Nhận danh các nhóm hoạt chất trong cánh hoa hồng vảng dựa theo phân tích sơ bộ hóa thực vật TRƯỜNG ĐẠI HỌC THƯƠNG MẠI

Hoa hồng cũng chịu mưa nhưng lượng mưa trung bình từ 1500mm- 2000mm mới thích hợp, không chịu được úng ngập, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng tốt của cây hồng là từ 18oC-25oC Cây hồ

TỔNG QUAN

Tổng quan về hoa hồng vàng

Tên khoa học : Rosa SP

I.1.1 Đặc điểm, phân bố, sinh thái: a Đặc điểm:

Là cây bụi mọc đứng hay trườn, cao 0,5-1,5m Cành non có gai cong Lá kép lông chim, nhẵn cả hai mặt, hình bầu dục mũi mác; lá dính liền với cuống thành những cánh hẹp có răng tuyến nhỏ Hoa to, có màu vàng, có mùi thơm quyến rũ Đế hoa lõm mang 5-6 lá đài, hoa thường có nhiều cánh hoa do nhị đực biến thành, nhiều nhị và nhiều lá noãn rời Các lá noãn rời này biến đổi thành những quả bế tụ lại trong đế hoa cũng tạo thành một quả giả hình trứng ngược hoặc gần hình cầu.[1,3] b Phân bố, sinh thái :

Hoa hồng vàng xuất hiện muộn hơn so với các hoa hồng màu khác, mãi cho đến khoảng thế kỷ 18 hoa hồng vàng được trồng ở các vùng Trung Đông Trước đó, hoa hồng trong canh tác chủ yếu tồn tại các sắc thái từ màu đỏ nhung, màu hồng và màu trắng Tuy nhiên, đến khi hoa hồng vàng đầu tiên được giới thiệu thì hoa hồng vàng được nhanh chóng lan rộng

Trong khoảng thời gian này, nhiều thí nghiệm mới về lai tạo và kỹ thuật lai đã được đổi mới Những thí nghiệm này đã đóng góp một vai trò quan trọng trong sự tiến hóa của màu vàng hoa hồng

Trong suốt lịch sử, màu vàng đã được gắn liền với mặt trời, là nguồn gốc của ánh sáng và sự ấm áp, ánh nắng mặt trời là không thể thiếu cho sự sống trên Trái Đất Trong nền văn hóa phương Đông màu vàng tượng trương cho niềm vui, sự khôn ngoan và sức mạnh

Một bó hoa hồng vàng mang đến cho ta cảm giác vui vẻ nắng ấm áp và hạnh phúc Trái ngược với những ý nghĩa lãng mạn do hoa hồng khác mang lại, hoa hồng vàng tượng trưng cho tình hữu nghị

Cây hoa hồng vàng là cây có xuất xứ ôn nhiệt đới vùng Bắc bán cầu Ở Việt Nam, cây được trồng khắp đất nước Đa số giống hồng rất chịu nắng, ánh nắng trong ngày càng nhiều giờ càng tốt, mùa nắng hồng ít bị sâu bệnh tấn công, cây sung sức cho hoa nhiều và hoa rất tươi tắn Hoa hồng cũng chịu mưa nhưng lượng mưa trung bình từ 1500mm- 2000mm mới thích hợp, không chịu được úng ngập, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng tốt của cây hồng là từ 18 o C-25 o C

Cây hồng cũng yếu ớt chỉ đứng vững trước gió nhẹ(3m/s), có thể trồng vào vụ xuân hoặc vụ thu với mật độ 40-50 cm/cây.[3]

Màu xanh của lá là do có mặt chất màu clorophyll Chất này đóng vai trò cực kì quan trọng trong quá trình quang hợp_quá trình chủ yếu tạo ra các hợp chất hữu cơ và tạo ra nguồn oxi tự do duy nhất của quả đất Clorophyll không những cho màu xanh mà còn che mờ các chất màu khác Trong các phần xanh của cây, clorophyll có tổ chức đặc biệt, phân tán ở trong nguyên sinh chất, gọi là lục lạp hoặc hạt diệp lục Hàm lượng clorophyll trong cây xanh chiếm khoảng 1% chất khô

Clorophyll có hai dạng: clorophyll α có công thức là C 55 H 72 O 5 N 4 Mg và clorophyll β có công thức: C55H70O6N4Mg có màu nhạt hơn clorophyll α Tỷ lệ clorophyll α và clorophyll β trong thực vật là 3 : 1

Dưới tác dụng của nhiệt độ và acid dịch bào màu xanh bị mất đi, một mặt là do protein bị đông tụ làm vỏ tế bào bị phá hủy, mặt khác là do liên kết giữa clorophyll và protein bị đứt làm cho clorophyll dễ dàng tham gia phản ứng Clorophyll + 2HX feofitin + MgX2 Để tạo ra feofitin có màu xanh oliu

Màu của cánh hoa hồng là sự tổng hợp của sáu sắc tố Một trong số đó thuộc nhóm carotenoid, tạo ra chuỗi màu từ vàng đến cam, ba sắc tố thuộc nhóm flavonol tạo ra màu vàng nhạt và hai nhóm anthocyanin cho màu từ hồng nhạt đến tía Cường độ của màu tùy thuộc sự tập trung các sắc tố khác nhau trong tế bào Ngoài ra, chất khoáng trong đất có thể kết hợp với các sắc tố để làm thay đổi màu Không có sắc tố, hoa hồng màu trắng [3]

Hầu hết các chất khoáng trong Bảng hệ thống tuần hoàn Mendeleep đều có trong cánh hoa hồng trong đó các chất khoáng có tác dụng trong y học như kali, canxi, iod Cánh hoa hồng có chứa vitamine C, carotenoid, các loại vitamine nhóm B và vitamine K

I.1.4 Thu hái và bảo quản hoa: a Thời điểm cắt hoa:

Nếu là hoa có sẵn trong vườn nhà thì nên cắt cành hoa vào lúc sáng sớm hoặc chiều tối, là thời điểm tốt nhất trong ngày vì lúc này cây thoát hơi nước không nhiều, cành hoa đang chứa nhiều nước và Carbonhydrat Tuyệt đối không thu hái buổi trưa vì lúc này nhiệt độ cao, ánh sáng mạnh sẽ làm cho hoa nhanh héo b Cách thức thu hái:

Hoa hồng được thu hoạch khi hoa vừa hé nở, nghĩa là cắt lúc hoa còn búp vì hoa sau khi thu hoạch tiếp tục nở Trước khi cắt hoa hồng nên tưới nhiều nước để hoa hút nước dự trữ nước, vì hoa hồng sau khi cắt sẽ bốc hơi mất rất nhiều nước dễ làm cho hoa hồng bị héo Để giữ nhựa còn dư trong cành hoa hồng không bị chảy mất ta nên cắm vào nước sạch , vết cắt phải xiên chéo để tăng diện tích bề mặt hút nước của hoa c Bảo quản hoa sau khi thu hoạch:

Sau khi cắt khỏi gốc hay rời khỏi cây mẹ, sự sống của cành hoa bắt đầu giảm dần vì khả năng hút chất dinh dưỡng, hút nước không còn nữa Nó chỉ sống được nhờ vào chất dinh dưỡng dự trữ còn lại trong cây, dần dần sẽ héo tàn do sự bốc hơi nước, hay do nấm hoặc vi khuẩn xâm nhập vào các tế bào mô dẫn, làm thối rữa các mạch dẫn truyền Ngoài ra hoa cắt cành tàn nhanh trong đó có vai trò gây héo hoa nhanh của Etylen, Etylen thường sản sinh ra nhiều ở hoa đã thụ phấn Các xốc nhiệt độ, thiếu nước, thiếu vật chất hô hấp cũng làm cho hoa sản sinh nhiều Etylen Do đó loại bỏ tác động xấu của Etylen trong bảo quản hoa cắt cành là một vấn đề quan trọng.[4]

Trong cánh hoa hồng có sự tổ hợp của flavonoid chủ yếu là kempferol, quercetin, cyanidin, pelargonidin, peonidin … Các loại carotenoid tạo nên những màu sắc khác nhau như đỏ, vàng, hồng, trắng Đối với những loại hoa khác nhau và màu sắc khác nhau thì các thành phần sắc tố này là không giống nhau, và theo nghiên cứu thì carotenoid và flavonol trong hoa hồng vàng cao hơn anthocyanin.

