Bài viết Khảo sát quy trình định lượng men G6PD trong máu khô của trẻ sơ sinh bằng phương pháp huỳnh quang nghiên cứu tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến cường độ huỳnh quang: nồng độ NADP và G6P, thời gian phản ứng, đồng thời đánh giá độ lặp, xây dựng đường chuẩn và tính toán giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) men G6PD trên giọt máu khô được lấy ở gót chân của trẻ sơ sinh.
Trang 1KHẢO SÁT QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG MEN G6PD
TRONG MÁU KHÔ CỦA TRẺ SƠ SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG
Trần Khánh Hòa
Trường Đại học Thủy lợi, email: hoatk@wru.vn
1 GIỚI THIỆU CHUNG
Thiếu men G6PD là rối loạn di truyền phổ
biến nhất ở trẻ sơ sinh do đột biến trên cánh
dài vùng 2 băng 8 của nhiễm sắc thể X
(Xq28) Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế
giới (WHO), 2,5% trẻ sơ sinh trên thế giới bị
thiếu men G6PD với các mức độ khác nhau
[3] Ở Việt Nam, theo báo cáo của Tổng c ục
Dân số, tỷ lệ trẻ sơ sinh bị thiếu men G6PD
khoảng 1,5 – 2,5% trẻ sinh sống và tỷ lệ
này thay đổi theo vùng địa lý và nhóm
dân tộc [1]
Trong chuỗi chuyển hóa pentose
phosphate, men G6PD xúc tác phản ứng
chuyển hóa nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate (NADP) thành dạng
rút gọn NADPH*, một coenzyme rất quan
trọng giúp bảo vệ hồng cầu chống lại c ác tác
nhân oxy hóa Khi trẻ bị thiếu men G6PD,
hồng cầu dễ bị phá hủy do tiếp xúc với c ác
chất oxy hóa mạnh như băng phiến (long
não), đậu tằm (đặc biệt khi chưa nấu c hín)
hoặc sử dụng một số dược phẩm gây thiếu
máu do tán huyết (vỡ hồng cầu) Tình trạng
này sẽ làm tăng lượng bilirubin trong máu
gây thiếu máu kèm theo vàng da, vàng mắt,
mệt mỏi Nếu bị vàng da nặng, nhất là trong
2 tuần đầu sau sinh, trẻ có thể bị tổn thương
não gây bại não, chậm phát triển tinh thần và
vận động Tuy nhiên, nếu được phát hiện
sớm qua sàng lọc (48 đến 72 giờ sau sinh),
được theo dõi tình trạng vàng da sơ sinh và
được khuyến cáo không tiếp xúc hoặc sử
dụng các loại thức ăn có chứa chất oxy hóa
mạnh, trẻ vẫn có thể có cuộc sống hoàn toàn
bình thường Do đó, định lượng men G6PD trên giọt máu khô được lấy ở gót chân của trẻ
sơ sinh một cách c hủ động với c hi phí thấp giúp phát hiện sớm để phòng ngừa những biến chứng ở trẻ sơ sinh là việc rất cần thiết, góp phần nâng cao chất lượng dân số
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Định lượng men G6PD trong mẫu máu khô của trẻ sơ sinh bằng phương pháp huỳnh quang dựa trên phản ứng oxi hóa glucose-6-phosphate (G6P) thành 6-phosphogluconate (6PG) nhờ men G6PD trong mẫu máu khô làm xúc tác, đồng thời NADP sẽ chuyển hóa thành chất phát huỳnh quang NADPH*, tỷ lệ với nồng độ men G6PD trong mẫu Đồng sunphat được thêm vào hỗn hợp để làm chậm phản ứng Huỳnh quang được đo với bước sóng kích thích 340 nm, bước sóng phát xạ
460 nm [4, 5]
G6P + NADP G 6 PD 6PG + NADPH* + H+ Các phản ứng trong nghiên cứu được thực hiện trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,5M, [CuSO4] = 0,1mM [5] Men G6PD được lấy
từ mẫu máu khô trên giấy thấm của trẻ sơ sinh không bị thiếu men G6PD Quy trình định lượng G6PD được tóm tắt như sau [4] (1) – Đục lỗ máu khô trên giấy thấm để thêm G6PD vào các giếng polystyren (2) – Thêm hỗn hợp dung dịch G6P và NADP theo tỷ lệ nồng độ: 1: 1,5
(3) – Ủ mẫu để oxi hóa G6P, tạo chất phát huỳnh quang NADPH*
(4) – Thêm CuSO4 để dập tắt phản ứng do
Cu2+ ức c hế men G6PD
Trang 2(5) – Đo cường độ huỳnh quang trên máy
Victor 2D, Perkin Elmer
Nghiên cứu tiến hành khảo sát các yếu tố
ảnh hưởng đến cường độ huỳnh quang: nồng
độ NADP và G6P, thời gian phản ứng, đồng
thời đánh giá độ lặp, xây dựng đường c huẩn
và tính toán giới hạn phát hiện (LOD), giới
hạn định lượng (LOQ) men G6PD trên giọt
máu khô được lấy ở gót chân của trẻ sơ sinh
3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NADP
và G6P
Nồng độ G6P và NADP được pha với tỷ
lệ: 1: 1,5 Để tối ưu hóa nồng độ của NADP
và G6P, nghiên cứu đã khảo sát các nồng độ
NADP (mM) khác nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0;
2,5 Thời gian phản ứng là 30 phút [5] Mỗi
mẫu đo lặp lại 3 lần và cường độ huỳnh
quang trung bình được trình bày trong Bảng
1 và Hình 1
Bảng 1 Sự phụ thuộc cường độ
