Thực hành hóa sinh Y học

ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH KHOA Y PHÂN MÔN HÓA SINH Lớp 20DYK1C Nhóm thực hành 3 Nhóm nhỏ 3 4 BÁO CÁO CUỐI KỲ MÔN THỰC HÀNH HÓA SINH Họ và tên học viên Lê Thị Minh Huệ MSSV 2000002762 Số ĐT 0931301873 E.

ĐỊNH LUẬT CƠ BẢN VỀ SỰ HẤP THU ÁNH SÁNG

Định luật Beer – Lambert

- Khi chiếu 1 chùm tia đơn sắc có bước sóng  và cường độ Io vào 1 dung dịch màu đồng nhất có nồng độ C, chiều dày lớp dung dịch mà ánh sáng chiếu qua (nghĩa là bề dày của vật liệu chứa dung dịch ví dụ như ống nghiệm, cóng đo, cuvette.) ký hiệu là L

- Khi đi qua dung dịch:

1 phần ánh sáng bị hấp thu (Ih)

1 phần ánh sáng bị phản xạ (Ip)

Phần còn lại (I) đi qua dung dịch

Mà Ip không đáng kể nên có thể coi như:

- Theo định luật Beer – Lambert, ta có:

𝐼 0 = 10 -kLC = T (transmittance): Độ truyền quang hay độ thấu quan, tính theo % Độ truyền quang là tỉ lệ phần trăm ánh sáng đi qua được dung dịch so với lượng ánh sáng ban đầu chiếu vào mẫu thử k: hệ số hấp thu, phụ thuộc vào bản chất màu và dung môi, bước sóng của chùm tia và nhiệt độ log 𝐼

Trong đo lường quang học, mật độ quang (OD - optic density) hay độ hấp thụ (A - absorbance) của dung dịch là cùng một đại lượng Các ký hiệu OD, A, D, ABS hay DO được dùng như các quy ước ký hiệu cho mật độ quang của dung dịch, tùy thuộc vào tài liệu hoặc thiết bị đo Việc nhận diện và đồng nhất các ký hiệu này giúp so sánh kết quả đo quang và diễn giải độ hấp thụ của mẫu một cách nhất quán.

Khi một chùm tia đơn sắc có cường độ Io chiếu qua dung dịch, ánh sáng sẽ được phân chia thành ba phần: một phần truyền qua dung dịch, một phần bị phản xạ lại và một phần bị dung dịch hấp thụ Mật độ quang ở đây thể hiện khả năng hấp thụ của dung dịch đối với phần ánh sáng bị hấp thụ.

Mật độ quang (độ hấp thụ) tỷ lệ thuận với hệ số hấp thụ k, nồng độ C của dung dịch và chiều dày L của lớp dung dịch mà ánh sáng chiếu qua, đồng thời nghịch với độ truyền quang Theo định luật Beer-Lambert, mật độ quang A được tính bằng A = k C L và độ truyền quang T liên hệ với A qua T = 10^(-A); do đó khi k, C hoặc L tăng thì A tăng và T giảm, cho thấy mối quan hệ nghịch giữa mật độ quang và độ truyền quang.

Lưu ý: Định định luật Beer - Lambert chỉ đúng với chùm tia đơn sắc, khi nồng độ các chất trong dung dịch là rất nhỏ

Ứng dụng định luật Beer – Lambert

- Tính chất hấp thụ ánh sáng được dùng để đo nồng độ các chất có màu hay có thể cho phản ứng màu

- Các giai đoạn của phương pháp đo màu:

▪ Thực hiện 1 dung dịch có màu chứa 1 chất cần định lượng với nồng độ biết trước (C o )

▪ Tiến hành phản ứng tương tự với 1 mẫu thử có nồng độ chưa biết (C)

▪ Đọc mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu thử

▪ Tính nồng độ của chất cần phân tích

Trong cùng một điều kiện thí nghiệm (có cùng k và L), mật độ quang tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch Do đó, khi so sánh C và Co và áp dụng quy tắc tam suất, ta có mối quan hệ giữa nồng độ các chất tham gia phản ứng theo tỷ lệ các hệ số cân bằng, từ đó có thể suy ra nồng độ của dung dịch sau phản ứng dựa trên mật độ quang quan sát được và nồng độ ban đầu.

Phương pháp định lượng đo quang

- Dựa trên cơ sở mật độ quang D của dung dịch với một chất có nồng độ C Ta có thể xác định

D bằng máy đo quang (photometer hay spectrophotometer)

Đặc điểm của máy đo quang là tia sáng sau khi đi qua dung dịch được chiếu lên tế bào quang điện (detector) để chuyển thành dòng điện; cường độ của dòng điện này được đo bằng một điện kế nhạy, sau đó được khuếch đại và truyền sang bộ phận ghi kết quả.

1 Nguồn sáng (ánh sáng trắng)

2 Bộ đơn sắc (kính lọc hay bộ cách tử) → lọc chùm tia đơn sắc

3 Buồng đo: chứa cóng đo riêng của máy

4 Đầu dò (detector, tế bào quang điện)

6 Bộ phận chỉ hiển thị kết quả: chỉ thị kim, hiện số, mode đo, Các hệ thống vi xử lý, chương trình cài đặt, → Máy sinh hóa bán tự động, máy sinh hóa tự động,

- Trong phép định lượng đo quang, thông thường thông qua kỹ thuật xét nghiệm, ta chuyển chất

X là chất cần xác định nồng độ và ở trạng thái không màu; khi phản ứng với thuốc thử R đặc hiệu, X chuyển thành hợp chất RX có màu Sau đó, đo mật độ quang của hợp chất RX bằng máy đo quang và xác định độ hấp thụ tại bước sóng xác định để phục vụ cho phân tích định lượng.

- Dung dịch đo quang phải trong suốt

- Xác định nồng độ C chưa biết của một chất:

✓ Bằng cách làm song song với ống chuẩn có nồng độ C0 đã biết: C = D.C 0

✓ Bằng cách lập 1 biểu đồ hoặc dùng hệ số factor: F = C 0

- Dùng mẫu trắng: Khi dung dịch đo có chứa các chất khác cũng hấp thụ các tia sử dụng

▪ Pha 1 mẫu trắng giống như chuẩn bị dung dịch đo (cho thuốc thử tạo màu nhưng không cho chất cần xác địch vào)

▪ Đo mật độ quang D của dung dịch đo đối chiếu với mẫu trắng

- Để xác định nồng độ C của chất X chính xác, cần có:

✓ Ống đo: chứa dung dịch chất X cần xác định nồng độ C + thuốc thử R  Dt

✓ Ống chuẩn: chứa dung dịch chất X có nồng độ Co + thuốc thử R  Do

✓ Ống trắng: thường chỉ có thuốc thử R  Dtr

D 0 C0 → Điều chỉnh lại công thức khi có Dtr :

- Bảng màu bổ sung: Để chọn đúng kính lọc màu hay tia đơn sắc trong phương pháp đo quang ta cần biết phổ hấp thụ của dung dịch

Màu của dung dịch phân tích

Vùng bước sóng gần đúng (nm)

Màu kính lọc thích hợp

Vùng bước sóng gần đúng của kính lọc ( nm)

Chàm ánh lục 480 - 490 Da cam 590 - 625

Da cam 590 - 625 Chàm ánh lục 480 - 490 Đỏ 625 - 750 Lục ánh chàm 490 - 500

Dung dịch xuất hiện màu lục ánh chàm do nó hấp thu màu đỏ, màu bổ sung đối xứng với đỏ trên vòng tròn màu Màu lục ánh chàm là kết quả của sự hấp thụ ánh sáng đỏ, để lại phần màu xanh lục pha chàm mà mắt thấy được Hiện tượng này dựa trên nguyên lý bổ sung màu và vòng tròn màu, giúp giải thích cách phân tích màu sắc trong thí nghiệm và tối ưu hóa nhận diện màu dựa trên phổ ánh sáng.

Do đó để đo mật độ quang D của dung dịch có màu lục ánh chàm c ần điề u ch ỉnh vùng bướ c sóng c ủ a kính l ọ c ở khoảng 625 – 750 nm.

NGUYÊN TẮC XÉT NGHIỆM HÓA SINH LÂM SÀNG THƯỜNG DÙNG QUA PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG

Phương pháp đo điểm cuối (End - point method)

Đây là phép đo mật độ quang D của dung dịch chất thử, được thực hiện trong suốt quá trình phản ứng diễn ra hoàn toàn từ thời điểm t0 bắt đầu cho tới thời điểm t kết thúc phản ứng.

- Có thể đo và tính kết quả bằng cách:

✓ So với chuẩn: đây là cách tính cho kết quả chính xác nhất

✓ So với hệ số factor (F = ΔA C 0

✓ So với biểu đồ mẫu Đồ th ị đườ ng chu ẩ n A = f(C)

- Kỹ thuật thực hiện: a) Phương pháp hóa họ c

- Dùng các phản ứng hóa học đặc hiệu cho các chất cần xác định

✓ Creatinin: phản ứng Jaffe, a.picric

✓ Ure: kỹ thuật Bousquet , dùng DAM (diacetyl monoxim)

✓ Protein : phản ứng biuret , dùng sulfat đồng/môi trường kiềm

✓ Cholesterol: phản ứng Liebermann - Burchard

✓ Glucose: dùng ortho - toluidine hoặc ph̉ản ứng khử Somogyi - Nelson … b) Phương pháp enzyme

- Dùng enzyme là thuốc thử tác dụng đặc hiệu, chuyên biệt trên cơ chất xác định

 Cho kết quả chính xác, xác thực hơn phương pháp cổ điển, hóa học, tiến hành nhanh, vi định lượng nên hiện nay được áp dụng rất phổ biến

- Ví dụ: Dùng glucose oxidase, urease, cholesterol oxidase, Để định lượng cơ chất tương ứng là glucose, ure, cholesterol,

Phương pháp đo động học (Kinetic method)

Đây là một phương pháp theo dõi động học cho phép quan sát liên tục quá trình diễn tiến của phản ứng qua các thời điểm t0, t1, t2, … trong miền tuyến tính của quá trình Phương pháp động học chuẩn (Standard Kinetic) — kỹ thuật động học hai điểm tại thời gian cố định để xác định các tham số và đặc tính động học một cách nhanh chóng và có độ lặp lại cao.

- Nồng độ chất phản ứng được tính so với mẫu chuẩn được làm song song trong từng loạt phản ứng

- Thường dùng đo hoạt độ enzym:

✓ Đo độ đục (vận tốc tạo thành sản phẩm trong một khoảng thời gian xác định thích hợp từ thời điểm t0 đến t1)

✓ Thường sử dụng các bước sóng vùng tử ngoại

Đo hiệu số mật độ quang trung bình trong 1 phút theo công thức C = ΔA/Δt, trong đó ΔA là sự thay đổi mật độ quang theo thời gian Từ các thời điểm t0, t1, t2, ta đo vận tốc tạo thành sản phẩm Hoạt tính enzyme được ước lượng bằng tích trung bình của các ΔD/phút với hệ số riêng của từng phản ứng (F), cho ra đơn vị UI/L.