Carotenoid

I.2.1 Giới thiệu chung về carotenoid:

Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ tự nhiên có trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn

Khác với cây cỏ, con người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng carotenoid từ việc ăn các thực phẩm tự nhiên như trái cây và rau quả, tốt cho sức khỏe

Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxi hóa từ bên ngoài

Thiên nhiên có đến khoảng 600 loại carotenoid khác nhau, trong đó có

50 loại carotenoid hiện diện trong thực phẩm Thế nhưng trong máu của người có khoảng 15 loại được tìm thấy và chúng đang được chứng minh là đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con người

Carotenoid là những chất màu vàng, da cam, đỏ phân bố rộng trong giới thực vật và động vật Người ta còn gọi là chất màu lipocromic ( màu trong chất lipid) vì chúng tan trong chất béo Trong thực vật và động vật carotenoid tồn tại ở dạng : α: Dung dịch nhũ tương với chất béo β : Phân tán trong keo trong môi trường dầu béo γ : Liên kết với protein δ : Ester hóa với acid béo

Trong thực vật carotenoid được tìm thấy ở hoa ( hướng dương, cúc vàng, ), ở quả ( cà chua, cam,…), ở rể, củ ( cà rốt, ) thường các carotenoid trong thực vật bị che bởi màu xanh của clorophyll và khi clorophyll bị phân hủy, màu của carotenoid mới xuất hiện Carotenoid cũng tồn tại rộng rãi trong vi sinh vật dưới dạng màu đỏ, màu cam và vàng của các vi sinh vật, nấm mốc và nấm kỵ quang để giúp chúng chống tác hại do ánh sáng và oxi Carotenoid cũng được tìm thấy ở động vật như: trong lông của chim flamingos, da hoặc vẩy của một số loài cá (astaxanthin trong cá vàng, cá hồi,…) và các loài tôm (axtaxanthin ở dưới dạng carotenoprotein)

Các carotenoid phổ biến nhất bao gồm lycopene và các β carotene là tiền chất của vitamin A Ở thực vật, các lutein xanthophyll là carotenoid phổ biến nhất và nó có vai trò trong việc ngăn ngừa bệnh về mắt Lutein và các sắc tố carotenoid khác có nhiều trong lá (lá chín và rụng) các màu vàng, đỏ, và cam là của carotenoids Đối với lá còn xanh thì thành phần carotenoid không chiếm ưu thế do còn chất diệp lục Vì thế, màu sắc carotenoid thường chiếm ưu thế trong trái cây chín (ví dụ: cam, cà chua, chuối,…), hiện diện sau khi các chất diệp lục không còn.[4,5]

Trong công nghiệp và nông nghiệp, carotenoid được sử dụng để nhuộm màu thực phẩm và thức ăn gia súc vì cường độ màu cao và giá trị dinh dưỡng của chúng

I.2.2 Cấu tạo- phân loại: a Cấu tạo :

Hầu hết các carotenoid trong tự nhiên đều là tetraterpenoid gồm có 8 phân tử isoprenoid

Công thức chung của carotenoid biểu diễn như sau:

1 8 Φ χ ψ Đa số các carotenoid trong tự nhiên đều có cấu hình lập thể ở dạng trans

Trong đa số các carotenoid có vòng, sự liên kết giữa vòng cuối và dãy trung tâm được tiến hành qua 1 nối đơn Tuy nhiên, nhờ có dehydrogen hóa, có thể chuyển liên kết đó thành một nối đôi Khi đó, tên các hợp chất đó có tiếp đầu ngữ ô retro ằ b Phân loại :

1/ Carotenoid hydrocarbon (carotene) tan trong dung môi phân cực kém như hexan, ester dầu hỏa, toluen,…

2/ Nhóm xanthophyl là các dẫn xuất oxi của carotenoid Những hợp chất đó là hydroxyl, keton, epoxy, methoxy hoặc carboxylic acid nhóm này tan trong etanol, aceton,…

Ngoài ra theo tính chất sinh học Người ta phân chia nhóm carotenoid thành hai nhóm:

• Nhóm carotenoid sơ cấp: làm nhiệm vụ quang hợp hoặc bảo vệ

• Nhóm carotenoid thứ cấp: có trong các cơ quan như hoa, quả, các cơ quan hoá già hoặc bị bệnh khi thiếu dinh dưỡng khoáng Chính nhóm này là nguồn cung cấp vitamine A cho chúng ta, khi ăn các loại hoa, quả có màu đỏ như ớt, cà chua, bí ngô, đu đủ, gấc, …

Xanthophyl có thể phân loại như sau:[6,7]

Các carotenoid hydrocarbon bão hòa như cryptoxanthin, lutein và zeaxanthin Nhóm hydroxyl này có thể ở dạng tự do hoặc ester hóa

Các carotenoid metoxyl hóa như Rhodovibrin chúng là những dẫn xuất của lycopene thế ở vị trí 1

Oxicarotenoid như capsanthin và Rhodoxanthin

Epoxycarotenoid có trong thiên nhiên dưới dạng 5, 6 và 5, 8 epoxit Ví dụ: viloaxanthin và flavoxanthin, còn Luteocheon thì có cả hai hệ thống 5,6 và

V io la xa n th in

Carboxycarotenoid như bixin và crocetin

I.2.3 Tính chất của carotenoid : a Tính tan:

Hầu hết các hợp chất của carotenoid đều không tan trong nước, chúng chỉ hòa tan được trong các dung môi hữu cơ như acetone, alcohol, ethylether, chloroform và ethyl acetate Ngoại trừ một số carotenoid có chứa nhóm phân cực mạnh tan được trong nước như norbixin, các sulphat carotenoid và các dẫn xuất glycosyl của crocetin trong đó có crocin.[9,10] b Khả năng hấp thu ánh sáng :

Hệ thống liên kết đôi liên hợp trong cấu trúc phân tử của carotenoid tạo thành nhóm mang màu có khả năng hấp thụ ánh sáng Nhóm này tạo cho carotenoid có những màu sắc hấp dẫn và từ đó xác định được các phổ hấp thu ánh sáng có ý nghĩa quan trọng trong việc nghiên cứu carotenoid Sự mất màu hay thay đổi màu sắc ở bất kỳ thời điểm nào trong suốt quá trình phân tích, cho biết dấu hiệu của sự biến tính hay thay đổi cấu trúc của hợp chất đang nghiên cứu

Phổ hấp thu ánh sáng ở vùng ánh sáng nhìn thấy và vùng tử ngoại là công cụ chủ yếu cho phép xác định chính xác các hợp chất carotenoid Bước sóng hấp thu cực đại và hình dạng của phổ tùy thuộc vào nhóm mang màu Giá trị của các chất carotenoid thông thường nằm trong khoảng giới hạn đã được Britton biên soạn.(phụ lục 4)

Hầu hết carotenoid hấp thu lớn nhất ở ba bước sóng, kết quả là trong phổ hấp thu thường xuất hiện ba mũi cực đại Số lượng liên kết đôi liên hợp càng lớn thì giá trị λ max càng tăng.[7,8]

Các hợp chất carotenoid có độ chưa bão hòa cao thường dễ bị đồng phân hóa Nhiệt độ, ánh sáng, acid, và sự hấp phụ trên các hoạt động bề mặt (như Al),…góp phần đẩy nhanh phản ứng đồng hóa dạng trans – carotenoid ( cấu dạng thông thường của carotenoid) có màu thành dạng cis – carotenoid làm mất màu Do dạng cis linh động nên nó hấp thụ ánh sáng ở bước sóng ngắn và có hệ số hấp thụ phân tử thấp hơn dạng trans Sự đồng phân hóa dưới tác dụng của nhiệt là một trong những biến đổi chủ yếu làm mất màu carotenoid trong quá trình chế biến thực phẩm nhất là khi nhiệt độ cao

Sự biến tính oxi hóa là nguyên nhân chủ yếu làm mất màu carotenoid, phụ thuộc vào sự có mặt của oxi và bị kích hoạt bởi ánh sáng, enzyme, các kim loại mạnh và sự đồng oxi hóa với các dung dịch hydroperoxid Mức độ bị oxi hóa của các carotenoid khác nhau Một số rất dễ bị oxi hóa như ζ - carotene, lutein, violaxanthin

Flavonol

Các hợp chất flavonol là một trong những yếu tố quyết định màu sắc của hoa Quá trình sinh tổng hợp flavonol là một quá trình biến dưỡng tổng hợp tự nhiên đã được nghiên cứu một cách rất sâu rộng Theo đó, hợp chất flavonol được sinh tổng hợp theo con đường sinh tổng hợp phenylpropanoid, chính là con đường tổng hợp thứ cấp chủ yếu trong tất cả thực vật bậc cao Hầu hết các enzyme cũng như các đoạn gene tương ứng cần thiết cho quá trình trên đều đã được nghiên cứu cụ thể, trong số đó nhiều protein đã được tinh thể hóa và phân tích cấu trúc

Chức năng chủ yếu của flavonol trong hoa là dùng để thu hút côn trùng và các loài động vật khác giúp cho quá trình thụ phấn chéo Cấu trúc và sự kết hợp độc đáo của các flavonol ở mỗi loài khác nhau tạo nên các quang phổ cực tím và thông thường được nhìn thấy bởi các loài côn trùng và động vật lớn hơn giúp gia tăng hiệu quả của việc thụ phấn và sự thụ tinh của hoa Flavonol trong hoa còn giúp chống lại bức xạ cực tím và có vai trò như một chất bảo vệ chống lại mầm bệnh giống như vai trò của chúng ở những cơ quan khác của thực vật Hơn nữa, trong nghiên cứu của Van der Meer và cộng sự năm 1992 đã xác định được một nhóm các flavonol đóng vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt phấn, từ đó chứng minh những sắc tố này có chức năng vô cùng quan trọng trong vai trò chính yếu của hoa là sinh sản

