Biểu hiện Keratin 4 trong biểu mô bình thường và ung thư tế bào gai niêm mạc miệng

Bài viết Biểu hiện Keratin 4 trong biểu mô bình thường và ung thư tế bào gai niêm mạc miệng trình bày việc xác định tỉ lệ và mức độ biểu hiện Keratin 4 trong ung thư tế bào gai niêm mạc miệng và biểu mô miệng bình thường.

BIỂU HIỆN KERATIN 4 TRONG BIỂU MÔ BÌNH THƯỜNG VÀ UNG

THƯ TẾ BÀO GAI NIÊM MẠC MIỆNG

NGUYỄN THỊ NGUYỆT ÁNH1, NGUYỄN CHẤN HÙNG2, NGUYỄN VĂN THÁI3, NGUYỄN THỊ HỒNG4

TÓM TẮT

Mở đầu: Keratin đóng vai trò quan trọng trong nhiều chức năng của tế bào Mỗi loại mô biểu hiện một bộ

keratin đặc hiệu Keratin 4 đặc hiệu định hướng giai đoạn biệt hóa sau cùng của biểu mô gai niêm mạc miệng

Mục tiêu: Xác định tỉ lệ và mức độ biểu hiện keratin 4 trong ung thư tế bào gai niêm mạc miệng và biểu mô

miệng bình thường

Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu cắt ngang trên 130 ca ung thư tế bào gai niêm mạc miệng được

điều trị phẫu thuật tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM Nhuộm hóa mô miễn dịch, đánh giá biểu hiện keratin 4 trong mô ung thư và biểu mô miệng bình thường ở rìa diện cắt của bệnh phẩm phẫu thuật

Kết quả: Mô bình thường biểu hiện keratin 4 dương tính mạnh và đồng nhất, với tỉ lệ trung bình 94,1% Mô

ung thư giảm keratin 4 rất nhiều so với mô bình thường (p <0,001), có đến 93,1% mất biểu hiện keratin 4 (độ 3), trong đó 52,3% mất hoàn toàn keratin 4 Tỉ lệ keratin 4 khác biệt không có ý nghĩa giữa các đặc điểm lâm sàng, các grad mô học của ung thư (p > 0,05)

Kết luận: Mất biểu hiện keratin 4 trong ung thư tế bào gai niêm mạc miệng so với biểu mô bình thường gợi

ý biểu hiện hóa mô miễn dịch keratin 4 có tiềm năng sử dụng trên lâm sàng hỗ trợ chẩn đoán phân biệt niêm mạc miệng lành-ác khách quan về mặt sinh học

Từ khóa: Keratin 4, ung thư tế bào gai niêm mạc miệng, biểu mô miệng bình thường

ABSTRACT

Keratin 4 expression in oral normal epithelium and squamous cell carcinoma

Background: Keratins play a major role in several cellular functions Each tissue type expresses a specific

set of keratins Keratin 4 is the keratin specific for the final stage of differentiation of oral stratified squamous epithelium

Objective: To determine the prevalence and expression levels of keratin 4 in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and in normal oral epithelium

Materials and methods: The cross-sectional study was conducted on 130 OSCC patients treated by

surgery at the Oncology Hospital at Ho Chi Minh city Paraffin-embedded tissue surgical specimens were immunohistochemically stained for keratin 4 The K4 expression in OSCC and normal epithelium at the surgical margin was evaluated

Results: In normal epithelium, keratin 4 staining showed a homogenous and strong expression, with the

mean value of 94.1% In OSCCs, keratin 4-positivity was significantly decreased when compared to normal oral mucosa (p <0.001), up to 93.1% of cases lost keratin 4 expression, of which 52.3% was completely absent The keratin 4 expression was not significantly different regarding to clinical features, histopathological grades of OSCC (p> 0.05)

1 Giảng viên Bộ môn Bệnh Học Miệng, Khoa Răng Hàm Mặt - Đại học Y Dược TP.HCM

2Chủ tịch Hội Ung thư Việt Nam

3BSCKI Khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Ung Bướu TP.HCM

4 PGS.TS Trưởng Bộ môn, Phụ trách Sau Đại học-Khoa Răng Hàm Mặt - Đại học Y Dược TP.HCM

Conclusions: Loss of keratin 4 expression in OSCC, in contrast to normal epithelium, suggests that

keratin 4 immunohistochemical expression may have clinical potential which enhances in the differential diagnosis between benign and malignant oral mucosa, subjectively

