Nghiên cứu xác định các snp có liên quan nguy cơ ung thư vú ở người việt nam

Vì vậy, nghiên cứu về mối tương quan giữa yếu tố di truyền với UTV đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, nhằm tìm kiếm các chỉ thị di truyền đặc trưng, góp phần hỗ trợ cho việc ph

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ NGỌC THANH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC SNP CÓ LIÊN QUAN NGUY CƠ UNG THƯ VÚ Ở

NGƯỜI VIỆT NAM

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Huệ

Phản biện 1: PGS.TS Ngô Thị Hoa

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM

2 Thư viện trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

MỤC LỤC

MỤC LỤC 3

DANH MỤC CÁC BẢNG 4

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 4

CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Dịch tễ học ung thư vú 4

2.2 Chỉ thị di truyền đa hình đơn nucleotide trong ung thư vú 5

2.3 Nghiên cứu xác định SNP liên quan nguy cơ ung thư vú 6

CHƯƠNG 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 9

3.1 Thiết kế thí nghiệm 9

3.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 10

CHƯƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 12

4.1 Xây dựng các phương pháp xác định kiểu gen 12

4.2 SNP trên các gen tham gia sửa sai DNA 14

4.3 SNP trên các gen tham gia miễn dịch tế bào 16

4.4 SNP trên các gen tham gia kiểm soát chu kỳ tế bào và tăng sinh tế bào 18

4.5 SNP trên các gen của RNA không mã hóa 20

4.6 SNP Haplotype và nguy cơ ung thư vú 21

CHƯƠNG 5 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23

5.1 Kết luận 23

5.2 Kiến nghị 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

Hình 3 1 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm 9

Hình 4 1 1 Các đường cong nóng chảy HRM đại diện cho 3 kiểu gen của rs3212986 12 Hình 4 1 2 Xác định kiểu gen của rs1053872 trên một số mẫu ngẫu nhiên với điều kiện TAPMA đã tối ưu 13 Hình 4 1 3 Kiểu gen của rs4919510 khảo sát trên một số mẫu bằng Tetra-Arms-PCR 13 Hình 4 1 4 Trình tự ba kiểu gen của rs3212986 từ ba mẫu DNA 13

CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU

Ung thư vú (UTV) là căn bệnh phổ biến và là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ trên toàn thế giới Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2018, Việt Nam có khoảng 15.229 trường hợp mắc bệnh mới được chẩn đoán và 6.103 trường hợp tử vong, tăng hơn 4.000

ca mắc bệnh mới và hơn 1.000 ca tử vong so với năm 2012 [36, 37] Theo các nghiên cứu dịch tễ học, nếu bệnh nhân được phát hiện mắc UTV ở giai đoạn từ 0 đến 1, tỷ lệ điều trị bệnh thành công có thể lên đến trên 90%, trong

đó ở Mỹ, tỷ lệ này chiếm 99% [97] và Việt Nam là 95% [111] Như vậy, việc xác định nguy cơ mắc UTV trước giai đoạn 0, tức là trước khi có dấu hiệu lâm sàng, có thể làm tăng tỷ lệ khỏi bệnh đến hơn 99%, tiệm cận với 100% Tuy nhiên, không giống với các nước phương Tây nơi phụ nữ được tầm soát ung thư rất sớm (62% bệnh nhân ở Mỹ được chẩn đoán ở giai đoạn 0 và 1 [2]), đa số phụ nữ mắc UTV ở nước ta được phát hiện ở các giai đoạn muộn (hơn 61% số ca được chẩn đoán ở giai đoạn II [58, 79]) dẫn đến giảm tỷ lệ sống sót của bệnh nhân (59,9% năm 2018) Tình trạng phần lớn các ca UTV