 Xác định hoạt tính của các thông số enzyme (GOT, GPT, ALP, amylase, )

Giảm ABS: Xác định hoạt tính GOT, GPT Tăng ABS: Xác định hoạt tính amylase

Trị số đối chiếu (giá trị tham khảo) của các thông số xét nghiệm phụ thuộc vào loại kỹ thuật xét nghiệm, điều kiện tiến hành và nhiệt độ; ngoài ra các biến thiên sinh lý cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Vì vậy khi nhận định kết quả, người dùng nên lưu ý đến các yếu tố trên để đánh giá chính xác và đưa ra quyết định y tế phù hợp.

LIPID

ĐỊNH LƯỢNG TRIGLYCERID

→ Phương pháp đo điểm cuối bằng enzyme (Kỹ thuật CHOD – PAP)

- Triglycerid (TG) hay còn gọi là chất béo trung tính, là ester của glycerol với acid béo

✓ Dự trữ năng lượng trong cơ thể

✓ Cách nhiệt (tạo lớp mỡ dưới da giúp giữ nhiệt)

✓ Tạo lớp mỡ bao quanh một số cơ quan → có tác dụng bảo vệ, đệm cơ học chống va đập

✓ Tính hòa tan: Không tan trong nước, không tạo nhũ tương bền trong ether, acol nóng, chloroform, benzen,

✓ Không màu, không mùi, không vị

- TG có hai nguồn gốc: ngoại sinh (thức ăn) và nội sinh (do gan tổng hợp)

Lipid liên kết với protein đặc hiệu được gọi là apoprotein (apo), hình thành các phân tử lipoprotein (LP) Các lipoprotein này có khả năng hòa tan trong nước và đóng vai trò là dạng vận chuyển của triglyceride và cholesterol ở dạng ester trong máu, giúp chúng di chuyển qua lại giữa các mô để cung cấp năng lượng và cấu trúc tế bào.

Các lipoprotein (LP) có thành phần lipit và protein ở tỉ lệ khác nhau nên có tỉ trọng và độ di chuyển điện di khác nhau, từ đó có thể tách riêng và phân loại LP bằng các phương pháp siêu ly tâm hoặc điện di, và kết quả thu được thể hiện như hình bên dưới.

Tính chất và thành phần CM VLDL

Tỷ trọng < 0,95 0,95 -1,006 1,006 - 1,063 1,063 - 1, 210 Kích thước (nm) > 120 30 - 100 21 - 25 7 - 15

Triglyceride (TG) được dự trữ chủ yếu trong mô mỡ Khi nguồn năng lượng từ glucose cạn kiệt, cơ thể sẽ thủy phân glycogen cho đến khi nguồn dự trữ glycogen hết, sau đó chuyển sang khai thác nguồn năng lượng từ axit amin của cơ và TG dự trữ ở mô mỡ để duy trì các hoạt động sinh lý.

Trong mô mỡ, lipase phân hủy triglycerid thành glycerol và axit béo Axit béo tự do sau đó được vận chuyển trong máu và đưa đến các tế bào để sử dụng trong quá trình trao đổi chất.

Phân loại LP bằng phương pháp siêu ly tâm hoặc điện di Cấu tạo của các loại lipoprotein

Khi acid béo tự do tới gan và được đưa vào tế bào gan, chúng trải qua quá trình beta-oxi hóa để hình thành acetyl-CoA, chất này sau đó đi vào chu trình axit citric (chu trình Krebs) để tổng hợp năng lượng dưới dạng ATP.

TG có mặt ở máu và mô mỡ Trong máu, TG không được vận chuyển tự do do tính chất không tan trong nước mà được vận chuyển dưới dạng lipoprotein TG ngoại sinh được vận chuyển từ thức ăn về gan bằng chylomicron (CM), còn TG nội sinh được gan tổng hợp và vận chuyển từ gan ra ngoại biên bằng VLDL, một lipoprotein mật độ rất thấp.

- Triglycerid được định lượng sau khi thủy phân bằng enzym Lipoprotein lipase (LPL) Đây là phản ứng đặc hiệu

- Glycerol phosphoryl nhờ glycerol kinase (GK) tạo glycerol-3-phosphate Trong đó, Mg 2+ là cofactor của enzyme GK Đây là phản ứng đặc hiệu

- Glycerol-3-phosphat oxidase (GPO) oxi hóa Glycerol-3-phosphate thành peroxide (H2O2 ) Đây là phản ứng đặc hiệu

- Hydrogen peroxide, 4-aminoantipyrine và 4-cholorophenol dưới xúc tác của peroxidase

(POD) tạo ra sản phẩm có màu nhóm phenazone (phản ứng phát hiện)

- Chất chỉ thị là màu hồng của phenazone Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ TG trong máu

(tạo môi trường thích hợp cho các enzyme họa động) 40 mmol/l

- Dung d ị ch tryglyceride chu ẩ n 200 mg/dl ho ặ c 2.28 mmol/l

Thuốc thử niêm phong sẽ duy trì chất lượng cho đến ngày hết hạn in trên bao bì khi được bảo quản ở nhiệt độ 2–8°C, còn thuốc thử đã mở sẽ duy trì chất lượng khoảng 20 ngày ở nhiệt độ 18–22°C và cần tránh ánh sáng trực tiếp.

2.1.4 Khoảng tuyến tính – Cách tiến hành

Khoảng tuyến tính là phạm vi giá trị của nồng độ mẫu mà nồng độ tỷ lệ thuận với mật độ quang của dung dịch Khi nồng độ TG vượt ra ngoài giới hạn của khoảng tuyến tính, kết quả đo sẽ không còn chính xác và có thể dẫn đến sai số trong phân tích.

Trong thử nghiệm tuyến tính cho nồng độ triglyceride (TG), các mẫu có nồng độ cao được xử lý bằng phương pháp pha loãng để đưa về phạm vi tuyến tính và đảm bảo độ nhạy của phân tích, sau đó kết quả được nhân hoặc điều chỉnh bằng một hệ số phù hợp để khớp với chuẩn tham chiếu và cho kết quả cuối cùng có độ chính xác cao.

- Giá trị giới hạn: 10 - 1000 mg/dl

- Đọc đối chiếu so với mẫu trắng thuốc thử Chỉ cần một mẫu trắng thuốc thử cho mỗi đợt xét nghiệm

- Dùng pipet cho vào cuvet (1cm):

12 Ống đo Ống trắng Ống chuẩn

Thuốc thử R 1000àl 1000àl 1000àl

Dung dịch TG chuẩn - - 10àl

Huyết thanh/huyết tương 10àl - -

- Trộn đều và ủ trong 5 phút ở nhiệt độ 37 o C Đo mật độ quang của ống đo A(SAMPLE) và ống chuẩn A(STANDARD) so với ống trắng A(RBL) trong 60 phút

2.1.5 Cách tính toán kết quả

- Ta có công thức tính nồng độ TG: C = A (SAMPLE) − A (RBL)

C: Nồng độ TG trong huyết thanh (mg/dl)

A (SAMPLE) : Mật độ quang của ống đo (chứa huyết thanh và thuốc thử R)

A (STANDARD) : Mật độ quang của ống chuẩn (chứa dung dịch TG chuẩn có nồng độ 200 mg/dl và thuốc thử R)

A (RBL) : Mật độ quang của ống trắng (chứa thuốc thử R)

2.1.6 Giá trị tham khảo (trích từ bộ kit Centronic GmbH)

- Người lớn < 65 tuổi: < 200 mg/dl (< 2,3 mmol/l)

- Người lớn > 65 tuổi: < 365mg/dl (< 3,7 mmol/l)

Ngoài ra, Hiệp hội tim mạch Hoa Kỳ đưa ra các tiêu chuẩn đối với nồng độ triglyceride như sau:

Nồng độ mg/dl Nồng độ mmol/l Giải thích

< 150 < 1.69 Bình thường, nguy cơ thấp

150 - 199 1.70 – 2.25 Mức cảnh báo (Borderline high)

- Đại cương về TG (đã trình bày ở m ụ c 2.1.1 )

- Ý nghĩa lâm sàng: chỉ số triglycerid thường được chỉ định xét nghiệm trong các trường hợp rối loạn lipid máu, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, béo phì,…

Diễn giải lâm sàng (trích từ bộ kit Centronic GmbH)

Rối loạn chuyển hóa lipid

Cholesterol 200 - 300mg/dl Có, nếu HDL-C < 35mg/dl

- Trị số TG bình thường (tham khảo sách thực tập Hóa Sinh y học):

**Trị số bình thường theo số liệu Việt Nam: 112 ± 40 mg/dL (1.27 ± 0.45 mmol/L)

Những yếu tố nguy cơ liên quan đến tăng lipid huyết và các biến chứng của nó gồm tăng lipid huyết vô căn, xơ vữa động mạch, đái tháo đường nặng kèm nhiễm acid, viêm tụy cấp, nghiện rượu, cao huyết áp, nhược giáp, xơ gan do rượu, hội chứng Down, stress, có thai và chế độ ăn giàu glucid.

- Giảm trong trường hợp giảm  - lipoprotein huyết bẩm sinh, cường giáp, cường cận giáp, kém dinh dưỡng protein.

ĐỊNH LƯỢNG CHOLESTEROL TOÀN PHẦN

Cholesterol là thành phần quan trọng của lipit máu và có mặt ở hầu hết tế bào của cơ thể Cấu trúc của cholesterol gồm nhóm chức hydroxyl ở C3, liên kết đôi ở C5–C6 và một mạch nhánh gồm 8 carbon tại C17, tạo nên đặc trưng của phân tử sterol Nó đóng vai trò là thành phần nền của màng tế bào và là tiền chất cho tổng hợp nhiều hormone steroid Cholesterol được tìm thấy ở nhiều mô, đặc biệt là mô thần kinh, và có liên quan đến hình thành sỏi mật cũng như chức năng của thể vàng ở buồng trứng.

Trong quá trình trao đổi chất của cơ thể, cholesterol tồn tại ở hai dạng chính: tự do hoặc este hóa với acid béo Khoảng 25 - 40% cholesterol huyết tương ở dưới dạng tự do, 60 - 75% còn lại ở dạng ester hóa với acid béo Gan là cơ quan chủ yếu tổng hợp cholesterol và cũng là bộ phận duy nhất ester hóa cholesterol.

