SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁP CÓ ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG CHITOSAN THU NHẬN TỪ VỎ TÔM VÀ KHẢO SÁT MỌT SỐ YẾU TÓ ẢNH HƯỚNG HOẠT TỈNH ENZYME CÓ DỊNH

Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định đã cho thấy khả năng ổn định với nhiệt độ của enzyme protease được cố định bằng phương pháp liên kết đồng hóa trị r

1

L ỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

Các th ầy cô trong bộ môn công nghệ sinh học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt 4,5 năm qua

PGS.TS Nguy ễn Tiến Thắng và CN Đỗ Thị Tuyến đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập tại viện và đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại đây

Các anh ch ị phụ trách phòng các chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM

Toàn thể các bạn sinh viên cùng thực tập tại phòng các chất có hoạt tính sinh học đã hết lòng giúp đỡ và cung cấp nhiều kiến thức quan trọng

Cùng toàn thể lớp 08SH1N thân thiện đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Cuối cùng con xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn luôn ở bên cạnh con và động viên con trong suốt thời gian học tập tại trường

Tháng 1 năm 2009 Nguyễn Hoàng Anh

2

NGUY ỄN HOÀNG, Đại học Tôn Đức Thắng tháng 01/2009

SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG CHITOSAN THU NH ẬN TỪ VỎ TÔM VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG HOẠT

TÍNH ENZYME C Ố ĐỊNH

GVHD: PGS.TS NGUY ỄN TIẾN THẮNG VÀ CN ĐỖ THỊ TUYẾN

Phòng các ch ất có hoạt tính sinh học, viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM

Chitosan là một polymer sinh học được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt có nhiều trong vỏ của các loài động vật giáp xác như tôm, cua, tôm hùm,… Và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y, dược và công nghệ Với những đặc tính trên của chitosan, chúng

tôi đã tiến hành thu nhận chitosan từ vỏ tôm và sử dụng nó làm chất mang để cố định enzyme protease Kết quả thu nhận chitosan bằng phương pháp hóa học cho hiệu suất thu nhận cao (20%) và các đặc tính tốt (độ hòa tan 98%, độ deacetyl 80%, và độ nhớt 0,69 Pa.s) Thực hiện

cố định enzyme protease trên chất mang chitosan bằng hai phương pháp (liên kết đồng hóa trị

- covalent binding và nhốt trong gel – entrapment in gel) và khảo sát hoạt tính của enzyme cố định bằng phương pháp Amano Hiệu suất cố định hàm lượng protein và hoạt tính protease

lần lượt là: 89,45% và 87,08% (phương pháp liên kết đồng hóa trị); 54,07% và 53,55%

(phương pháp nhốt trong gel) Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của

enzyme cố định đã cho thấy khả năng ổn định với nhiệt độ của enzyme protease được cố định

bằng phương pháp liên kết đồng hóa trị rất cao (sau 100 phút ủ ở 600

C, hoạt tính còn giữ lại là 67,24%), tuy nhiên ở phương pháp nhốt trong gel thì enzyme protease cố định không có khả năng ổn định với nhiệt độ (hoạt tính còn giữ lại là 28,38% sau 100 phút ủ ở 600

C)

Từ khóa: chitosan, cố định, protease

4.1.3 Các y ếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân bằng enzyme 18

4

4.2.1 Định nghĩa Enzyme cố định (Enzyme không hòa tan) 21

4.2.3 Các y ếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme không hòa tan 22

4.2.4 Phân lo ại chât mang dùng đê tạo enzyme không hòa tan 23

5

5 Xác định hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn enzyme cố

10 Xác định độ deacetyl hóa bằng phương pháp dựa vào hàm lượng

14.1 Phương pháp gắn kết Enzyme protease với chitosan thông qua

14.2 Phương pháp nhốt Enzyme protease vào chất mang chitosan 47

15 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý đến hoạt tính enzyme

protease ban đầu, và enzyme protease cố định (EProtease cố định) 47

6

17 Khảo sát số lần tái sử dụng của Enzyme protease được cố định

18 Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease trong chế phẩm

19 Xác định hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn enzyme

protease cố định, hiệu suất cố định protein, và hiệu suất hoạt tính enzyme

19.1 C ố định trên chất mang chitosan bằng phương pháp gắn kết

19.2 C ố định trên chất mang chitosan bằng phương pháp nhốt 51

20 Xác định hoạt tính và hoạt tính riêng của enzyme protease cố

2 Kết quả quá trình cố định enzyme protease trên chất mang chitosan 53

2.1 K ết quả quá trình cố định enzyme protease trên chất mang

chitosan b ằng phương pháp gắn kết thông qua cầu nối GA (liên kết đồng

4 Hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn enzyme protease cố

định (EProtease cố định), hiệu suất cố định protein và hiệu suất hoạt tính Enzyme

5 Hoạt tính và hoạt tính riêng của Enzyme protease cố định (EProtease

7

6 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý đến chế phẩm enzyme

10 So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme protease ban đầu,

enzyme protease được cố định bằng phương pháp nhốt và được cố định

8

DANH SÁCH CÁC B ẢNG

Bảng 3.1 Dựng đường chuẩn albumine 25

Bảng 3.2 Tính hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitosan theo lý thuyết 33

Bảng 3.3 Tính hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitosan theo lý thuyết 34

Bảng 4.1 Hiệu suất thu hồi chitosan 44

Bảng 4.2 Hàm lượng protein và hoạt tính protease của enzyme protease ban đầu 47

Bảng 4.3 Hiệu suất cố định và hàm lượng protein có trong 1g chất mang trang 48

Bảng 4.4 Hoạt tính riêng của enzyme protease cố định (EProtease cố định Bảng 4.5 Hoạt tính enzyme protease ban đầu theo nhiệt độ 49

) 49

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease ban đầu 51

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát hoạt tính của enzyme protease ban đầu theo pH 52

Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme 55

Bảng 4.9 Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease cố định 56

Bảng 4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cố định theo pH 57

Bảng 4.11 Kết quả khảo sát hoạt tính của enzyme theo nhiệt độ 59

Bảng 4.12 Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease cố định 60

Bảng 4.13 Kết quả khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo pH 61

Bảng 4.14 Kết quả khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme protease cố định 63