ở Việt Nam được phát hiện ở các giai đoạn trễ một phần là do thiếu các phương pháp tầm soát sớm UTV [117] Do đó, việc phát triển các phương pháp phát hiện sớm nguy cơ UTV có thể hỗ trợ tăng tỉ lệ sống sót của bệnh nhân đang là mục tiêu nghiên cứu chung của cả Việt Nam và thế giới [113] Trong số các yếu tố nguy cơ tác động đến sự hình thành và phát triển ung thư, yếu tố di truyền được đánh giá là yếu tố tiềm năng trong việc hỗ trợ

dự đoán sớm nguy cơ mắc bệnh [11, 100] Vì vậy, nghiên cứu về mối tương quan giữa yếu tố di truyền với UTV đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, nhằm tìm kiếm các chỉ thị di truyền đặc trưng, góp phần hỗ trợ cho việc phát hiện sớm nguy cơ gây bệnh, từ đó đưa ra phương pháp kiểm soát và điều trị thích hợp Một số đột biến điểm trên các gen nhạy cảm cao

và trung bình với nguy cơ UTV như BRCA1, BRCA2, p53, PTEN, ATM, và CHEK2 đã được phát hiện liên quan mạnh mẽ với nguy cơ mắc bệnh [93,

106, 127] Tuy nhiên, phần lớn các ca mắc UTV lại không xuất hiện các đột biến này [19, 98] Do đó, các nghiên cứu mối liên quan được tiếp tục thực hiện trên các đột biến điểm có tần số xuất hiện cao trong quần thể (được gọi

là đa hình đơn nucleotide (SNP)) nhằm tăng khả năng tìm được các chỉ thị

di truyền sử dụng trong dự đoán sớm nguy cơ mắc bệnh cho đa số các trường hợp

Các SNP này thường nằm trên những gen tham gia điều hòa biểu hiện

và chức năng của các gen khác [61, 94] Sự hiện diện của các SNP này có thể ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của gen chủ, dẫn đến rối loạn điều hòa biểu hiện và chức năng của gen hạ nguồn, tạo điều kiện cho các tế bào tăng sinh bất thường và dẫn đến hình thành khối u [81, 94] Mặc dù mỗi SNP đều có giá trị khi phân tích độc lập, nhưng việc phân tích sự tương tác của các SNP sẽ cung cấp nhiều thông tin hơn cho nghiên cứu mối liên quan Sự kết hợp hoặc tương tác giữa các alen của các SNP tạo thành một chỉ thị di truyền đặc trưng cho bệnh được gọi là Haplotype [141] Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã xác định được một số SNP và SNP Haplotype đặc trưng cho nguy cơ UTV, hứa hẹn trở thành các chỉ thị sinh học đáng tin cậy trong dự đoán nguy cơ mắc bệnh ở phụ nữ từ rất sớm [3, 4, 41, 47, 56, 86, 110, 116, 118]

Mối liên quan giữa SNP và nguy cơ UTV đã được chứng minh là khác nhau giữa các quần thể khác nhau, đồng nghĩa với việc SNP có thể đặc trưng cho từng quần thể Các nghiên cứu mối liên quan giữa SNP và nguy cơ UTV cũng đã cho thấy có các ý kiến trái chiều trên các nhóm mẫu của các quốc gia khác nhau Một số SNP đã được chứng minh là có liên quan đến nguy

cơ UTV và có thể được sử dụng như là một chỉ thị đặc trưng cho nguy cơ mắc bệnh ở phụ nữ châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, Nhật Bản, Trung Quốc, và Hàn Quốc Tuy nhiên, chỉ thị SNP đặc trưng cho phụ nữ Việt Nam chưa được xác định do chưa có nghiên cứu nào được thực hiện ở Việt Nam Do đó, một nghiên cứu ban đầu nhằm tìm ra các SNP liên quan nguy cơ UTV ở người Việt Nam là thật sự cần thiết

Mục tiêu nghiên cứu:

Mục tiêu chung của nghiên cứu

Xác định mối liên quan của SNP với nguy cơ UTV nhằm cung cấp thông tin về chỉ thị tiềm năng trong hỗ trợ dự đoán sớm nguy cơ mắc bệnh ở phụ nữ Việt Nam

Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp xác định kiểu gen của từng SNP

