tận thu hoa hồng từ nguồn thải ra của hoa hồng chưng nghiên cứu chiết tách anthoeyanin từ cánh hoa hồng

ii Mục đích của bài luận văn này nhằm tận thu hoa hồng từ nguồn thải ra của hoa hồng chưng, từ đó nghiên cứu sự chiết tách anthocyanin từ cánh hoa hồng, để tìm ra được điều kiện chiết an

i



Cho con xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất của mình đến cô Vương Ngọc Chính, cám ơn Cô đã hết lòng chỉ bảo, truyền thụ cho con những kiến thức mới trong suốt khoảng thời gian con thực tập tại trường Đại học Bách Khoa, con lúc nào cũng thấy sự yêu nghề và yêu người, say mê, nhiệt tình với nghiên cứu trong Cô, ngọn lửa đó làm cho chúng con không thể nào lùi bước khi gặp khó khăn Với tất cả tấm lòng con luôn cầu chúc Cô thật nhiều sức khỏe

Con cũng cám ơn thật nhiều vì Ba Mẹ đã động viên, cổ vũ cho con mỗi khi con gặp khó khăn

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô trong Bộ môn Kỹ Thuật Hữu Cơ, Khoa

Kỹ Thuật Hóa Học, trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô trong Bộ môn Tổng Hợp Hữu Cơ trường đại Học Tôn Đức Thắng đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng em xin gửi lời cám ơn đến các Anh, Chị học Cao học và các bạn ở trường Đại Học Bách Khoa, trường Đại Học Tôn Đức Thắng đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ với em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

ii

Mục đích của bài luận văn này nhằm tận thu hoa hồng từ nguồn thải ra của hoa hồng chưng, từ đó nghiên cứu sự chiết tách anthocyanin từ cánh hoa hồng, để tìm ra được điều kiện chiết anthocyanin tốt nhất với hy vọng tạo tiền đề khai thác và ứng dụng họat chất này một cách thích hợp trong tương lai như trong các ngành mỹ phẩm, thực phẩm, dược phẩm…

Trong quá trình khảo sát trên 4 loại hoa hồng (đỏ, hồng, vàng, cam), ta thấy anthocyanin trong hoa hồng đỏ có chứa nhiều hơn những loại hoa còn lại Quá trình chiết tách anthocyanin của hoa hồng đỏ được thực hiện trong acid citric1.3% /ethanol 32% ở nhiệt độ 45oC, trong 5 giờ là khá cao Sản phẩm phụ của quá trình chiết cũng có giá trị cao như các hợp chất flavonol, carotenoid…

Bằng phương pháp đo pH vi sai ta tính được hàm lượng anthocyanin tổng trong hoa hồng đỏ là 1.909 g/ 100g hoa khô

Bằng cách đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa thông qua phản ứng bao vây gốc tự

do DPPH đã đạt được các kết quả sau: 24.8 ± 1.0 (µg/ml)

iii

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC ĐỒ THỊ ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x

LỜI MỞ ĐẦU xi

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu về cây hoa hồng 2

1.1.1 Tên gọi 2

1.1.2 Đặc điểm 2

1.1.3 Phân bố sinh thái 3

1.1.5 Thành phần 3

1.1.6 Dược tính 3

1.2 Anthocyanin 4

1.2.1 Giới thiệu về anthocyanin 4

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến anthocyanin 6

1.2.3 Công dụng của anthocyanin 10

1.3 Favonol 10

1.3.1 Giới thiệu về favonol 10

1.3.2 Tính chất của flavanol 11

1.4 Carotenoid 11

1.4.1 Giới thiệu về carotenoid 11

1.4.2 Cấu trúc hóa học 12

iv

1.7 Nguyên tắc và cơ sở lý thuyết một số phương pháp xác định và đánh giá dùng

trong luận văn 15

1.7.1 Phương pháp đo màu theo hệ CIE 15

1.7.2 Đo quang phổ hấp thu UV – vis 18

1.7.3 Phương pháp pH vi sai 19

1.7.4 Phương pháp DPPH 20

CHƯƠNG 2PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nội dung nghiên cứu 23

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 23

2.2.2 Xác định độ ẩm 23

2.2.3 Xác định hàm lượng của hoạt chất trong dịch chiết bằng phương pháp quang phổ hấp thu UV - Vis 24

2.2.4 Xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết từ cánh hoa hồng 24

2.3 Quy trình nghiên cứu 26

2.3.1 Khảo sát chế độ lưu trữ nguyên liệu 26

2.3.2 Nhận danh nhóm họ chất theo phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật (dùng phản ứng màu phối hợp với phổ Vis) 26

2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết tách anthocyanin từ cánh hoa hồng 30

2.3.4 Xây dựng quy trình tách chiết anthocyanin từ cánh hoa hồng 31

2.3.5 Xác định khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp đánh bắt gốc tự do bằng thử nghiệm DPPH 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ & BÀN LUẬN 37

3.1 Khảo sát chế độ lưu trữ nguyên liệu 38

3.2 Nhận danh nhóm họ chất theo phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 40

v

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết anthocyanin trong cánh

hoa hồng 46

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nồng độ cồn và nhiệt độ 46

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ citric acid 47

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian 48

3.4 Qui trình chiết tách anthocyanin - Xác định hàm lượng anthocyanin tổng và thành phần phần trămcác cao thu được trên 100g cánh hoa khô 49

3.5 Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của cao anthocyanin và các cao phụ thu từ qui trình chiết tách 53

3.5.1 Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của anthocyanin 53

3.5.2 Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của các sản phẩm phụ của quá trình chiết của anthocyanin 55

KẾT LUẬN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 65

vi

Bảng 1.1 Nhóm chính anthocyanin 5

Bảng 3.1 Thông số đo màu  trên 4 loại cánh hoa ở các điều kiện: nhiệt độ phòng, có ánh sáng; nhiệt độ phòng, không có ánh sáng;ở 20 o C, không có ánh sáng 38

