Nghiên Cứu Khả Năng Hấp Thụ, Tích Lũy Chì (Pb) Và Sự Biểu Hiện Gen Liên Quan Đến Tính Chịu Chì (Pb) Của Cây Phát Tài (Dracaena Sanderiana)

TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu khả năng hấp thụ, tích lũy chì Pb và sự biểu hiện gen liên quan đến tính chịu chì Pb của cây Phát tài Dracaena sanderiana” được thực hiện trên loài thực vật D

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

-

HỒ BÍCH LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ, TÍCH LŨY CHÌ (Pb) VÀ SỰ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN

TÍNH CHỊU CHÌ (Pb) CỦA CÂY PHÁT TÀI

(Dracaena sanderiana)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí minh - Năm 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

-

HỒ BÍCH LIÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ, TÍCH LŨY CHÌ (Pb) VÀ SỰ BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN

TÍNH CHỊU CHÌ (Pb) CỦA CÂY PHÁT TÀI

(Dracaena sanderiana)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Bùi Cách Tuyến

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chính tác giả Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và không sao chép từ bất kỳ một người nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Tác giả luận án

Hồ Bích Liên

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này, tôi đã

nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của tập thể Quý Thầy Cô, các cơ quan,

các anh chị và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ

lời cảm ơn chân thành đến:

GS TS Bùi Cách Tuyến và TS Huỳnh Văn Biết đã tận tình hướng dẫn,

giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm và kiến thức quý báo giúp tôi hoàn thành tốt

luận án

TS Bùi Minh Trí đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ thiết bị đo diệp lục tố và chia sẽ

nhiều tài liệu chuyên môn quý báu

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Thủ Dầu Một, Lãnh đạo Khoa Tài nguyên

Môi trường, Khoa Khoa học quản lý, Viện Phát triển Ứng dụng, tập thể Giảng viên

Bộ môn Khoa học Môi trường đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện để tôi học tập, thực

hiện và hoàn thành tốt luận án

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Phòng Đào tạo Sau

Đại học, Khoa Khoa học Sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường Trường

Đại học Nông Lâm TP.HCM đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi

trong quá trình thực hiện luận án

Tất cả bạn bè và đồng nghiệp những người luôn động viên, giúp đỡ chân

thành tôi trong quá trình làm luận án

Ba Mẹ và những người thân trong gia đình, chồng và các con đã luôn ủng hộ,

động viên và là điểm tựa tinh thần cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Nghiên cứu sinh

Hồ Bích Liên

TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu khả năng hấp thụ, tích lũy chì (Pb) và sự biểu hiện gen liên

quan đến tính chịu chì (Pb) của cây Phát tài (Dracaena sanderiana)” được thực hiện

trên loài thực vật Dracaena sanderiana Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng

sinh trưởng, tích lũy Pb và biểu hiện gen chống oxy hóa liên quan đến tính chịu Pb của

D sanderiana trong môi trường thí nghiệm nhiễm Pb nhân tạo, nhằm có cơ sở khoa

học về cơ chế đáp ứng ở mức độ phân tử và tế bào của tính chống chịu Pb để ứng dụng

D sanderiana trong xử lý ô nhiễm Pb Đề tài với các nội dung sau đã được thực

hiện: (1) Xác định cơ sở khoa học của việc chọn lựa vật liệu sinh học và pH của môi trường thích hợp cho nghiên cứu; (2) Nghiên cứu khả năng hấp thụ và tích lũy Pb

của D sanderiana ở các thời gian xử lý và nồng độ Pb khác nhau; (3) Đánh giá mức

độ biểu hiện của 3 gen chống oxy hóa glutathione S-transferase (GST), Cyt-Cu/Zn

superoxide dismutase (Cyt-Cu/Zn SOD) và glutathione peroxidase (GPX) ở các thời

gian và nồng độ Pb khác nhau Kết quả cho thấy:

Loài thực vật sử dụng nghiên cứu thích hợp nhất trong 3 loài Dracaena là Phát tài (Dracaena sanderiana) và pH dung dịch Pb thích hợp là 4,5 Sự sinh trưởng của D sanderiana bị ảnh hưởng không đáng kể ở nồng độ Pb 200 - 800 ppm