Bảng 4.15 Kết quả so sánh độ bền nhiệt của enzym protease ban đầu với enzyme protease cố định bằng hai phương pháp 64

9

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của chitin 4

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của chitosan 5

Hình 3.1 Cấu tạo nhớt kế mao quản Ostwald 37

Hình 3.2 Nguyên lý gắn kết của Enzyme với chtiosan thông qua cầu nối GA 38

Hình 4.1 Chitosan được thu nhận từ vỏ tôm 42

Hình 4.2 Kết quả Enzyme protease cố định bằng phương pháp liên kết đồng hóa trị 44 Hình 4.3 Enzyme protease được cố định trong gel chitosan 44

Bi ểu đồ Biểu đồ 4.1 Hoạt tính của enzyme protease ban đầu theo nhiệt độ 48

Biểu đồ 4.2 Hoạt tính enzyme protease ban đầu theo thời gian ủ ở 600 Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme protease ban đầu theo pH 50

C 49

Biểu đồ 4.4 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo nhiệt độ 51

Biểu đồ 4.5 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo thời gian ủ 53

Biểu đồ 4.6 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme cố định theo pH 54

Biểu đồ 4.7 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme theo nhiệt độ 55

Biểu đồ 4.8 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme cố định theo thời gian ủ 56

Biểu đồ 4.9 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme protease cố định theo pH 57

Biểu đồ 4.10 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số lần tái sử dụng 59

Biểu đồ 4.11 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số lần tái sử dụng… Biểu đồ 4.11 Đường biểu diễn độ bền nhiệt của ba loại enzyme protease 60

Sơ đồ Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát để thu nhận chitosan từ vỏ tôm 32

Sơ đồ 3.2 Quy trình thu nhận chitosan từ vỏ tôm 33

CBB: Coomassie brilliant blue

Trong khi thế kỷ 19 và 20 lãnh vực công nghệ enzyme được phát triển chủ yếu là phát triển các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme từ nhiều nguồn khác nhau (động vật,

thực vật và vi sinh vật), thì thế kỷ 21 được xem là thế kỷ phát triển các phương pháp cố định Enzyme để tạo Enzyme không hòa tan

T ại sao lại cố định Enzyme và cố định nó như thế nào?

Đối với những enzyme hòa tan, chúng ta không thể nào ngừng quá trình phản ứng ở bất kỳ giai đoạn nào Hơn nữa, sau khi sử dụng enzyme hòa tan thường lẫn vào

sản phẩm phản ứng khó có thể tách ra được Nếu tách ra thì enzyme cũng bị vô hoạt,

hoặc chi phí rất tốn kém Do đó với một lượng enzyme nhất định chỉ có thể sử dụng trong một lần Để khắc phục tình trạng trên thì việc sử dụng enzyme cố định sẽ cải thiện phần nào những khuyết điểm của Enzyme hòa tan

Có nhiều phương pháp để cố định enzyme, trong đó việc gắn enzyme với một

chất mang không tan để tạo enzyme không hòa tan là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất Hiện nay cũng có nhiều chất mang (có bản chất là polyme vô cơ và hữu cơ) dùng để cố định enzyme và đã được thương mại hóa như agarose, cellulose,

polyacrylamide, polyester…

Trong các chất mang dùng để cố định enzyme thì chitosan là một dẫn xuất của chitin (là một polyme có nhiều trong tự nhiên (vỏ tôm, cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật) chỉ đứng sau cellulose về số lượng) được xem là có nhiều triển vọng trong việc cố định enzyme

và tế bào

Cũng có nhiều nghiên cứu trên thế giới sử dụng chitosan để làm vật liệu mang cố định nhiều loại enzyme như: “Cố định catalase trong chitosan để tháo H2O2 trong nước” của D.S Yoon và các cộng sự; “Ổn định Penicillin G Acylase bằng việc cố định trên chitosan được

hoạt hóa bởi glutaraldehyde” của W.S Adriano và các cộng sự Theo khuynh hướng đó chúng tôi thực hiện đề tài “Cố định enzyme protease bằng chitosan thu nhận từ vỏ tôm và khảo sát ho ạt tính của enzyme cố định”, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng và

CN Đỗ Thị Tuyến

12

Với đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ góp một phần nhỏ trong nghiên cứu sinh hóa cơ

bản và phát triển khả năng ứng dụng của chitosan trong việc cố định enzyme, vẫn còn là điều

mới mẻ với khoa học và sản xuất ở nước ta hiện nay

II Mục tiêu của đề tài

Thực hiện việc cố định enzyme protease trên cơ chất chitosan thu nhận từ vỏ tôm bằng hai phương pháp: liên kết đồng hóa trị và nhốt trong gel

1 M ục đích

Làm cơ sở để nghiên cứu ứng dụng chitosan làm chất mang để cố định nhiều loại enzyme khác nhau và trên quy mô công nghiệp

2 Gi ới hạn của đề tài

Do thời gian và thiết bị còn hạn chế nên bước đầu chỉ nghiên cứu cố định enzyme protease trên cơ chất chitosan ở quy mô nhỏ

3 N ội dung thực hiện

Thu nhận chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học

Sử dụng chitosan được thu nhận để cố định enzyme protease bằng hai phương pháp: liên kết đồng hóa trị và nhốt trong gel

Khảo sát các yếu tố hóa lý ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định

Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme protease được cố định bằng phương pháp

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

13

I Đại cương về chitin-chitosan

1 Giới thiệu về chitin-chitosan

Lần đầu tiên chitin được Henri Braconnot tìm thấy ở nấm vào năm 1811

Chitin là một polyme rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng thứ 2 sau cellulose Chitin

có cấu tạo tương tự cellulose, là một polymer của 2-acetomido-deoxy-β-D-glucose

Chitin tham gia vào thành phần cấu trúc của vỏ tôm, cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng thể rắn, có cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối

với nhau bằng các mối nối hydro và tạo thành một hệ thống sợi Trong tự nhiên chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do, mà gần như luôn luôn liên kết ở dạng phức hợp chitin – protein, chitin – canxicacbonat Điều này dẫn đến chitin khá bền với các hóa chất và các men thủy phân gây nhiều khó khăn cho việc tách chiết, tinh chế chúng