- Xác định mối liên quan của các SNP ứng viên với nguy cơ UTV ở người Việt Nam

- Xác định mối liên quan của các SNP Haplotype với nguy cơ UTV ở người Việt Nam

CHƯƠNG 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

sẽ tăng lên hơn 2,6 triệu ca năm 2030 và 3 triệu ca vào năm 2040 Bên cạnh

đó, số ca tử vong cũng chưa có dấu hiệu suy giảm với hơn 626 ngàn phụ nữ

tử vong năm 2018 (chiếm 15% tổng số ca chết vì UT ở nữ giới), tăng hơn 100.000 ca so với năm 2012 Nếu không có biện pháp khắc phục, tính đến năm 2040, con số này có thể tăng lên đến gần 1 triệu ca Ở Việt Nam, tình trạng này cũng chưa có chiều hướng cải thiện Số phụ nữ mắc bệnh và tử vong vì UTV năm 2018 lần lượt là 15.229 ca và 6.103 ca, tăng hơn 4 ngàn

ca mắc bệnh và 1 ngàn ca tử vong so với năm 2012 [36, 37] Dự đoán trong hơn 20 năm tiếp theo, số phụ nữ mắc bệnh ở nước ta có thể tiếp tục tăng lên đến hơn 22 ngàn ca

Theo thống kê của Nguyễn Thị Mai Lan, giai đoạn 2014-2016 [1], tỉ

lệ bệnh nhân được chẩn đoán vào các giai đoạn đầu (giai đoạn 0 và 1) ở Việt Nam chiếm tỉ lệ thấp, khoảng 18,4% Trong khi đó, phần lớn (khoảng 81,6%) các trường hợp phát hiện bệnh thường rơi vào các giai đoạn muộn hơn Việc phát hiện bệnh ở các giai đoạn muộn có thể góp phần làm cho việc điều trị ở Việt Nam gặp nhiều khó khăn hơn Thật vậy, theo WHO, việc chẩn đoán sớm UTV ở các giai đoạn 0 hoặc I có thể làm tăng khả năng sống sót của bệnh nhân lên đến 99%, trong khi tỷ lệ này chỉ khoảng 22% nếu bệnh được phát hiện ở các giai đoạn muộn hơn [50, 104] Vì vậy, việc xác định sớm và chính xác các chỉ thị của yếu tố nguy cơ tham gia vào sự hình thành và phát triển UTV sẽ góp phần vào việc hạn chế tỉ lệ tử vong do căn bệnh này

Tầm soát và phát hiện sớm luôn là một trong những ưu tiên hàng đầu trong chương trình phòng chống ung thư ở các nước, đặc biệt là các nước phát triển Điều này đang bắt đầu được áp dụng ở Việt Nam Tầm soát là đánh giá mỗi cá thể hay cộng đồng khoẻ mạnh về mặt lâm sàng, nhằm phát hiện ung thư tiềm ẩn hay thương tổn tiền ung thư để điều trị khỏi Mục tiêu chính của phát hiện sớm UTV là giảm tỷ lệ tử vong do phát hiện trễ Các phương pháp đang được áp dụng trong chương trình tầm soát UTV ở Việt Nam gồm tự khám vú, khám lâm sàng tuyến vú, chụp nhũ ảnh, kiểm tra kháng nguyên ung thư (CEA và CA 15-3)

Tuy nhiên các phương pháp tầm soát trên chỉ phát hiện được UTV ở các giai đoạn 0 và 1, không phù hợp để phát hiện nguy cơ UTV ở giai đoạn sớm hơn khi chưa có dấu hiệu lâm sàng (trước giai đoạn 0) Do đó, các nghiên cứu hiện nay đang có xu hướng tập trung vào phát triển các phương pháp dự đoán nguy cơ UTV sớm, trước khi có dấu hiệu lâm sàng Trong các yếu tố nguy cơ gây ra UTV, bao gồm , yếu tố di truyền phù hợp để sử dụng làm chỉ thị dự đoán sớm nguy cơ UTV ở các giai đoạn trước 0 [124]

2.2 Chỉ thị di truyền đa hình đơn nucleotide trong ung thư vú

Chỉ thị di truyền là các trình tự DNA đã biết vị trí trên nhiễm sắc thể,

có thể được di truyền kèm với tính trạng đang khảo sát cho thế hệ con Đây

là những biến đổi gen có thể được sử dụng để phân biệt, so sánh, đánh giá các cá thể cùng loài, quần thể hay nhóm quần thể dựa trên sự khác biệt về trình tự gen của mỗi cá thể Dựa vào tần số xuất hiện trong quần thể, các biến đổi trên gen xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể được gọi là đột biến, ngược lại, lớn hơn 1% được gọi là đa hình Trong đó, các đa hình tại duy nhất 1 vị trí base (đa hình đơn nucleotide - SNP) xuất hiện phổ biến nhất trong bộ gen người, với trung bình một SNP trong mỗi 1000 base Hiện nay, hơn 100 triệu SNP trên bộ gen người đã được công bố trong các nghiên cứu trên toàn thế giới, nhiều hơn bất cứ chỉ thị di truyền nào đã được công bố trước đó [72]