Cấu trúc của flavonol gồm có bộ khung carbon C6-C3-C6 thường có hai vòng thơm (vòng A và B) và một vòng carbon có một nguyên tử oxygen Sắc tố anthocyanin là một phân nhóm của flavonol hiện diện chủ yếu trong không bào của tế bào thực vật Dựa vào các nhóm OH của vòng B, có ba nhóm anthocyanin chính được tìm thấy trong thiên nhiên là pelargonidin, cyanidin và delphinidin Methyl hóa cyanidin và delphinidin tạo ra thêm ba nhóm anthocyanin bổ sung nữa là peonidin, petudin và malvidin

Màu sắc của hoa được xác định bởi các yếu tố trong tế bào cũng như các yếu tố điều khiển sự phân bố theo thời gian và không gian của các sắc tố ở cấp độ mô – cơ quan thực vật Trong các tế bào của cánh hoa, màu sắc được điều hòa bởi ít nhất 6 yếu tố sau:

1 Sinh tổng hợp anthocyanin – là yếu tố quan trọng nhất

2 Sinh tổng hợp các sắc tố khác như carotenoid và betalain

3 Sự chuyển đổi các phân tử anthocyanin cơ bản trong các quá trình hydro hóa, methyl hóa hoặc kết hợp

4 Các sắc tố phụ như flavone và các ion kim loại

5 Sự thay đổi của pH trong không bào

6 Cấu trúc và đặc tính sinh hóa của các siêu phân tử sắc tố

Tất cả yếu tố trên đều có khả năng thay đổi cường độ và quang phổ của màu sắc hoa Từ những năm đầu của thế kỷ 19 từ khi nhà di truyền học Gregor Mendel coi màu hoa như là một bước ngoặc trong các thí nghiệm di truyền cổ điển của ông, sự khám phá flavonol đã đóng góp rất to lớn cho sự phát triển của nền sinh học hiện đại Ngược lại sự phát triển của sinh học hiện đại cũng giúp các nhà khoa học hiểu biết một cách sâu rộng khoa học di truyền và sinh hóa của màu sắc hoa.[1]

Là hợp chất phân cực nên tan trong nước, ít tan trong dung môi hữu cơ Cường độ màu của chúng phụ thuộc vào vị trí nhóm OH Màu xanh nhất khi

Flavonol tương tác với sắt tạo phức màu xanh lá cây, sau chuyển sang màu nâu Với chì axetat, flavonol cho phức màu vàng xám Trong môi trường kiềm flavonol rất dễ bị oxi hóa và sau đó ngưng tụ để tạo thành sản phẩm màu đỏ.[11]

Flavonol nói chung thể hiện cường độ hấp thu cao trong vùng bước sóng 320-380 μm (nhánh I) và vùng 240-270 μm (nhánh II) Vị trí và cường độ của λ max của mỗi nhánh biến đổi liên quan đến sự cộng hưởng của benzoyl, cinnamoyl, và vòng pyrone hợp thành sự cộng hưởng hoàn toàn của phân tử flavonol.[11]

Dựa vào mức độ oxi hóa hoặc khử của dị vòng, có thể chia flavonol ra các nhóm có dạng cấu trúc chủ yếu như sau:

Hình 1.9- Catesin (flavanol-3 không màu) Hình 1.10- Locoantoxianidol

Hình 1.11- Antoxianidol (màu đỏ, màu xanh) Hình 1.12- Flavol ( màu vàng)

Hình 1.13 flavanon( không màu, khi đun Hình 1.14- flavanonol( vàng da cam, nâu sẫm) nóng có màu đỏ)

Hình 1.15- Flavonol( màu vàng) Hình 1.16- izoflavon

Hình 1.17- chalcon(màu đỏ tía) Hình 1.18- Auron( màu vàng)

I.3.3 Hoạt tính của flavonol trong y học:

Có tác dụng với khối u và một số dạng ung thư như enpatin (3,5,3'- trihydroxy-6,7,4'-trimetoxyflavon), enpatoretin (3,3'-dihydroxy -5,6,7,4'- tetrametoxyflavon) Nâng cao tính bền của thành mạch máu như rutin Có tác dụng estrogen như glycosid quercetin và kaempferol- 3-3-ramnogalacto-7- ramnorid Ngoài các tác dụng trên, flavonol còn có các tác dụng khác như: chống dị ứng, chống co giật, giãn phế quản, giãn mạch, lợi mật, giảm đau và có tác dụng diệt nấm Một số dẫn chất của flavonol có tác dụng thông tiểu như quercetin (có trong lá diếp cá), kháng khuẩn như acvicularin Đặc biệt, flavonol còn có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và giảm tính giòn của thành mạch

Các kết quả nghiên cứu khoa học đã kết luận rằng: tác dụng sinh học của flavonol là do khả năng chống oxi hoá của chúng quy định Do khả năng ức chế quá trình oxi hoá nên chúng có hiệu ứng chống u lành tính và u ác tính Các flavonol còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng như chống viêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận, thương hàn, lị

Anthocyanin

Chất anthocyanin là hợp glycosid của các dẫn xuất polyhydroxy và polymetoxy của 2-phenylbenzopyrylium hoặc muối flavilium Đây là sắc tố rất phổ biến trong thực vật Từ “anthocyanin” được Marquart đưa ra năm 1895 để chỉ sắc tố màu xanh của cây centaurea cyanus Từ anthocyanin do chữ anthos: hoa, kyanos: xanh, về sau được dùng để chỉ các sắc tố thuộc nhóm flavnanoid có màu xanh, đỏ hoặc tím Trong cây khoảng 97% các sắc tố này ở dạng glycosid (anthocyanin = anthocyanosid) có trong mô tế bào Khi đun nóng anthocyanin trong dung dịch HCl 20% thì phần đường trong phân tử (thường nối vào OH ở C-3) bị cắt và cho ra aglycol được gọi là anthocyanidin Sự khác nhau giữa các anthocyanin là số và vị trí các nhóm hydroxyl, mức độ methyl hóa các nhóm này, bản chất và số nhóm đường gắn vào phân tử, vị trí gắn của chúng, bản chất và số nhóm acid mạch thẳng hay vòng gắn vào phân tử Các loại đường thông thường nhất liên kết với anthocyanidin là: glucose, galactose, rhamnose, di hay trisacharid tạo thành từ 4 loại đường đơn này Trong nhiều trường hợp các gốc đường bị acyl hóa bởi các acid: p-coumaric, cafferic, sinapic, p-hydroxybenzoic, oxalic, succinic, acetic, Hiện nay trên thế giới đã phân lập được khoảng 540 anthocyanin, 90% trong số đó cấu tạo từ 6 anthocyanidin phổ biến sau: pelargonidin (Pg) (18%), cyanidin (Cy) (30%), delphinidin (Dp) (22%), 20% còn lại là petunidin (Pt), malvidin (Mv) và peonidin (Pn)

I.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền màu của anthocyanin: a Cấu trúc anthocyanin:

Số lượng các nhóm hydroxyl, metoxyl, đường và các đường được acyl hóa quyết định màu sắc và độ bền màu của anthocyanin.[21]

Khi số nhóm hydroxyl trong vòng B tăng lên thì cực đại hấp thu của vùng ánh sáng thấy được (λvis-max) chuyển về bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương Ví dụ: bước sóng hấp thu cực đại trong dung dịch acid chlorhydric 0.01% methanol là 520nm (cam) đối với pelargonidin, 535nm (đỏ cam) đối với cyanidin, 545nm (đỏ xanh) đối với delphinidin Khi nhóm metoxyl thế nhóm hydroxyl thì cho kết quả ngược lại.[12,13]

Hình 1.19- Cấu trúc, λ max của 6 anthocyanin phổ biến trong tự nhiên

Hoa hồng trong dược phẩm

a) Trị khai huyết và tăng cường sức khỏe cho tuyến nội tiết

Cánh của hoa hồng có chứa vitamine C, carotene, các loại vitamine nhóm B và vitamine K - chất cần thiết để điều trị bệnh ho ra máu (bệnh khai huyết)

Hầu hết các chất khoáng trong Bảng Hệ thống tuần hoàn Mendeleep đều có trong cánh hoa hồng Chúng có chứa canxi nên giúp cơ thể trao đổi chất tốt và giúp tiêu hoá các loại thức ăn Kali trong hoa hồng cũng có vai trò quan trọng cho hoạt động của tim, giúp chống lại bệnh ho ra máu và cải thiện các tuyến nội tiết

Chất Iod tốt cho tuyến giáp cũng được phát hiện có trong cánh hoa hồng Những tác dụng vô kể của hoa hồng đã đưa nó trở thành một loại dược phẩm đầu tiên của đất trời

Người ta cho rằng, ngắt những cánh hoa hồng nở rộ vào buổi sớm tinh mơ khi không khí còn trong lành và ẩm, đặc biệt là những sáng có mưa nhiều và sương mù, có khả năng chữa bệnh rất tốt