Năm 1859 giáo sư C.Rouget đã phát hiện ra chitosan dạng deacetyl của chitin khi xử

lý bằng kiềm đặc Từ đó đến nay nhiều nghiên cứu cơ bản và công nghệ về những hợp chất này đã được tiến hành

Động lực chính cho sự phát triển và ứng dụng chitin-chitosan là nó được điều chế dễ dàng từ nguồn nguyên liệu phế thải phong phú trong tự nhiên, hạn chế được ô nhiễm môi

trường, không độc tính đối với con người và khả năng tự phân hủy sinh học

Nói chung chitin – chitosan tồn tại khá phong phú trong tự nhiên, chúng có cả trong động vật và thực vật Đặc biệt trong động vật thủy sản (vỏ cua, tôm, ghẹ,…) có khoảng 25%

là chitin và protein, phần còn lại 75% là các chất vô cơ mà chủ yếu là carbonate calci Vì vậy

vỏ tôm, cua là nguồn nguyên liệu tốt để chúng ta sản xuất chitin – chitosan và các dẫn xuất

của chúng

2 Cấu trúc và tính chất của chitin

2.1 Cấu trúc phân tử của chitin

Từ những nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay bằng acid chlohydic đậm đặc đều cho kết quả là chitin có cấu trúc đa phân tử (polymer) đồng nhất từ các đơn vị N – axety – 2 – amino – 2 – deoxi – b – D – glucopyranozơ liên kết với nhau bằng liên kết β - C – 1- 4 – glucozit

CTPT: (C8H13O5N)n

14

Hình 1.1: C ấu trúc phân tử của chitin

2.2 Tính ch ất của chitin

Chitin ở thể rắn và có độ kết tinh cao do gốc – NHCOCH3 ở C2

Chitin là một polysaccharide bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong môi

trường acid

(cacbon số 2) làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch

Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong acid loãng, trong kiềm loãng, các thuốc thử Schweitzer và các dung môi hữu cơ như rượu, este,…nhưng nó hòa tan trong một

số dung dịch như hydrochloride, acid đậm đặc (acid nitric, formic, acid khan) Đặc biệt nó còn hòa tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và muối thixianat canxi [Ca(SCN)2

Chitin ổn định với các chất oxy hóa khử như KMnO

] tạo thành dung dịch keo

4, H2O2, NaClO hay [Ca(ClO)2

Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử gốc acetyl tạo thành chitosan

]… Lợi dụng tính chất này để khử màu cho chitin

3 C ấu trúc và tính chất của chitosan

3.1 C ấu trúc phân tử của chitosan

Khi xử lý chitin với kiềm đậm đặc đun nóng ta thu được chitosan Chitosan là một polysaccharide gồm các phân tử β – D – glucozamin liên kết với nhau bằng liên kết β – 1 – 4 – glucozid

CTPT: (C6H11O4N)n

Chitosan ở thể rắn, màu trắng ngà, không mùi, không vị, không tan trong nước,

kiềm, acid đậm đặc, nhưng tan trong acid loãng, tan t ốt trong dung dịch acid acetic loãng (0,5÷1,5%) tạo thành dung dịch keo, trong suốt Lợi dụng tính chất này của chitosan để thực

hiện cố định Enzyme bằng phương pháp nhốt

Chitosan là một poliamine, nó được xem như một polyme cationic có khả năng cho các ion kim loại nặng bám dính vào các bề mặt tích điện âm tạo ra phức chất với kim loại

và tủa xuống, loại các ion kim loại nặng ra khỏi dung dịch

Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các khuẩn gây bệnh như

E.coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất là nấm

Candida albicans

Chitosan có nhiệt độ nóng chảy là 309÷ 311 0

Chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp phụ tốt, tính chất

cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng cố định Enzyme qua cầu nối glutaraldehyde

C

Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod

và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính chitosan

Ngoài các tính năng trên của chitosan, nó còn được xem là nguồn nguyên liệu vô cùng quí giá để cho ra các dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, sinh học và bảo vệ môi trường…

3.3 Ứng dụng của chitosan

3.3.1 Trong công nghi ệp thực phẩm

Chitosan dùng để bảo quản hoa quả và rau tươi, bảo quản thực phẩm tươi sống Làm màng mỏng để bao gói bánh kẹo

16

Chitosan và muối của nó được dùng như chất tinh luyện nước ép từ trái cây như

nước táo, cà rốt, chất này làm thay thế chất củ như Silicasol, gelatin…

3.3.2 Trong m ỹ phẩm

Chitosan dùng làm chất phụ gia, làm kem bôi mặt, thuốc làm mềm da, làm tăng

khả năng hòa hợp sinh học giữa kem thuốc và da, cấu tạo thuốc định hình tóc, kem bôi lột da

mặt…

3.3.3 Trong y t ế

Ngành dược:

Chitosan dùng làm chất phụ gia rất tốt cho kỹ nghệ bào chế dược phẩm (keo

kết dính viên, tá dược độn, chất tạo màng, tạo nang mềm…)

Chitosan là chất mang polyme sinh học để gắn thuốc bằng liên kết cơ học hay hóa học nhằm tạo ra thuốc polyme có nhiều tác dụng mới Chitosan được coi là một hệ

thống vận tải thuốc khá lý tưởng

Bản thân chitosan và các dẫn xuất của nó được dùng làm thuốc chữa bệnh: Thuốc hạ cholesterol trong máu, thuốc chữa các vết thương, vết bỏng, thuốc chữa đau

dạ dày, thuốc chống đông tụ máu, thuốc dùng tăng cường miễn dịch cơ thể và khả năng

chống nhiễm HIV…

Ngành y:

Chitosan là vật liệu cho y khoa rất tốt như: Da nhân tạo, mô ghép, chỉ khâu

phẫu thuật tự tiêu, kem chữa bỏng, thuốc chữa lành nướu sau khi nhổ răng…

3.3.4 Trong nông nghi ệp

Chitosan được dùng như là một thành phần chính trong thuốc phòng trừ nấm (đạo

ôn, khô vằn…) dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cây trồng cho lúa, cây công nghiệp, cây

ăn quả, cây cảnh

3.3.5 Trong công ngh ệ hóa học

Chitosan được dùng để xử lý nước thải công nghiệp, có khả năng tạo phức với các kim loại nặng độc hại, dùng để lọc nước sạch tiêu dùng