- Cholesterol là tiền chất của nhiều steroid có hoạt tính sinh học quan trọng: acid mật, muối mật, vitamin D, hormone sinh dục, hormone vỏ thượng thận

- Cholesterol được hình thành từ hai nguồn:

✓ Ngoại sinh (thức ăn): được vận chuyển từ ruột tới gan nhờ CM

✓ Nội sinh (cơ thể): tổng hợp chủ yếu từ gan, một phần mô mỡ, tuyến thượng thận; được vận chuyển bởi LDL, IDL, VLDL…

- Cholesterol được định lượng sau khi thủy phân bằng enzyme và oxy hóa tạo ra H2O2

Hydrogen peroxide, 4-aminoantipyrine và phenol dưới xúc tác của peroxidase (POD) tạo ra sản phẩm có màu nhóm phenazone

Trong cơ chế này, hai phương trình phản ứng đầu tiên là các phản ứng đặc hiệu được xúc tác bởi hai enzyme đặc hiệu là cholesterol esterase và cholesterol oxidase Phương trình phản ứng thứ ba đóng vai trò là phản ứng phát hiện, nhằm nhận diện và xác nhận sản phẩm sinh ra từ hai phản ứng đầu tiên Việc kết hợp ba phản ứng này tạo nền tảng cho quá trình phân tích cholesterol diễn ra một cách chính xác và hiệu quả.

- Cường độ màu của phức sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ Cholesterol ban đầu có trong mẫu

- Dung d ị ch cholesterol chu ẩ n 200 mg/l ho ặ c 5.17 mmol/l

Thuốc thử niêm phong sẽ duy trì chất lượng đến ngày hết hạn ghi trên bao bì nếu được bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C Đối với thuốc thử đã mở, cần tránh nhiễm bẩn và thời hạn sử dụng khoảng 28 ngày khi được bảo quản ở 18-22°C.

Trong thử nghiệm tuyến tính, nồng độ cholesterol được chuẩn ở 750 mg/dl (19,3 mmol/l) Các mẫu có nồng độ cao hơn phải được pha loãng theo tỷ lệ 1+2 với nước muối sinh lý (0,9%) Giá trị lặp lại và kết quả sau khi pha loãng được nhân với 3.

- Giá trị giới hạn: 4 - 750 mg/dl

- Đo đối chiếu với mẫu trắng thuốc thử (RBL) Chỉ cần một mẫu trắng thuốc thử cho mỗi đợt xét nghiệm

- Dùng Pipet cho vào cuvet (1cm): Ống đo Ống trắng Ống chuẩn

Thuốc thử R 1000àl 1000àl 1000àl

Dung dịch cholesterol chuẩn - - 10àl

Huyết thanh/huyết tương 10àl - -

- Trộn đều và ủ trong 5 phút ở 37 o C hoặc 10 phút ở 25 o C Đo mật độ quang của ống đo

A(SAMPLE) và ống chuẩn A(STANDARD) so với ống trắng A(RBL) trong vòng 5-60 phút

- Ta có công thức tính nồng độ cholesterol toàn phần:

C: Nồng độ cholesterol toàn phần trong huyết thanh (mg/dl)

A (SAMPLE) : Mật độ quang của ống đo (chứa huyết thanh và thuốc thử R)

A (STANDARD) : Mật độ quang của ống chuẩn (chứa dung dịch cholesterol chuẩn có nồng độ

200 mg/dl và thuốc thử R)

A (RBL) : Mật độ quang của ống trắng (chứa thuốc thử R)

- Ta có công thức tính nồng độ cholesterol toàn phần:

▪ Ở bước sóng 546nm: C = A(S) 840 (mg/dl)

▪ Ở bước sóng 500nm: C = A(S) 553 (mg/dl)

- Trong đó 840 và 553 là hệ số factor (F = C o

Ao ) do nhà sản xuất bộ kit cung cấp

Nghi ngờ > 220 mg/dl hoặc 5,7 mmol/l

Cao > 260 mg/dl hoặc 6,7 mmol/l

- Đại cương về cholesterol (đã trình bày ở m ụ c 2.2.1 )

Xét nghiệm định lượng cholesterol toàn phần cho biết tổng lượng cholesterol có trong máu người bệnh và được dùng để chẩn đoán cũng như theo dõi các rối loạn lipid máu, xơ vữa động mạch và tăng huyết áp Chỉ số cholesterol toàn phần còn hỗ trợ đánh giá chức năng gan và nguy cơ bệnh ở người béo phì, đồng thời là xét nghiệm quan trọng trong khám sức khỏe định kỳ ở người trên 40 tuổi nhằm theo dõi mức cholesterol và quản lý rủi ro tim mạch.

Chỉ số cholesterol toàn phần từ xét nghiệm phản ánh nguy cơ mắc bệnh tim mạch Do đó, mức cholesterol toàn phần được định lượng càng cao sẽ đồng nghĩa với nguy cơ mắc bệnh tim mạch càng lớn, theo tham khảo sách thực tập Hóa Sinh y học.

< 200 mg/dl :không có nguy cơ xơ vữa động mạch

200 - 250 mg/dl :nguy cơ vừa đối với bệnh mạch vành

250 - 300 mg/dl :nguy cơ cao đối với bệnh mạch vành

Ngoài ra, cần kết hợp với các thông số lipit và lipoprotein khác để đưa ra kết luận chính xác Ví dụ, cholesterol toàn phần dưới 200 mg/dL nhưng LDL-C cao, HDL-C thấp, triglyceride tăng hoặc ApoB bất thường có thể cho thấy nguy cơ tim mạch vẫn tồn tại và cần được đánh giá đầy đủ trên tổng thể các tham số lipid.

17 thì vẫn có nguy cơ

**Trị số bình thường theo số liệu Việt Nam: 185 ± 23 mg/dl (4.76 ± 0.59 mmol/l)

- Cholesterol tăng nguyên phát trong bệnh tăng cholesterol huyết gia đinh và tăng thứ phát trong các bệnh suy giáp, hội chứng thận hư, đái thao đường,…

Đặc biệt, mối tương quan tỷ lệ thuận giữa nồng độ cholesterol huyết và tần suất mắc bệnh động mạch vành đã được khẳng định qua nhiều nghiên cứu Theo khuyến cáo của Hội xơ vữa động mạch châu Âu, nguy cơ mắc bệnh động mạch vành tăng cao khi nồng độ cholesterol vượt quá 250 mg/dL, cho thấy việc kiểm soát cholesterol là yếu tố then chốt trong phòng ngừa bệnh tim mạch.

- Tỉ số: Cholesterol toàn phần / HDL-C < 4 là tốt nhất, ít có nguy cơ bệnh mạch vành.

ĐỊNH LƯỢNG HDL-C

- High Density Lipoprotein (HDL) là lipoprotein tỷ trọng cao, có kích thước nhỏ nhất trong các loại lipoprotein

HDL được hình thành tại gan và ruột non, được giải phóng dưới dạng nascent HDL (đĩa dẹp) gồm hai lớp phospholipid liên kết với các protein apolipoprotein và sau đó vào máu để vận chuyển tới các mô ngoại biên Tại mô đích, HDL nhận cholesterol tự do từ tế bào và ester hóa nó bằng cách gắn thêm một axit béo ở vị trí C3, quá trình này chuyển HDL-3 thành HDL-2 nhờ enzyme LCAT (lecithin cholesterol acyltransferase) có mặt trong máu và ở gan.

HDL là một lipoprotein giàu protein và apo chính của HDL là apoA-I HDL tham gia vận chuyển cholesterol từ các mô ngoại vi về gan (vận chuyển cholesterol ngược về gan); tại gan, cholesterol được HDL thoái hóa thành acid mật và được đào thải qua đường mật xuống ruột.

HDL cholesterol được xem là cholesterol “tốt” vì nó giúp vận chuyển cholesterol dư thừa ra khỏi tế bào ngoại vi và lớp nội mạc động mạch, từ đó bảo vệ thành mạch và ngăn ngừa xơ vữa động mạch Nồng độ cholesterol-HDL thấp ( 2,5 mg/dl) sẽ cho giá trị thấp hơn

3 Lượng hemoglobin cao hơn 100 mg/dl và lượng bilirubin cao hơn 10mg/dl sẽ ảnh hưởng tới kết quả xét nghiệm

4 Những điều kiện đã nêu của các bước ly tâm phải được tuân theo một cách nghiêm ngặt để có được kết quả đúng

**Cách tính nồng độ LDL-C (lipoprotein tỷ trọng thấp)

LDL Chol (mg/dl) = Cholesterol toàn phần – HDL Chol –

Tiên lượng tốt Mức nguy cơ tiêu chuẩn Chỉ thị nguy cơ

Nam > 65mg/dl 45-65mg/dl < 45mg/dl

N ữ > 55mg/dl 35-55mg/dl < 35mg/dl

- Đại cương về HDL-C (đã trình bày ở m ụ c 2.3.1 )

Ý nghĩa lâm sàng của HDL-C là nồng độ HDL-C trong máu có liên quan trực tiếp đến nguy cơ xơ vữa động mạch HDL-C cao mang lại lợi ích cho sức khỏe, giúp giảm nguy cơ các bệnh tim mạch; tuy nhiên, khi chỉ số HDL-C đạt mức quá cao bất thường, cần được đánh giá thêm để đảm bảo không có dấu hiệu bất thường chuyển hóa hoặc nguồn gốc bệnh lý khác.

- Khoảng 25% cholesterol huyết tương được vận chuyển trong HDL

- Giá trị bình thường của HDL-C >35mg/dl (trích sách Thực tập hóa sinh y học)

Giá trị HDL-C bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như hút thuốc lá, tuổi tác, giới tính và mức độ luyện tập Những yếu tố này có thể tác động lên nồng độ HDL-C trong máu theo nhiều hướng khác nhau Các nguyên nhân chính được ghi nhận làm tăng HDL-C gồm tăng α-lipoprotein máu, tập thể dục đều đặn, giảm cân và một số trường hợp gan mãn tính Để duy trì nồng độ HDL-C ở mức tối ưu, cần duy trì lối sống lành mạnh: bỏ hút thuốc, tập luyện đều đặn, quản lý cân nặng và theo dõi tình trạng gan.

Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra mối tương quan nghịch giữa HDL-C và tần suất mắc bệnh mạch vành HDL-C thấp được xem là yếu tố nguy cơ đáng kể cho bệnh mạch vành, đặc biệt khi HDL-C dưới 35 mg/dL, cho thấy nguy cơ ở cả nam và nữ cao hơn.

- Nồng độ HDL-Cholesterol trong máu < 40 mg/dl làm tăng nguy cơ các bệnh lý tim mạch

Ở ngưỡng nồng độ HDL-Cholesterol từ 40 mg/dl đến 59 mg/dl, nồng độ HDL-Cholesterol càng cao thì hiệu quả bảo vệ tim mạch càng tốt; mỗi khi HDL-Cholesterol tăng thêm 4 mg/dl sẽ làm giảm khoảng 10% nguy cơ các bệnh lý tim mạch.

Nồng độ HDL-Cholesterol trong máu được coi là cao khi vượt quá 60 mg/dl (tương đương 1,55 mmol/l) Ở ngưỡng này, nồng độ HDL cao có ý nghĩa giảm tỉ lệ các biến cố tim mạch và được Hội Tim mạch Mỹ xem là mức bảo vệ tim mạch có tác dụng rõ rệt.

Nồng độ HDL-Cholesterol rất cao (> 90 mg/dl) hiếm gặp và chủ yếu gặp ở những người mắc các bệnh lý di truyền hoặc rối loạn chuyển hóa Những trường hợp này được ghi nhận cho thấy HDL-C rất cao có liên quan tới tăng nguy cơ mắc các bệnh lý tim mạch.