Key words: Keratin 4, oral squamous cell carcinoma, normal oral epithelium

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư niêm mạc miệng (UTNMM) là một bệnh

ác tính phổ biến, đa số là carcinôm tế bào gai (hơn

90%)12 Điều trị thường không hiệu quả cao do

thường xảy ra tái phát và di căn, thậm chí ở những

bướu nhỏ Tác hại của những tác nhân sinh ung thư

như thuốc lá, rượu, gây ra môi trường ung thư hóa

khiến cho dễ tái phát và xuất hiện ung thư thứ hai

Do đó, hiểu rõ cơ chế phân tử về bệnh sinh và diễn

tiến ung thư sẽ giúp cải thiện điều trị bệnh

Các keratin (còn gọi là cytokeratin) là những sợi

trung gian trong biểu mô gai, giữ vai trò quan trọng

đối với sự ổn định, hình dạng và di cư của tế bào, sự

dẫn truyền các tín hiệu trong tế bào4,6 Trong số các

keratin, keratin 4 (K4) là thành phần đặc biệt quan

trọng cho giai đoạn biệt hóa sau cùng của biểu mô

gai lát tầng niêm mạc miệng4,6 Những nghiên cứu

gần đây cho thấy có sự giảm biểu hiện keratin 4 (K4)

trong ung thư vùng đầu cổ8,9,12,13 Schaaij-Visser và

c.s (2009) báo cáo biểu hiện K4 thấp ở rìa diện cắt

liên quan với tái phát tại chỗ của UTNMM10 Enokida

và c.s (2017) tìm thấy mất biểu hiện K4 liên quan

với giảm thời gian sống còn ở bệnh nhân UTNMM3

Để đánh giá tình trạng protein keratin 4 trong

UTNMM ở người Việt Nam và NMMBT (niêm mạc

miệng bình thường) ở rìa diện cắt có thực sự an

toàn về mặt sinh học protein keratin 4, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu này với mục tiêu: (1) Xác định tỉ lệ

và mức độ biểu hiện keratin 4 trong UTNMM và

NMMBT, (2) Phân tích liên quan giữa biểu hiện

của UTNMM

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nghiên cứu cắt ngang mô tả có phân tích 130

trường hợp ung thư tế bào gai niêm mạc miệng

được điều trị tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM từ

tháng 9 năm 2013 đến tháng 6 năm 2015

Mẫu nghiên cứu gồm 130 trường hợp UTNMM

phẫu thuật cắt rộng bướu nguyên phát, trong đó 111

trường hợp (84,6%) có hiện diện NMMBT ở rìa diện

ngâm cố định trong formalin đệm pH trung tính, xử lý

mô, đúc khối paraffin, cắt lát mỏng 4 µm, nhuộm

Hematoxylin - Eosin (HE) và chẩn đoán mô bệnh

học

Thực hiện kỹ thuật tissue microarray (MTA), mỗi microarray chứa 20 mẫu mô khác nhau trong đó có

đã biết cho kết quả K4 dương tính) Sau đó, đúc khối paraffin, cắt lát mỏng 4 µm, trải trên phiến kính có

LSAB tại Labo Bệnh học miệng Đại học Y Nha Tokyo (Nhật Bản), sử dụng kháng thể đơn dòng kháng keratin 4 (Abcam, Hoa Kỳ) (clone [EP1599Y] ab51599, pha loãng 1:500) và kit EnVision+Dual link system-HRP (Dako, Đan Mạch) Mỗi đợt nhuộm có chứng dương là nội chứng và chứng âm (thay thế kháng thể kháng K4 bằng dung dịch PBS)