Số lượng lớn SNP đã được công bố này mở ra nhiều cơ hội cho các nhà

nghiên cứu tìm được chỉ thị SNP tiềm năng cho nguy cơ UTV Đây cũng là loại chị thị di truyền đang được nghiên cứu phổ biến nhất hiện nay

Mặc dù tác động riêng lẽ của từng SNP đến nguy cơ UTV thấp, sự tương tác giữa các SNP này với nhau và với các đột biến khác có thể ảnh hưởng đáng kể đến nguy cơ mắc UTV [87] Các SNP xuất hiện trên những gen nhạy cảm thấp với nguy cơ UTV có tần số xuất hiện trong quần thể cao,

và do đó có nhiều tiềm năng trở thành các chỉ thị di truyền cho quần thể nhằm

dự đoán sớm nguy cơ UTV [38] Một số gen nhạy cảm thấp với UTV đã

được biết đến như TOX3, E2F2, BARX2, ESR1, HIF-1A, MAP3K1, ERBB4, KRAS, PVT1, BCL2, LSP1, TP53, FGFR2, SMAD5, và TAB2 [43] Các gen

mã hóa và điều hòa biểu hiện của các RNA không mã hóa cũng thuộc nhóm gen nhạy cảm thấp với nguy cơ UTV

2.3 Nghiên cứu xác định SNP liên quan nguy cơ ung thư vú

SNP được xác định là yếu tố tiềm năng trong dự đoán sớm nguy cơ UTV trong quần thể Tuy nhiên, SNP lại luôn mang tính đặc trưng cho từng dân tộc Nghĩa là, có một số SNP được xác định là có liên quan với nguy cơ UTV ở một số dân tộc này nhưng lại không có mối liên quan ở các dân tộc khác Qua đó, có thể thấy mối tương quan giữa SNP với UTV là khác nhau

ở từng quần thể nghiên cứu Tuy nhiên từ một số nghiên cứu vẫn có thể nhận thấy, mối tương quan của SNP với UTV là giống nhau giữa các quần thể có cùng/gần nguồn gốc di truyền và sự khác nhau giữa các quần thể có nguồn gốc di truyền xa Chẳng hạn như ở cấp độ giữa các châu lục, SNP rs10941679 cho thấy có mối liên quan với nguy cơ UTV ở người Châu Âu và Châu Úc nhưng lại không liên quan với nguy cơ UTV ở người Châu Á và Mỹ gốc phi [10, 35, 96, 112, 142] Một ví dụ khác, SNP rs3803662 được tìm thấy không liên quan đến nguy cơ UTV ở người Mỹ gốc Phi nhưng lại liên quan đến hầu hết các nước ở Châu Âu và Châu Á [26, 71, 95, 112, 123, 131, 142] Khi nghiên cứu về mối tương quan với UTV giữa các quốc gia trong cùng châu lục, SNP rs7107217 được xác định là có nguy cơ làm tăng khả năng mắc

bệnh ở dân tộc Trung Quốc và Hàn Quốc nhưng lại không làm tăng nguy cơ mắc UTV ở dân tộc Nhật Bản [67] Cùng tình trạng như vậy, mặc dù SNP rs1219648 đã được tìm thấy có liên quan đến nguy cơ UTV ở một số dân tộc Châu Á như Ấn Độ và Trung Quốc nhưng ở Việt Nam và Nhật Bản thì không [53, 63, 102, 112, 125, 139] Thậm chí các nghiên cứu trong cùng một dân tộc cũng có sự không thống nhất, ví dụ ở Trung Quốc, đã có hai nghiên cứu khác nhau cho thấy SNP rs889312 có thể liên quan hoặc không liên quan đến nguy cơ UTV [26, 57, 112, 142] Điều này cho thấy, SNP có thể là chỉ thị di truyền cho từng vùng nhỏ trong cùng một dân tộc