ĐỊNH LƯỢNG LDL-C

- LDL-C là lipoprotein tỉ trọng thấp, hay còn gọi là cholesterol xấu, là một trong 5 nhóm lipoprotein chính

VLDL sau khi giải phóng triglyceride cho mô sẽ mất apoC và nhận cholesterol este, chuyển thành IDL IDL sau đó nhanh chóng thoái hóa thành LDL, dạng lipoprotein giàu cholesterol và cholesterol ester ApoB-100 là apo chính của LDL.

LDL đóng vai trò vận chuyển cholesterol từ gan tới các mô ngoại vi, cung cấp cholesterol cho hoạt động của tế bào và các quá trình sinh học thiết yếu Tất cả các tế bào, kể cả tế bào gan, đều có thụ thể nhận LDL-C và có thể hấp thu cholesterol thông qua các thụ thể này, nhưng nồng độ LDL-C được phép duy trì ở mức dưới 130 mg/dL.

Khi nồng độ LDL-C vượt quá ngưỡng cho phép (>130 mg/dl), gan và các tế bào ngoại vi không thể tiếp nhận thêm LDL-C, làm tăng tính thấm LDL-C vào lớp dưới nội mô thành động mạch và khiến LDL-C tích tụ tại đây Quá trình tích tụ này kích hoạt các phản ứng viêm, thu hút và tích tụ các tế bào hệ miễn dịch, mở đầu cho sự hình thành và phát triển của các mảng xơ vữa động mạch.

- LDL-C trong huyết thanh sẽ kết tủa sau khi thêm dung dịch đệm citrat

Sau ly tâm, VLDL (nồng độ lipoprotein rất thấp) và HDL-C (nồng độ lipoprotein cao) còn lại ở phần dung dịch nổi được định lượng bằng thuốc thử Centronic Cholesterol.

- Từ hiệu số giữa nồng độ Cholessterol toàn phần với nồng độ của VLDL và HDL-C trong phần dung dịch nổi sẽ tính được nồng độ của LDL-C

▪ Heparin 0.68 g/l tương ứng với 100.00 IU/l

Thuốc thử xác định cholesterol bổ sung của Centronic GmbH là bắt buộc để xác định nồng độ cholesterol trong phần dung dịch nổi cũng như nồng độ cholesterol toàn phần Việc sử dụng đúng thuốc thử này đảm bảo độ chính xác của phép đo và phù hợp cho các ứng dụng phân tích nồng độ cholesterol trong mẫu.

Lưu ý: Thuốc thử được đậy kín sẽ ổn định đến hết hạn sử dụng trên bao bì nếu được bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 o C

2.4.4 Khoảng tuyến tính - cách tiến hành

Khoảng tuyến tính (bộ kit không cung cấp)

Nhiệt độ: ủ ấm để tạo sự kết tủa ở 20 - 25 o C

- Dùng pipette cho vào trong ống ly tâm:

▪ Thuốc thử kết tủa LDL-C 1000 𝜇l

Trộn đều mẫu, để yên ở nhiệt độ 18–22°C trong 10 phút và tiến hành ly tâm ở khoảng 4000 rpm trong 15 phút Sau khi ly tâm, tách phần dung dịch nổi ở phía trên và tiến hành xác định nồng độ cholesterol của phần dung dịch nổi trong vòng 1 giờ sau khi ly tâm.

Bước 2: Xác định nồng độ cholesterol

- Dùng pipette cho vào cuvettes:

▪ Thuốc thử định lượng Cholesterol 1000 𝜇l

- Trộn đều, ủ trong vòng 10 phút ở 25 o C hoặc 5 phút ở 37 o C

- Đo mật độ quang của mẫu thử so với mật độ quang của ống trắng thuốc thử

- Ta có công thức tính nồng độ cholesterol trong phần dung dịch nổi: C = A A (S) o Co mg/dl mmol/l

- Theo bộ kit Centronic GmbH, ta có cách tính nồng độ cholesterol trong phần dung dịch nổi theo hệ số Factor như sau:

- Trong đó các giá trị 1000 và 7,21 … là hệ số factor (F = C o

 Nồng độ LDL-C = Cholesterol toàn phần – cholesterol trong phần dung dịch nổi

- Lưu ý: Những điều kiện đã nêu của các bước ly tâm phải được tuân theo một cách nghiêm ngặt để có được kết quả đúng

**Ngoài ra có thể tính nồng độ LDL-C khi biết nồng độ HDL-C và triglycerides:

LDL Chol (mg/dl) = Cholesterol toàn phần – HDL Chol –

Khả nghi 150 mg/dl hoặc 3.9 mmol/l

Cao 190 mg/dl hoặc 4.9 mmol/l

- Đại cương về LDL-C (đã trình bày ở m ụ c 2.4.1 )

- Ý nghĩa lâm sàng:LDL là “cholesterol xấu”, do đó giá trị của LDL trên kết quả xét nghiệm sinh hóa máu càng thấp càng tốt

- LDL-C có mối tương quan thuận với tần số chết do bệnh mạch vành

- Giá trị bình thường của LDL-C < 130 mg/dL (trích sách Thực tập hóa sinh y học)

▪ Nếu có thêm các yếu tố nguy cơ khác thì LDL-C cần giảm xuống < 100 mg/dl

▪ LDL-C là yếu tố rất mạnh gây xơ vữa động mạch

Đối với cholesterol LDL ở người lớn, kết quả từ 130–159 mg/dL được xem là ở mức giới hạn cao, 160–189 mg/dL ở mức cao và từ 190 mg/dL trở lên là rất cao Ở trẻ em, giá trị bình thường thấp hơn so với người lớn; LDL giữ ở ngưỡng dưới 110 mg/dL, mức giới hạn cao là 110–129 mg/dL, và từ 130 mg/dL trở lên là mức cao.

LDL-C, hay cholesterol xấu, có thể tăng lên do nhiều yếu tố liên quan đến chế độ ăn uống và lối sống Những thói quen như hút thuốc lá, ít vận động và chế độ ăn nhiều chất béo bão hòa có thể làm mức LDL-C cao hơn và gia tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch Bên cạnh đó, các bệnh lý như tăng huyết áp và đái tháo đường cũng là các yếu tố liên quan khiến LDL-C tăng và ảnh hưởng đến sức khỏe Việc chú ý ăn uống lành mạnh, bỏ thuốc lá, tăng cường vận động và quản lý các bệnh nền có thể giúp kiểm soát LDL-C hiệu quả và giảm nguy cơ biến chứng tim mạch.

PROTID

XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH GOT

→ Phương pháp đo động học đa điểm bằng enzyme

GOT hay AST là một enzyme xúc tác trao đổi amin (transaminase) có mặt ở nhiều cơ quan của cơ thể Nó xuất hiện chủ yếu trong tế bào gan và thận, ngoài ra còn có ở tim, cơ xương và não Khi một số bệnh hoặc mô của các cơ quan bị tổn thương, tế bào bị ly giải và phóng thích AST vào máu, làm nồng độ AST trong máu tăng cao.

Quá trình phản ứng chuyển nhóm amin được xúc tác bởi enzyme transaminase với sự tham gia của coenzyme pyridoxal phosphate (PLP, vitamin B6) PLP liên kết với lysine tại vị trí hoạt động của enzyme tạo aldimine nội tại; khi axit amin làm substrate đến, nhóm amino của nó thay thế lysine và hình thành aldimine ngoại tại giữa PLP và axit amin Quá trình isomer hóa dịch chuyển liên kết tạo thành ketimine và thủy phân để tạo alpha-keto acid của axit amin thứ hai và pyridoxamine phosphate (PMP) Phản ứng này là thuận nghịch: ở chiều ngược lại PMP và alpha-keto acid của axit amin thứ hai có thể hình thành ketimine và aldimine, giải phóng axit amin thứ hai và tái sinh PLP để chu trình chuyển amin tiếp theo.

Ở người bình thường, lượng transaminase trong huyết thanh rất thấp và ổn định Lượng enzyme này tăng lên khi tế bào bị tổn thương và mức tăng phụ thuộc thời gian sau tổn thương; sau vài ngày, nồng độ transaminase sẽ trở về bình thường Cụ thể, transaminase huyết thanh bắt đầu tăng lên trong 8 giờ đầu sau khi tế bào bị tổn thương, đạt đỉnh ở khoảng 24–36 giờ và trở về mức bình thường sau 3–7 ngày Khi tổn thương tế bào mang tính mạn tính, nồng độ transaminase trong máu luôn ở mức cao, vì vậy xác định hoạt tính của enzyme này trong huyết thanh là một xét nghiệm có giá trị trong đánh giá tình trạng bệnh gây tổn thương tế bào và mô.

GOT và ALT (hay còn gọi là glutamate-pyruvate transaminase, GPT) là hai enzyme aminotransferase đóng vai trò là chất chỉ điểm sinh hóa trong chẩn đoán tổn thương mô tim và mô gan Chúng đặc biệt hữu ích trong nhận định nhồi máu cơ tim, ngộ độc thuốc và nhiễm trùng Định lượng GOT và ALT trong huyết thanh cho phép đánh giá mức độ tổn thương và theo dõi diễn biến của tổn thương, từ đó hỗ trợ quyết định điều trị và tiên lượng cho từng bệnh lý.

- Phương trình phản ứng đặc hiệu:

- Sự tăng oxaloacetate được xác định bằng một phản ứng chỉ thị được xúc tác bởi enzyme MDH (Malate dehydrogenase) Đây là phản ứng phát hiện

Trong quá trình phản ứng, NADH bị oxy hóa thành NAD+, do đó tốc độ giảm của NADH và H+ tỉ lệ thuận với tốc độ hình thành oxaloacetate; nhờ mối liên hệ này, hoạt độ GOT có thể được xác định bằng cách đo sự giảm hấp thu của NADH trong mẫu thử, cho biết mức độ hoạt động enzyme GOT một cách nhạy và trực quan.

NADH, H + : dạng vận chuyển H + của NAD +

Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is a coenzyme whose adenine component is a purine derivative and whose nicotinamide moiety forms a six-membered ring This cyclic organic compound plays a key role in cellular redox reactions as the NAD+/NADH couple Many dehydrogenase enzymes require NAD+ as their essential cofactor to catalyze hydride transfer during oxidation-reduction processes.

▪ Dung dịch đệm TRIS pH = 7.8 (30 o C) 80.00 mmol/l

Lưu ý: Các thuốc thử được niêm phong sẽ bền cho tới ngày hết hạn sử dụng khi để tránh ánh sáng, bảo quản ở nhiệt độ 2 - 8 o C

Kho ả ng tuy ế n tính: 700 U/l ở bước sóng 334 hoặc 340 nm

- Đối với các giá trị cao hơn, nên lặp lại pha loãng 20𝜇l mẫu với 200𝜇l dung dịch NaCl sinh lý Trong trường hợp này nhân kết quả với 11

- Bước sóng: 334 hoặc 340 hoặc 365 nm

Tạo hỗn hợp phản ứng bằng cách trộn thuốc thử R1 với thuốc thử R2 theo tỉ lệ 5:1 và ủ ấm trước khi sử dụng Độ ổn định của hỗn hợp phản ứng là 15 ngày ở 2–8 °C hoặc 3 ngày ở 18–.

