàng lọc các cao chiết có trong thư viện Từ kết quả sàng lọc trên 4 mô hình này, nghiên cứu đã chọn ra những cao chiết có IC50 thấp nhất trên

tế bào ung thư và tác dụng phụ thấp nhất trên tế bào thường để phân lập hợp chất tinh khiết Một số chất từ các cao chiết tiềm năng được tiếp tục xác định cơ chế gây độc cho tế bào ung thư

1.2 Cách tiếp cận mới trong sàng lọc phát triển thuốc

1.2.1 Mô hình tế bào gốc ung thư (CSCs) trong sàng lọc thuốc

Có bằng chứng thực nghiệm cho thấy rằng CSCs kháng lại thuốc chống ung thư trong trị liệu [10-12] Điều này cho thấy các quy trình sàng lọc nên được sửa đổi theo hướng chọn thuốc hoặc kết hợp thuốc có thể nhắm mục tiêu CSCs Hiện

tại, sàng lọc trên các hệ thống in vitro, với mô hình dòng tế bào NCI 60 được biết

đến rộng rãi nhất Tác dụng gây độc tế bào được đánh giá bằng các thí nghiệm đánh

giá sống chết của tế bào, thường sử dụng xét nghiệm MTT (khử MTT thành formazan), các phép đo dựa trên lượng ATP nội bào

Một số phương pháp thí nghiệm sàng lọc khác đã được đề xuất để sàng lọc chất chống ung thư đặc hiệu CSC Một trong số đó, các thí nghiệm gây độc tế bào sử dụng các quần thể CSC được tách dựa trên biểu hiện của các dấu ấn bề mặt tế bào bằng kỹ thuật FCM Sau đó, tác dụng gây độc tế bào đối với CSC được so sánh với tác dụng gây độc trên tế bào không phải CSC Một biến thể đơn giản hơn của phương pháp này là tách các tế bào trong quần thể phụ (SP) từ quần thể tế bào khối

u Phương pháp này cũng có thể là áp dụng để đánh giá sự hiệu quả của thuốc chống ung thư trên mô hình động vật

Một cách khác để làm giàu quần thể tế bào CSC là tạo ra tế bào dạng khối cầu (sphere) ở điều kiện thiếu bám dính của tế bào khối u với chất nền Việc này

có thể thực hiện theo nhiều cách khác nhau, mà điển hình là sử dụng phương pháp nuôi cấy trên bề mặt bám dính kém Phức tạp hơn là phương pháp sử dụng từ trường trọng lực, trong đó các tế bào khối u được nuôi cấy trong hydrogel trên các hạt nano oxit sắt từ tính, với hệ thống từ trường được kiểm soát từ [13] Trong các nghiên cứu trước, nuôi cấy tế bào glioblastoma bằng phương pháp từ trường trọng lực cho thấy cấu hình biểu hiện protein tương tự như những protein quan sát thấy ở khối u

dị ghép [13] Các mô hình sphere đã được sử dụng để xác định hoạt tính gây độc tế bào của thuốc chống ung thư trên các loại tế bào khối u khác nhau, bao gồm tế bào ung thư biểu mô tuyến vú (mammosphere), tế bào thần kinh (neurosphere) và phổi carcinomas [14] [15] [16, 17]

1.2.2 Nuôi cấy tế bào 3D và những ưu điểm so với nuôi cấy 2D

Có 5 lý do để nhà nghiên cứu ung thư chọn nuôi cấy tế bào dạng 3D [18]: + Khi nuôi cấy tế bào dạng 2D, tế bào phát triển giống nhau và không có sự khác biệt về oxy, dinh dưỡng, tác nhân sinh trưởng Tế bào được nuôi cấy dạng 3D sẽ tạo ra các vùng phát triển khác nhau về oxi, dinh dưỡng, tác nhân sinh trưởng trong khối u

+ Các tế bào nuôi cấy dạng 3D được chứng minh gia tăng sự kháng lại thuốc hơn so với nuôi cấy dạng 2D Tế bào bên trong sẽ được bảo vệ bởi tế bào ngoài, giúp hạn chế sự xâm nhập của thuốc vào bên trong

+ Mô hình nuôi cấy tế bào dạng 3D hình thành những vùng tế bào khác biệt

nhau về tốc độ biến dưỡng, tăng sinh…tương tự như trong khối u in vivo

+ Tế bào nuôi cấy dạng 3D có sự tương tác khác nhau với chất nền ngoại bào

và tế bào xung quanh, dẫn đến sự khác biệt về biểu hiện gen khi so sánh với nuôi cấy tế bào dạng 2D

+ Tế bào ung thư nuôi cấy dạng 3D mô phỏng vi môi trường tương tự khối

u, điều mà mô hình nuôi cấy tế bào dạng 2D không mô phỏng được

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP

2.1 Tế bào

Các dòng tế bào HepG2, MDA-MB-231 và MCF-7 được mua từ ATCC ( Manassas, VA), VNBRCA1 được thiết lập từ mô ung thư vú của các bệnh nhân tại Việt Nam bởi Phòng thí nghiệm nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp HCM [19], ADSC được phân lập từ da bao quy đầu

2.2 Hoá chất

2.2.1 Dung môi

Methanol; ethanol, DMSO được mua từ Merck (Darmstadt, Đức)

2.2.2 Các hóa chất chính

Hóa chất nhuộm Alamar Blue (Sigma-Aldrich,Mỹ; hóa chất nhận biết tế ung thư

bị apoptosis trong kĩ thuật flow-cytometry ANNEXIN V/ PE (BD Biosciences, Mỹ); Hóa chất dùng trong kỹ thuật quan sát phân mảnh nhân Thuốc nhuộm Hoechst