Một nghiên cứu sơ khởi trong đề tài của Nghiên cứu sinh được thực hiện ở Việt Nam cho thấy những mối liên hệ đầu tiên nữa các SNP trên gen với nguy cơ UTV Có thể do cùng nguồn gốc di truyền với người Trung Quốc [88], một số điểm tương đồng giữa kết quả trên người VN và người TQ đã được tìm thấy Ví dụ các SNP rs13281615 và rs10941679 đều được tìm thấy

là không liên quan đến nguy cơ UTV ở cả hai quần thể Việt Nam và Trung Quốc [10, 112, 142]; trong khi đó SNP rs3803662 lại cho thấy điều ngược lại [112, 123, 131, 142] Mặc dù vậy, vẫn có SNP có mối liên quan với UTV khác nhau ở hai dân tộc SNP rs1219648 và rs9485372 đã được tìm thấy không có mối liên quan ở người Việt Nam nhưng lại liên quan ở người Trung Quốc [32, 48, 63, 112, 125, 139] Điều này cho thấy, mỗi dân tộc đều có thể

có các chỉ thị di truyền đặc trưng riêng dù cho có gần nguồn gốc di truyền với dân tộc khác Tất cả những minh chứng cho thấy chỉ thị di truyền cho nguy cơ mắc UTV, cụ thể ở đây là SNP, đặc trưng cho từng Châu lục, và từng dân tộc, đặc biệt là dân tộc Việt Nam là hoàn toàn có thể tìm được Xác định được mối tương quan giữa các SNP này với nguy cơ mắc UTV ở người Việt Nam sẽ được dự đoán sớm và chính xác hơn hiện nay, từ đó góp phần làm tăng hiệu quả điều trị UTV ở Việt Nam

Tương tự SNP trên gen mã hóa protein, các SNP trên gen mã hóa cho miRNA cũng đã được chứng minh có liên quan ở các quần thể khác nhau trên thế giới Các nghiên cứu ban đầu là kết quả thuộc đề tài của Nghiên cứu

sinh ở Việt Nam cũng đã xác định được hai SNP rs11614913 và rs2910164 trên miR-196a2 và miR-146a liên quan nguy cơ UTV, tương đồng với các nghiên cứu trên người Iran [70, 73, 78] Bên cạnh đó, hai SNP rs6505162 và rs353291 cũng đã bước đầu xác định không liên quan nguy cơ UTV ở Việt Nam [49, 73]

Mặc dù mỗi SNP đều có giá trị khi phân tích độc lập, nhưng việc phân tích sự tương tác của các SNP sẽ cung cấp nhiều thông tin hơn cho nghiên cứu mối liên quan Kết quả nghiên cứu thuộc đề tài của Nghiên cứu sinh được thực hiện ở Việt Nam cho thấy trong 3 SNP trên 3 miRNA khác nhau, khi xét từng SNP riêng lẻ, chỉ có 1 SNP (rs11614913) liên quan nguy cơ UTV Tuy nhiên, khi cộng gộp tác động của cả 3 SNP, 2 haplotype được tạo

từ 3 SNP này lại cho thấy mối liên quan với nguy cơ UTV [73]

Haplotype là tên gọi của sự kết hợp/tương tác giữa các alen của các SNP tạo thành một chỉ thị di truyền đặc trưng cho bệnh [141] Đối với các haplotype gồm các chỉ thị liên kết chặc chẽ với nhau, chẳng hạn như các chỉ thị nằm trên cùng một gen, sẽ có các alen xuất hiện diện cùng nhau, hiện tượng này được gọi là liên kết không cân bằng (Linkage Disequilibrium (LD), hoặc alen liên kết Một vấn đề quan trọng trong phân tích haplotype là cần xác định kiểu LD trên các vùng khác nhau và trong các dân tộc khác nhau vì sự tồn tại của LD có thể là chỉ thị đặc trưng cho quần thể và khoanh vùng các SNP liên quan các bệnh phức tạp [141], bao gồm UTV Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã xác định được một số haplotype đặc trưng cho nguy cơ UTV [3, 4, 41, 47, 56, 73, 86, 110, 116, 118], hứa hẹn trở thành các chỉ thị sinh học đáng tin cậy trong dự đoán nguy cơ mắc UTV ở phụ nữ từ rất sớm