▪ Dùng pipet cho vào cuvet (1cm):

Hỗn hợp phản ứng 1000 àl

Trong quy trình này, có thể áp dụng phương pháp 1 hoặc phương pháp 2 tùy từng trường hợp Sau khi chọn được phương pháp phù hợp, tiến hành trộn đều và ủ trong 30 giây, sau đó đo sự thay đổi của mật độ quang trong ít nhất 3 phút Từ đó xác định ΔA/phút để đánh giá tốc độ biến đổi mật độ quang của mẫu.

- Đây là kỹ thuận động học enzyme, ta phải theo dõi liên tục quá trình diễn tiến của phản ứng qua 4 thời điểm A1, A2, A3, A4 trong thời gian 180 giây

- Thời gian đo: 3 phút (180 giây đếm ngược), không bao gồm thời gian ủ Tại thời điểm t1 là

Trong quá trình đo kéo dài 180 giây, mật độ quang được ghi nhận tại các thời điểm sau: A1 ở 180 giây, A2 ở 120 giây, A3 ở 60 giây và A4 ở 0 giây (kết thúc 180 giây).

- Công thức tính hoạt tính của enzyme GOT: U/L (37 o C) = A/phút Hệ số Factor

Hệ số Factor dùng cho cách 1 (for serum start)

Bước sóng λ 334 nm 340 nm 365 nm

Hệ số Factor dùng cho cách 2 (for substrate start R2)

Nam lên đến 38 U/l lên đến 0.63

Nữ lên đến 32 U/l lên đến 0.53

- Đại cương về GOT (đã trình bày ở m ụ c 3.1.1 )

Chỉ số GOT (AST) mang ý nghĩa lâm sàng quan trọng trong bệnh lý gan, là căn cứ giúp bác sĩ chẩn đoán các tổn thương gan và theo dõi quá trình cũng như hiệu quả điều trị các bệnh lý gan Bên cạnh đó, GOT còn có vai trò trong theo dõi và chẩn đoán bệnh lý cơ tim, cho thấy giá trị của GOT trong đánh giá sức khỏe tim mạch và toàn diện.

- Trị số bình thường (theo bộ y tế):

- Hoạt độ GOT có thể giảm trong các nguyên nhân chính sau:

▪ Nhiễm toan ceton do đái tháo đường

▪ Hội chứng ure máu cao

- GOT tăng trong các trường hợp:

▪ Các bệnh gan (tỉ số GOT/GPT 1): Xơ gan, Viêm gan do rượu, Xâm nhiễm gan (do di căn ung thư, nhiễm sarcoid, lao, u lympho, luput ban đỏ)

Các bệnh về tim bao gồm suy tim mất bù (gan xung huyết), viêm cơ tim và nhồi máu cơ tim, trong đó nhồi máu cơ tim có thể khiến các chỉ dấu sinh học tăng lên nhiều lần, có khi gấp 20 lần Đôi khi người bệnh cần các thủ thuật như bóp tim ngoài lồng ngực hoặc phẫu thuật tim và sau thông tim có thể gặp tỉ số GOT/GPT > 1, là một chỉ dấu đánh giá tổn thương gan liên quan đến bệnh tim Việc nhận diện sớm và điều trị phù hợp là cần thiết để giảm biến chứng và cải thiện tiên lượng.

▪ Viêm tuỵ cấp hoại tử

▪ Viêm đa cơ, viêm da và cơ

XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH GPT

→ Phương pháp đo động học đa điểm bằng enzyme

- Glutamate Pyruvate Transaminase (GPT) hay còn gọi là

Alanine aminotransferase (ALT), enzym này cũng thực hiện chức năng trao đổi amin (transaminase) tương tự như GOT

ALT (GPT) là enzyme chủ yếu tập trung trong tế bào gan (bào tương) Mặc dù không chỉ hiện diện ở gan mà còn có ở cơ vân và cơ tim, gan là nơi nồng độ ALT cao nhất Khi gan bị tổn thương, ALT được phóng thích vào máu khiến nồng độ enzyme này tăng lên Vì vậy ALT được xem như một chỉ số đặc hiệu cho tình trạng gan, hữu ích trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh lý gan.

- Sự gia tăng pyruvate được xác định trong một phản ứng chỉ thị được xúc tác bởi LDH

(Lactate dehydrogenase) Đây là phản ứng phát hiện

NADH bị oxy hóa thành NAD+ trong quá trình xúc tác, nên tốc độ giảm của NADH và H+ tỷ lệ thuận với tốc độ hình thành pyruvate Do đó, hoạt tính GPT có thể được xác định bằng cách đo sự giảm hấp thụ của NADH theo thời gian trong một assay, thông qua đo quang ở phổ hấp thụ đặc trưng của NADH Phương pháp này tận dụng mối liên hệ giữa quá trình oxy hóa NADH và sự hình thành pyruvate để ước lượng hoạt tính GPT một cách nhạy bén và định lượng, cho phép so sánh vận tốc phản ứng với nồng độ chất tham gia và điều kiện phản ứng.

NADH, H + : dạng vận chuyển H + của NAD +

NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotide) is a coenzyme built from an adenine unit derived from purine and a six-member nicotinamide ring It is an organic cyclic compound with the ability to absorb light, particularly in the UV range NAD+ functions as a key electron carrier in cellular redox reactions, cycling between NAD+ and its reduced form NADH in many dehydrogenase-catalyzed processes.

▪ Dung dịch đệm TRIS pH = 7.5 (25 o C) 70.00 mmol/l

Kho ả ng tuy ế n tính: 700 U/l ở bước sóng 334 hoặc 340 nm

- Đối với các giá trị cao hơn, nên lặp lại pha loãng 20𝜇l mẫu với 200𝜇l dung dịch NaCl sinh lý Trong trường hợp này nhân kết quả với 11

- Bước sóng: 334 hoặc 340 hoặc 365 nm

Để tạo hỗn hợp phản ứng, trộn thuốc thử R1 với thuốc thử R2 theo tỉ lệ 5:1 và ủ ấm trước khi sử dụng Hỗn hợp phản ứng có độ ổn định 15 ngày ở nhiệt độ 2–8°C hoặc 3 ngày ở nhiệt độ 18°C.

▪ Dùng pipet cho vào cuvet (1cm):

Hỗn hợp phản ứng (37 o C) 1000 àl

Có thể áp dụng cách 1 hoặc cách 2 tùy từng trường hợp Sau đó trộn đều hỗn hợp, ủ trong 30 giây, rồi đo sự thay đổi của mật độ quang học trong ít nhất 3 phút Tiến hành xác định ΔA/phút để đánh giá tốc độ biến đổi quang học của mẫu và phục vụ cho các phân tích tiếp theo.

- Đây là kỹ thuận động học enzyme, ta phải theo dõi liên tục quá trình diễn tiến của phản ứng qua 4 thời điểm A1, A2, A3, A4 trong thời gian 180 giây

Quá trình đo mật độ quang được thực hiện trong 3 phút (180 giây), không tính thời gian ủ Tại thời điểm t1 là 180 giây, đo mật độ quang A1; tại t2 là 120 giây, đo mật độ quang A2; tại t3 là 60 giây, đo mật độ quang A3; và tại t4 là 0 giây (kết thúc 180 giây), đo mật độ quang A4.

- Công thức tính hoạt tính của enzyme GOT: U/L (37 o C) = A/phút Hệ số Factor

Hệ số Factor dùng cho cách 1 (for serum start)

Nam lên đến 41 U/l lên đến 0.70

Nữ lên đến 31 U/l lên đến 0.50

- Đại cương về GPT (đã trình bày ở m ụ c 3.2.1 )

- Ý nghĩa lâm sàng: các transaminase (hay aminotransferase), alanin aminotransferase (ALT hoặc

ALT (alanine aminotransferase) và AST (aspartate aminotransferase) là các enzyme được giải phóng vào máu khi tế bào gan hoặc các tế bào khác bị tổn thương, cho thấy mức độ tổn thương và chức năng gan ALT chủ yếu tập trung ở gan, nên tăng ALT trong huyết thanh là dấu hiệu đặc hiệu cho tổn thương tế bào gan và thường nhạy hơn so với AST Trong khi đó, AST có mặt không chỉ ở gan mà còn ở tim, cơ vân, thận, não, tụy, phổi và cả bạch cầu, hồng cầu, nên mức tăng AST có thể phản ánh tổn thương ở nhiều cơ quan, không phải gan riêng biệt Do đó, xét nghiệm ALT và AST giúp đánh giá mức độ tổn thương gan và nguồn gốc của nó, với ALT cung cấp chỉ số đặc hiệu cho tổn thương tế bào gan.

- Trị số bình thường (theo bộ y tế):

- Hoạt độ GPT có thể TĂNG trong trường hợp:

▪ Các bệnh gan: viêm gan cấp (tăng nhiều, gấp 50-100 lần bình thường) và mạn (tăng gấp 5-6 lần bình thường), xơ gan, ung thư gan

▪ Các bệnh về tim: suy tim xung huyết, viêm màng ngoài tim, nhồi máu cơ tim

▪ Tai biến mạch máu não

▪ Viêm tuỵ cấp hoại tử

Hệ số Factor dùng cho cách 2 (for substrate start R2)

ĐỊNH LƯỢNG URE

→ Phương pháp đo động học 2 điểm bằng enzyme

- Ure là sản phẩm thoái hóa cuối cùng có chứa Nitơ của quá trình chuyển hóa protein trong cơ thể (qua chu trình Ure)

Ure được hình thành ở gan, đi vào máu và được thận đào thải qua nước tiểu Trong trạng thái bình thường, nồng độ ure trong máu từ 0,2–0,4 g/L (3,5–7 mmol/L) và lượng ure thải qua nước tiểu khoảng 15–20 g/24 giờ Lượng ure thay đổi tùy thuộc vào khẩu phần ăn giàu protein.

- Phản ứng 1: Enzyme urease thủy phân ure

- Phản ứng 2: Amoniac (NH3) được tạo thành phản ứng với -Ketoglutarate và NADH2 với sự hiện diện của enzyme GLDH (Glutamate dehydrogenase) để tạo ra Glutamate và NAD +

- Định lượng ure bằng cách đo sự giảm độ hấp thụ của NADH2

▪ Dung dịch ure chuẩn 50mg/dL (8.35 mmol/L)

3.3.4 Chuẩn bị mẫu: Huyết thanh, huyết tương hoặc nước tiểu Nước tiểu phải được pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1+100 Nhân kết quả với 101

Kho ả ng tuy ế n tính: lên đến 400mg/dl (66.7mmol/l)

Khoảng tuyến tính là phạm vi giá trị mà nồng độ mẫu tỷ lệ thuận với mật độ quang của dung dịch Khi nồng độ ure vượt ngoài giới hạn của khoảng tuyến tính, mối quan hệ giữa nồng độ và tín hiệu quang học bị lệch và kết quả đo sẽ không chính xác Đảm bảo độ chính xác của phân tích quang học đòi hỏi xác định giới hạn tuyến tính và thực hiện hiệu chuẩn với các mẫu ure có nồng độ phù hợp, tránh vượt quá khoảng tuyến tính để duy trì độ tin cậy của kết quả.