Bảng 3.2 Kết quả nhận dạng các nhóm hợp chất trong cánh hoa bằng phản ứng màu 40 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin theo đồng thời nồng độ cồn và nhiệt độ 46

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát sự biến đổi hàm lượng Anthocyanin theo nồng độ citric acid47 Bảng 3.5 Hàm lượng anthocyanin theo thời gian chiết 48

Bảng 3.6 Hàm lượng anthocyanin tổng 52

Bảng 3.7 Thành phần phần trăm của các cao thu được 52

Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra DPPH của CA/EtOH ở nồng độ 1mg/ml 53

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra DPPH của mẫu CA/EtOH theo phương pháp IC 50 53

Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra DPPH của vitamin C theo phương pháp IC 50 54

Bảng 3.11 Giá trị IC 50 của anthocyanin chiết tách từ hoa hồng đỏ, Vitamine C 54

Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra DPPH ở nồng độ 0.1mg/ml của các hoạt chất phụ 55

Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra DPPH của HCl/EtOH và CA/EtOH ở nồng độ 1mg/ml 55

vii

Hình 1.1 Hoa hồng 2

Hình 1.2 Lá của hoa hồng 2

Hình 1.3 Thân của hoa hồng 2

Hình 1.4 Flavylium cation 5

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của 6 loại anthocyanin phổ biến 6

Hình 1.6 Các dạng cấu trúc của anthocyanin ở những môi trường pH khác nhau 7

Hình 1.7 Màu sắc của dịch chiết anthocyanin ở bắp cải tím thay đổi trong môi trường pH khác nhau 8

Hình 1.8 Phổ hấp thu cực đại của malvin-3-glucoside ở môi trường pH khác nhau 8

Hình 1.9 Cấu trúc Aglugon 10

Hình 1.10 Tetraterpenoid 12

Hình 1.11 Một số carotenoid thường gặp 13

Hình 1.12 Không gian màu CEI-Lab 16

Hình 1.13 Sơ đồ máy quang phổ UV-VIS 18

Hình 1.14 : Phổ hấp thu của anthocyanin (acylated pelargonidin-3-sophoroside-5-glucoside) trong dung dịch đệm pH 1 và pH 4.5 19

Hình 1.15 DPPH 20

Hình 1.16 Phổ Vis của DPPH trước và sau khi phản ứng với hoạt chất 21

Hình 2.1 Qui trình chiết tách để nhận danh các nhóm hoạt chất bằng phản ứng màu 28

Hình 2.2 Qui trình chiết tách để nhận biết các nhóm hoạt chất bằng thông qua phổ UV-Vis 29

Hình 2.3 Qui trình dùng để khảo sát các yếu tồ ảnh hưởng đến chiết tách anthocyanin từ cánh hoa hồng đỏ 31

Hình 3.1 : Sơ đồ tổng hợp nhóm họ anthocyanin và flavonoid trong hoa hồng theo con đường sinh tổng hợp 45

viii

ix

Đồ thị 3.1 So sánh mức độ của các hợp chất trong cánh hoa hồng vàng, đỏ, cam, hồng39

Đồ thị 3.2 Sự biến đổi ∆E theo thời gian của hoa hồng 40

Đồ thị 3.3 Phổ Vis của dịch chiết V1 của hoa hồng đỏ 41

Đồ thị 3.4 Phổ Vis của dịch chiết V2 của hoa hồng đỏ 42

Đồ thị 3.5 Phổ Vis của dịch chiết V3 của hoa đỏ 43

Đồ thị 3.6 Phổ Vis của dịch chiết V4 của hoa hồng đỏ 43

Đồ thị 3.7 Phổ Vis của dịch chiết V5 của hoa hồng đỏ 44

Đồ thị 3.8 Hàm lượng anthocyanin theo đồng thời nồng độ cồn và nhiệt độ 46

Đồ thị 3.9 Hàm lượng anthocyanin theo nồng độ acid citric 47

Đồ thị 3.10 Hàm lượng anthocyanin theo thời gian 48

Đồ thị 3.11 Phổ của 4 dịch chiết thu được trong qui trình chiết 51

Đồ thị3.12 Đường chuẩn tính IC 50 của anthocyanin tách từ hoa hồng đỏ và vitamine C.54

xi

Từ ngày xưa con người đã biết dùng cây thuốc, biết lấy màu của cây, cánh hoa làm phấn, chiết lấy tinh dầu làm nước hoa… Ngày nay khi khoa học kĩ thuật phát triển thiên nhiên vẫn là kho nguyên liệu vô tận mà con người khám phá, tìm tòi mãi không hết

Trong lĩnh vực thực phẩm, chúng ta phát hiện ngày càng nhiều những loại cây cho màu thực phẩm rất đẹp Khi sử dụng chúng, người tiêu dùng không phải lo lắng chúng có gây hại gì cho mình hay không Vì ngoài việc cung cấp chất màu tạo màu, những hợp chất đó còn có nhiều công dụng khác như gấc ngoài tác dụng cho màu đẹp,

nó còn chứa rất nhiều vitamin A, vitamin E,

Trong lĩnh vực dược phẩm, những cây thuốc đông y được điều chế dưới viên đang dần được mọi người ưa dùng, vì chúng có tác dụng không thua gì so với viên thuốc tây đi từ những phản ứng hóa học mặt khác chúng cũng không có tác dụng phụ,

ít gây kích ứng với người dùng

Không ngừng nghiên cứu tìm ra cái mới và hoàn thiện cái cũ, lĩnh vực mỹ phẩm đã thu về nhiều thành tựu to lớn không kém Với những ưu điểm nổi trội của mình, hoa hồng luôn sự lựa chọn số một của nhiều loại hình sản phẩm mỹ phẩm