Mẫu nhuộm được đánh giá bởi hai bác sĩ có kinh nghiệm về giải phẫu bệnh Sau khi đánh giá độc lập, hai bác sĩ này đối chiếu kết quả và đồng thuận kết quả cuối cùng, với tỉ lệ thống nhất 100% Tế bào biểu mô biểu hiện K4 dương tính khi bào tương nhuộm màu nâu DAB phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể, K4 âm tính khi bào tương chỉ

nhuộm màu xanh Hematoxylin Đánh giá tỉ lệ % và

K4 dương tính khi có tỉ lệ K4 ≥ 5% (Enokida và c.s., 2017)12

Bảng 1 Đánh giá biểu hiện keratin 4

Biểu hiện Keratin 4

Vị trí

2: Tế bào gai

Tỉ lệ % Tỉ lệ % của số tế bào K4 dương tính trên tổng số tế bào đếm được

trong 10 vi trường ×400

Mức độ

Độ 1 (bảo tồn được K4) = 70 - 100%

Độ 2 (trung bình) = 30 - 69%

Độ 3 (mất biểu hiện K4) = 0 - 29%

Nhập và xử lý dữ liệu bằng phần mềm Excel và STATA 14.0 Liên quan có ý nghĩa khi p < 0,05

KẾT QUẢ Đặc điểm mẫu nghiên cứu UTNMM

UTNMM gồm 82 nam và 48 nữ, với tỉ lệ nam/nữ

là 1,7:1; độ tuổi trung bình 56,9 ± 13,5 tuổi, đa số

(90%) trên 40 tuổi, nhỏ nhất 25 tuổi và cao nhất 88

tuổi

Ung thư thường xảy ra nhất ở lưỡi (49,2%) Ở

nam thường gặp ung thư ở lưỡi (43,9%), sàn miệng

(28%) và nướu răng (14,6%); trong khi ở nữ thường

gặp ung thư lưỡi (58,3%), môi (20,8%) và niêm mạc

má (12,5%) (Kiểm định chính xác Fisher, p < 0,001)

Tỉ lệ di căn hạch cổ là 30% Về giai đoạn ung

thư, có 19,2% ở giai đoạn 1; 36,2% giai đoạn 2;

19,2% giai đoạn 3; và 25,4% giai đoạn 4 Ở nữ, ung

thư giai đoạn sớm (37,5% giai đoạn 1; 29,2% giai

đoạn 2) hơn ở nam (8,6% giai đoạn 1; 40,2% giai

đoạn 2; 19,5% giai đoạn 3; 31,7% giai đoạn 4) (Kiểm

định chính xác Fisher, p < 0,001)

Đa số là carcinôm tế bào gai grad 1 (43,1%) và

grad 2 (49,2%), ít gặp grad 3 (7,7%)

Keratin 4 trong NMMBT

Biểu hiện K4 trong toàn bộ mẫu NMMBT có sự

nhất quán về mức độ và vị trí

Trong NMMBT, tất cả tế bào gai cho đến lớp bề

mặt biểu mô biểu hiện K4 dương tính với cường độ

mạnh, liên tục và đồng nhất; trong khi các tế bào đáy

và cận đáy không biểu hiện K4 Về mức độ, đa số

(70 ca; 63,1%) có tỉ lệ K4 dương tính 100%, các ca

còn lại (41 ca; 36,9%) giảm K4 nhưng vẫn bảo tồn

trên 75% (độ 1)

Tỉ lệ K4 trong NMMBT khác nhau không có ý

nghĩa thống kê giữa các độ tuổi, giữa nam và nữ,

giữa các vị trí trong miệng (p > 0,05)

Keratin 4 trong UTNMM

Hầu hết tế bào ung thư mất protein K4 nên biểu

hiện K4 trong UTNMM bị giảm rất nhiều, đa số

(93,1%) biểu hiện K4 dưới 30% (độ 3); chỉ có 8 ca

(6,1%) biểu hiện K4 từ 30-50% (độ 2) và 1 ca (0,8%)

còn bảo tồn được K4 tỉ lệ 90% (độ 1)

Trong mô ung thư còn biểu hiện dương tính K4,

biểu hiện không đồng nhất, phân tán vài chỗ trong

mô bướu, chủ yếu ở trung tâm ổ tế bào ung thư,

hoặc ở các tế bào gai quanh cầu sừng Riêng một

trường hợp còn bảo tồn được K4 cao có cường độ

nhuộm đậm, đồng nhất gần giống trong NMMBT

So sánh K4 trong UTNMM với NMMBT

Biểu hiện K4 trong UTNMM khác biệt rất có ý

nghĩa so với trong NMMBT (p < 0,001) (Bảng 2) Tỉ

lệ % trung bình K4 dương tính ở NMMBT là 94,1%,

bị giảm rất nhiều ở UTNMM (p < 0,001)