3.3.6 Trong công ngh ệ sinh học

Chitosan được sử dụng làm chất mang để cố định enzyme và các tế bào

 Tóm lại, những polymer tự nhiên như chitosan ngày càng tỏ ra ưu việt, nhất là trong thời điểm hiện nay khi vật liệu hóa học đã mất dần tính hấp dẫn và khả năng phân hủy sinh học rất kém của nó Chitosan là vật liệu sinh học có nhiều hứa hẹn trong tương lai

4 Đại cương về enzyme protease và enzyme cố định

4.1 Đại cương về enzyme protease

tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất, nghĩa là phản ứng thủy phân bởi enzyme là

phản ứng đơn phân có thứ bậc 1 Trong quá trình phản ứng, các phân tử cơ chất ban đầu sẽ

phản ứng một cách độc lập, không phụ thuộc vào sự có mặt của các phân tử khác

O Sản phẩm)

Cần lưu ý: Trong quá trình thủy phân, phản ứng thủy phân cơ chất là phản ứng chính nhưng không phải duy nhất mà còn có một số phản ứng phụ Như: trong phản ứng thủy phân protein thành axit amin, các phản ứng phụ có thể là phản ứng phân huỷ axit amin thành các sản phẩm thứ cấp, phản ứng Melanoidin tạo thành các hợp chất màu…

+ Pancreatin gồm: trypsin, chymotrypsin và một số enzyme khác có ở tuỵ

tạng, chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tuỵ

+ Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch

18

Enzyme này chủ yếu có ở một số cây vùng nhiệt đới như: đu đủ, dứa, cây sung, articho và đậu tương

Ví dụ:

+ Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh

+ Bromelin có trong thân cây thơm và quả thơm xanh

+ Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả

 T ừ vi sinh vật

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này

có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và được

sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dược Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,…Harley (1960) đã phân

loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau: Protease serine, Protease kim

loại, Protease acid, Protease tiol

4.1.3 Các y ếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân bằng enzyme

 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng

độ enzyme Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ

cơ chất Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ

chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng

Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ chất, nồng

độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của quá trình phản ứng Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme

 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa

Hoạt độ của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và

hữu cơ khác nhau Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm giảm (chất kìm hãm) hoạt độ enzyme Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu

và thay đổi tùy từng chất, tùy từng enzyme

19

Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các protein

Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động Các chất này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại hoặc các

chất hữu cơ Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của enzyme một cách

trực tiếp hoặc gián tiếp

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ

giảm và dẫn đến mức triệt tiêu

Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ bị

giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính

Ngược lại, ở nhiệt độ 00

Ở nhiệt độ thấp (0-41

C, enzyme bị hạn chế rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt

độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp

0

Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzyme, ở khoảng 45

C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng Sự gia tăng

vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng

0C), vận tốc

phản ứng giảm do sự biến tính của protein Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở

80-1000

Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ

chất, pH, lực ion của môi trường

C

 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH của môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein-enzyme

Đa số enzyme bền trong khoảng pH = 5-9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các

yếu tố làm bền như: cơ chất, coEnzyme, Ca2+

Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ…

…

Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng có

một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepxin, protease axit của vi sinh vật,…) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10

20

 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài hay

ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ,… Thời gian

thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản

phẩm cần thiết của quá trình thủy phân Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt

Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể

 Ảnh hưởng của lượng nước

Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng Nước có ảnh hưởng đến tốc độ

và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme Vì thế, nước là một yếu tố điều

chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme, nó có thể tăng cường hoặc ức chế các phản ứng

do enzyme xúc tác

4.1.4 Ứng dụng

 Trong công nghi ệp thực phẩm

Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm quan, làm tăng giá trị sản phẩm Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội tạng động

vật để thuỷ phân làm mềm nguyên liệu hoặc thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các dạng

dịch thuỷ phân dễ hấp thu, dễ tiêu hoá

Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease

sử dụng để làm trong dịch quả, dịch bia tạo điều kiện cho quá trình lọc

Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm phomat

Sản xuất nước chấm: nước mắm, tương, chao,…

Protease dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của các sản phẩm

có giá trị thấp, như: dùng protease để thủy phân protein trong phế liệu công nghiệp thực

phẩm (xương, collagen,…) thành các dạng hoà tan thu dịch đạm thủy phân cho người

hoặc thức ăn chăn nuôi

Dùng protease để thuỷ phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá hoặc để tinh

chế guanin

 Trong công nghi ệp dệt

Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng, không ảnh hưởng đến độ bền của tơ

21

 Trong công nghi ệp phim ảnh

Protease được dùng để sản xuất gellatin phủ trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X-quang

 Trong công nghi ệp da

Protease được dùng để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lượng lông thu hồi và tỷ lệ thu hồi tăng 25-30% so với khi dùng phương pháp hoá học, da có chất lượng cao

 Trong công nghiệp sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm

Protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, thuốc đánh răng, để tẩy sạch các

vết máu mủ hoặc bổ sung protease vào kem bôi mặt, có tác dụng loại được các lớp biểu

bì chết, làm mịn da

 Trong công nghi ệp dược phẩm

Protease được dùng để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hoá, thuốc tiêu mủ ở các vết thương và giảm đau cho người bệnh

4.2 Đại cương về Enzyme cố định

4.2.1 Định nghĩa Enzyme cố định (Enzyme không hòa tan)

Enzyme cố định hay enzyme không hòa tan là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do Pha enzyme không hòa tan trong nước và được gắn với những polyme ưa nước có trọng lượng phân tử lớn (Michael Trevan) Các enzyme hòa tan được gắn với các polyme (chất mang) bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, nhờ quá trình gắn này mà enzyme chuyển từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan

4.2.2 Đặc điểm của Enzyme không hòa tan

Khi gắn enzyme hòa tan vào một số chất mang, enzyme này có những đặc điểm sau:

- Hoạt tính riêng của enzyme không hòa tan thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của enzyme hòa tan cùng loại Nguyên nhân là do:

+ Do ảnh hưởng điện tích của chất mang Khi gắn enzyme vào chất mang

có điện tích khác với điện tích của enzyme, cấu trúc không gian của enzyme có sự thay đổi ở mức độ nhất định Do đó sự tương tác của enzyme v à cơ chất chậm lại,

phản ứng xảy ra sẽ yếu hơn Mức độ giảm hoạt tính của enzyme phụ thuộc vào mức

độ thay đổi cấu trúc không gian của enzyme khi ta gắn chúng vào chất mang

+ Do enzyme bị nhốt vào một gel Khi enzyme đ ược nhốt trong gel nào

đó, gel sẽ bao lấy phân tử enzyme Do đó, sự tiếp xúc giữa trung tâm hoạt động của

- Enzyme không hòa tan có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng loại

vì chúng được bảo vệ bởi chất mang

- Enzyme không hòa tan có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm

hoặc acid so với pH tối ưu của enzyme hòa tan chứ không trùng với pH tối ưu của enzyme hòa tan cùng loại

- Enzyme không hòa tan có khả năng bảo quản tốt h ơn enzyme hòa tan cùng loại

- Enzyme không hòa tan có thể tái sử dụng nhiều lần Trong khi đó enzyme hòa tan chỉ có thể sử dụng một lần Đặc điểm này rất có ý nghĩa về kinh tế khi ta tiến hành các phản ứng theo qui mô công nghiệp

4.2.3 Các y ếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme không hòa tan

Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính

chất của enzyme ban đầu (enzyme hòa tan) Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme không hòa tan là:

 Bản chất và tính chất hóa học của chất mang

Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, độ

trương, điện tích, tính háo nước và kỵ nước,…đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzyme được liên kết, tính bền, và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định

Bản chất hóa học của chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo thành dẫn

xuất enzyme, và tới khả năng chất mang hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi trường

phản ứng

Dẫn xuất enzyme không tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme tan do

kết quả của sự định vị enzyme tạo nên Chất mang cũng có tác d ụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt nối liên kết hydrogen và liên

kết kỵ nước

23

 S ự khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác

Tốc độ khuyếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các yếu

tố:

Kích thước lỗ gel của chất mang polymer

Trọng lượng phân tử của cơ chất

Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do

Trong vấn đề này, đường kính lỗ của chất mang polymer và trọng lượng phân tử

của cơ chất đóng vai trò hàng đầu Song những hạn chế khuyếch tán không chỉ đơn giản

như vậy bởi vì còn có sự khác biệt nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do

 Ảnh hưởng của pH lên Enzyme không hòa tan

Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của enzyme cố định pH tối ưu của enzyme cố định có thể bị chuyển dịch về phía kiềm hay acid so với

pH tối ưu của enzyme hòa tan Sự chuyển dịch pH tối ưu là do ảnh hưởng của trường

tĩnh điện của chất mang tạo nên

4.2.4 Phân lo ại chất mang dùng để tạo enzyme không hòa tan

 Nh ững yêu cầu chung của một chất mang lý tưởng

Một chất mang lý tưởng cần có những tính chất sau đây:

+ Một chất mang lý tưởng sử dụng trong cố định enzyme điều trước hết

là cần phải rẻ Điều này có liên quan đến hiệu quả kinh tế của quy trình công nghệ

+ Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định Nhờ đó mà chất mang mới chịu được các điều kiện của môi trường như khuấy trộn, áp lực trong các quy trình sản xuất

+ Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường

phản ứng Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme Chất mang không gây

ra những phản ứng hấp phụ không đặc hiệu

+ Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công của

vi sinh vật

+ Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính

chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định enzyme, vừa tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính của enzyme cố định và số

lần tái sử dụng

24

+ Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể ở dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng…

 Phân loại chất mang

Tất cả các chất mang dùng trong cố đinh enzyme được chia làm hai nhóm: chất mang polymer hữu cơ; chất mang vô cơ

Chất mang là polymer hữu cơ, gồm hai nhóm: polymer tổng hợp và polymer tự nhiên

a Ch ất mang là các polymer tự nhiên

+ Chất mang polysaccharide: Là nhóm chất mang đang thịnh hành

và được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay, đó là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng

+ Agarose là vật liệu ổn định, đồng nhất và dễ dàng tạo hạt Tuy nhiên do vấn đề giá cả nên chỉ đ ược sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu và vì

mục đích y học

+ Cellulose và các dẫn xuất của chúng như CM-cellulose, cellulose có tính chất c ơ lý khá tốt, giá rẻ nh ưng lại không đồng nhất và ổn định nên chỉ được sử dụng ở dạng sợi và dạng vi hạt

DEAE-+ Alginate, carrageenan là hai vật liệu khá mới mẽ Cả hai vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2

+ Tinh bột là vật liệu rất phong phú và rẻ tiền Từ lâu, tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định enzyme như là lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase Tuy nhiên, có

nhược điểm là độ trương còn hạn chế và thiếu các nhóm chức năng, vì vậy khả năng cố định và hoạt tính enzyme còn thấp

dùng để nhốt tế bào, enzyme Tuy nhiên gel

của hai loại vật liệu này đều không ổn định trong môi trường có phosphate

+ Chitin và chitosan là một vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố định enzyme và tế bào Chitin và chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp phụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng cố định enzyme qua cầu nối glutaraldehyde Chitosan dùng để nhốt enzyme, tế bào trong khuôn gel khi xử lý với glutaraldehyde và sodiumtripolyphosphate, ferrocianur potassium… Cả chitin và chitosan đều có

một nhược điểm là tính chất kỵ nước, độ trương kém, diện tích bề mặt tiếp xúc

nhỏ

phản ứng miễn dịch với cơ thể khi sử dụng trên người và động vật

+ Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố định enzyme nh ư polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polystyrene, polyethylene ghép với vinyl

monomer,… Ưu điểm chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý

tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer

có thể điều chỉnh được kích thước siêu lỗ… Tuy nhiên các polymer tổng hợp

cũng bộc lộ những nhược điểm nhất định như một số có giá thành cao như polyacrylic, polyacrylamide; có khả năn g tương hợp sinh học kém và một

nhược điểm quan trọng nữa là do quá bền vững, không thể phân hủy trong tự nhiên vì vậy gây ô nhiễm môi trường

Các chất mang vô cơ: Ngoài các polymer được sử dụng làm chất mang còn có mốt

số chất mang vô cơ đã được sử dụng thương mại như sợi bông thủy tinh, silicum oxide, alluminium oxide, mangesium oxide Đây là những dạng oxide có cấu trúc siêu lỗ và có

khả năng hấp phụ tốt Nhược điểm của các vật liệu này là tan trong dung dịch kiềm có

+ Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)

+ Phương pháp hấp phụ vật lý (physical adsorption)

+ Phương pháp nhốt (entrapment)

+ Phương pháp khâu mạch (cross – linking)

 Các ph ương pháp tạo enzyme không hòa tan

a Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)

26

Chất mang để gắn enzyme phải thỏa mãn những yêu cầu nhất định sau:

+ Có độ hòa tan thấp và bền vững với các tác động cơ học, hóa học + Không gây tác dụng kiềm hãm đến enzyme

+ Không hấp thụ phi chọn lọc đối với các protein khác; chất mang trong

phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị là các polymer khác nhau + Chất mang tốt hơn cả là háo nước, vì chất mang kỵ nước có thể gây tác

dụng ức chế đến enzyme đã được liên kết

+ Việc gắn enzyme sẽ có hiệu quả hơn khi điện tích của enzyme và chất mang có dấu trái ng ược nhau Đồng thời, khi gắn phân tử enzyme riêng biệt

với nhau bằng liên kết cộng hóa trị thì ta phải làm thế nào để các nhóm thể

hiện hoạt tính của enzyme không bị tham gia phản ứng

+ Nguyên tắc của ph ương pháp này là enzyme được nối với chất mang thông qua “cầu” nối “Cầu” nối phải có kích th ước không lớn và có hai đầu,

một đầu gắn chất mang còn đầu kia gắn enzyme, đảm bảo liên kết vững chắc

của Enzyme với chất mang

Quá trình kết hợp với enzyme có thể xảy ra một giai đoạn nếu chất mang có

chứa các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzyme

Trường hợp ngược lại là quá trình xảy ra hai giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu để hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào các nhóm có

khả năng phản ứng hơn

+ Giai đoạn hai gắn enzyme vào chất mang đã được hoạt hóa

Tùy vào từng loại chất mang khác nhau mà ta sử dụng chất hoạt hóa nào cho phù hợp như hoạt hóa bằng cyanogen bromide cho vật liệu cố định có nhóm (-OH) được

thực hiện đầu tiên bởi Axen và Porath (1967), hoặc là hoạt hóa bằng azit với các vật liệu

cố định có nhóm chức (-COOH) được thực hiện đầu tiên bởi Mitz và các cộng sự

(1961)…

Phương pháp này thì không bị rửa trôi khỏi chất mang trong quá trình sử dụng,

do liên kết chặt chẽ với vật liệu cố định bằng liên kết cộng hóa trị nên tăng khả năng ổn định với sự thay đổi của nhiệt độ Nhưng do liên kết chặt chẽ enzyme với chất mang, nên cản trở hoạt động của phân tử enzyme, làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và

cơ chất, kết quả làm giảm hoạt tính của enzyme cố định Vật liệu cố định thường không tái sử dụng được, vì vậy phương pháp này chỉ thích hợp với những enzyme đắt tiền và

ổn định hoạt tính khi cố định

b Ph ương pháp hấp phụ vật lý (physical adsorption)

27

Phương pháp này khá là đơn giản, được sử dụng sớm nhất và được ứng dụng

rộng rãi để cố định enzyme Quá trình cố định là trộn lẫn dung dịch enzyme với vật liệu

cố định rồi ủ một thời gian cho phép, sau đó lọc và rửa phần enzyme không hấp phụ enzyme được cố định trên chất mang nhờ các liên kết yếu như: liên kết ion, liên kết hydro, liên kết Van der Waals,… Trong phương pháp hấp thụ vật lý thì hoạt tính

enzyme cố định thường cao, từ 50-100% Tuy nhiên hoạt tính không ổn định lâu dài, enzyme dễ bị giải hấp phụ do sự thay đổi pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme và các thành

phần ion

Một số vật liệu thường dùng là các vật liệu hữu cơ như: cellulose, agarose, chitin, phospholipid, hoặc là các vật liệu vô cơ như: Kaolin, Al2O3

Phương pháp khá đơn giản nên enzyme ít bị biến đổi, không chỉ cố định một

loại enzyme mà có thể cố định nhiều loại enzyme khác nhau Nhưng khả năng tiếp xúc

giữa enzyme và cơ chất bị hạn chế nên hoạt tính thường thấp, nhất là trong trường hợp

cơ chất có phân tử lượng lớn Ngoài ra vật liệu cố định không thể sử dụng lại

, Silicat

c Ph ương pháp nhốt (entrapment)

• Nh ốt trong cấu trúc mạng gel (entrapment in gel)

Đây là phương pháp khá đơn giản, enzyme ít bị biến đổi qua quá trình cố định

Để gói enzyme vào trong khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hóa các gel khi có mặt đồng thời enzyme Sau khi hoàn thành quá trình trùng hợp ta thu được enzyme bị nhốt trong các lỗ gel Gel đã có enzyme có thể nghiền nhỏ bằng cách đồng hóa hoặc ép qua rây có lỗ nhỏ rồi đem sấy ở nhiệt độ thấp Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1933) thu được bằng cách trùng hợp acrylamide với N, N-

metylenbisacrylamide Phương pháp này thường dùng gần đây do chất trùng hợp thu được dễ tạo thành hạt và tùy vào điều kiện tiến hành mà gel có độ xốp khác nhau Alginate và caraghehan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt, thuận

lợi để gói enzyme và tế bào Canxialginate là một trong những vật liệu thích hợp cho

phương pháp nhốt enzyme Hỗn hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dịch CaCl2

• D ạng các sợi tổng hợp (liposome)

để tạo hạt

Phương pháp này được thực hiện bằng việc trộn Enzyme vào chất mang, tạo

dịch lỏng, cho dịch lỏng này chảy tuần hoàn bên trong sợi do đó hạn chế sự phân cực bề

mặt và sự bịt lấp thường gặp ở các màng Phương pháp này được Dinelli (1972) tiến hành giống như tạo sợi xelluloza trong công nghiệp dệt Một nhũ tương của xelluloza triaxetate trong metylen clorua và Enzyme dạng dung dịch trong đệm có chứa glixerol

28

được ép qua một khuôn lọc dưới áp suất của Nitơ Các sợi ra khỏi khuôn được nhúng vào trong một cái bể đông tụ có chứa toluen, sau đó được làm khô trong chân không