(khả năng chống chịu đạt 80,38 - 114,47%) Nhưng khi nồng độ Pb trong môi trường vượt ngưỡng gây độc (1000, 2000, 3000 và 4000 ppm), sinh trưởng của cây

sẽ kìm hãm Các chỉ tiêu về chiều cao cây, chiều dài rễ, sinh khối tươi và khô, hàm

lượng diệp lục tố và hàm lượng nước giảm đáng kể so với đối chứng D sanderiana

có khả năng hấp thụ và tích lũy trong cây 39235 mg/kg TLK Pb trong môi trường

có nồng độ Pb = 800 ppm Ngưỡng nồng độ gây độc của Pb trong nước đối với cây

D sanderiana được xác định là 1000 ppm Biểu hiện ngộ độc của Pb ở D sanderiana xuất hiện khi cây tiếp xúc với nước ô nhiễm Pb vượt ngưỡng chịu đựng

của cây Các triệu chứng điển hình như cây không tăng trưởng chiều cao, héo khô

cả lá và thân, rễ co ngắn lại

Phần lớn Pb hấp thụ được cây tích lũy chủ yếu trong rễ (chiếm 97,5%) Sự

tích lũy Pb trong cây giảm dần theo thứ tự rễ > thân > lá D sanderiana có thể được

xem là cây siêu tích lũy Pb vì có khả năng hấp thụ Pb cao hơn 500 lần, tích lũy Pb

cao hơn 1% trọng lượng cây Hàm lượng Pb tích lũy chủ yếu trong rễ nên D

sanderiana chỉ phù hợp cho cơ chế phytofiltration hoặc phytostabilization để xử lý

Pb trong môi trường ô nhiễm Pb phân bố chủ yếu trong gian bào và vách tế bào Ở

mức độ tế bào, D sanderiana có thể đã có một số phản ứng để đối phó với độc tính

Pb: Loại bỏ Pb ra khỏi tế bào chất bằng cách cô lập Pb trong gian bào; Liên kết Pb với các thành phần trên vách tế bào hoặc kết tủa trong gian bào; Làm dày vách tế bào, trung trụ và làm tăng đường kính ống mạch

Trên cây D sanderiana, lần đầu tiên đoạn trình tự của các gen chống oxy hóa GST, Cyt-Cu/Zn SOD và GPX với kích thước tương ứng lần lượt là 362, 221 và

202 bp đã được xác định Mức độ biểu hiện gen GST, Cyt-Cu/Zn SOD và GPX bị ức

chế ở nồng độ Pb vượt ngưỡng chịu đựng của cây (1000 ppm) Sự tăng biểu hiện gen xảy ra ở các nồng độ Pb 200, 400, 600 và 800 ppm có thể là nguyên nhân giúp

cây chống chịu tốt hơn với các tác động bất lợi của Pb Gen Cyt-Cu/Zn SOD và

GPX biểu hiện sớm và mạnh ở bộ phận rễ nơi có hàm lượng Pb tích lũy cao nhất

nhằm đáp ứng kịp thời với độc tố Pb Gen GST biểu hiện mạnh ở thân và lá của D

sanderiana đáp ứng cho sự vận chuyển Pb Gen GST biểu hiện mạnh ở thân hơn lá

có thể là lý do dẫn đến hàm lượng Pb tích lũy trong thân nhiều hơn trong lá

Từ khóa: Biểu hiện gen, cây Phát tài, chì, gen chống oxy hóa, sự tích lũy chì

SUMMARY

The thesis “Study on the lead absorption, accumulation and expression

profiles of lead tolerant genes in Dracaena sanderiana” was conducted on Lucky bamboo plant (Dracaena sanderiana) The objective of the research aimed to

evaluate the growth, the ability of Pb tolerance, Pb accumulation, and antioxidant

gene expression of D sanderiana under artificial Pb poisoning experimental

environment to supply scientific footing on molecular and cellular mechanisms of

Pb induced plant stress responses to apply D sanderiana in lead pollution

treatment Contents of the thesis were carried out: 1) Determining the scientific basis for the selection of suitable biological materials and the pH for research; 2) Examination of the growth and the capacity of Pb absorption and accumulation of

D sanderiana under different times and Pb concentrations conditions; 3) Evaluation

of expression level of 3 antioxidant genes GST, Cyt-Cu/Zn SOD, and GPX under

time, and Pb concentration dependent conditions The results showed that:

D sanderiana was the most appropriate plant among three species of Dracaena genus pH 4.5 was the most suitable value for this study The growth of

the D sanderiana was not significantly affected at Pb concentrations 200 - 800 ppm

(tolerance capacity was from 80.38 to 114.47%) However, when the concentrations

of Pb in the medium were higher than the tolerance limit of the plant (1000, 2000,