Anthocyanin là một hợp chất màu được tìm thấy rất nhiều trong hoa, đặc biệt là hoa hồng đỏ vì nó không những cho màu đẹp mà còn có khả năng kháng oxi hóa cao

Với ước mong sự kết hợp giữa anthocyanin và các nhóm hoạt chất khác trong hoa hồng có thể tạo ra những sản phẩm có giá trị trong tương lai Vì vậy mục đích chính của luận văn này là nghiên cứu chiết tách được hoạt chất anthocyanin trong cánh hoa hồng đỏ

1 CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN

2

1.1.1 Tên gọi:

Cây hoa hồng có tên khoa học là Rosa SP

Thuô ̣c họ hoa hồng Rosaceae [1; 2]

tụ lại trong đế hoa cũng tạo thành một quả giả hình trứng ngƣợc hoặc gần hình cầu.[1; 3]

Hình1.2 Lá của hoa hồng Hình1.3 Thân của hoa hồng

3

Đa số giống hồng rất chịu nắng, ánh nắng trong ngày càng nhiều giờ càng tốt Hoa hồng cũng chịu mưa nhưng lượng mưa trung bình từ 1500-2000 mm mới thích hợp Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng tốt của cây hồng là từ 18-25 oC

Cây hồng khá yếu ớt chỉ đứng vững trước gió nhẹ (3 m/s)

1.1.3 Phân bố sinh thái:

Cây hoa hồng là cây có xuất xứ ôn nhiệt đới vùng Bắc bán cầu Ở nước ta, cây hoa hồng được trồng ở hầu khắp đất nước.[2]

Hoa hồng trồng hiện nay có nguồn gốc rất phức tạp nó là kết quả tạp giao của tầm xuân (Rosa multiflora) và mai khôi (Rosa Rugosa) và hoa hồng (Rosa Indica)

1.1.4 Thành phần:

Trong cánh hoa hồng là sự kết hợp của nhiều loại flavanoids (quercetin, kaempferol,…), chlorophylls và carotenoids Tùy vào sự có mặt nhiều hay ít các hợp chất trên cho ra những loài hoa với màu sắc phong phú và đa dạng.[5; 6]

Các nhà khoa học phân tích trong hoa hồng có chứa tinh dầu với tỉ lệ 0.013 – 0.15% mà thành phần chủ yếu gổm geraniol 12.78%, 1-citronellol 23.89%, phenethyl alcol 16.36%, stearoptenes 22.1%.[7]

Cánh của hoa hồng có chứa vtamin C, các loại vitamin nhóm B và vitamin K Hầu hết các chất khoáng trong bảng Hệ thống tuần hoàn Mendeleev đều có trong cánh hoa hồng

1.1.5 Dược tính:

Theo y học cổ truyền, hoa hồng có vị ngọt, tính ấm, tác dụng hoạt huyết, điều kinh, tiêu viêm, tiêu sưng Người Trung Quốc và nhiều nước châu Á đã dùng hoa hồng

để chữa bệnh từ rất lâu đời

Tinh dầu hoa hồng là chất an thần, làm dịu các chứng bệnh về tiêu hóa, trị đau nhức, căng thẳng thần kinh, suy nhược, mất ngủ, rối loạn kinh nguyệt Ngoài tác dụng kích thích tuần hoàn máu, nó còn là chất sát khuẩn nhẹ, ít độc nhất trong các loại tinh dầu nên có thể dùng cho trẻ nhỏ

Nước hoa hồng có tác dụng như một loại sữa làm mát dịu và sạch sẽ làn da, có tính sát khuẩn nhẹ và làm hưng phấn tinh thần

4

Cánh hoa hồng tươi còn hạn chế mưng mủ vết thương và vết bỏng Chúng cũng

có thể làm dịu những vết ngứa do dị ứng gây ra

Cánh của hoa hồng có chứa vitamin C, các loại vitamin nhóm B và vitamin K - chất cần thiết để điều trị bệnh ho ra máu (bệnh khai huyết)

Hầu hết các chất khoáng trong Bảng Hệ thống tuần hoàn Mendenleev đều có trong cánh hoa hồng Chúng có chứa calci nên giúp cơ thể trao đổi chất tốt và giúp tiêu hoá các loại thức ăn Kali trong hoa hồng cũng có vai trò quan trọng cho hoạt động của tim, chất Đồng thì giúp chống lại bệnh ho ra máu và cải thiện các tuyến nội tiết Chất Iodine tốt cho tuyến giáp cũng được phát hiện có trong cánh hoa hồng [8] Những tác dụng vô kể của hoa hồng đã đưa nó trở thành một loại dược phẩm đầu tiên của đất trời Trà chế biến từ cánh hoa hồng có khả năng chống cảm lạnh, viêm họng, viêm phế quản

và chứng loạn thần kinh chức năng Đây cũng là loại nước uống nhiều vitamin.[10]

Mứt làm từ cánh hoa hồng là đơn thuốc tự nhiên tuyệt vời, đặc biệt là vào thời tiết lạnh.[10]

1.2.1 Giới thiệu về anthocyanin:

Anthocyanin là hợp chất glycosid của các dẫn xuất polyhydroxy và polymetoxy của 2-phenylbenzopyrylium hoặc muối flavilium Anthocyanin có mặt trong tất cả các loài thực vật, nhiều nhất ở hoa và trái cây chủ yếu trong lá, thân cây, và hoa