Do đó, mục tiêu của đề tài là xác định mối liên quan của SNP với nguy

cơ UTV nhằm cung cấp thông tin về chỉ thị tiềm năng trong hỗ trợ dự đoán

và tiên lượng đặc trưng cho phụ nữ Việt Nam

CHƯƠNG 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

100 bệnh/chứng sau đó phân tích mối liên quan ban đầu Từ kết quả mối liên quan ban đầu này, sử dụng các thông số của người Việt Nam để tiếp tục chọn

ra các SNP thật sự có tiềm năng liên quan với UTV ở người Việt Nam Các SNP này được tiếp tục khảo sát và phân tích mối liên quan với nguy cơ UTV trên 300 bệnh/chứng ở nội dung thứ 2 Trong nội dung này, các SNP được phân tích tác động riêng lẽ và cộng gộp với UTV để cuối cùng xác định các SNP liên quan nguy cơ UTV ở người Việt Nam

Hình 3 1 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm

3.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Để xác định mối liên quan với nguy cơ UTV, nghiên cứu bệnh – chứng được thực hiện với nhóm bệnh gồm 300 bệnh nhân UTV và nhóm chứng gồm 300 người không mắc ung thư, được thu từ bệnh viện Ung Bướu TP.HCM Các mẫu bệnh được thu từ người nữ được chẩn đoán mắc UTV dựa trên các phương pháp thăm khám và các xét nghiệm thường quy của bệnh viện và chưa qua điều trị Các mẫu trong nhóm chứng cũng được thu

từ người nữ đã được kết luận không mắc bất kỳ loại ung thư nào tại thời điểm thu mẫu Mẫu được thu là mẫu máu toàn phần, sau đó được tách chiết DNA

và sử dụng trong nghiên cứu

Đối tượng phân tích mối liên quan với UTV trong nghiên cứu này là

50 SNP nằm trên các gen tham gia sửa sai DNA, miễn dịch tế bào, kiểm soát chu kỳ tế bào và tăng sinh tế bào, và các gen của RNA không mã hóa Các SNP được chọn dựa trên tiêu chí về tần số trong quần thể và mức độ liên quan UTV (Hình 3 2) nhằm đạt độ tin cậy của phân tích từ 80% trở lên ở cỡ mẫu 300 bệnh và 300 chứng

Trong nghiên cứu này, từng SNP được xây dựng phương pháp xác định kiểu gen Các SNP được lựa chọn phương pháp dựa vào loại nucleotide biến đổi và đặc điểm trình tự xung quanh vị trí SNP Trong đó, 47 SNP được xác định bằng phương pháp HRM, 2 SNP được xác định bằng phương pháp TAPMA, và 1 SNP được xác định bằng phương pháp Tetra-Arms-PCR Cuối cùng, nghiên cứu này tập trung phân tích mối liên quan của từng SNP và SNP Haplotype với nguy cơ UTV ở người Việt Nam bằng các kiểm định thống kê đặc trưng cho nghiên cứu mối liên quan

Hình 3 2 Quy trình chọn SNP

CHƯƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1 Xây dựng các phương pháp xác định kiểu gen

Trong 50 SNP mục tiêu, 47 SNP phù hợp xác định kiểu gen bằng phương pháp HRM (rs25487, rs2155209, rs249954, rs12443621, rs12922061, rs3803662, rs4784227, rs8051542, rs2094258, rs751402, rs3212986, rs10801935, rs3738414, rs12508721, rs7072793, rs153109, rs10439478, rs12621038, rs10941679, rs11568820, rs2228570, rs2046210, rs2605039, rs3817198, rs569550, rs704010, rs9485372, rs889312, rs1219648, rs2981582, rs7107217, rs3218035, rs3218038, rs2854744, rs7965399, rs2279744, rs11614913, rs4284505, rs12325489, rs6505162, rs34678647, rs12976445, rs353291, rs2682818, rs895819, rs2048672, rs13281615) Một kết quả đại diện cho phương pháp HRM được trình bày trong Hình 4 1 1

Hình 4 1 1 Các đường cong nóng chảy HRM đại diện cho 3 kiểu gen

của rs3212986 A) Đỉnh nóng chảy; B) Đường cong nóng chảy; C) Differenece Plot

Hai SNP phù hợp với phương pháp TAPMA (rs1053872 và rs2910164) Một kết quả đại diện của phương pháp TAPMA được trình bày trong Hình 4 1 2 Một SNP, rs4919510, sử dụng phương pháp Tetra-Arms-PCR để xác định kiểu gen (Hình 4 1 3)