3000 and 4000 ppm), the growth of D sanderiana could be inhibited Plant height,

root length, fresh and dry biomass, chlorophyll content and water content were

significantly reduced compared with the control D sanderiana can accumulate up

to 39235 mg/kg Pb in the presence of Pb at 800 ppm The threshold limit of

Dracaena sanderiana was recorded at 1000 ppm of Pb in water When the

concentrations of Pb in the medium were higher than the tolerance limit of the plant,

poisoning expressions in Dracaena sanderiana appeared Typical symptoms

included reducing plant height growth, withering both leaves and stems, and shortened roots

The lead was accumulated mainly in the roots (approximately 97.5%), and

sanderiana plants decreased in the order of roots > stems > leaves D sanderiana

can be considered as a hyperaccumulator plant species because its capacity of Pb absorption was 500 times higher than control, and the Pb accumulation was 1%

higher than its weight The Pb content accumulated mainly in the roots, so D

sanderiana is suitable for phytofiltration or phytostabilization to treat lead in

polluted environments The Pb was deposited mainly in extracellular spaces and the

the cytoplasm, sequestering of Pb in extracellular spaces, binding of Pb to components of the cell wall, or precipitation of Pb in extracellular spaces;

For the first time, the sequences of the antioxidant genes GST, Cyt-Cu/Zn

SOD and GPX with sizes of 362, 221 and 202 bp, respectively, were identified in D sanderiana The expression levels of antioxidant genes GST, Cyt-Cu/Zn SOD and GPX were inhibited at Pb concentrations above a tolerance limit of the plants (1000

ppm) The enhancement of gene expression at Pb 200 - 800 ppm may have evolved

as part of the system protecting the cell from oxygen toxicity Cyt-Cu/Zn SOD and

GPX genes were early and strongly expressed in the root where accumulation and

deposition of Pb were highest This helps D sanderiana respond promptly to lead The significant enhancement of GST expression in stems and leaves of D

sanderiana that may be the way to transport lead to aerial plant parts The

overexpression of the GST gene may help the Pb concentration on stems greater

than in leaves

Keywords: Antioxidant gene, Dracaena sanderiana, gene expression, lead, lead accumulation

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

SUMMARY v

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi

DANH MỤC CÁC BẢNG xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH xiv

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 6

1.1 Các đặc tính của chì (Pb) và tình hình ô nhiễm Pb 6

1.1.1 Các đặc tính của Pb 6

1.1.2 Tình hình ô nhiễm Pb trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.1.2.1 Tình hình ô nhiễm Pb trên thế giới 7

1.1.2.2 Tình hình ô nhiễm Pb ở Việt Nam 8

1.2 Phương pháp sử dụng thực vật xử lý ô nhiễm (phytoremediation) 9

1.2.1 Định nghĩa 9

1.2.2 Phân loại 10

1.2.2.1 Phương pháp thu hút độc chất (Phytoextraction) 10

1.2.2.2 Phương pháp lọc độc chất (Rhizofiltration) 11

1.2.2.3 Phương pháp bay hơi (Phytovolatilization) 12

1.2.2.4 Phương pháp cố định độc chất (Phytostabilization) 12

1.3 Khả năng hấp thụ, tích lũy, phân bố và chống chịu pb của thực vật 13

1.3.1 Khả năng hấp thụ và tích lũy Pb của thực vật 13

1.3.1.1 Cơ chế hấp thụ Pb của thực vật 13

1.3.1.3 Thực vật siêu hấp thụ 14

1.3.1.4 Khả năng tích lũy Pb ở thực vật 16

1.3.2 Khả năng phân bố Pb của thực vật 17

1.3.3 Khả năng chống chịu Pb của thực vật 18

1.3.3.1 Cơ chế làm dày vách tế bào 18

1.3.3.2 Cơ chế cô lập Pb 19

1.3.3.3 Cơ chế chống oxy hóa 21

1.3.3.4 Cơ chế dẫn truyền tín hiệu trong chống chịu Pb của thực vật 23

1.3.4 Ảnh hưởng của Pb đến thực vật 24

1.4 Giới thiệu cây Phát tài (Dracaena sanderiana) 29

1.4.1 Phân loại thực vật và nguồn gốc phân bố 29

1.4.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái và sinh sản của Phát tài 29