Thuật ngữ "Anthocyanin" lần đầu đã được đề xuất vào năm 1835 bởi Marquart chỉ đơn giản để biểu thị các sắc tố màu xanh của cornflower, và sau đó đã được sử dụng trong một ý nghĩa rộng hơn bao gồm cả nhóm sắc tố tương tự, kể từ khi nó được công nhận

là màu đỏ và màu xanh được thể hiện bởi một loại sắc tố duy nhất.Anthocyanins trong

tiếng Hy Lạp : anthos = hoa, kyanos = màu xanh

Các anthocyanin đều dựa trên một cấu trúc lõi cơ bản, các ion flavyllium

5

Hình1.4 Flavylium cation

Nhƣ thể hiện trong hình 1.4 có bảy nhóm phụ khác nhau trên ion flavylium

Những nhóm phụ có thể là một nguyên tử hydro, hydroxit một hoặc một

Pelargonin -H -OH -H -OH -OH -H -OH Màu hồng da

cam Malvin -OCH 3 -OH -OCH 3 -OH -OH -H -OH Màu tím Peonin -OCH 3 -OH -H -OH -OH -H -OH Màu đỏ sâ ̣m Petunin -OH -OH -OCH 3 -OH -OH -H -OH Màu tím Pulchellin -OH -OH -OH -OH -OCH 3 -H -OH Màu xanh-đỏ

6

Rosinin -OCH 3 -OH -H -OH -OH -H -OCH 3 Màu đỏ Triacetin -OH -OH -OH -H -OH -H -OH Màu đỏ

Hiện nay trên thế giới đã phân lập được khoảng 540 anthocyanin, 90% trong số

đó cấu tạo từ 6 anthocyanin phổ biến sau: pelargonin (Pg) (18%), cyanin (Cy) (30%), delphinin (Dp) (22%), 20% còn lại là petunin (Pt), malvin (Mv) và peonin (Pn).[20; 22;

24]

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc của anthocyanin:

1.2.2.1 Cấu trúc hóa học:

Hình1.5 Cấu trúc hóa học của 6 loại anthocyanin phổ biến

Tùy vào sự có mặt của các nhóm hydroxyl, metoxyl, đường và các đường được acyl hóa quyết định màu sắc của anthocyanin.[25; 26]

Khi số nhóm hydroxyl trong vòng B tăng lên thì cực đại hấp thu của vùng ánh sáng thấy được (λvis-max) chuyển về bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương.[27; 28]

Sự có mặt của nhóm hyrdoxyl ở vị trí C5 và C4 làm bền hoá anthocyanin do chúng ngăn cản các phản ứng hydrate hoá dẫn đến sự tạo thành dạng không màu.[30]

Quá trình glycoxyl hoá cũng ảnh hưởng đến độ bền màu của anthocyanin Cùng một anthocyanidin thì các diglucosid bền nhiệt và ánh sáng hơn các monoglucosid.[27]

7

Anthocyanin không bị acyl hóa rất dễ mất màu trong môi trường trung tính hoặc acid yếu Sự mất màu này là do C2 bị hydrate hóa Anthocyanin chứa hai hoặc nhiều nhóm acyl (ternatin, platyconin, cinerarin, gentiodenphin và zebrinin) bền trong môi trường trung tính hoặc acid yếu do liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong anthocyanin và các acid vòng thơm.[31]

1.2.2.2 pH:

Tùy thuộc vào pH môi trường mà anthocyanin sẽ tồn tại ở 5 dạng khác nhau: cation flavylium, carbinol base (hemiketon), chalcone, quinonoidal base và anion quinonoidal base.[32]

Hình1.6 Các dạng cấu trúc của anthocyanin ở những môi trường pH khác nhau[32]

Năm 1988, từ những kết quả nghiên cứu trên những anthocyanin đơn giản, Brouillard đã đưa ra cơ chế chuyển hóa cấu trúc của anthocyanin ở môi trường pH khác nhau như sau: tại pH nhỏ hơn 3 anthocyanin tồn tại ở dạng cation flavylium màu

đỏ, khi pH tăng xảy ra sự cạnh tranh giữa hai phản ứng hydrat hóa cation flavylium và phản ứng chuyển vị proton liên quan đến các nhóm hydroxyl của phần aglycon Khi cation flavilium bị hydrat hóa cho ra dạng carbinol không màu, dạng này cân bằng với dạng chalcon vòng mở màu vàng hoặc không màu Phản ứng chuyển vị proton tạo ra dạng quinonoidal base Khi pH tăng trên 7, phản ứng khử proton xảy ra mạnh chuyển các quinonoidal base thành dạng anion quinonoidal có màu tím đến xanh.[33; 34]

8

Khi nghiên cứu màu sắc và độ bền màu trên hợp chất 3-O-glucoside của 6 anthocyanidin phổ biến, Luis Cabrita và cộng sự đã chỉ ra rằng tất cả các mẫu anthocyanin thử nghiệm đều có độ bền trên 70% sau 60 ngày ở pH 1-3, khi giá trị pH tăng thì độ bền giảm dần Tuy nhiên, khi pH tăng đến khoảng pH kiềm thì độ bền của các anthocyanin này tăng dần, ở pH từ 8-9 độ bền đạt cực đại trong khoảng pH kiềm.[33]

Hình1.7 Màu sắc của dịch chiết anthocyanin ở bắp cải tím theo pH

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510540nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin, thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.[35]

Hình1.8 Phổ hấp thu cực đại của malvin-3-glucoside theo pH

9

1.2.2.3 Nhiệt độ:

Nhiệt độ có thể phá hủy các ion flavylium, và do đó làm mất màu sắc Nhiệt độ cũng gây ra phản ứng Maillard, trong đó lượng đường dư trong anthocyanins có thể tham gia.[36-38]

Trong nghiên cứu về độ bền của cao chiết từ quả mâm xôi cho thấy khi nhiệt độ bảo quản tăng từ 5oC, 25oC, đến 37oC thì thời gian phân hủy tương ứng là 330.1, 32.1

và 11.7 ngày[38] Dưới tác dụng của nhiệt anthocyanin bị mất màu và dần hóa nâu, sự biến đổi này được giải thích như sau: dưới tác dụng của nhiệt độ cân bằng phản ứng dịch chuyển về phía tạo ra dạng chalcone và carbinol không màu, các gốc glycosyl chuyển thành α-diketone Ngoài ra trong thành phần của sản phẩm cuối còn có các dẫn xuất courmarin, benzoic acid và trihydrobenzaldehyde Sự hóa nâu của anthocyanin dưới tác động của nhiệt độ là do quá trình polymer hóa anthocyanin tạo thành các chất màu nâu.[32; 35; 38]