2.2 Phương pháp

2.2.4 Sơ đồ thí nghiệm và bố trí thí nghiệm

Hình 3 Sơ đồ những thí nghiệm chính của nghiên cứu sàng lọc cao chiết có

khả năng kháng phân bào trên tế bào ung thư biểu mô gan HepG2

2.2.5 Các phương pháp chính

 Phương pháp nuôi cấy tế bào dạng 2D và dạng 3D

Nuôi cấy tế bào dạng 2D (hay còn được gọi nuôi cấy 2D)

Tế bào được nuôi cấy trong Dulbecco’s Modified Eagle Eagle Medium (DMEM), được bổ sung 10% huyết thanh thai bò bất hoạt nhiệt (FBS) và streptomycin 1% penicillin, và nuôi cấy trong tủ ấm độ ẩm với 5% CO2 ở

37 ° C

Nuôi cấy tế bào trong điều kiện 3D (hay còn được gọi nuôi cấy 3D)

Phương pháp này sử dụng đĩa nuôi giọt treo Perfecta3D Hanging Drop Plates

96 giếng của hãng 3D Biomatrix, Mỹ

Tế bào nuôi lớp đơn bám trải khoảng 70-80% bề mặt nuôi cấy, rửa 2 lần bằng PBS Sau khi loại sạch PBS, tách hoàn toàn tế bào thành tế bào đơn bằng Trypsin/EDTA 0,05% Chuyển dịch huyền phù vào falcon 15ml

Ly tâm loại bỏ dịch nổi, hòa cặn trong môi trường DMEM/F12 10% FBS, 1% kháng sinh

Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu

Các thao tác cấy tế bào vào đĩa 96 giếng, xử lý thuốc, nạp thuốc nhuộm được thao tác bằng hệ thống robot Liquid Handling (Beckman Coulter, Đức)

 Phương pháp phân lập tế bào gốc ung thư gan

 Kỹ thuật tách tế bào bằng MACS

 Phương pháp đáng giá sự tăng sinh tế bào dạng 2D:

- Kỹ thuật đánh giá mức nhân đôi quần thể (population double level)

- Kỹ thuật xCELLigence RTCA SP

 Phương pháp đánh giá sự tăng sinh tế bào dạng 3D

- Khảo sát đường cong tăng trưởng bằng phương pháp đo kích thước khối cầu tế bào spheroid

- Kỹ thuật nhuộm AlamarBlue

 Phương pháp đánh giá cấu trúc spheroid

 Tách chiết RNA tổng số

 Realtime PCR

 Cắt lát mô khối spheroid tế bào HepG2

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình sàng lọc cao chiết kháng phân bào

in vitro

3.1.1 Thiết lập mô hình tế bào đối chứng trong sàng lọc

So sánh sự ổn định của tế bào gốc mô mỡ và tế bào da người trong việc sử dụng làm tế bào đối chứng trong xét nghiệm sàng lọc

Giá trị IC 50 của doxorubicin trên ADSC, DF, MCF-7 và HepG2

Hình 8 : Giá trị IC 50 của doxorubicin là khác nhau giữa các lần cấy chuyền của DF và ADSC Các giá trị IC50 của DF đã giảm đáng kể khi các lần cấy chuyền

DF tăng lên, trong khi các giá trị đó thay đổi một chút khi lần cấy chuyền ADSC tăng từ lần cấy chuyền 3 đến lần cấy chuyền 6 và từ lần cấy chuyền 6 đến lần cấy chuyền 9 hoặc 12 (A) Giá trị IC50 của doxorubicin khác biệt không có ý nghĩa giữa

DF và ADSC ở lần cấy chuyền thứ 3; tuy nhiên, những giá trị này có sự khác biệt đáng kể giữa DF và ADSC ở lần cấy chuyền thứ 6, 9 và 12 (B)

Giá trị SEI của doxorubicin trên ADSC, DF, MCF-7 và HepG2

Hình 9: Giá trị SEI của doxorubicin trên DF và ADSC ở các lần cấy chuyền khác nhau của chúng khi so sánh với tế bào HepG2 và MCF-7

Giá trị SEI tăng lên đáng kể khi các lần cấy chuyền DF tăng từ lần cấy chuyền 3 lên lần cấy chuyền 6, 9 và 12 - trong mô hình HepG2; tuy nhiên, các giá trị SEI đã thay đổi đối với ADSC từ lần cấy chuyền thứ 3 đến thứ 12 (B) Tương tự, giá trị SEI cũng tăng mạnh khi sử dụng DF làm tế bào đối chứng, trong khi giá trị SEI không thay đổi đáng kể khi ADSC được sử dụng làm tế bào đối chứng trong mô

hình MCF-7

3.1.2 Thiết lập dòng tế bào gốc ung thư sử dụng trong sàng lọc

Hình 13 Sự khác biệt của tế bào HepG2 trước và sau khi tách bằng kỹ thuật MACS (A) Tế bào HepG2 trước khi tách MACS (B) Tế bào CD133+HepG2 được tách từ phương pháp MACS Độ phóng đại 10X cho cả 2 hình A và B

3.1.2.1 Phân lập quần thể tế bào gốc ung thư gan dựa vào đặc tính

kháng thuốc chống ung thư doxorubicin (DOX)

Có sự khác nhau về hình thái và kích thước giữa quần thể HepG2 trước và sau khi

xử lý thuốc khi sử dụng phương pháp làm giàu quần thể kháng thuốc điều trị doxorubicin 150 nM ở tế bào ung thư gan HepG2 Các tế bào sau khi điều trị với DOX 150 nM có kích thước to hơn, dẹt hơn và có nhiều nhánh so với tế bào trước khi xử lý