Sau khi ngắt những cánh hoa này, mang đi sao hoặc sấy khô hay sử dụng để điều trị bệnh luôn chứ không được rửa vì khi rửa bằng nước, nó sẽ làm mất hết những thành phần chữa bệnh của cánh hoa Cánh hoa hồng cũng có thể sắc lấy nước hoặc lấy tinh dầu để trị bệnh b) Chống các bệnh ngoài da và hạn chế vết thương mưng mủ

Các nhà nghiên cứu cho biết, vi khuẩn sẽ chết trong vòng 5 phút sau khi tiếp xúc với cánh hoa hồng tươi, điều này sẽ làm cho hoa hồng trở thành một loại dược phẩm hoàn hảo để chống lại các bệnh ở da

Cánh hoa hồng tươi còn hạn chế mưng mủ vết thương và vết bỏng Chúng cũng có thể làm dịu những vết ngứa do dị ứng gây ra Hoa hồng còn được dùng làm thuốc chữa trị mụn nhọt, làm tan máu tụ và làm tiêu sưng Cách sử dụng cực kì đơn giản chỉ cần dùng cánh hoa hồng giã và đắp lên da là được Các sản phẩm chăm sóc da có chứa chiết xuất hoa hồng giúp nuôi dưỡng, tăng độ đàn hồi của da, làm mờ các vết thâm c) Tăng cường hệ miễn dịch, chống vi khuẩn và bảo vệ đường tiêu hoá

Tinh dầu của hoa hồng là thành phần cơ bản của dược phẩm tự nhiên kỳ diệu, có tác dụng kích thích và cân bằng hệ miễn dịch cũng như hệ thần kinh con người

Tinh dầu hoa hồng giúp cải thiện hoạt động của các tuyến nội tiết, loại bỏ rối loạn của các cơ quan và phục hồi các tế bào

Ngoài ra nó cũng rất tốt cho đường tiêu hoá nhờ khả năng làm lành các màng nhầy bị tổn thương, chống lại các vi khuẩn và giúp lên men số men thiếu hụt ở trong ruột và dạ dày d) Trà hoa hồng chống viêm phế quản, viêm họng, viêm loét dạ dày

Trà chế biến từ cánh hoa hồng (khoảng một muỗng cánh hoa hồng phơi khô cho mỗi cốc nước) có khả năng chống cảm lạnh, viêm họng, viêm phế quản và chứng loạn thần kinh chức năng Đây cũng là loại nước uống nhiều vitamine Mứt làm từ cánh hoa hồng là đơn thuốc tự nhiên tuyệt vời, đặc biệt là vào thời tiết lạnh e) Chống cảm cúm, sốt, rối loạn thần kinh, viêm lợi và đau tim

Bột của cánh hoa hồng phơi khô trộn với mật ong là một phương thuốc hiệu nghiệm để chống lại bệnh viêm miệng, viêm lợi Đau đầu, ốm yếu và suy nhược cơ thể có thể điều trị bằng xông hương và tinh dầu của hoa hồng

Cách này cũng có tác dụng với những người có hệ miễn dịch yếu, dễ bị loạn dây thần kinh chức năng và thể lực kém Tinh dầu hoa hồng cũng có thể làm khoẻ mạnh các cơ tim và đó là điều lý giải vì sao các bác sĩ thường sử dụng liệu pháp xông hương hoa hồng để điều trị bệnh

Tắm bằng nước hoa hồng là một liệu pháp hoàn hảo chống lại các bệnh ở thần kinh, làm sạch da, làm dịu những lo lắng và mang lại sự thư thái, sảng khoái cho con người f) Thư giãn cơ thể

Khi cảm thấy căng thẳng hay mệt mỏi có thể rắc cánh hoa hồng vào bát nước nóng, đặt ở trong phòng Cách này sẽ giúp bạn cảm thấy bớt cẳng thẳng, ngoài ra cũng tốt với những bạn bị lạnh đỉnh đầu hoặc cảm cúm Nếu có thời gian để ngâm mình trong bồn nước nóng thư giãn cơ thể thì hãy đổ nước nóng và nửa cốc đựng cánh hoa hồng, che kín lại Đổ vào bồn trước khi tắm Hoa hồng rất tốt cho hệ thần kinh, giúp cơ thể thư giãn Có thể dùng cánh hoa hồng để ngâm chân buổi tối trước khi đi ngủ

Ngoài ra, còn có thể đốt, xông bằng tinh dầu hoa hồng Vì tinh dầu hoa hồng kích thích và điều hòa hệ kháng thể cũng như hệ thần kinh của con người, làm tăng hoạt động của các tuyến nội tiết.

Các công trình nghiên cứu về hợp chất trong hoa hồng

Đã có nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến các hợp chất tách ra từ các loại cây hoa hồng:

Năm 1915, phân tích về anthocyanin trong cánh hoa hồng được bắt đầu bằng những thí nghiệm cổ điển của Willstafter và Nolan về việc cô lập cyanin từ loài flores rosae gallicae rubrae đã làm khô

Năm 1934, pelargonin được tách ra đầu tiên từ loài hoa hồng đỏ cam

Năm 1961, peonin được cô lập từ R.rugosa

Từ nay 1963 với việc kiểm tra những thuộc tính như là tan trong ether, khả năng nhuộm xanh với SbCl3, đã dần đến kết luận rằng có sự hiện diện của carotenoid trong hoa hồng

Năm 1967, qua thí nghiệm của William Allen Richardson (Ducher 1878) và Whisky Mac (Tantau 1967) đưa ra nhận định tất cả các loài hoa hồng chứa rất nhiều flavonoid, cùng với carotenoid tạo màu sắc trong vùng hấp thu thấp được

Năm 1977, phân tích đầu tiên về carotenoid từ hoa hồng vàng R.foetida, sử dụng phép ghi sắc hấp phụ cổ điển đưa ra định nghĩa của bảy loại carotenoid Vài năm sau đó thêm một nghiên cứu về loài thực vật tương tự, sử dụng kĩ thuật tiến bộ hơn cho phép xác định thêm gần 40 hợp chất

Năm 2009, công trình nghiên cứu của khoa sinh học trường đại học Shahed, Iran đã công bố kết quả về hoạt tính kháng oxi hóa, hoạt tính kháng vi sinh vật của hoa hồng Rosa hemisphaerica Herm kết luận rằng các hợp chất tách ra từ hoa này có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh, có khả năng chống ung thư, giúp giảm nguy cơ bệnh tim và các bệnh liên quan đến tuổi tác

Năm 2010, công trình nghiên cứu của khoa dược đại học Chiang Mai

50200, Thái Lan đưa ra kết quả về hoạt tính kháng oxi hóa mạnh của các hợp chất phenolic của hoa hồng Thái Lan Công trình nghiên cứu của đại học quốc gia Chungbuk, Hàn Quốc tách các hợp chất dễ bay hơi và phenolic từ hoa hồng

Rosa rugosa trắng, và ước lượng tính hoạt động dược học của sản phẩm thiên nhiên tách được này Công trình nghiên cứu của khoa sinh học trường đại học Shahed, Iran đã công bố kết quả về hoạt tính kháng oxi hóa, hoạt tính kháng vi sinh vật cao của hoa hồng Rose damascena.

Nguyên tắc và cơ sở lý thuyết một số phương pháp xác định và đánh giá dùng trong luận văn

I.7.1 Phương pháp đo màu theo hệ CIE:

Việc nghiên cứu đặc tính của màu sắc theo một hệ thống là rất cần thiết trong đánh giá khách quan về sự khác biệt màu sắc cũng như hàm lượng các chất màu Các hệ thống đo màu chủ yếu dựa trên sự cảm thụ màu sắc của mắt khi bị ánh sáng có các cường độ và bước sóng khác nhau kích thích Hệ thống được sử dụng phổ biến để đánh giá màu sắc nói chung và các sản phẩm thực phẩm nói riêng là hệ thống CIE

Hệ thống này dựa trên cơ sở ánh sáng phản xạ từ bất cứ bề mặt có màu nào cũng có thể quy về hỗn hợp của ba tia màu : đỏ (red), xanh da trời (blue), xanh lá (green) Dưới đây giới thiệu hai không gian màu thuộc hệ thống CIE được sử dụng phổ biến nhất.[18,19]

Hình 1.20- Không gian màu CIE-Lab và CIE-Lch

Hệ thống CIELab Để thuận lợi hơn nữa cho việc tính toán và so sánh các màu với nhau, năm 1976 CIE giới thiệu một hệ thống sắp xếp màusắc CIELab Trong đó sử dụng 3 thông số:

L : độ sáng a : tọa độ màu trên trục đỏ -lục b : tọa độ màu trên trục vàng–lam

Giao điểm của 2 trục a và b là điểm vô sắc( đen, ghi, trắng tùy thuộc vào độ sáng) Những đoạn có cùng tông màu trong mặt phẳng a b nằm trong một đoạn thẳng kéo dài từ điểm trung tâm ra phía ngoài

Trục độ sáng L có giá trị từ 0 - ứng với màu đen đến 100 - ứng với màu trắng Những màu có cùng độ sáng nằm trên mặt phẳng song song với mặt phẳng giấy