1.2.2.4 Ánh sáng:

Ánh sáng có thể có một tác dụng tương tự như nhiệt độ.Kết quả nghiên cứu của Jan Oszmian´ski và cộng sự về ảnh hưởng của nhiệt độ, tia UV lên phức copigment anthocyanin–polyphenol chỉ ra rằng các hợp chất anthocyanin tự do hay ở dạng copigment đều bị phân huỷ mạnh dưới tác dụng của tia UV Tác dụng phân hủy của tia

UV trên phức copigment của cyanindin mạnh hơn cả ảnh hưởng của quá trình gia nhiệt

ở 80oC lên phức này.[25]

1.2.2.5 Các copigment khác:

Điều tra gần đây cho thấy quá trình copigment hóa là sự kết hợp giữa anthocyanin và các loại hợp chất khác nhau như proteins, tannins, các flavonoid khác, acid hữu cơ, acid nucleic, alkaloid, polysaccaride và các ion kim loại theo cơ chế tạo phức liên phân tử (intermolecular copigmentation) Các tác nhân copigment giàu điện

tử sẽ kết hợp với ion flavylium nghèo điện tử, ngăn cản sự hydrate hoá giúp ion flavylium không bị chuyển về dạng pseudobase không màu Bản thân các tác nhân thường không màu nhưng khi được thêm vào dung dịch chứa anthocyanin, chúng sẽ tạo ra hiện tượng sâu màu, làm tăng độ hấp thu và độ bền của các anthocyanin.[25; 37]

10

Ví dụ: Quinon trong táo, làm tăng cường sự thoái hóa của anthocyanins, trong khi loại đường lại giúp dâu tây ổn định màu sắc

1.2.3 Công dụng của anthocyanin:

Trong hoa, màu đỏ tươi sáng và tím giúp thích ứng cho việc thu hút các loài thụ phấn Trong trái cây, nhiều màu sắc cũng thu hút sự chú ý của động vật, chúng có thể

ăn hoa quả và phát tán hạt

Trong các mô quang hợp (như lá và đôi khi ở thân cây), anthocyanin được hiển thị để hoạt động như một “ kem chống nắng ”, bảo vệ tế bào giảm những thiệt hại cao bằng cách hấp thụ màu xanh-màu xanh lá cây và ánh sáng tia cực tím, qua đó bảo vệ các mô từ photoinhibition, hoặc cánh khỏi ánh sáng gay gắt

Ngoài vai trò làm giảm ánh sáng, anthocyanins cũng hoạt động như chất chống oxy hóa mạnh mẽ Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hydrogen peroxide được sản xuất trong bào quan khác có thể được vô hiệu hóa bởi anthocyanin trong không bào.[36]

1.3.1 Giới thiệu về flavonol:[49]

Flavonol là một hợp chất thuộc nhóm họ flavonoid Flavonol là dạng glucozit làm cho rau quả và hoa có màu vàng và da cam Khi flavanol bị thủy phân thì giải phóng ra aglucon có màu vàng Các glucozit nhóm flavonol rất nhiều, nhưng thường gặp hơn cả là những aglucon dẫn xuất sau đây:

Hình1.9 Cấu trúc Aglugon

Flavonol nói chung thể hiện cường độ hấp thu cao trong vùng bước sóng 320-

380 µm (nhánh I) và vùng 240-270 µm ( nhánh II) Vị trí và cường độ của λmax của mổi nhánh biến đổi liên quan đến sự cộng hưởng của benzoyl, cinnamoyl, và vòng pyrone hợp thành sự cộng hưởng hoàn toàn của phân tử flavone.[50]

1.4.1 Giới thiệu về carotenoid:

Carotenoid là hợp chất màu thuộc nhóm tetraterpenoid, phân bố rộng rãi trong giới thực vật và động vật.Carotenoid còn được gọi là chất màu lipocromic vì chúng tan trong chất béo

Trong thực vật và động vật carotenoid tồn tại ở các dạng:

α Dung dịch nhũ tương với chất béo

β Phân tán keo trong môi trường dầu béo

γ Liên kết với protein

δ Ester hóa với acid béo

Trong thực vật carotenoid được tìm thấy ở hoa (hướng dương, cúc vàng,…), ở quả (cà chua, gấc, cam,…), ở củ, rễ (cà rốt,…); thường các carotenoid trong thực vật bị che bởi màu xanh của chlorophyl và khi chlorophyl bị phân hủy thì màu của carotenoid mới xuất hiện Carotenoid cũng tồn tại rộng rãi trong vi sinh vật dưới dạng màu đỏ, cam, và vàng của các vi sinh vật, nấm mốc và nấm kỵ quang để giúp chúng chống lại tác hại do ánh sáng và oxy Carotenoid cũng được tìm thấy ở động vật như trong da hoặc vảy của một số loài cá (cá vàng, cá hồi), và các loài tôm…[11;13]

 Nhóm xanthophy là các dẫn xuất oxy của carotenoid nhƣ lutein và zeaxanthin.[15-17]

13 alpha carotene

Hình 1.11 : Một số carotenoid thường gặp

là crocin.[18;19]

1.4.3.2 Khả năng hấp thụ ánh sáng:

Hệ thống liên kết đôi liên hợp trong cấu trúc phân tử của carotenoid tạo thành nhóm mang màu có khả năng hấp thụ ánh sáng, nhóm này tạo cho carotenoid có những màu sắc hấp dẫn và từ đó xác định được các phổ hấp thu ánh sáng có ý nghĩ quan trọng trong việc nghiên cứu carotenoid Sự mất màu hay thay đổi màu sắc ở bất kỳ thời điểm nào trong suốt quá trình phân tích cho biết dấu hiệu của sự biến tính hay thay đổi cấu trúc của hợp chất đang nghiên cứu.[11; 14; 18; 19]