Hình 4 1 2 Xác định kiểu gen của rs1053872 trên một số mẫu ngẫu

nhiên với điều kiện TAPMA đã tối ưu

Hình 4 1 3 Kiểu gen của rs4919510 khảo sát trên một số mẫu bằng

Tetra-Arms-PCR

*Mẫu chứng kiểu gen; (-) Mẫu chứng âm (NA) Mẫu không xác định

được kiểu gen

Hình 4 1 4 Trình tự ba kiểu gen của rs3212986 từ ba mẫu DNA A) Kiểu gen TT; B) Kiểu gen GT; C) Kiểu gen GG; (*): Vị trí SNP

Mỗi SNP được giải trình tự ba mẫu đại diện cho ba kiểu gen và sử dụng các mẫu này để làm chuẩn trong xây dựng phương pháp Đại diện một

kết quả giải trình tự được trình bày trong Hình 4 1 4 Trình tự mồi và điều

kiện tối ưu (Ta và nồng độ MgCl2) xác định kiểu gen của mỗi SNP được tổng hợp trong Phụ lục 2, Phụ lục 3, và Phụ lục 4 trong Luận án

Các phương pháp xác định kiểu gen được đánh giá qua ba tiêu chí độ

ổn định, độ đặc hiệu và độ nhạy Dựa vào so sánh với những mẫu đã giải trình tự, tất cả các phương pháp xác định kiểu gen của 50 SNP đều ổn định

và đặc hiệu thông qua kiểm định T.test (PT.test > 0,05) và Anova (PAnova < 0,01) (Kết quả chi tiết được tổng hợp trong Phụ lục 5 và Phụ lục 6) Điều này cho thấy kiểu gen được xác định bằng các phương pháp này đều đáng tin cậy Độ nhạy của phương pháp được đánh giá dựa trên số lượng mẫu xác định được kiểu gen của mỗi SNP trên tổng số mẫu khảo sát ở DNA từ 20ng đến 50ng trong một phản ứng Kết quả đánh giá độ nhạy của 50 SNP được tổng hợp trong Phụ lục 7 Trong 50 SNP, 45 SNP có độ nhạy phương pháp trên 90%, 3 SNP có độ nhạy phương pháp trên 80%, 1 SNP có độ nhạy phương pháp 67% (rs2854744), và 1 SNP (rs2279744) có độ nhạy phương pháp 42% Điều này cho thấy 2 SNP rs2854744 và rs2279744 có số lượng mẫu xác định được kiểu gen bị hạn chế

4.2 SNP trên các gen tham gia sửa sai DNA

Các SNP rs2155209, rs249954, rs12443621, rs12922061, rs3803662, rs4784227, rs8051542, rs2094258, rs751402, rs3212986, và rs25487 nằm

trên các gen tham gia vào các cơ chế sửa sai DNA gồm MRE11A, PALB2, TOX3, ERCC5, ERCC1, và XRCC1 Trong 11 SNP tiềm năng trên, nghiên cứu này đã tìm thấy 2 SNP rs2155209 trên MRE11 và rs4784227 trên TOX3

liên quan với nguy cơ UTV ở người Việt Nam (Bảng 4 2 1)

Bảng 4 2 1 Mối liên quan của rs2155209 và rs4784227 với nguy cơ

UTV trên cỡ mẫu 300 bệnh và 300 chứng SNP Mô hình di truyền OR (95% CI) P Độ tin cậy

- 1,54; P = 0,03) ở người Trung Quốc Khi phân tích sâu hơn về các mô hình kiểu gen cho thấy người Trung Quốc mang kiểu gen TC có xu hướng tăng nguy cơ UTV lên 1,87 lần (TC vs TT: OR = 1,87; 95 % CI = 1,23 – 2,86, P

= < 0,001) Ngoài ra, nghiên cứu này cũng tìm thấy mối liên quan của alen

C với tình trạng ER, PR và HER2 của bệnh UTV ở người Trung Quốc (OR

= 1,25; 95 % CI = 1,02–1,54) Sự khác biệt này có thể do sự khác biệt trong đặc trưng di truyền của từng quần thể