Hình 1.21- Không gian ba chiều màu CIELab trên mặt phẳng

Không gian màu LCh sử dụng chung biểu đồ với không gian màu Lab nhưng thay vì sử dụng trục tọa độ vuông thì nó lại sử dụng trục tọa độ hình trụ

Trong không gian màu này L biểu thị độ sáng giống với L trong không gian màu Lab, C là cường độ màu và h là góc tông màu Giá trị góc tông màu h được xác định khởi điểm tại trục a và được tính bằng đơn vị độ Mắt người có thể nhận biết được sự khác biệt giữa hai màu sắc khi giá trị góc màu h của chúng khác nhau 1 o Giá trị cường độ màu C bằng 0 ngay tại tâm và gia tăng tùy thuộc khoảng cách từ tọa độ màu đến tâm Ví dụ một chất màu đỏ với độ pha loãng khác nhau cho màu từ hồng đến đỏ, các mẫu pha loãng này sẽ có cùng góc màu h nhưng giá trị cường độ màu C sẽ tăng dần

Giá trị góc tông màu h được xác định khởi điểm tại trục a và được tính bằng đơn vị độ :

Các giá trị C và h được xác định từ a và b theo công thức: Độ màu: C = a 2 +b 2

Góc tông màu: h ab = tan -1 ⎜ ⎝ ⎛ a b ⎟ ⎠ ⎞

Hình 1.22- Không gian màu CIELch

* Sự khác nhau giữa màu 1 và màu 2 trong hệ thống CIELab và CIELCh được xác định thông qua các hiệu số sau: ΔL = L2 -L1 : sự khác nhau về độ sáng giữa 2 màu Δa = a2 -a1 : sự khác nhau về tọa độ trên trục đỏ-lục Δb = b2 -b1 : sự khác nhau về tọa độ trên trục vàng-lam ΔC = C2 -C1 : sự khác nhau về độ bão hòa giữa 2 màu Δh = h2 -h1 : sự khác nhau về tông màu giữa 2 màu

Nếu ΔL mang dấu+ nghĩa là sự sai lệch màu theo chiều hướng sáng lên và ngược lại

Nếu Δa mang dấu+ nghĩa là sự lệch màu theo hướng đỏ hơn, mang dấu - nghĩa là theo hướng lục hơn

Nếu Δb mang dấu+ nghĩa là vàng hơn, nếu mang dấu – nghĩa là theo hướng lam hơn

Giá trị sai biệt màu sắc trong 2 hệ thống trên được tính bằng giá trị ΔE:

Hai màu có giá trị ΔE>1 tương ứng với khoảng cách màu mà mắt có thể nhận biết được sự khác biệt màu sắc giữa 2 màu đó Khoảng cách màu nhỏ hơn

1 : mắt không thể nhận ra sự khác biệt màu sắc giữa 2 màu

Các công trình nghiên cứu đã chứng minh hệ thống màu CIE cung cấp các thông tin cần thiết về sự cảm thụ màu sắc để đánh giá màu sắc của các sản phẩm thực phẩm

I.7.2 Đo quang phổ hấp thu UV-vis:

Các thế hệ máy quang phổ tử ngoại- khả kiến (UV-vis spectrophometer) hiện nay thường gồm:

Thường dùng đèn hồ quang hydro nặng cho phổ ở vùng tử ngoại (180-400nm) và đèn vonfram-halogen hoặc đèn thạch anh – iod cho phổ ở vùng khả kiến (trên 400nm)

I.7.2.2 Bộ phận phân tách ánh sáng:

Các bức xạ do nguồn cung cấp được bộ phận tạo đơn sắc tách riêng thành từng giải sóng hẹp (đơn sắc), được bộ phận chia chùm sáng hướng chùm tia đơn sắc lần lượt qua cuvet chứa dung môi và cuvet chứa mẫu Detector sẽ so sánh cường độ bức xạ đi qua mẫu (IT) và đi qua dung môi (Io), chuyền tín hiệu quang thành tín hiệu điện và tính toán định lượng dựa vào định luật Lambert- Beer

Sau khi xuyên qua mẫu, chùm ánh sáng đơn sắc được thu nhận bởi detector Bộ tự ghi thường được nối với máy tính với các phần mềm chuyên dùng có khả năng tính toán, lưu giữ phổ, đối chiếu và so sánh khi cần thiết

Các máy UV-vis thường cung cấp cho ta đường cong A=f(λ) hoặc A=f(ν) hay T=f(λ) Phổ T=f(λ) chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thu mà không phụ thuộc vào nồng độ của chất đó như các phổ A=f(λ) hoặc A=f(ν)

Các máy quang phổ UV-vis thông thường có khả năng ghi phổ trong vùng tử ngoại gần và vùng khả kiến (200-800nm) và một số máy còn có thể đo đến vùng hồng ngoại (gần 1000nm) Chỉ có các máy quang phổ đặc biệt mới đo được ở các vùng tử ngoại xa, còn gọi là vùng tử ngoại chân không (λ50% thì mẫu được coi là biểu hiện hoạt tính ở nồng độ 1mg/ml và sẽ được hạ nồng độ xuống 10 lần tiếp tục đo như trên Nếu ở nồng độ 0.1 mg/ml ta vẫn thu được Q >50% mẫu sẽ được tiến hành thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50

• Tìm giá trị ức chế IC50

Pha mẫu theo 6 thang nồng độ và tiến hành đo như trên Tính giá trị IC50 bằng phần mềm GraphPad Prism thông qua đường chuẩn phần trăm ức chế (đường chuẩn được xây dựng từ 6 nồng độ khác nhau)

CHƯƠ NG III: KẾT QUẢ

Trong chương này các kết quả về lưu trữ nguyên liệu, phân tích sơ bộ hóa thực vật tìm các nhóm hoạt chất của hoa hồng vàng, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách nhóm hoạt chất Tiếp theo là kiểm tra hoạt tính kháng oxi hóa của các hợp chất tách được.

Khảo sát chế độ lưu trữ nguyên liệu

Hoa hồng vàng mới mua về được dùng dao cắt xéo thân cây bỏ phần thân dập nát ở dưới, vẫn giữ gai và lá ở phần trên, sau đó cắm 1/3 cây hoa còn lại vào trong nước

- Thời gian đánh giá: 10 ngày (kể từ ngày mua hoa về)

- Nguyên liệu: hoa hồng có nguồn gốc từ Đà Lạt

- Hoa hồng được cắm trong nước ở ba điều kiện:

+ Nhiệt độ phòng, có ánh sáng

+ Nhiệt độ phòng, không ánh sáng

+ Nhiệt độ mát, không ánh sáng b Kết quả khảo sát

Bảng III.1- Hoa ở các điều kiện khảo sát (phụ lục 1, 2, 3)

Thời gian lưu trữ (ngày) Thông số 1 3 5 7 10

Nhiệt độ phòng, có ánh sáng ΕΔ 0 5.25 12.62 19.85 26.04

Nhiệt độ L 84.14 83.97 81.49 67.85 58.39 a -9.87 -10.96 -7.74 0.89 3.74 b 53.88 52.9 44.68 35.15 28.29 phòng, không ánh sáng ΕΔ 0 1.62 3.41 8.23 17.2

Nhiệt độ mát, không ánh sáng ΕΔ 0 4.39 4.07 4.47 4.22

So sánh sự biến đổi của ΔΕ theo thời gian

E nhiệt độ phòng, có as nhiệt độ phòng, k as nhiệt độ mát, k as Đồ thị III.1- Sự biến đổi của ΔΕ theo thời gian lưu trữ

Theo đồ thị III.1 ta thấy đối với hoa hồng vàng bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phòng, có ánh sáng thì ΔΕ là cao nhất và tăng nhanh Nhiệt độ mát, không ánh sáng giá trị ΔΕ ngày thứ 3 và thứ 5 cao hơn điều kiện nhiệt độ phòng, không ánh sáng Nhưng qua những ngày sau thì tăng chậm và nhỏ nhất, còn ở điều kiện nhiệt độ phòng, không ánh sáng thì tăng nhanh qua những ngày trữ tiếp sau đó ΔΕ

Như vậy ta có thể kết luận màu sắc của cánh hoa hồng vàng thay đổi theo nhiệt độ, ánh sáng, thời gian và điều kiện mát không ánh sáng chính là điều kiện lý tưởng để bảo quản nguyên liệu và tốt nhất là trữ hoa trong vòng ba ngày.

Nhận danh các nhóm hoạt chất trong cánh hoa hồng vàng dựa theo phân tích sơ bộ hóa thực vật

III.2.1 Sơ đồ nhận danh nhóm hoạt chất:

Hình 3.1-Sơ đồ nhận dạng nhóm chất bằng phản ứng màu

III.2.2 Kết quả nhận danh bằng phản ứng màu:

Bảng III.2 Kết quả nhận danh các nhóm hợp chất trong cánh hoa hồng vàng bằng phản ứng màu

Dung môi Dịch chiết Thuốc thử Hiện tượng Kết luận Mức độ dịch kiềm bột Fe màu nâu đậm flavonol +++

Diethyl ether dịch ether đun cách thủy vàng lục đậm carotenoid +++ bột Fe màu nâu đậm flavonol +++ HCl hồng rất nhạt

NaOH lục rất nhạt anthocyanin +

Màu sắc của hoa hồng là sự tổ hợp của 3 nhóm sắc tố: carotenoid tạo ra chuổi màu từ vàng đến cam, flavonol tạo ra màu vàng nhạt, anthocyanin tạo màu từ hồng nhạt đến tía Tùy vào hàm lượng các sắc tố trong hoa mà chúng có màu khác nhau Theo kết quả nhận danh các nhóm hợp chất trong cánh hoa hồng vàng ở trên thì trong hoa hồng vàng có nhiều sắc tố carotenoid, flavonol, và rất ít anthocyanin.