• Dạng bao vi thể (microcapsul)

Enzyme được nhốt trong bao vi thể có màng bán thấm, màng này được tạo ra

từ các polymer có kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuyếch tán của Enzyme ra ngoài và đủ lớn để cơ chất thấm vào trong và cho sản phẩm khuyếch tán ra ngoài Vì Enzyme hoạt động trong môi trường dung dịch nên khả năng tiếp xúc giữa Enzyme và

cơ chất lớn hơn so với trường hợp nhốt trong cấu trúc mạng gel

• D ạng màng siêu lọc

Phương pháp này đơn giản, tương tự như nhốt trong bao vi thể Enzyme được

giữ trong màng siêu lọc Màng bán thấm này cho phép các cơ chất và sản phẩm có trọng

lượng phân tử thấp qua lại tự do, nhưng giữ lại Enzyme có trọng lượng phân tử cao

d Ph ương pháp khâu mạch (cross-linking)

Những chất có hai hoặc đa nhóm chức năng như: diisocyanate, glutaraldehyde, hexametylen diisocyanate được dùng làm cầu nối khâu mạch các phân tử Enzyme

Những Enzyme được khâu mạch tạo thành mạng lưới không tan trong nước Theo

phương pháp này thì hoạt tính enzyme cố định thường thấp, do các hợp chất khâu mạch

có thể liên kết không đặc hiệu vào trung tâm hoạt động của enzyme và enzyme bị liên

kết tạo thành một khối kém linh động

4.2.6 Ứng dụng của Enzyme không hòa tan

 Trong công nghi ệp

Ngày nay, nhiều quy trình ứng dụng enzyme cố định trong công nghiệp như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến sữa, sản xuất da, hóa chất…

+ Rượu bia: Các enzyme amylase, tế bào nấm men cố định enzyme được

sử dụng ở quy mô lớn

+ Chế biến sữa: enzyme lactase cố định để thủy phân lactose trong sữa + Năm 1969 Wilson đã sản xuất liên tục glucose bằng glucoseamylase cố định

+ Năm 1971 đã dùng Chimotrypsin liên kết cộng hóa trị với

carboximethyl cellulase làm đông tụ sữa thay cho renin đắt tiền

 Trong y h ọc

Enzyme cố định được ứng dụng nhiều trong y học, để chữa các bệnh di truyền

do thiếu enzyme hoặc hoạt độ enzyme yếu Năm 1954, Chung đã tạo được vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzyme, nhờ thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme

Enzyme L – asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả hơn

 Trong nghiên cứu khoa học

Năm 1967, điện cực enzyme đầu tiên đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucooxydase cố định Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt có gel polyacrylamide Nhúng điện cực vào dung dịch có glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ của phản ứng và nồng độ glucose

+ Kaetsu dùng điện cực urease để đo nồng độ urea trong máu, dùng cholesterol oxidase đo nồng độ cholesterol

+ Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn + Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng trong phương pháp sắc ký ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng chế phẩm tế bào cố định để xử lý nước

thải đạt hiệu quả

 Trong b ảo vệ môi trường

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường… chất thải,

phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu hữu cơ Do đó có

thể sử dụng enzyme cố định để xử lý nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra môi trường bên ngoài

4.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

4.3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Lịch sử nghiên cứu enzyme cố định bắt đầu từ năm 1916 khi Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng Enzyme invertase của nấm men khi hấp thụ vào than có khả năng

và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng ở quy mô pilot

Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghi ệm thành công việc nhốt các enzyme như amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào polyacrylamide

Năm 1969, Wilson đã xây d ựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định Cũng trong năm này Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku - Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzyme không hòa tan vào sản xuất công nghiệp

Từ những thành công bước đầu này đã m ở ra những ứng dụng to lớn của enzyme

và tế bào vào công nghiệp Một trong những bằng chứng thuyết phục là sử dụng enzyme glucoisomerase cố định trong sản xuất fructose từ glucose ở quy mô công nghiệp Theo số

liệu thống kê năm 1988 có khoảng 7 triệu tấn fructose siro (siro giàu fructose)/ năm được sản

xuất trên thế giới nhờ công nghệ này [5]

Và trong những năm gần đây đã có nhi ều nghiên cứu việc cố định enzyme trên

chất mang chitosan, điển hình là một số nghiên cứu sau đây: Ali KILINC và ctv (2001), đã nghiên cứu việc ổn định Papain bằng việc thay đổi với chitosan [12] Adriano và ctv (2005),

đã nghiên cứu việc ổn định Penicillin G Acylase bằng việc cố định trên chitosan đã được hoạt hóa bởi glutaraldehyde [11] Ehab Taqieddin và ctv (2002), đã nghiên c ứu việc cố định Enzyme Horseradish Peroxidase (HRP) bằng phương pháp vi nang trên chitosan kết hợp với alginate [13] Asta Zubriene và ctv (2003), đã nghiên c ứu việc cố định hydrolase lên trên các

vi hạt chitosan [14]

4.3.2 Tình hình nghiên c ứu trong nước

Ở Việt Nam, những nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn r ất hạn chế Năm 1994 – 1995, Viện sinh học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu cố định enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom

B2

Những năm gần đây, Phòng Công ngh ệ bức xạ, Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt

đã có nhiều công trình nghiên cứu cố định enzyme, tế bào và các chất có hoạt tính sinh học khác bằng kỷ thuật bức xạ Vỏ Tấn Thiện (1995), nghiên cứu cố định glucoamylase lên giá

hoạt hóa bằng glutaraldehyde Nguyễn Quang Tâm (2002) đã nghiên c ứu cố định pectinase thu nhập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) đã nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis…

31

thể polyhydroxy ethyl metrhcryla (PHEMA) bằng phương pháp polymer hóa bức xạ ở nhiệt

độ thấp; Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibro cholerea) lên giá thể PHEMA bằng

kỷ thuật bức xạ; Nguyễn Quốc Hiến (1996) đã nghiên c ứu chế tạo chế phẩm hormon progesteron thải chậm bằng kỷ thuật bức xạ; Lê Quang Luân (1997) đã c ố định vi khuẩn Pseudomonas maltophlla để xử lý chất hữu cơ nước: Nguyễn Anh Dũng (1999) đã nghiên cứu

cố định enzyme trypsin trong gel copolymer hóa ghép chitosan – PHEMA…

32

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Th ời gian và địa điểm tiến hành