- Đối với mẫu thử có nồng độ cao hơn, nên pha loãng mới nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) theo tỉ lệ 1+2 Trong trường hợp này nhân kết quả với 3

- Đo: đối chiếu với nước, phương pháp động học 2 điểm

Để tạo hỗn hợp phản ứng, trộn thuốc thử R1 với thuốc thử R2 theo tỉ lệ 5:1 Độ ổn định của hỗn hợp phản ứng này là 20 ngày ở nhiệt độ 2-8°C hoặc 8 ngày ở nhiệt độ 18-22°C.

- Dùng pipet cho vào cuvette (1cm): Ống chuẩn Ống đo

Hỗn hợp phản ứng 1000 àl 1000 àl

Dung dịch ure chuẩn 10 àl -

Huyết thanh/huyết tương - 10 àl

- Trộn đều, đọc độ hấp thụ của ống đo A1(S) và ống chuẩn A1(STD) sau 60s ở 37 o C Tiếp tục, sau 60s tiếp theo, đọc chính xác độ hấp thụ của ống đo A2(S) và ống chuẩn A2(STD) Rồi tiến hành xác định:

- Ta có công thức tính nồng độ Ure: C = A (S)

- Trong đó, 50 là nồng độ của dung dịch ure chuẩn

Huyết thanh/ Huyết tương Urea-N

Tuổi mg/dl mmol/l mg/dl mmol/l

- Đại cương về ure ( đã trình bày ở m ụ c 3.3.1 )

- Ure là một chất không độc, nhưng sự ứ động của nó trong cơ thể kéo thường kèm theo sự ứ động những sản phẩm chuyển hóa độc như NH3

- Ý nghĩa lâm sàng: Định lượng nồng độ ure trong máu giúp chẩn đoán bệnh thận, bệnh gan và các trường hợp nhiễm trùng hoặc nhiễm độc

- URE huyết TĂNG CAO trong các trường hợp:

▪ Ngoài thận: Giảm lưu lượng máu đến thận, giảm lọc ở cầu thận (suy tim sung huyết, mất nước mất muối, mất máu ); tắc nghẽn hệ tiết niệu do sỏi, u tiền liệt tuyến ; tăng thoái hóa protein (chấn thương, bỏng, sốt)

▪ Tại thận: viêm cầu thận cấp; viêm ống thận cấp (ngộ độc, truyền nhầm nhóm máu); viêm thận mạn tính

- URE huyết GIẢM trong các trường hợp:

▪ Suy gan, xơ gan, viêm gan nặng cấp hay mạn tính làm giảm tổng hợp ure

▪ Chế độ ăn nghèo protein, hòa loãng máu, hội chứng thận hư…

▪ Hội chứng tiết ADH không thích hợp

▪ Hội chứng giảm hấp thu

- Một số bệnh lý liên quan:

Rối loạn chức năng thận, bao gồm rối loạn chuyển hóa và một số nguyên nhân khác, làm tăng urê huyết do thận không thể lọc và bài tiết ure hiệu quả Tình trạng này xuất hiện khi thận, cầu thận và ống thận bị tổn thương hoặc suy giảm chức năng lọc chất thải Nguyên nhân có thể là rối loạn chuyển hóa kéo dài, bệnh thận mạn, nhiễm độc, hoặc các yếu tố đi kèm như tiểu đường và tăng huyết áp Ví dụ phổ biến là viêm cầu thận, tổn thương cầu thận và tổn thương ống thận do độc tố, gây tích tụ ure trong máu Việc nhận diện sớm các yếu tố nguy cơ và tổn thương thận giúp kiểm soát urê huyết và ngăn ngừa biến chứng Đánh giá y tế và quản lý phù hợp là cần thiết để giảm urê huyết và cải thiện chức năng thận.

+ Bệnh viêm cầu thận cấp g/24h mmol/d

+ Viêm cầu thận bán cấp

▪ Ngoài ra còn một số bệnh khác

ĐỊNH LƯỢNG CREATININ

→ Phương pháp đo động học 2 điểm bằng enzyme

- Creatin là sản phẩm chuyển hóa chuyên biệt của 3 acid amin glycin, arginin và methionin Quá trình tổng hợp creatin xảy ra qua 2 bước:

▪ Tại thận: arginin tác dụng với glycin tạo guanidoacetat và ornithin Guanidoacetat theo máu tới gan

▪ Tại gan nó tác dụng với methionin ở dạng hoạt hóa S-adenosyl methionin (SAM) để tạo nên creatin Creatin được vận chuyển theo máu tới cơ

Trong cơ thể, creatine phosphate (creatine~P) liên kết với ATP để tạo nguồn năng lượng dự trữ cho hoạt động cơ bắp Khi cơ cần năng lượng cho quá trình co cơ, creatine phosphate bị thủy phân thành creatin và phosphate, giải phóng năng lượng cho cơ Sản phẩm thủy phân của creatine phosphate được khử nước và đóng vòng thành creatinine, chất đào thải được vận chuyển qua máu tới thận và thải hoàn toàn qua nước tiểu Nồng độ creatinine trong máu tăng lên cho biết tình trạng suy thận.

Sơ đồ tổng hợp creatin và tạo thành creatinin

Creatin được vận chuyển khoảng 98% đến cơ, trong đó 70-80% gắn với ATP trong ty thể của tế bào cơ và 20% tồn tại ở dạng tự do Khoảng 1,5% creatin chuyển hóa thành creatinin trong một ngày (tương đương 1,8 g) Lượng creatinin trong máu phụ thuộc vào khối lượng cơ, tuổi và giới tính (nam thường cao hơn nữ, vận động viên thường cao hơn người bình thường) Vì là sản phẩm thải hoàn toàn qua thận ra nước tiểu và không phụ thuộc chế độ ăn, creatinin thường được xét nghiệm song song với ure để đánh giá chức năng lọc của cầu thận.

- Trong môi trường kiềm, creatinin tác dụng với acid picric cho phức màu cam

- Mật độ quang của phức màu tỉ lệ với nồng độ creatinin trong mẫu

- Thu ố c th ử B: Picric Acid 15.7 mmol/l

- Dung d ị ch creatinin chu ẩ n 2mg/dl (176.8 mol/L)

Lưu ý: Thuốc thử được niêm phong bền cho tới ngày hết hạn sử dụng nếu được bảo quản ở nhiệt độ 18 - 22 o C

3.4.4 Chuẩn bị mẫu: Huyết thanh, huyết tương hoặc nước tiểu Nước tiểu phải được pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1+49 Nhân kết quả với 50

Kho ả ng tuy ế n tính: 20mg/dl hoặc 1768mol/l

Khoảng tuyến tính là phạm vi giá trị mà nồng độ mẫu tỷ lệ thuận với mật độ quang của dung dịch, cho phép suy ra nồng độ creatinin một cách chính xác Trong phạm vi này, kết quả đo được phản ánh đúng nồng độ thực của mẫu và đảm bảo tính tin cậy của phân tích creatinin Nếu nồng độ creatinin vượt ra ngoài giới hạn của khoảng tuyến tính, kết quả sẽ không chính xác và có thể dẫn đến sai lệch trong đánh giá mẫu.

Trong trường hợp giá trị creatinine vượt quá 20 mg/dL ở huyết thanh hoặc nước tiểu được pha loãng, xét nghiệm được lặp lại trên mẫu đã pha loãng ở tỉ lệ 1:5 bằng dung dịch NaCl sinh lý 0,9%, và kết quả thu được sẽ được nhân với 6.

- Phạm vi đo lường: 0,19 – 20 mg/dl

- Bước sóng: 492nm hoặc 500 nm

Để tạo hỗn hợp phản ứng, trộn thuốc thử A và thuốc thử B theo tỉ lệ 1:1 và để yên khoảng 30 phút trước khi sử dụng Độ ổn định của hỗn hợp phản ứng là 28 ngày ở nhiệt độ 2–8 °C hoặc 8 giờ ở nhiệt độ 18–22 °C.

- Dùng pipet cho vào cuvette (1cm): Ống chuẩn Ống đo huyết thanh/ huyết tương Ống đo nước tiểu

Hỗn hợn phản ứng 1000 àl 1000 àl 1000 àl

Dung dịch creatinin chuẩn 150 àl - -

Mẫu tương ứng - 150 àl 150 àl

- Trộn và ủ trong 60s ở 25oC hoặc 30s ở 37 o C Đo độ hấp thụ của ống đo A(S1) và ống chuẩn

A(STD1) Đo lại độ hấp thụ của ống đo A(S2) và và ống chuẩn A(STD2) chính xác sau 3 phút ở 25 o C hoặc 60s ở 37 o C

- Công thức tính nồng độ creatinin trong huyết thanh/huyết tương: C = A (S)

- Công thức tính nồng độ creatinin trong nước tiểu (pha loãng): C = A (S)

- Trong đó: 2 là nồng độ của dung dịch creatinin chuẩn (mg/dl);

100 là 2 nhân với 50 (hệ số pha loãng nước tiểu)

Huyết thanh/ Huyết tương mg/dl 𝛍mol/l

37 Độ thanh thải creatinin mL/phút

- Đại cương về Creatinin (đã trình bày ở m ụ c 3.4.1 )

Creatinin được lọc qua cầu thận, không tái hấp thu ở ống thận và được bài tiết vào nước tiểu Lượng creatinin bài tiết ra nước tiểu tương đối ổn định và không bị ảnh hưởng nhiều bởi chế độ ăn uống, vì vậy xét nghiệm creatinin huyết có tác dụng đánh giá chức năng lọc của cầu thận và theo dõi tiến triển của chức năng thận Mức ure huyết không đáng lo ngại khi creatinin huyết ở mức bình thường; nếu creatinin huyết tăng thì cần thăm dò chức năng thận kỹ hơn.

Creatinin huyết, creatinin niệu, độ thanh thải creatinin, ure huyết, ure niệu và ion đồ máu, ion đồ niệu là những thông số cơ bản trong việc xác định và theo dõi các trường hợp suy thận Chúng cho thấy khả năng thải lọc của thận, cân bằng điện giải và mức độ tích tụ ure trong máu cũng như các bất thường điện giải trong nước tiểu Việc thiếu bất kỳ thông số nào cũng sẽ làm cho việc đánh giá suy thận trở nên khó khăn và giảm độ chính xác của chẩn đoán cùng phác đồ điều trị.