huỳnh quang vào nồng độ NADP (mM)
NADP Cường độ NADP Cường độ
1,5 5440
Hình 1 Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang
vào nồng độ NADP
Kết quả cho thấy, giếng polystyren với
[NADP] = 1,5 mM; [G6P] = 1 mM cho tín
hiệu huỳnh quang cao nhất
3.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm với 6
khoảng thời gian (phút) khác nhau: 5; 10; 20;
30; 40; 45 khi cố định [NADP] = 1,5 mM và
G6P = 1,0 mM Cường độ huỳnh quang thu được trình bày trong Bảng 2 và Hình 2
Bảng 2 Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang vào thời gian phản ứng (phút)
t (phút) Cường độ t (phút) Cường độ
Hình 2 Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang
vào thời gian phản ứng (phút)
Thời gian phản ứng tăng từ 5 phút đến 30 phút, cường độ huỳnh quang tăng lên Tuy nhiên, tăng thời gian phản ứng lên đến 40, 45 phút thì cường độ huỳnh quang tăng không đáng kể Do đó, 30 phút là khoảng thời gian phù hợp c ho việc định lượng men G6PD 3.3 Khảo sát độ lặp của phép phân tích Nghiên cứu đã khảo sát cường độ huỳnh quang của 10 giếng với các điều kiện tối ưu
đã khảo sát ở trên: [G6P] = 1 mM; [NADP] = 1,5 mM; thời gian phản ứng 30 phút; [CuSO4] = 0,1 mM Men G6PD được lấy trên cùng một mẫu máu khô trên giấy thấm của trẻ sơ sinh không bị thiếu G6PD Cường độ huỳnh quang được trình bày ở Bảng 3
Bảng 3 Cường độ huỳnh quang của 10 giếng chuẩn ở điều kiện tối ưu Giếng Cường độ Giếng Cường độ
Trang 3Sử dụng Exel 2013, nghiên cứu tính được:
Hệ số biến thiên (CV) = 7,3%, nhỏ hơn
CV của kit IVD cho G6PD [4]
3.4 Xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn để định lượng G6PD được
xây dựng dựa trên các điều kiện tối ưu Nồng
độ men G6PD ở trẻ không mắc thiếu men
G6PD lớn hơn 2,6 (U/g Hb), do đó nghiên
cứu xây dựng đường chuẩn trong khoảng
nồng độ G6PD từ 0,77-10,5 (U/g Hb) Cường
độ huỳnh quang ứng với các nồng độ G6PD
được đưa ra trong Bảng 4 và Hình 3
Bảng 4 Sự phụ thuộc cường độ
huỳnh quang vào nồng độ G6PD
Giếng G6PD (U/g Hb) Huỳnh quang
Hình 3 Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang
vào nồng độ G6PD
Từ đồ thị, phương trình đường chuẩn
tuyến tính trong khoảng nồng độ G6PD từ
0,77 10,5 U/g Hb, có hệ số tương quan
R2 = 0,9977 thỏa mãn tiêu chuẩn 0,99 R2
1 và thu được phương trình đường c huẩn
có dạng: y = a + bx là: y = 1094x + 546,91
3.5 Tính giới hạn phát hiện (LOD) và
giới hạn định lượng (LOQ)
Nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm với
6 mẫu trắng (không men G6PD làm xúc tác
phản ứng) như quy trình phần 3.4 Cường độ
huỳnh quang được trình bày trong Bảng 5
Bảng 5 Cường độ huỳnh quang
của các mẫu trắng Giếng Cường độ Giếng Cường độ
Sử dụng Exel 2013, nghiên cứu tính được: LOD = 1066,4
LOQ = 1445,8
4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu bước đầu đã khảo sát quy trình định lượng G6PD trên giọt máu khô được lấy
ở gót chân của trẻ sơ sinh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang với c ác điều kiện tối ưu: [G6P] = 1 mM; [NADP] = 1,5 mM; Thời gian phản ứng = 30 phút; [CuSO4] = 0,1 mM Xây dựng được đường chuẩn định lượng men G6PD trên giọt máu khô được lấy ở gót chân của trẻ sơ sinh: y = 1094x + 546,91 Với trẻ sơ sinh, việc lấy mẫu máu (huyết thanh) để định lượng men G6PD cũng như bảo quản và vận chuyển mẫu là việc rất khó khăn, đặc biệt ở những vùng xa trung tâm
Do đó, kết quả của nghiên cứu là c ơ sở cho những nghiên cứu toàn diện hơn để định lượng men G6PD trên giọt máu khô được lấy
ở gót chân của trẻ sơ sinh một cách chủ động (không phụ thuộc vào các bộ kit nhập khẩu) giúp nhiều trẻ sơ sinh hơn nữa được sàng lọc thiếu men G6PD, đặc biệt trẻ sơ sinh ở xa trung tâm, nơi có khó khăn trong việc bảo quản và vận c huyển mẫu
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Kết quả thực hiện sàng lọc trước sinh và sơ sinh đến năm 2010 và kế hoạch triển khai năm 2011, Số 6 (123), 2011, Tạp chí Dân số
và Phát triển
[2] Nguyễn Viết Nhân, 2010, Tài liệu hướng dẫn sàng lọc sơ sinh, Trường Đại học Y Dược Huế
[3] Perkin Elmer, 2012, Complete solutions for screening newborns, 1244-1216-12
[4] Perkin Elmer, 2016, Neonatal G6PD, ND-1000
[5] Pointe Scientific, 2009, Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Reagent Set, Rev 12/09 P803-G7583-01