Nhận danh các nhóm hoạt chất trong cánh hoa hồng vàng

Qua thí nghiệm phân tích sơ bộ hóa thực vật đã cho ta biết sự có mặt của carotenoid, flavonol, anthocyanin trong cánh hoa hồng vàng Để dễ tách riêng các nhóm hoạt chất trong thí nghiệm này lần lượt tiến hành dùng các dung môi có độ phân cực tăng dần: ether petrol, diethyl ether, ethanol chiết các nhóm hoạt chất thay vì chiết riêng lẻ các nhóm hoạt chất bằng các dung môi (phổ Vis- phụ lục 6) và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách để tìm điều kiện chiết tách thích hợp nhất, sau đó quét phổ UV-vis các dịch tương ứng

III.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách khi dùng dung môi ether petrol:

Hình 3.2- Sơ đồ qui trình chiết carotenoid trong khảo sát

III.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ ether Petrol và cánh hoa (F EP/CH )lên quá trình chiết tách: (phụ lục 7,12)

Nguyên liệu để khảo sát tỉ lệ ether petrol và cánh hoa hồng vàng được chuẩn bị vào ngày 22/11/2010 a Điều kiện khảo sát: φ (mm) ∼ 1-2 mNLQK/mẻ (g) =1.00

Tchiết (phút) = 60 t ( o C) = nhiệt độ phòng

Dịch EP Định mức lên 100ml

Xác định điều kiện chiết thích hợp

Quét phổ Vis Xác định A

Bã vkhuấy (vòng/ phút) cố định ở mức 7

A(λ = 440nm) = f(FEp/CH) Với F dm/ngl = 6/1-12/1 b Kết quả khảo sát

A λ440nm Đồ thị III.2- Biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ ether petrol và cánh hoa lên quá trình chiết tách

A nm eter dau 1.6.dsp eter dau 1.6 lan2.dsp

A nm eter dau 1.8 lan2.dsp eter dau 1.8.dsp

A nm eter dau 1.10 lan2.dsp eter dau 1.10.dsp

A nm eter dau 1.12 do lai.dsp eter dau 1.12.dsp Đồ thị III.3- Phổ Vis của dịch chiết trong ether petrol trong khảo sát tỉ lệ

III.3.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chiết lên quá trình chiết tách: (phụ lục 8,13)

Nguyên liệu để khảo sát thời gian chiết ether petrol và cánh hoa hồng vàng được chuẩn bị vào ngày 24/11/2010 a Điều kiện khảo sát φ (mm) ∼ 1-2 mNLQK/mẻ (g) =1.00 t ( o C) = nhiệt độ phòng

A(λ D0nm) = f(T) Với T (phút) = 45, 60, 75, 90 b Kết quả khảo sát

A λ max Đồ thị III.4- Biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian lên quá trình chiết tách

A nm eter dau 1.10 45.dsp eter dau 45phut lan 3.dsp

A nm eter dau 1.10 60 lan2.dsp eter dau 60phut lan3.dsp

A nm eter dau 1.10 75 lan2.dsp eter dau 75phut lan3.dsp

A nm eter dau 1.10 90 lan2.dsp eter dau 1.10 90.dsp Đồ thị III.5- Phổ Vis của dịch chiết trong ether petrol trong khảo sát thời gian

III.3.1.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết tách carotenoid: (phụ lục 9,14)

Nguyên liệu để khảo sát nhiệt độ chiết ether petrol và cánh hoa hồng vàng được chuẩn bị vào ngày 26/11/2011

T(phút)u T(phút) a Điều kiện khảo sát φ (mm) ∼ 1-2 mNLQK/mẻ (g) =1.00

A(λ = 440nm) = f(t o C) t ( o C) = 40-70 b Kết quả khảo sát

A λmax Đồ thị III.6- Biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết tách

A nm etedau40oC.dsp eter dau 40oC lan 2.dsp

A nm eter dau 50oC.dsp eter dau 50oC lan2.dsp t( o C)@ t( o C)P

A nm eter dau 60oC.dsp eter dau 60oC lan2.dsp

A nm eter dau 70oC lan 1new.dsp eter dau 70oC lan2.dsp Đồ thị III.7- Phổ Vis của dịch chiết trong ether petrol trong khảo sát nhiệt độ

• Nhận xét: Ở đồ thị III.2 cho thấy một trong những thông số quan trọng trong quá trình chiết tách carotenoid là tỉ lệ dung môi ether petrol và nguyên liệu Kết quả cho thấy lượng carotenoid tăng từ 6/1-12/1 và đạt cực trị tại tỉ lệ F/1

Cố định tỉ lệ này, khảo sát tiếp ảnh hưởng của thời gian chiết

Qua độ thị III.4 thấy độ hấp thu chiết tách tăng dần và đạt cực trị tại 75 phút Nhưng sau đó giảm dần Vì vậy ta cố định thời gian 75 phút để khảo sát tiếp ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết tách

Còn ở đồ thị III.6 thì nhiệt độ tăng kéo theo độ hấp thu cũng tăng, đạt cực trị tại t ` o C Nếu nâng nhiệt độ lên 70 o C và kèm theo thời gian quá lâu

75 phút thì độ hấp thu giảm do carotenoid bị oxi hóa

Qua các khảo sát trên ta thấy phổ Vis của dịch chiết trong ether petrol có bước sóng hấp thu cực đại trong vùng 400nm-500nm với ba mũi rõ rệt của carotenoid, ở các phổ Vis đều thể hiện các mũi λ 1 = 416-419nm, λ 2 D0- 441nm, λ3F7-469nm Từ bảng tra của carotenoid trong hoa hồng(phụ lục4), cho thấy carotenoid của hoa hồng vàng thuộc nhóm neurosporene,

A 1% 1cm )18, ε 7000, M= 536 Và điều kiện thích hợp để chiết tách carotenoid từ hoa hồng vàng trong dung môi ether petrol: ở tỉ lệ F dm/ngl là 10/1, thời gian 75 phút, nhiệt độ là 60 o C

Từ kết quả trên tiến hành chiết mẻ lớn hơn cánh hoa hồng vàng với dung môi ether petrol (m Qk =5g), dịch chiết thu được mang đi cô quay chân không t( o C)` t( o C)p để xác định lượng cao Mỗi thí nghiệm được thực hiện 2 lần và lấy trị số trung bình Mẫu cao sẽ trữ trong chai màu ở điều kiện nhiệt độ khoảng 20 o C và không ánh sáng, để xác định hoạt tính kháng oxi hóa trong phần III.4 Dựa theo công thức (*) ở II.3.5 ta có:

Bảng III.3- Hiệu suất chiết được carotenoid từ cánh hoa hồng vàng

III.3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách khi dùng dung môi diethyl ehter:

Hình 3.3- Sơ đồ qui trình chiết flavonol trong khảo sát

Dịch Et 2 O Định mức lên 100ml

Xác định điều kiện chiết thích hợp

Quét phổ Vis Xác định A

III.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ diethyl ether và cánh hoa hồng (F Et2O/CH ) lên quá trình chiết tách: (phụ lục 10)

Nguyên liệu để khảo sát tỉ lệ diethyl ether và cánh hoa hồng vàng được chuẩn bị vào ngày 24/12/2010 a Điều kiện khảo sát: φ (mm) ∼ 1-2 m NLQK/mẻ (g) =1.00

Tchiết (phút) = 45 t ( o C) = nhiệt độ phòng vkhuấy (vòng/ phút) cố định ở mức 7

Với F dm/ngl = 6/1-12/1 b Kết quả

Fdm/ngl A Đồ thị III.8- Biểu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ diethyl ether lên quá trình chiết tách

A nm de sau ed 1.6 pha 1.10.dsp de sau ed 1.6 lan2 pha 1.10.dsp

A nm de sau ed 1.8 pha 1.10.dsp de sau ed 1.8 lan2 pha 1.10.dsp

A nm de sau ed 1.10 pha 1.10.dsp de sau ed 1.10 lan2 pha 1.10.dsp

A nm de sau ed 1.12 pha 1.10.dsp de sau ed 1.12 lan2 pha 1.10new.dsp Đồ thị III.9- Phổ Vis của dịch chiết trong diethyl ether trong khảo sát tỉ lệ

III.3.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên quá trình chiết tách: (phụ lục 11)

Nguyên liệu để khảo sát tỉ lệ diethyl ether và cánh hoa hồng vàng được chuẩn bị vào ngày 3/1/2011 a Điều kiện khảo sát φ (mm) ∼ 1-2 m NLQK/mẻ (g) =1.00 t ( o C) = nhiệt độ phòng