Hầu hết carotenoid hấp thu lớn nhất ở ba bước sóng, kết quả là trong phổ hấp thu thường xuất hiện ba mũi cực đại.[16; 17]

Năm 1915, phân tích về anthocyanin trong cánh hoa hồng được bắt đầu bằng những thí nghiệm cổ điển của Willstafter và Nolan về việc cô lập cyanin từ loài flores rosae gallicae rubrae đã làm khô.[6]

Năm 1934, pelargonin được tách ra đầu tiên từ loài hoa hồng đỏ cam „Gloria Mundi‟ (deRuiter, 1929).[6]

Năm 1961, peonin được cô lập từ loài R rugosa.[6]

Từ năm 1963 với việc kiểm tra những thuộc tính như là tan trong ether, khả năng nhuộm xanh với SbCl3, đã dẫn đến kết luận rằng có sự hiện diện của carotenoid trong hoa hồng.[6]

Năm 1967, qua thí nghiệm của William Allen Richardson (Ducher 1878) và Whisky Mac (Tantau, 1967) đưa ra nhận định tất cả các loài hoa hồng chứa rất nhiều flavonoid, cùng với carotenoid tạo màu sắc trong vùng hấp thu thấy được.[6]

Những copigment có thể là một trong những hợp chất flavonoid, kim loại và chính các anthocyanin.[51]

Năm 2009, công trình nghiên cứu của khoa sinh học trường đại học Shahed, Iran đã công bố kết quả về hoạt tính kháng ôxi hóa, hoạt tính kháng vi sinh vật của hoa hồng Rosa hemisphaerica Herrm kết luận rằng các hợp chất tách ra từ hoa này có hoạt tính kháng ôxi hóa mạnh, có khả năng chống ung thư, giúp giảm nguy cơ bệnh tim.[52]

Năm 2010, công trình nghiên cứu của khoa dược trường đại học Chiang Mai

50200, Thailand đưa ra kết quả về hoạt tính kháng ôxi hóa mạnh của các hợp chất phenolic của hoa hồng Thái Lan[53]; Công trình nghiên cứu của đại học quốc gia Chungbuk, Hàn Quốc tách các hợp chất dễ bay hơi và phenolic từ hoa hồng Rosa rugosa trắng, và ước lượng dược tính của sản phẩm thiên nhiên tách được này.[54]

được dung trong luận văn:

1.6.1 Phương pháp đo màu theo hệ CIE:

Năm 1931, Ủy Ban Quốc Tế “The Commission I nternationale d‟Eclairage” (CIE), đã đặt ra tiêu chuẩn cho cả hai yếu tố : Nguồn sáng và các quy đi ̣nh cho người quan sát CIE đã được Tổ Chức Chứng Nhâ ̣n Quốc Tế (ISO) thừa nhâ ̣n như mô ̣t tiêu chuẩn quốc tế

Việc nghiên cứu đặc tính của màu sắc theo một hệ thống là rất cần thiết trong đánh giá khách quan về sự khác biệt màu sắc cũng như hàm lượng các chất màu Các

hệ thống đo màu chủ yếu dựa trên sự cảm thụ màu sắc của mắt khi bị ánh sáng có các

16

cường độ và bước sóng khác nhau kích thích Hệ thống được sử dụng phổ biến để đánh giá màu sắc nói chung và các sản phẩm thực phẩm nói riêng là hệ thống CIE (Commision International de l‟Eclairage) Hệ này dựa trên cơ sở ánh sáng phản xạ từ bất cứ bề mặt có màu nào cũng có thể quy về hỗn hợp của ba tia màu: đỏ (red); xanh lá (green); xanh da trời (blue) với tỷ lệ thích hợp Dưới đây giới thiệu hai không gian màu thuộc hệ thống CIE được sử dụng phổ biến nhất:[42; 56]

1.6.1.1 Không gian màu CIE-Lab:

Hình 1.12 Không gian màu CEI-Lab

Để thuận lợi cho việc tính toán và so sánh các màu với nhau, năm 1976 CIE giới thiệu một hệ thống sắp xếp màu sắc CIE-Lab Trong đó sử dụng 3 thông số:

- L: độ sáng

- a: tọa độ màu trên trục đỏ-lục

- b: tọa độ màu trên trục vàng–lam

Giao điểm của 2 trục a và b là điểm vô sắc (đen, ghi, trắng tùy thuộc vào độ sáng) Những đoạn có cùng tông màu trong mặt phẳng ab nằm trên một đoạn thẳng kéo dài từ điểm trung tâm ra phía ngoài Trục độ sáng L có giá trị từ 0, ứng với màu đen

đến 100 ứng với màu trắng Những màu có cùng độ sáng nằm trên mặt phẳng song song với mặt phẳng giấy

17

1.6.1.2 Không gian màu CIE –LCh:

Không gian màu LCh sử dụng chung biểu đồ với không gian màu Lab nhưng

thay vì sử dụng trục tọa độ vuông thì nó lại sử dụng trục tọa độ hình trụ Trong không gian màu này L biểu thị độ sáng giống với L trong không gian màu Lab, C là cường độ màu và h là góc tông màu Giá trị góc tông màu h được xác định khởi điểm tại trục a và được tính bằng đơn vị độ Mắt người có thể nhận biết được sự khác biệt giữa hai màu sắc khi giá trị góc màu h của chúng khác nhau 1o Giá trị cường độ màu C bằng 0 ngay tại tâm và gia tăng tùy thuộc khoảng cách từ tọa độ màu đến tâm Ví dụ một chất màu

đỏ với độ pha loãng khác nhau cho màu từ hồng đến đỏ, các mẫu pha loãng này sẽ có cùng góc màu h nhưng giá trị cường độ màu C sẽ tăng dần