Bên cạnh đó, kết quả mối liên quan của rs4784227 với nguy cơ UTV

ở người Việt Nam trong nghiên cứu này là tương đồng với kết quả của những nghiên cứu ở các dân tộc khác Một nghiên cứu QWAS ở phụ nữ Hàn Quốc (T vs C: OR = 1,24, 95% CI = 1,20 – 1,29, P = 1  10-28 [55]) và các

nghiên cứu bệnh – chứng khác ở người Trung Quốc (T vs C: OR = 1,24; 95% CI = 1,06 – 1,45; P = 0,009 [65]; OR = 1,31; 95% CI = 1,10 – 1,57; P

= 0,003 [44]; TC + TT vs CC: OR = 1,28; 95% CI = 1,03 – 1,59; P = 0,025 [144]) cũng đã tìm thấy alen T của rs4784227 liên quan với tăng nguy cơ UTV lên đến 1,31 lần Bên cạnh đó, mối liên quan mạnh mẽ với nguy cơ UTV của kiểu gen CT của SNP này cũng được tìm thấy ở các dân tộc Châu

Âu (TC vs CC: 1,72; 95% CI = 1,28 – 2,31; P = 9,7  10-5) [39] và Iran (TC vs CC: OR = 2,15; 95% CI = 1,35 – 3,41; P = 0,001) [107]

4.3 SNP trên các gen tham gia miễn dịch tế bào

Trong nghiên cứu này, các SNP rs10801935, rs3738414, rs12508721,

rs7072793, và rs153109 nằm trên các gen VTCN1, IL-21, CD25, và IL-27 có

tham gia vào các cơ chế miễn dịch tế bào được khảo sát mối liên quan với nguy cơ UTV ở người Việt Nam Kết quả phân tích chưa cho thấy mối liên quan giữa 5 SNP trên với nguy cơ UTV trên quần thể người Việt Nam (Bảng

4 3 1)

Trong khi đó, ở các nghiên cứu trên quần thể Đài Loan và Trung Quốc,

5 SNP rs10801935, rs3738414, rs12508721, rs7072793, và rs153109 được tìm thấy mối liên quan với nguy cơ UTV Đối với rs10801935, nghiên cứu của Tsai và cộng sự năm 2015 cho thấy SNP này có liên quan tới sự tăng nguy cơ UTV ở phụ nữ Đài Loan (ORC vs A = 1,39; 95% CI = 1,10 – 1,77;

P = 0,006; Độ tin cậy = 78%) [114] SNP rs3738414 cũng Tsai và cộng sự được tìm thấy liên quan với sự giảm nguy cơ UTV ở quần thể Đài Loan (ORA vs G = 0,81; 95% CI = 0,67 – 0,99; P = 0,037) [114] và Trung Quốc (ORA vs G = 0,698; 95% CI = 0,564 - 0,864; P = 0,001) [137] của alen A- rs3738414 Đối với ba SNP rs12508721, rs7072793, và rs153109, mối liên quan với nguy cơ UTV cũng đã được tìm thấy ở người Trung Quốc Cụ thể với rs12508721, so với người mang kiểu gen CC, người mang kiểu gen TT liên quan với tiên lượng UTV tốt hơn (TT vs CC: HR = 0,376; 95% CI = 0,191 - 0,740; P = 0,0046) và có khả năng sống sót sau 5 năm cao hơn (P <

0,0001) [133] Với rs7072793, người mang kiểu gen TT có nguy cơ mắc UTV cao hơn so với người mang kiểu gen CC (TT vs CC: OR = 2,11; 95%

CI = 1,66 – 2,87; P < 0,001) [60] Với rs153109, alen G liên quan với việc giảm nguy cơ UTV ở phụ nữ mãn kinh Trung Quốc (G vs A: OR = 0,75; 95% CI = 0,59 - 0,97; P = 0,03) [138]

Bảng 4 3 1 Tóm tắt mối liên quan của 5 SNP trên các gen tham gia miễn dịch tế bào với nguy cơ UTV trên cỡ mẫu 100 bệnh và 100

A1A1 + A1A2

vs

A2A2

A1A1

vs A1A2 + A2A2

có sự tương đồng về kết quả nghiên cứu ở những quần thể khác nhau có thể

là do các yếu tố ngoại di truyền (epigenetics) Các quần thể khác nhau, có