+ Các hóa chất dùng để thu nhận chitosan: HCl, NaOH

+ Các hóa chất dùng để định lượng Protein theo phương pháp Bradford: coomassie brilliant blue G250; Ethanol; H3PO4

+ Các hóa chất dùng để xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano: Na

; albumin của hãng Merck

2HPO4.2H2O; NaH2PO4.7H2O; casein; TCA; Na2CO3

+ Các hóa chất sử dụng trong cố định Enzyme: Acid Acetic; TPP; Glutaraldehyde 25% (GA)

; thuốc thử Folin; tyrosine

III Các phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford

1.1 Nguyên tắc

biễu diễn sự biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml)

 Xác định hàm lượng protein trong mẫu

 Tương tự hút 1ml protein cần phân tích, thêm vào 2 ml thuốc nhuộm Bradford, để yên

10 phút, đem đo OD tại bước sóng 595nm

 Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích (OD595

2 Phương pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phương pháp Amano)

* Độ pha loãng của

mẫu)

2.1 Nguyên tắc

34

Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của Enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin

Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của Enzyme Hoạt động của Enzyme được biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính

thủy phân protein của Enzyme

 Xây d ựng đường chuẩn Tyrosin

Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml dung

dịch HCl

Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3

Thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp

0,4M vào 1 ml dung dịch Tyrosin đã pha trên

Trộn đều, để yên dung dịch ở 370

Đối với ống đối chứng: Dùng 1 ml HCl 0,1M thay cho Tyrosin Đo độ hấp thu

của dung dịch này ở bước sóng 660nm, ghi nhận kết quả là As

 Xác định hoạt tính Enzyme protease

Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của ∆OD theo nồng độ protease Đồ thị này gọi là đường chuẩn Tyrosin

Cho 1 ml dung dịch Casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 370

C ±0,50

Cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào lắc đều Đem ủ hỗn hợp này ở 37

C trong 10-15 phút

Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng enzyme

để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg Tyrosin trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm

) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn Tyrosin để xác định hoạt độ protease

Hoạt tính Enzyme protease (ĐVHT/ml)=

100

)(A m−A0 ×F×n

Hoạt tính Enzyme protease (ĐVHT/g)=

m

V n

F A

: độ hấp thu của ống đối chứng

n: hệ số pha loãng của enzyme

1/100: hệ số chuyển đổi

V: thể tích của dung dịch enzyme

m: khối lượng chế phẩm enzyme thô

3 Ph ương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số - Kjeldahl

3.1 Nguyên tắc

Chất đạm được vô cơ hóa bằng H2SO4đậm đặc và chất xúc tác thành muối

amonium sulphate (NH4)2SO4 Muối này đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH

36

Xúc tác, t(NH

0

4)2SO4 + NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SOSau đó lượng NH

O

2- là một bazơ mạnh, bởi vậy dung dịch của bình phản ứng chuyển từ màu tím

đỏ sang màu xanh lá mạ Lượng BO2được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm Xác định lượng BO2

Hòa tan 0.264 g methyl đỏ trong 250 ml cồn tuyệt đối

Hòa tàn 1.28 g bromocresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối

Trộn đều 2 dung dịch trên, bổ sung 96 ml HCl 0.25N Bổ sung đến một lít

bằng cồn tuyệt đối

Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị màu: làm tan 80 g acid boric trong 1000 ml nước cất, đun nóng một chút Để nguội và bổ sung 25 ml hỗn hợp chất chỉ thị màu rồi thêm nước cât cho đủ 2 lít

3.3 Cách tiến hành

Vô cơ hóa mẫu: cân 0.1g mẫu đã nghiền kỹ, thêm 5ml H2SO4

Chưng cất:

đậm đặc và 1g chất xúc tác cho vào bình Kjeldahl Sau khi thêm xúc tác đun nhẹ hỗn hợp, tránh sôi trào và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng Trong quá trình đun thỉnh thoảng

lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu nguyên liệu chưa bị phân

hủy còn sót lại trên thành bình Đun cho tới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng Khi

thời gian phá mẫu kết thúc, khoảng 3-4h, để nguội rồi chuyển toàn bộ vào bình chưng cất

37

Sau khi chuyển mẫu đã được vô cơ hóa vào bình chưng cất, bổ sung 30ml NaOH 32% Dịch chưng cất chuyển qua erlen có chứa sẵn 20ml dung dịch acid boric 4% có

chỉ thị màu

Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3

Thông qua lượng HCl 0.25N ta biết được lượng acid boric kết hợp với NH

(không làm thay đổi màu của giấy quỳ) Chuẩn độ bằng HCl 0.25N đến khi xuất hiện màu đỏ phớt

C: khối lượng mẫu đem xác định (g)

4 Xác định hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme

Hoạt tính của chế phẩm Enzyme được xác định bởi công thức sau:

∑ĐVHT: Số đơn vị hoạt tính Enzyme/g CPE

P: hàm lượng protein (mg/g CPE)

5 Xác định hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn enzyme cố định

Hàm lượng protein có trong 1 g chất mang gắn enzyme cố định được xác định bởi công thức sau:

1000

f f g

C V C V W

: Nồng độ protein của dung dịch enzyme protease trước khi cố định (µg/ml) f

6 Xác định hiệu suất cố định protein

: Trọng lượng của chất mang gắn enzyme cố định (g)

0 0

×

−

V E

V E V

8 Thu nhận chitosan từ vỏ tôm

: Thể tích enzyme còn lại sau cố định (ml)

8.1 Sơ đồ tổng quát

Việc thu nhận chitosan từ vỏ tôm gồm 2 giai đoạn chính:

+ Thu nhận chitin từ vỏ tôm

+ Deacetyl hóa chitin để tạo chitosan

Sơ đồ tổng quát như sau:

39

8.2 Quy trình thu nhận chitosan từ vỏ tôm

Việc thu nhận chitosan từ vỏ tôm được thực hiện theo quy trình trong khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu sản xuất chitosan từ phế liệu vỏ tôm” của sinh viên Đồng Thị Minh Trang (GVHD: TS Vũ Ngọc Bội; Th.S Nguyễn Thanh Mai) [2]