Bảng 2 Biểu hiện K4 trong UTNMM và NMMBT

N=130

Bình thường

Tỉ lệ % K4

Trung bình (độ lệch chuẩn) 6,3 (12,7) 94,1 (8,4) <0,001 a

Trung vị (khoảng tứ vị) 0 (0 - 5) 100 (90 - 100) <0,001 b

a Kiểm định t bắt cặp; bKiểm định Wilcoxon Signed Rank

Trong mô ung thư, tỉ lệ % K4 dương tính giảm rất nhiều:

68 ca (52,3%) mất hoàn toàn K4 và 17 ca (13,1%) biểu hiện K4 rất thấp từ 1 - 4% (độ 3);

ca (0,8%) độ 1; 8 ca (6,1%) độ 2; 36 ca (27,7%) độ

3

Ngược lại, tất cả 111 ca NMMBT luôn biểu hiện

K4 cao, từ 75 - 100% (độ 1) (p < 0,001) (Biểu đồ 1)

Biểu đồ 1 Tỉ lệ % K4 dương tính trong UTNMM và

NMMBT

Liên quan K4 với lâm sàng, giải phẫu bệnh UTNMM:

Biểu hiện K4 khác biệt không có ý nghĩa thống

kê giữa các nhóm tuổi, các thói quen nguy cơ, vị trí

và kích thước bướu nguyên phát, tình trạng di căn hạch, giai đoạn ung thư, độ ác tính (grad) mô học

của ung thư (p > 0,05) (Bảng 3)

Bảng 3 Liên quan K4 với lâm sàng, giải phẫu bệnh của UTNMM

Đặc điểm

Biểu hiện K4 trong UTNMM

p Tổng

Số ca (%)

Độ 1

N = 3

Độ 2

N =10

Độ 3

N =117

Các thói quen

Giai đoạn 0,467 a

a Kiểm định ANOVA; b Kiểm định t hai mẫu độc lập

Tỉ lệ trung bình K4 dương tính giảm dần khi

grad mô học ung thư tăng: tỉ lệ K4 trong nhóm grad

1 là 7,1%, giảm còn 5,9% trong nhóm grad 2, và

4,5% trong nhóm grad 3, tuy nhiên sự khác biệt này

không có ý nghĩa thống kê (Kiểm định ANOVA,

p = 0,797)