Các giá trị C và h được xác định từ a và b theo công thức:

b a

C  

Góc màu:  a

b

Giá trị sai biệt màu sắc trong 2 hệ thống trên được tính bằng giá trị ΔE Hai màu

có giá trị ΔE > 1 tương ứng với khoảng cách màu mà mắt có thể nhận biết được sự khác biệt màu sắc giữa 2 màu đó Khoảng cách màu nhỏ hơn 1, mắt không thể nhận ra

sự khác biệt màu sắc giữa 2 màu

Sự sai khác màu sắc ΔEH trong không gian màu Hunter Lab được xác định bằng công thức sau:

18

1.6.2 Phương pháp đo bằng quang phổ hấp thu UV- vis:

1- Nguồn (UV: deuterium; VIS : đèn W/I 2 ); 2- Bộ tạo đơn sắc; 3- Bộ chia chùm sáng; 4- Cuvet chứa mẫu; 5- Cuvet chứa dung môi; 6- Detector; 7- Bộ tự ghi

Hình 1.13 Sơ đồ máy quang phổ UV-VIS

Các thế hệ máy quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS spectrophometer) hiện nay thường gồm:

1.6.2.1 Nguồn sáng:

Thường dùng đèn hồ quang hydro nặng cho phổ ở vùng tử ngoại (180-400nm)

và đèn vonfram-halogen hoặc đèn thạch anh-iod cho phổ ở vùng khả kiến (trên 400nm)

 Bộ phận phân tách ánh sáng:

Các bức xạ do nguồn cung cấp được bộ tạo đơn sắc tách riêng thành từng dãy sóng hẹp (đơn sắc), được bộ phận chia chùm sáng hướng chùm tia đơn sắc lần lượt qua cuvet chứa dung môi và cuvet chứa mẫu Detector sẽ so sánh cường độ bức xạ đi qua mẫu ( IT ) và đi qua dung môi ( I0 ), chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện và tính toán định lượng dựa vào định luật Lambert – Beer

 Detector:

Sau khi xuyên qua mẫu, chùm ánh sáng đơn sắc được thu nhận bởi detector, bộ

tự ghi thường được nối với máy tính với các phần mềm chuyên dùng có khả năng tính toán, lưu giữ phổ, đối chiếu và so sánh khi cần thiết

Các máy UV – vis thường cung cấp cho ta đường cong A = f( ) hoặc A = f () hay T = f ( ) Phổ T = f ( ) chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thu mà không phụ thuộc vào nồng độ của chất đó như các phổ A = f ( ) hoặc A = ()

19

Các máy quang phổ UV – vis thông thường có khả năng ghi phổ trong vùng tử ngoại gần và vùng khả biến (200 – 800) và một số máy còn có thể đo đến vùng hồng ngoại gần (1000 nm ) Chỉ có các máy quang phổ đặc biệt mới đo được ở các vùng tử ngoại xa, còn gọi là vùng tử ngoại chân không (< 200 nm).[58; 59]

1.6.3 Phương pháp pH vi sai:

Phương pháp pH vi sai dựa vào sự chuyển đổi thành các cấu trúc khác nhau theo

pH của các sắc tố anthocyanin, dạng oxonium có màu tồn tại ở pH 1.0 và dạng hemiketal không màu ở pH 4.5, điều này thể hiện rõ qua phổ hấp thu khác nhau tương ứng

Hình 1.14: Phổ hấp thu của anthocyanin (acylated pelargonidin-3-sophoroside-5-glucoside)

trong dung dịch đệm pH 1 và pH 4.5 [60]

Khái niệm này được Sondheimer và Kertesz áp dụng lần đầu tiên vào năm 1948

để phân tích mứt dâu với hai dung dịch đệm pH 2.0 và 3.4 Năm 1968 Fuleki và Francis đã sử dụng dung dịch đệm pH 1.0 và 4.5 để xác định hàm lượng anthocyanin trong quả việt quốc (cranberry) Phương pháp bổ sung sau này đã được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm thương mại, trở thành phương pháp dễ dàng và nhanh chóng trong việc xác định hàm lượng anthocyanin Các nghiên cứu đã chứng minh rằng việc xác định hàm lượng anthocyanins bằng phương pháp pH vi sai và phương pháp HPLC cho kết quả tương tự nhau.[42; 60-62]

20

Dựa trên công thức của định luật Lambert-Beer:

C l I

Io

.

lg Trong đó:

I: Cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch;

I0: Cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch;

C: Nồng độ chất nghiên cứu, mol/l;

l: Chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua;

: Hệ số hấp thụ phân tử, mol-1 cm-1

1.6.4 Phương pháp DPPH:

DPPH là một từ viết tắt cho chất hữu cơ 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Nó là một tinh bột màu tím gồm các gốc tự do DPPH có hai ứng dụng lớn là theo dõi các phản ứng hóa học liên quan đến các gốc và là tiêu chuẩn của các vị trí và cường độ của các tín hiệu cộng hưởng điện từ thuận từ.[63]

Hình 1.15 DPPH

Tốc độ giảm của phản ứng hóa học khi bổ sung các DPPH được sử dụng như một chỉ báo về tính chất cấp tiến của phản ứng đó Bởi vì DPPH hấp thụ mạnh ở khoảng 520 nm, các gốc tự do DPPH có màu tím đậm và nó sẽ trở thành không màu hoặc màu vàng nhạt khi vô hiệu hóa Điều này cho phép giám sát trực quan phản ứng

và số lượng các gốc tự do ban đầu có thể được tính từ sự thay đổi trong sự hấp thụ

quang tại 520nm.[63]

21

Hình 1.16 Phổ Vis của DPPH trước và sau khi phản ứng với hoạt chất

Phương pháp sàng lọc sơ bộ khả năng bẩy gốc tự do thử nghiệm chống ôxy hóa dựa trên nguyên lý DPPH có khả năng tạo gốc tự do bền trong methanol bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào trong hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với mẫu đối chứng khi đọc trên máy đo độ hấp thu UV- vis ở bước sóng 517nm