1.4.3 Đặc tính đặc biệt của cây Phát tài 30

1.5 Gen, sự biểu hiện gen liên quan đến chống chịu Pb ở thực vật và kỹ thuật phân tử nghiên cứu biểu hiện gen 31

1.5.1 Các gen có liên quan đến chống chịu Pb ở thực vật 31

1.5.2 Sự biểu hiện gen liên quan đến chống chịu Pb ở thực vật 33

1.5.3 Kỹ thuật phân tử nghiên cứu biểu hiện gen 35

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 Tiến trình nghiên cứu 38

2.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 39

2.3.3.4 Tạo dòng gen GST, Cyt-Cu/ZnSOD, GPX và ACT trên vi khuẩn Escherichia coli DH5α 51

2.3.3.5 Ly trích DNA plasmid và giải trình tự gen 53

2.3.3.6 Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng Real-time PCR 54

2.3.3.7 Phân tích và đánh giá kết quả 55

2.4 Phân tích số liệu 56

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57

3.1 Cơ sở chọn lựa loài dracaena và khảo sát ph thích hợp cho nghiên cứu 57 3.1.1 Sự tăng trưởng và khả năng tích lũy pb của ba loài Dracaena trong điều

3.1.1.1 Sự tăng trưởng của ba loài Dracaena 57

3.1.1.2 Khả năng hấp thụ và tích lũy Pb của ba loài Dracaena 59

3.1.1.3 Khả năng loại bỏ Pb trong nước của ba loài Dracaena 60

3.1.2 Ảnh hưởng của ph đến khả năng hấp thụ và tích lũy pb của cây phát tài 63

3.1.2.1 Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng của cây Phát tài ở nồng độ Pb 100 ppm 63

3.1.2.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng hấp thụ và tích lũy Pb trong cây D sanderiana 65

3.2 Khả năng hấp thụ, tích lũy và phân bố chì (pb) của cây phát tài trong môi trường nhiễm độc Pb 67

3.2.1 Sự sinh trưởng của cây Phát tài 67

3.2.1.1 Sự tăng trưởng chiều cao cây Phát tài 67

3.2.1.2 Sự tăng trưởng chiều dài rễ của cây Phát tài 69

3.2.1.3 Sự tăng trưởng sinh khối tươi và khô của cây Phát tài 70

3.2.1.4 Sự tổng hợp diệp lục tố trong lá của cây Phát tài 72

3.2.1.5 Hàm lượng nước trong cây Phát tài 73

3.2.1.6 Khả năng chống chịu Pb của cây Phát tài 74

3.2.2 Khả năng tích lũy Pb trong cây Phát tài 75

3.2.2.1 Hàm lượng Pb tích lũy trong rễ, thân và lá của cây Phát tài 75

3.2.2.2 Khả năng vận chuyển Pb từ rễ lên thân, lá của cây Phát tài 81

3.2.2.3 Sự cân bằng Pb trong nước và trong cây và hiệu quả loại bỏ Pb của cây Phát tài 82

3.2.3 Sự phân bố Pb trong phạm vi tế bào của cây Phát tài 85

3.2.3.1 Sự phân bố Pb trong rễ 85

3.2.3.2 Sự phân bố Pb trong thân 88

3.2.4 Phản ứng của mô thực vật Phát tài trong điều kiện nhiễm độc Pb 91

3.2.4.1 Phản ứng của các mô ở rễ 91

3.2.4.2 Phản ứng của các mô ở thân 95

3.2.4.3 Phản ứng của các mô ở lá 99

3.3 Sự biểu hiện gen chống oxy hóa ở cây phát tài trong môi trường nhiễm

độc Pb 104

3.3.1 Kiểm tra sản phẩm RNA ly trích của các mẫu nghiên cứu 104

3.3.2 Khuếch đại trình tự gen chống oxy hoá ở cây Phát tài 104

3.3.3 Tạo dòng gen chống oxy hóa 105

3.3.5 Giải trình tự các gen chống oxy hóa 108

3.3.5.1 Trình tự gen GST 108

3.3.5.2 Trình tự gen Cyt-Cu/Zn SOD 111

3.3.5.2 Trình tự gen GPX 113

3.3.6 Đánh giá mức độ biểu hiện gen chống oxy hóa của cây Phát tài 116

3.3.6.1 Đánh giá mức độ biểu hiện gen GST 116

3.3.6.2 Đánh giá mức độ biểu hiện gen Cyt-Cu/Zn SOD 120

3.3.6.3 Đánh giá mức độ biểu hiện gen GPX 124

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 133

TÀI LIỆU THAM KHẢO 136

PHỤ LỤC 149