- Trị số Creatinin bình thường trong huyết thanh/huyết tương (tham khảo sách thực tập Hóa

Sinh y học): nằm trong khoảng 6,6 - 14,4 mg/l (58 -127 mol/l)

- Trị số Creatinin bình thường trong nước tiểu:

- Lưu ý: Creatinin huyết thay đổi phụ thuộc sinh lý

Các yếu tố khác ảnh hưởng đến creatinin huyết gồm giảm khoảng 6% khi mang thai và khoảng 10% khi dùng thuốc chống động kinh; creatinin huyết tăng về đêm khoảng 5%, tăng khi tập thể dục mạnh khoảng 20%, tăng khi dùng thuốc lợi niệu khoảng 15%, và tăng khi dùng thuốc salicylat khoảng 40%.

- Creatinin huyết TĂNG trong các trường hợp:

+ Bệnh nội tiết có liên quan đến cơ: khổng lồ, to đầu chi

+ Suy tim ứ huyết, xuất huyết tiêu hóa, mất nước và muối khoáng

+ Dị tật bẩm sinh, lao hệ niệu, hẹp đường niệu do chấn thương hay viêm âm đạo

+ Tăng bạch cầu, cường giáp, thống phong (gout)

+ Rối loạn chức năng thận: viêm cầu thận, viêm ống thận cấp, suy thận cấp hay mạn,…

Creatinin là một chất có nitơ trong máu có mức độ ổn định và sự tổng hợp nội sinh của nó không bị ảnh hưởng bởi chế độ ăn hay sự thoái hóa protid Sự sản xuất creatinin hàng ngày thực tế phụ thuộc duy nhất vào khối lượng cơ Do đó, nồng độ creatinin huyết giảm ở các bệnh cơ và bệnh liệt.

- Creatinin niệu TĂNG trong các trường hợp:

+ Thay đổi sinh lý: creatinin niệu tăng khi đói, kinh nguyệt, có thai, sau sinh

+ Thay đổi bệnh lý: creatinin niệu tăng khi có phân hủy cơ (bệnh cơ vô căn, cường giáp, tiểu đường kèm rối loạn dinh dưỡng, bại liệt

- Creatinin niệu GIẢM trong trường hợp suy thận

- Độ thanh thải creatinin (C) được tính theo công thức:

U: nồng độ creatinin trong 1 ml nước tiểu

V: thể tích nước tiểu thải ra trong 1 phút

U x V: lượng creatinin được thải ra trong 1 phút

P: nồng độ creatinin trong 1 ml huyết tương

- Độ thanh thải creatinin bình thường là 2 ml/s + 0,3 = 95-105 ml/min Dựa vào độ thanh thải creatinin có thể tiên lượng trình trạng suy thận:

C > 0,83 ml/s: suy thận có thể hồi phục

< 0,17 ml/s: phải loại bỏ thận hoặc ghép thận

- Ý nghĩa khi sử dụng độ thanh thải creatinin

Trong quá trình ghép thận, việc theo dõi chức năng thận hàng ngày là rất quan trọng Cần xác định độ thanh thải creatinin nhằm đánh giá khả năng lọc của thận được ghép và phát hiện sớm những thay đổi chức năng sau phẫu thuật Khi độ thanh thải creatinin giảm đáng kể, đó được xem là một trong những dấu hiệu đầu tiên của sự thải ghép.

▪ Trong việc theo dõi ảnh hưởng gây độc của thuốc điều trị: cần đo liên tục creatinin để theo dõi độ lọc cầu thận

▪ Ở bệnh nhân suy thận mạn: khi độ thanh thải creatinin 7 mg/dl) có ý nghĩa lâm sàng

✓ Giảm hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT): hội chứng Lesch-Nyhan (thiếu hoàn toàn), hội chứng Kelly Seegmiller (thiếu 1 phần)

✓ Tăng hoạt 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate (PRPP) synthetase g/24h mmol/ngày

Nguyên nhân thứ phát bao gồm chế độ ăn giàu purin và tình trạng dung huyết, các yếu tố điều trị như hóa trị và xạ trị, thiếu G-6-phosphatase, suy thận, tiểu đường và cao huyết áp; cùng với các rối loạn nội tiết và chuyển hóa như nhiễm toan, cường cận giáp, nhược giáp và có liên quan đến hội chứng Down.

ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TOÀN PHẦN

- Bilirubin là sắc tố có màu vàng, là sản phẩm của quá trình thoái hóa heme – một thành phần trong Hemoglobin của hồng cầu

- Các chỉ số bilirubin trong máu bao gồm: Bilirubin toàn phần (Bil TP), Bilirubin gián tiếp (Bil GT), Bilirubin trực tiếp (Bil TT)

Bil TP = Bil GT (70%) + Bil TT ((30%)

** Bilirubin tự do (gián tiếp)

Sau khi được giải phóng khỏi globin, heme bị oxy hóa bởi hệ thống heme oxygenase—một enzyme microsomal liên kết với cytochrome P450—hoạt động ở hệ võng nội mô và cần có oxy cùng NADPH Quá trình này mở liên kết methenyl của heme, giải phóng sắt vàcarbon monoxide, và tạo ra biliverdin IXα; biliverdin sau đó được biliverdin reductase khử thành bilirubin, thành phần quan trọng của chu trình phân hủy heme và sự bài tiết qua gan Hệ thống này gồm hai isozyme chính là HO-1 và HO-2, HO-1 thường inducible và HO-2 mang tính ổn định, góp phần điều hòa sản xuất bilirubin và các sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa.

 giữa vòng pyrol I và II để tạo thành biliverdin có màu xanh, CO và giải phóng nguyên tử sắt dưới dạng

Fe 3+ Sau đó, biliverdin nhanh chóng bị khử nhờ sự xúc tác của enzym biliverdin reductase có coenzym là

- Quá trình thoái hóa Hb thành Bilirubin tự do xảy ra ở hệ võng nội mô chủ yếu là lách, một phần nhỏ ở gan và tủy xương

- Blirubin có màu vàng, không tan trong nước (do 2 gốc propionate tạo liên kết H nội phân tử)

- Bilirubin tự do: chưa kết hợp với acid glucuronic ở gan, nó rất độc đối với cơ thể (đặc biệt là hệ thần kinh)

- Phản ứng nhận biết diazo chậm → bilirubin gián tiếp

** Bilirubin liên hợp (trực tiếp)

Bilirubin tự do được một loại albumin (haptoglobin) vận chuyển qua máu tới gan Khi tới màng tế bào gan, bilirubin tự do tách ra khỏi phức hợp bilirubin-haptoglobin và được các thụ thể trên màng tế bào gan nhận biết để vận chuyển tích cực vào gan.

Thoái hóa Hb tạo bilirubin tự do

In the liver, the enzyme UDP-glucuronyl transferase catalyzes the glucuronidation of unconjugated bilirubin by transferring one or two glucuronic acid units to the propionic acid side chain, producing conjugated bilirubin in the forms of bilirubin monoglucuronide and bilirubin diglucuronide This process increases bilirubin’s water solubility, enabling its excretion into bile.

- Bilirubin liên hợp không độc, tan trong nước và cho phản ứng diazo nhanh nên còn đuợc gọi là bilirubin trực tiếp

Bilirubin liên hợp được gan bài tiết vào các ống dẫn mật trong gan và theo mật xuống ruột non Nếu đường dẫn mật bị tắc nghẽn, bilirubin liên hợp sẽ vào máu và bài tiết ra qua nước tiểu Trong trường hợp bilirubin liên hợp xuất hiện trong nước tiểu, người ta gọi đó là sắc tố mật trong nước tiểu.

- Bilirubin toàn phần phản ứng với diazotized 2,4-dichloroaniline tạo thành phức hợp azobilirubin có màu đỏ Albumin liên kết với bilirubin sẽ được giải phóng bằng chất tẩy rửa

- Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ Bilirubin toàn phần

1 Thuốc thử được niêm phong sẽ ổn định đến hết hạn sử dụng được chỉ định nếu được bảo quản ở nhiệt độ 18° - 22°C

2 Thuốc thử A và C chứa Dichloroanilin cần tránh ánh sáng

3 Đảm bảo an toàn khi sử dụng hóa chất

Sự tạo thành bilirubin liên hợp

Khoảng tuyến tính là phạm vi giá trị nơi nồng độ mẫu tỷ lệ thuận với mật độ quang của dung dịch, cho phép kết quả đo chính xác Khi nồng độ bilirubin vượt ra ngoài giới hạn của khoảng tuyến tính, kết quả sẽ không chính xác và có thể gây sai lệch trong phân tích.

- Giới hạn tuyến tính là 30 mg/dL hoặc 510 μmol/L

- Trong trường hợp có giá trị cao hơn, mẫu phải được pha loãng với nước cất (tỉ lệ 1+2), phép đo được lặp lại, kết quả nhân với 3

Để tạo hỗn hợp phản ứng, trộn thuốc thử A với thuốc thử B theo tỷ lệ 1:1 Trước khi sử dụng, để nhiệt độ phòng ít nhất 15 phút để phản ứng xảy ra và bảo quản ở nơi tránh ánh sáng Hỗn hợp phản ứng ổn định trong 7 ngày ở nhiệt độ 18-22°C hoặc 21 ngày ở nhiệt độ 2-8°C.

- Thuốc thử C đã sẵn sàng để sử dụng

- Dùng Pipet cho vào cuvet (1cm):

Thử nghiệm bình thường Thử nghiệm nhi khoa Ống đo Ống trắng huyết thanh Ống đo Ống trắng huyết thanh

- Trộn và để yên ít nhất 10 phút (để ở nơi tránh ánh sáng) Sau đó, đo độ hấp thụ của ống đo

A(SAMPLE) so với ống trắng huyết thanh A(BLANK) trong 30 phút

Lưu ý: cần phân chia thử nghiệm bình thường và thử nghiệm nhi khoa vì Bil TP ở trẻ nhỏ có thể tăng lên gấp 10 lần so với người bình thường Do đó, chỉ cần lấy 20 μl huyết thanh ở trẻ nhỏ, còn người lớn thì lấy 100 μl huyết thanh.

- Khi đó nồng độ Bil TP: C = A(S) x hệ số Factor

Thử nghiệm bình thường Thử nghiệm nhi khoa mg/dL A(S) x 12.5 A(S) x 58 μmol/L A(S) x 214 A(S) x 992

C: Nồng độ Bil TP trong huyết thanh

A (SAMPLE) : Mật độ quang của ống đo (chứa huyết thanh và hỗn hợp phản ứng)

Mật độ quang của ống trắng huyết thanh (chứa huyết thanh và thuốc thử C) được dùng để đo nồng độ Bil TP; thuốc thử C có thành phần tương tự thuốc thử A nhưng nồng độ thấp hơn một nửa nhằm tiết kiệm hoá chất, vì ở nồng độ này phản ứng diazo đặc trưng sẽ không xảy ra; màu vàng của huyết thanh cũ có thể ảnh hưởng đến nồng độ Bil TP cần đo (vì Bil TP rất nhỏ và có màu vàng); do đó cần chuẩn bị ống trắng huyết thanh.