Fdm/ngl (g/g) = 10/1 vkhuấy (vòng/ phút) cố định ở mức 7

Với T = 60, 75, 90, 105 b Kết quả khảo sát

T(phút) A Đồ thị III.10- Phổ Vis của dịch chiết trong diethyl ether trong khảo sát thời gian

A nm de sau ed 1.10 45ph.dsp pha 1.10.dsp de sau ed 1.10 45ph lan2 pha1.10.dsp

A nm de sau ed 1.10 60ph pha 1.10.dsp de sau ed 1.10 60.ph lan 2 pha1.10.dsp

A nm de sau ed 1.10 90.ph lan2 pha1.10.dsp de sau ed 1.10 90ph pha 1.10.dsp Đồ thị III.11- Biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian lên quá trình chiết tách

• Nhận xét: Đồ thị III.8 cho thấy dùng dung môi diethyl ether chiết thu được phổ Vis có bước sóng dịch chiết hấp thu cực đại trong vùng 325nm-400nm Phổ hấp thu tăng dần từ tỉ lệ 6/1 → 10/1 và đạt cực trị ở tỉ lệ Fdm/ngl là 10/1 Vì vậy ta cố định tỉ lệ này cho quá trình khảo sát yếu tố thời gian tiếp theo

Qua đồ thị III.10 thì độ hấp thu chiết tách tăng dần và đạt cao nhất tại 90 phút Nhưng sau đó giảm dần

Vậy điều kiện thích hợp để chiết flavonol trong cánh hoa hồng vàng ở tỉ lệ F dm/ngl là 10/1 và thời gian 90 phút Tiến hành chiết mẻ lớn (m Qk =5g), dịch thu được đem cô quay chân không xác định lượng cao Mỗi thí nghiệm được thực hiện 2 lần và lấy trị số trung bình Mẫu cao sẽ trữ trong chai màu ở điều kiện nhiệt độ khoảng 20 o C và không ánh sáng, để xác định hoạt tính kháng oxi hóa trong phần III.4

Qua hai khảo sát trên ta thấy phổ Vis dịch chiết trong diethyl ether có bước sóng hấp thu cực đại trong vùng 325nm-400nm như vậy trong hoa hồng vàng có chứa flavonol Từ bảng tra của flavonol trong hoa hồng (phụ lục 5), cho thấy flavonol trong cánh hoa hồng vàng là isoquercetin λ= 352.5nm, ε

892, M= 464.37g/mol Và điều kiện tối ưu để chiết tách flavonol từ hoa hồng vàng trong dung môi diethyl ether: ở tỉ lệ F dm/ngl là 10/1, thời gian 90 phút

A nm de sau ed 1.10 75ph pha 1.10.dsp de sau ed 1.1075.ph lan2 pha 1.10.dsp

Dựa theo công thức (*) ở II.3.5 ta có:

Bảng III.4- Hiệu suất chiết được flavonol từ cánh hoa hồng vàng

III.3.3 Tách hoạt chất còn lại trong bã sau chiết bằng ether petrol và diethyl ether:

Sau khi chiết qua ether petrol, bã còn lại để bay hơi dung môi chiết lần đầu sau đó chiết với cồn Chiết bã sau chiết ether petrol và diethyl ether lần lượt bằng cồn nóng (EtOH1) và cồn nguội (EtOH2) a Điều kiện khảo sát φ (mm) ∼ 1-2 mNLQK/mẻ (g) =1.00

Fdm/ngl (g/g) = 10/1 v khuấy (vòng/ phút) cố định ở mức 7 b Kết quả khảo sát

A nm connong sau chiet e.dau 1.2.dsp connong sau chiet e.dau.dsp connong sau chiet e.dau 1.4.dsp

A nm con 2.1.dsp con 2.2.dsp con 2.dsp

A nm connog sau e.dau va d.e 1.5.dsp connog sau e.dau va d.e 1.10.dsp

A nm connguoi sau e.dau va d.e 1.10.dsp connguoi sau e.dau va de 1.5.dsp Đồ thị III.12- Phổ Vis của dịch chiết EtOH1 và EtOH2

Qua đồ thị III.12 ta thấy phổ Vis của dịch chiết EtOH1 (nóng và nguội) có bước sóng hấp thu cực đại trong vùng 325nm -380nm và 400nm -500nm như vậy chứng tỏ trong dịch chiết có flavonol và carotenoid tan trong cồn Tuy nhiên các mũi hấp thu carotenoid bị che, và các mũi hấp thu flavonol không đồng nhất và không thể hiện rõ λ max khi thay đổi tỉ lệ pha loãng điều này cho thấy dịch chiết này chứa flavonol còn flavonol còn lẫn tạp chất

Phổ Vis của dịch chiết EtOH2 (nóng và nguội) có bước sóng hấp thu cực đại trong vùng 325nm -380nm và 400nm -500nm như vậy chứng tỏ trong dịch chiết có flavonol và carotenoid tan trong cồn

Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các nhóm hoạt chất chiết tách

III.4.1 Chuẩn bị các mẫu cao đánh giá tính kháng oxi hóa:

Hình 3.4- Sơ đồ qui trình tách các nhóm hoạt chất dưới dạng cao

Bảng III.5- Bảng hiệu suất thu cao

A nm edau lamlan1 lai.dsp eterdau lan1hsuat lamlan2.dsp

A nm connogsaue.dau.dsp connogdaue.dau pha 1.10lai.dsp connogsaue.dau pha 1.5.dsp

A nm con sau chiet e.dau lan2.dsp connguoisaue.dau1.5.dsp connguoisaue.dau1.10.dsp

A nm de sau ed mau lon1.dsp de sau ed maulon2 dsp

A nm con sau chiet e.dau lan2.dsp connguoisaue.dau1.5.dsp connguoisaue.dau1.10.dsp

A nm connguoi sau e.dau va d.e 1.10.dsp connguoi sau e.dau va de 1.5.dsp connguoi sau chiet e.dau va d.e dsp Đồ thị III.13- Phổ Vis của các cao tương ứng

III.4.2 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa theo phương pháp DPPH

Sàng lọc khả năng kháng oxi hóa

- Tiến hành xác định hoạt tính của các cao ở nồng độ 1mg/ml

- Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng

+ Mẫu đối chiếu: gồm dung dịch DPPH, methanol, vitaminC + Mẫu trắng: gồm DMSO và methanol

- Tiến hành xác định giá trị IC50

Kết quả sàng lọc Bảng III.6- Kết quả kiểm tra DPPH ở nồng độ 1mg/ml

Theo Bảng III.6 ta thấy chỉ trừ mẫu TH1 nồng độ quá thấp thể hiện mẫu này không có hoạt tính, nguyên nhân này có thể là là do trong dịch chiết thu được có chất sáp đã làm che mất hoạt tính nên ta không đo được hoạt tính ở mẫu này, còn 5 mẫu còn lại thì các hợp chất tách được đều ức chế gần như hoàn toàn các gốc tự do DPPH Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của các nhóm hoạt chất chiết được:

Bảng III.7- Kết quả đo IC50 của các mẫu và vitamine C (phụ lục 16,

TH6 97.9 87.75 24.45 19.15 2.55 0.95 vitamine C 99.95 99.9 99.8 44.6 13.35 2.55 Đồ thị III.14- Đường chuẩn tính IC50 của các hợp chất chiết tách được từ cánh hoa hồng vàng và vitamine C

Bảng III.8- Giá trị IC50 của các hợp chất chiết tách được từ cánh hoa hồng vàng và vitamine C

Ghi chú: TH1 : Cao chiết bằng ether petrol

TH2: Cao chiết bằng diethyl ether sau khi chiết qua ether petrol

TH3: Cao chiết bằng cồn nóng sau khi chiết qua ether petrol và diethyl ether

TH4: Cao chiết bằng cồn nguội sau khi chiết qua ether petrol và diethyl ether

TH5: Cao chiết bằng cồn nóng sau khi chiết qua ether petrol

TH6: Cao chiết bằng cồn nguội sau khi chiết qua ether petrol

Theo đồ thị III.14, bảng III.8 ta có thể kết luận theo phương pháp DPPH tính kháng oxi hóa của hợp chất TH4 là thấp nhất, còn lại các hợp chất khác đều có tính kháng oxi hóa khá mạnh Từ kết quả này thì các hợp chất TH2, TH3, TH5,TH6 có thể sử dụng trong y học, mỹ phẩm và dược phẩm chức năng

Với mục đích chiết tách các nhóm hoạt chất từ cánh hoa hồng vàng, đồng thời kiểm tra hoạt tính kháng oxi hóa của các nhóm chất chiết được từ cánh hoa hồng vàng Đà Lạt để đưa vào ứng dụng trong mỹ phẩm và dược phẩm chức năng, kết quả nghiên cứu đã đạt được các kết quả sau: Điều kiện thích hợp để lưu trữ nguyên liệu là bảo quản ở nhiệt độ mát, không ánh sáng