Sử dụng DPPH đo lường sự quét gốc tự do được mô tả bởi Yen và Duh (1994), Yordanov và Christova (1997), Anderson và Padhye (2004), Iwashima et al (2005) DPPH là gốc tự do ổn định trong dung môi methanol Ở dạng oxy hóa, gốc tự do DPPH hấp thụ bước sóng cực đại tập trung ở khoảng 520nm (Molyneux, 2004) Phương pháp này được mô tả là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và thuận tiện phụ thuộc vào mẫu đối chứng so với nhiều mẫu sàng lọc về khả năng quét gốc tự do (Koleva et al 2001) Những thuận tiện này làm cho phương pháp DPPH được quan tâm dùng để kiểm tra với lượng nhỏ về khả năng quét gốc tự do của những chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và nhận ra những ứng cử viên hứa hẹn có tính thương mại.[64]

22 CHƯƠNG 2:

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

23

2.1 Nội dung nghiên cứu:

Mục đích chính của luận văn này là nghiên cứu chiết tách anthocyanin từ cánh hoa hồng làm tiền đề cho sự ứng dụng anthocyanin làm sản phẩm trong các ngành mỹ phẩm, dược phẩm…Nội dung nghiên cứu sẽ được thực hiện với các nhiệm vụ sau:

- Khảo sát điều kiện lưu trữ hoa

- Dựa vào phương pháp phân tích sơ bộ hóa thực vật, chọn loại hoa giàu anthocyanin

- Khảo sát các thông số ảnh hưởng lên quá trình chiết tách anthocyanin (nồng

độ EtOH, nồng độ citric acid, nhiệt độ, thời gian)

- Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của sản phẩm anthocyanin thu được và các sản phẩm phụ của nó bằng phương pháp DPPH

2.2.1 Xử lý nguyên liệu:

Cánh hoa hồng được thu từ phần thải của hoa chưng ở chợ Hồ Thị Kỉ, xử lí sơ

bộ sau đó cánh hoa được đem đi xay nhuyễn, rồi đo độ ẩm trước khi khảo sát

100 10

l

V F M A

Trong đó: A : độ hấp thu

M : phân tử khối của chất, g

V : thể tích dung dịch có chứa chất, ml

F : độ pha loãng dung dịch

m : khối lượng nguyên liệu, g

w : độ ẩm của nguyên liệu

Các dung dịch đệm được bảo quản trong chai kín ở nhiệt độ phòng Trước khi

sử dụng nên kiểm tra và chỉnh về đúng pH của phép đo

2.2.4.2 Tiến hành thí nghiệm:

Mở máy quang phổ và làm nóng máy 30 phút trước khi đo

Chỉnh đường nền bằng nước cất ở bước sóng từ 325 đến 700nm

25

Cân m g cao hoa hồng (hay Vml đối với dịch) hoà tan trong nước cất Cho dịch vừa pha vào cuvet và quét qua máy quang phổ với bước sóng từ 325 đến 700 (vì phổ hấp thu cực đại của anthocyanin nằm trong vùng thấy được từ 500 đến 550nm) Bước sóng hấp thu cực đại được ghi nhận là bước sóng tại đó độ hấp thu A đo được cao nhất

 Hàm lượng anthocyanin trong dịch trích:

Pha loãng dịch dịch trích ly thu được sau khi lọc (M d ) theo độ pha loãng DF xác

định ở phần trên bằng dung dịch đệm pH 1.0 (M1) và dung dịch đệm pH 4.5 (M2), để

mẫu đạt cân bằng trong 15 phút

Chỉnh điểm 0 cho máy quang phổ bằng nước cất tại các bước sóng (λvis max) và

 Hàm lượng anthocyanin trong cao rắn:

Cân m g sản phẩm cao, hoà tan rồi định mức thành 100ml (M c)

Pha loãng dịch M c theo độ pha loãng DF xác định như ở phần trên bằng dung dịch đệm pH 1.0 (M1) và dung dịch đệm pH 4.5 (M2), để mẫu đạt cân bằng trong 15

1.010

l

DF MW A



26

Trong đó

- A: mật độ quang (độ hấp thu của anthocyanin)

- A = (A λvis max – A 700nm ) pH 1.0 – (A λvis max – A 700nm ) pH 4.5

- MW = 449.2 g/mol : khối lượng phân tử của cyanidin-3-glucosdie

Lưu ý: Vì mẫu sau khi chuẩn bị có thể ổn định trong khoảng 1 giờ nên tất cả các phép

đo được thực hiện trong vòng từ 15 phút đến 1 giờ sau khi mẫu chuẩn bị xong

2.3.1 Khảo sát chế độ lưu trữ nguyên liệu:

Sau đó ghi lại các thông số L, a, b của chúng trong thời gian 10 ngày để khảo sát

độ biến đổi màu theo thời gian

Để kết quả đo được chính xác ta thực hiện đo ở 4 vị trí sau đó lấy kết quả trung bình

2.3.2 Nhận danh nhóm họ của các hoạt chất trong cánh hoa hồng bằng phương pháp phân tích sơ bộ hóa thực vật:

2.3.2.1.1 Hóa chất:

Diethyl ether : Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd

NaOH : Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd

27

H2SO4 : Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd

HCl : Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd

Cồn 90o : Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd

Bột Magie : Mec

Dịch có màu vàng Dịch có màu đỏ nâu Dịch có màu đỏ Dịch có màu xanh

Carotenoid Flavonoid Anthocyanin

Hình 2.1 Qui trình chiết tách để nhận danh các nhóm hoạt chất bằng phản ứng màu

Chiết

Lọc

Tách

Dịch Et2O

Chiết

mg cánh hoa

Chiết

Lọc

Tách H2O

V1ml dịch Et2O (Nhóm carotenoid và flavonol)

V2ml dịch nước (Nhóm anthocyanin)