Các giá trị 12.5 và 58; 214 và 992 là hệ số factor (F = C o

- Lưu ý: nếu không sử dụng hệ số Factor do nhà sản xuất cung cung cấp, ta có thể xác định C o

Ao bằng cách chuẩn bị thêm ống chuẩn, sau đó xác định mật độ quang Ao của ống chuẩn Khi đó:

4.2.6 Giá trị tham khảo (trích từ bộ kit Centronic GmbH) mg/dL μmol/L

- Đại cương về bil TT (đã trình bày ở m ụ c 4.2.1)

Việc bilirubin trực tiếp hoặc bilirubin gián tiếp tăng cao so với mức bình thường cho thấy nguy cơ mắc các bệnh về gan cao hơn Nồng độ bilirubin tăng đi kèm với sự tăng tỷ lệ hủy hoại tế bào hồng cầu, phản ánh rối loạn chức năng gan và quá trình phá hủy tế bào máu đỏ trong cơ thể.

Bilirubin huyết thanh là xét nghiệm thường quy trong chẩn đoán và tìm nguyên nhân gây vàng da cũng như đánh giá các bệnh liên quan đến gan mật Dù không phải là chỉ số đặc hiệu cho một tình trạng bệnh cụ thể, xét nghiệm này vẫn mang lại nhiều lợi ích trong việc phân biệt các nguyên nhân vàng da và theo dõi diễn biến của các bệnh lý gan mật ở bệnh nhân.

- Trị số bình thường (tham khảo sách thực tập Hóa Sinh Y học):

▪ Bilirubin trực tiếp: ≤ 3 mg/l (thường không quá 30% của toàn phần)

▪ Bilirubin gián tiếp: ≤ 7 mg/l (thường không quá 70% của toàn phần)

- Khi Bil TP tăng > 2mg/dl sẽ có hiện tượng vàng da, đó là biểu hiện của bệnh lý Ví dụ như:

Vàng da trước gan là tình trạng tăng bilirubin gián tiếp do các nguyên nhân trước gan, gồm vàng da sinh lý ở trẻ sơ sinh, phản ứng truyền máu không tương thích nhóm máu, thiếu men G6PD và nhiễm sốt rét; các yếu tố này làm tăng quá trình phân hủy hồng cầu hoặc làm giảm khả năng conjugation bilirubin ở gan, khiến bilirubin gián tiếp chiếm phần lớn và cần được đánh giá sớm để phòng ngừa biến chứng.

Các trường hợp gây vàng da ở gan và sau gan gồm viêm gan siêu vi, viêm và xơ gan do rượu, ung thư tụy, ung thư gan và tắc đường mật do sỏi hoặc do giun Trong những tình trạng này, tăng bilirubin trực tiếp là đặc trưng chính, giúp nhận diện nguyên nhân vàng da liên quan đến gan và đường mật.

(cụ thể về các bệnh lý vàng da sẽ trình bày thêm ở m ụ c 4.3.7 ):

ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TRỰC TIẾP

4.3.1 Đại cương (đã trình bày ở mục 4.2.1)

Total bilirubin reacts with diazotized sulfanilic acid (DSA) in the presence of dimethyl sulfoxide (DMSO) or caffeine to form the red azobilirubin complex.

Sunfanilic acid + NaNO 2 → Diazotized sulfanilic acid (DSA) Bilirubin toàn phần + DSA + chất gia tốc → Azobilirubin toàn phần

- Bilirubin trực tiếp phản ứng trực tiếp mà không cần thêm chất gia tốc.

Bilirubin trực tiếp + DSA → Azobilirubin trực tiếp

- Nồng độ bilirubin trong mẫu huyết thanh tỷ lệ với mật độ quang của dung dịch azobilirubin ở bước sóng 546 nm

Lưu ý: Thuốc thử được niêm phong sẽ ổn định đến hết hạn sử dụng được chỉ định nếu được bảo quản ở nhiệt độ 18° - 22°C

Khoảng tuyến tính là phạm vi giá trị nơi nồng độ mẫu tỷ lệ thuận với mật độ quang của dung dịch, cho phép ước lượng nồng độ bilirubin từ giá trị đo được một cách chính xác Khi nồng độ bilirubin vượt ngoài giới hạn của khoảng tuyến tính, mối quan hệ giữa nồng độ và mật độ quang trở nên phi tuyến, dẫn đến kết quả đo không đáng tin cậy Vì vậy, xác định và tuân thủ khoảng tuyến tính là yếu tố then chốt để đảm bảo độ chính xác của phép đo bilirubin bằng phương pháp quang phổ và tối ưu hóa quy trình phân tích.

- Giới hạn tuyến tính là 8 mg/dL hoặc 137 μmol/L

Trong trường hợp nồng độ bilirubin trực tiếp vượt quá giới hạn cho phép, mẫu xét nghiệm cần được pha loãng bằng nước muối sinh lý 0,9% theo tỉ lệ 1:5 (một phần mẫu với năm phần nước muối) Sau khi pha loãng, kết quả đo được cần được nhân với 6 để quy đổi về giá trị phù hợp với mức chuẩn và đảm bảo độ chính xác của phân tích bilirubin trực tiếp.

- Phạm vi đo lường được: 0.25 - 8 mg/dL

- Thuốc thử đã sẵn sàng để sử dụng

- Dùng Pipet cho vào cuvet (1cm): Ống đo Ống trắng huyết thanh

Huy ế t thanh/ huy ết tương 100μL 100μL

- Trộn đều, để yên sau 5 phút đo mật độ quang của ống đo A(SAMPLE) so với ống trắng huyết thanh A(SBL).

- Lưu ý: Sử dụng mẫu huyết thanh mới, không tan huyết Bảo quản nơi không có ánh sáng cho đến khi sử dụng

- Khi đó nồng độ Bil TT: C = A(S) x hệ số Factor

Bước sóng 546 nm mg/dL A(S) x 12.5 μmol/L A(S) x 214

C: Nồng độ Bil TT trong huyết thanh

A (SAMPLE) : Mật độ quang của ống đo (chứa huyết thanh và hỗn hợp phản ứng)

A (SBL) : Mật độ quang của ống trắng huyết thanh (chứa huyết thanh và thuốc thử C)

Các giá trị 12.5 và 214 là hệ số factor (F = C o

- Lưu ý: nếu không sử dụng hệ số Factor do nhà sản xuất cung cung cấp, ta có thể xác định C o

Ao bằng cách chuẩn bị thêm ống chuẩn, sau đó xác định mật độ quang Ao của ống chuẩn Khi đó:

Nồng độ Bil TT bình thường:  0.3mg/dl (5.1 μmol/l)

- Đại cương về Bil TT (đã trình bày ở m ụ c 4.2.1)

- Trị số bình thường (tham khảo sách thực tập Hóa Sinh Y học):

▪ Bilirubin toàn phần: 0.5 - 1 mg/dl

▪ Bilirubin trực tiếp: ≤ 0.3 mg/dl (thường không quá 30% của toàn phần)

▪ Bilirubin gián tiếp: ≤ 0.7 mg/dl (thường không quá 70% của toàn phần)

- Ý nghĩa lâm sàng của xét nghiệm:

Việc bilirubin trực tiếp hoặc bilirubin gián tiếp tăng cao so với mức bình thường cho thấy nguy cơ mắc các bệnh về gan cao hơn Mức bilirubin tăng cũng phản ánh quá trình hủy hoại tế bào hồng cầu diễn ra nhiều hơn, từ đó có thể cảnh báo về các vấn đề liên quan đến gan và máu.

Xét nghiệm bilirubin huyết thanh là xét nghiệm thường quy được dùng trong chẩn đoán và tìm nguyên nhân gây vàng da cũng như các bệnh liên quan đến gan mật Dù không phải là chỉ số đặc trưng cho một tình trạng bệnh cụ thể, xét nghiệm này vẫn mang lại nhiều lợi ích trong việc phân biệt nguyên nhân và theo dõi diễn biến của bệnh nhân.

- Nồng độ bilirubin trong máu tăng trong các trường hợp: vàng da trước gan, tại gan và sau gan

Nguyên nhân: tán huyết - do tăng hủy hồng cầu

- Bệnh hemoglobin: HbS, Thalasemia, Minkowski Chauffard

- Bệnh di truyền: không có men G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) gây thiếu máu tán huyết

- Bệnh miễn dịch: bất đồng nhóm máu, Rh

- Bệnh mắc phải: sốt rét, sốt xuất huyết, nhiễm trùng, nhiễm độc dung môi hữu cơ

Vàng da sinh lý ở trẻ sơ sinh là hiện tượng vàng da đơn thuần, không kèm theo thiếu máu hay rối loạn nào khác, do hệ thống liên hợp và thụ thể màng tế bào gan chưa phát triển bình thường Tình trạng này xuất hiện từ ngày thứ 2–3 sau sinh và tự hết sau khoảng 10 ngày.

- Máu: Bil TD tăng cao; Bil LH tăng nhẹ/bình thường

- Nước tiểu, phân: urobilinogen tăng trong nước tiểu, stercobilinogen có trong phân

** Vàng da t ạ i gan: còn gọi là vàng da “nội khoa”

- Do các tổn thương tại gan → giảm khả năng liên hợp Hoặc do tắc nghẽn đường dẫn mật trong gan, ứ mật ở tế bào gan, khối u lan tràn cả gan

- Bệnh di truyền: thiếu hụt men liên hợp bilirubin UDP glucoronyl transferase

▪ Hội chứng Crigler-Najjar (loại I, II): hoạt tính men bị giảm

▪ Bệnh Gilbert: giảm thu nhận bilirubin vào tế bào gan, hoạt tính men giảm

- Bệnh mắc phải: viêm gan do virus, nhiễm độc gan do hóa chất (chloroform, acetaminophen ), xơ gan, ung thư gan

- Máu: Bil TD và Bil LH đều tăng

- Nước tiểu: urobilinogen tăng (giảm tái tạo bilirubin), sắc tố mật (+) (do tắt mật trong gan)

** Vàng da sau gan: còn gọi là vàng da "ngoại khoa"

Nguyên nhân gây tắc đường dẫn mật bao gồm: sỏi mật gây tắc ống mật và đường dẫn mật chính; ung thư đầu tụy làm hẹp hoặc tắc đường dẫn mật; hạch to chèn ép đường dẫn mật; giun chui ống mật; tắc mật ngoài gan; và sỏi ống mật chủ.

- Máu: Bil LH tăng là chính, Bil TD bình thường/ tăng nhẹ

- Nước tiểu: muối mật (+), sắc tổ mật (+)

- Phân nhạt màu (phân mỡ), trong trường hợp tắt mật nặng hay hoàn toàn, phân có thể bạc màu

GLUCID

PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU VỚI GIẤY THỬ 11 THÔNG SỐ

Tiêu đề	Thực hành Hóa Sinh Y Học
Tác giả	Nhóm Thực Hành Hóa Sinh Y Học
Trường học	Đại Học Nguyễn Tất Thành
Chuyên ngành	Hóa Sinh Y Học
Thể loại	Báo Cáo Cuối Kỳ
Năm xuất bản	2021
Thành phố	TP Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	73
Dung lượng	5,04 MB