Phân tích tìm các nhóm hoạt chất chính trong cánh hoa hồng vàng là carotenoid, flavonol anthocyanin Điều kiện thích hợp để chiết tách và nhận danh carotenoid và flavonol từ cánh hoa hồng vàng cũng như việc tính được hiệu suất chiết tách các hoạt chất này

Tính được hiệu suất của các cao thu được/5g nguyên liệu qui khô: hiệu suất của cao thu được từ dịch chiết ether petrol 1.261% Hiệu suất của cao thu được từ dịch chiết diethyl ether 0.253% Hiệu suất của cao thu được từ dịch chiết cồn nóng và nguội sau khi đã chiết ether petrol và diethyl ether 4.740% và 5.104% Hiệu suất của cao thu được từ dịch chiết cồn nóng và nguội sau khi đã chiết ether petrol 6.056% và 6.623% Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các nhóm hoạt chất chiết tách được trong cánh hoa hồng vàng theo phương pháp DPPH nhận được kết quả Trong đó các mẫu TH2 (IC50= 49.5 ± 0.9), TH3 (IC50= 67.1 ± 0.3), TH5 (55.6 ± 0.9),TH6 (66.7 ± 1.1) có hoạt tính tương đối mạnh

Có thể thấy, đề tài nghiên cứu chiết tách các nhóm hợp chất từ cánh hoa hồng vàng bằng dung môi ether petrol và diethyl ether đã hoàn thành đúng theo các dự định ban đầu Các kết quả thu được có giá trị nghiên cứu cũng như có thể áp dụng vào sản xuất công nghiệp Tuy nhiên trong quá trình thực hiện vẫn còn nhiều khó khăn và hạn chế Các nhóm hợp chất tách được từ cánh hoa hồng vàng chỉ được nhận biết dựa trên phổ Vis Bên cạnh đó, các yếu tố ảnh hưởng độ bền của các hợp chất tách được chưa khảo sát cũng như chưa đề xuất được các phương hướng khắc phục độ bền Hy vọng trong thời gian sắp tới, đề tài được triển khai tiếp tục Đồng thời, giá trị sử dụng của cây hoa hồng vàng sẽ được nâng cao hơn Và những kết quả trong đề tài này sẽ là nền tảng cho những nghiên cứu về các hợp chất trong cánh hoa hồng vàng

1 [21] Anna Bakowska, Jan Oszmian ski- The effects of heating, UV irradiation and storage on stability of the anthocyanin-polyphenol copigment complex- Food Chemistry-

2 [6] Belia B Rodriguez – Amaya, A guide to carotenoid analyist in food, printed in the United State of Americs

3 [5] Eric Yarnell – carotenoid, Bastyr university-1999

4 [9] Fikrat I Abdullaev Ph, J.J, Espinosa- Aguirre PhD- Biomendical properties saffron and ts potential use in cacer therapy and chemoprevention trials- Cancer Dectection and Prevention 28- 2004(19)

5 [10] FI Abdullaev, cancerr chemopreventive and Tumoricidal properties of saffron (crocus sativus L)- The Society for Experimental Biology and Medicine -2001

6 [12] G Mazza and R.Brouillard- The mechanism of copigmentation of anthocyanin in aqueous solutions – Phytochemistry- 1990

7 [13] K Aaby, G.Skrede, and R.E Wrolstad, Phenolic composition and antioxidant activities in flesh and achenes of strawberries- J Agric Food Chem- 2005

8 [15] K Gould, K Davies and C Winefield, eds- Anthocyanins: Biosynthesis,

9 [7] Lu y, Etoh H, Watanabe N, et al- A new carotenoid, hydrogen peroxide oxidantion products from lycopene, Biosci Biotech Biochem 59-1995

10 [17] Prof Dr Conrad Hans Eugster- The chemistry of rose pigment -1991

11 [14] R Brouillard- Chemical structure of anthocyanin- Anthocyain as Food colour-

12 [8] R.Edge, D.J.McGarvey, TG Truscott- The carotenoid as anti- oxidants- a review, Joural of Photochemistry and photobiology -1997

13 [18] Ronald E Wrolstad- Tracking color and pigment changes in anthocyanin products.-Trends in food science & technology -2005

14 [11] T.A Geisman- The chemistry of flavonoid compounds, ed D.o.c.U.o.C.L Angles – The Macmillan company New York -1962

15 [16] T.F Luis Cabrita, Oyvind M Andersen- Colour and stability of the six common anthocyanidin 3-glucosides in aqueous solutions- Food Chemistry -2000

16 [2] Võ Văn Chi-Từ điển cây thuốc Việt Nam- NXB Y học-1996

17 [3] Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến – Phân loại học thực vật bậc cao- NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội-1978

18 [4] Đỗ Lam Sơn- luận văn thạc sĩ- khoa công nghệ hóa học- khảo sát quá trình bền hóa crocetin từ quả dành dành bằng cyclodextrin – 2007

19 [19] Phạm Thành Quân- Giáo trình kỹ thuật nhuộm in bông-Bộ môn công nghệ hóa hữu cơ- ĐH Bách Khoa Tp HCM

20 [1] Lê Ngọc Tú, L.V.C, Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lê Doãn Diên - Hóa Sinh Công Nghiệp- Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội -2005

21 [20] Nguyễn Thị Thu Vân- Phân tích định lượng- NXB ĐH Quốc Gia Tp HCM-

Ph ụ l ụ c 1 - Kh ả o sát độ bi ế n đổ i màu theo th ờ i gian đ i ề u ki ệ n nhi ệ t độ phòng, có ánh sáng

Ph ụ l ụ c 2- Kh ả o sát độ bi ế n đổ i màu theo th ờ i gian đ i ề u ki ệ n nhi ệ t độ phòng, không ánh sáng

Ph ụ l ụ c 3 - Kh ả o sát độ bi ế n đổ i màu theo th ờ i gian đ i ề u ki ệ n nhi ệ t độ mát, không ánh sáng

Ph ụ l ụ c 4- B ướ c sóng h ấ p thu c ủ a m ộ t s ố caroteoid

Carotenoid λ max nm Dung môi

Ph ụ l ụ c 5- Các m ũ i h ấ p thu c ủ a m ộ t s ố flavonol flavonol EtOH lmax (log ε)

312(3.94) quercetin 3-L- arabinoside 360(4.24), 260(4.32) isoquercitin 360(4.32), 258(4.41) isorhamnetin 360, 306, 254 quercetin 4'- glucoside 366, 254 azalein 339(4.23), 251(4.32) xanthorhamnin 362(4.22), 258(4.33)

6-hydroxy-5,7,3'-trimethoxy-3',4'- methylenedioxyflavone 337(4.35), 272(4.07), 245(4.24) melsisimplexin 336(4.29),235(4.3) hexa-O-methylquercetagetin 335(4.42), 240(4.37)

Ph ụ l ụ c 6- Th ă m dò đ i ề u ki ệ n chi ế t tr ướ c kh ả o sát

Ph ổ c ủ a d ị ch chi ế t ether petrol Ph ổ c ủ a d ị ch chi ế t diethyl ether Ph ổ c ủ a d ị ch chi ế t c ồ n ngu ộ i Ph ổ c ủ a d ị ch chi ế t c ồ n nóng

Ph ụ l ụ c 7- K ế t qu ả kh ả o sát ả nh h ưở ng c ủ a t ỉ l ệ dung môi F dm/ngl lên quá trình tách chi ế t carotenoid ở λ D0nm

Fdm/ngl Lần 1 Lần 2 TB

Ph ụ l ụ c 8- K ế t qu ả kh ả o sát ả nh h ưở ng c ủ a th ờ i gian lên quá trình chi ế t tách carotenoid ở t ỉ l ệ 10/1 ở λ D0nm

Ph ụ l ụ c 9- K ế t qu ả kh ả o sát ả nh h ưở ng c ủ a nhi ệ t độ lên quá trình chi ế t tách carotenoid ở t ỉ l ệ 10/1 ở λ D0nm t ( o C) Lần 1 Lần 2 TB

Ph ụ l ụ c 10- K ế t qu ả kh ả o sát ả nh h ưở ng c ủ a t ỉ l ệ dung môi diethyl eter

F dm/ngl lên quá trình tách chi ế t

F dm/ngl Lần 1 Lần 2 TB

Ph ụ l ụ c 11- K ế t qu ả kh ả o sát ả nh h ưở ng c ủ a th ờ i gian lên quá trình tách chi ế t b ằ ng dung môi diethyl eter

Ph ụ l ụ c 12- Ph ổ h ấ p thu UV-vis c ủ a các m ũ i carotenoid ở các t ỉ l ệ khác nhau

Ph ụ l ụ c 13- Ph ổ h ấ p thu UV-vis c ủ a các m ũ i carotenoid ở các th ờ i gian khác nhau

Ph ụ l ụ c 14- Ph ổ h ấ p thu UV-vis c ủ a các m ũ i carotenoid ở các nhi ệ t độ khác nhau t ( o C) Lần A1 λ 1 A2 λ 2 A3 λ 3

Ph ụ l ụ c 15 - K ế t qu ả hàm l ượ ng c ủ a carotenoid và flavonol chi ế t đượ c t ừ cánh hoa h ồ ng vàng