BÀN LUẬN

Protein là những chỉ dấu sinh học tiềm năng vì

nó tham gia vào các hoạt động của tế bào nhiều hơn

so với DNA và RNA Keratin 4 và K13 là cặp keratin

đặc hiệu cho giai đoạn biệt hóa sau cùng của tế bào

sừng niêm mạc miệng, trong đó K4 nhạy hơn về sự

rối loạn điều hòa biệt hóa8 K4 do gen KRT4 mã hóa

Gần đây, trong nghiên cứu phân tính tương quan

giữa biểu hiện dương tính protein K4 với biểu hiện

của gen KRT4, Enokida và c.s (2017) đã xác định

ngưỡng cắt cho protein K4 dương tính là 5%, kết

quả tỉ lệ K4 dương tính trong UTNMM là 31,5%

(40/127 ca)3 Nghiên cứu của chúng tôi cũng tìm

thấy kết quả tương tự, chỉ có 34,6% UTNMM biểu

hiện K4 dương tính trên 5% Tỉ lệ K4 âm tính (dưới

5%) cao như 68,5% (Enokida và c.s.)3 hay 65,4%

(nghiên cứu này) phản ánh tình trạng mất protein K4

làm cho tế bào không thể biệt hóa trưởng thành bình

thường Sự rối loạn biệt hóa tế bào làm thay đổi hình

dạng và chức năng của tế bào là đặc trưng của tế

bào ác tính

Tính chính xác tỉ lệ K4 dương tính phức tạp và

mất thời gian cho nên để thuận tiện thực hành,

Takashima và c.s (2012) đề nghị thang đánh giá

bán định lượng K4 với ba mức độ 1, 2, 3 dựa trên tỉ

lệ % tế bào dương tính K4, các tác giả kết luận độ 3

gợi ý tổn thương tân sinh trong biểu mô nguy cơ

cao, độ 1 gợi ý tổn thương nguy cơ thấp2 Áp dụng

thang bán định lượng K4 này, với độ dao động trong

một mức độ K4 khoảng 30%, nghiên cứu của chúng

tôi tìm thấy sự khác biệt rõ rệt biểu hiện K4 giữa

NMMBT (Tất cả biểu hiện K4 cao trên 75% - độ 1) với UTNMM (đa số 93,1% biểu hiện K4 thấp dưới 30% - độ 3) Kết quả cho thấy thang đánh giá K4 của Takashima và c.s (2012) nhạy trong chẩn đoán UTNMM và và đặc hiệu phân biệt rõ với NMMBT Khảo sát K4 trong NMMBT có thể ở người không ung thư2,8 hoặc ở rìa diện cắt bệnh phẩm phẫu thuật ung thư4,10,12 Nghiên cứu này sử dụng NMMBT ở rìa diện cắt cho kết quả biểu hiện K4 dương tính mạnh, nhuộm màu nâu đậm của DAB,

và khá đồng nhất từ lớp gai đến lớp bề mặt, với tỉ lệ trung bình dương tính K4 là 94,1 ± 8,4% Kết quả này nhất quán với đa số nghiên cứu trên thế giới ghi nhận tỉ lệ biểu hiện K4 mạnh trong NMMBT từ 85% đến 100%1,2,8,11,10,112

Ngược lại với biểu hiện mạnh của K4 trong mô NMMBT, mô ung thư rất ít biểu hiện K4 (trung vị 0%, khoảng tứ vị 0-5) Có đến 99,2% UTNMM giảm biểu hiện K4 dưới 70% (độ 2 và độ 3), trong đó 93,1% biểu hiện K4 thấp dưới 30% (độ 3), thậm chí mất hoàn toàn K4 (52,3%) Tỉ lệ này tương đương tỉ lệ 100% của Ohkura và c.s (2005)7, Schaaij-Visser và c.s (2009)10, Sakamoto và c.s (2011)8, Fuzele và c.s (2013)4 Trong mô ung thư, hầu hết các tế bào ung thư âm tính K4 mặc dù đôi khi có vài ổ ung thư với các tế bào biểu hiện K4 phân tán Chỉ có một trường hợp bảo tồn K4 được 90% (độ 1) là carcinôm

tế bào gai grad 1 Nhờ có khả năng bảo tồn được K4, các tế bào ung thư biệt hóa cao về hình dạng và chức năng tạo cầu sừng, dẫn đến kiểu hình độ ác tính thấp (grad 1)

Mặt khác, kết quả nghiên cứu này còn cho thấy xét nghiệm hóa mô miễn dịch keratin 4 là phương pháp chẩn đoán khách quan và hữu ích đối với chẩn đoán mô bệnh học để nhận diện NMMBT ở rìa diện cắt, xác định giá rìa diện cắt an toàn, phẫu thuật ung thư đủ rộng Biểu hiện K4 ở rìa diện cắt dưới 70% là

chỉ điểm sự bất thường, rối loạn biệt hóa của tế bào

cho dù về hình thái tế bào biểu mô vẫn bình thường

Nghiên cứu của Schaaij-Visser và c.s (2009) cung

cấp bằng chứng biểu hiện K4 thấp ở rìa diện cắt liên

quan với tái phát tại chỗ của UTNMM10 Như vậy,

đánh giá biểu hiện K4 ở rìa diện cắt có thể cung cấp

thêm thông tin để tiên lượng tái phát, định hướng xử

trí tiếp theo và theo dõi tái khám

Ngoài giá trị chẩn đoán, giá trị tiên lượng tái

phát nêu trên, xét nghiệm hóa mô miễn dịch keratin

4 trong UTNMM còn được tiếp tục bổ sung giá trị

tiên lượng sống còn qua nghiên cứu gần đây

Enokida và c.s (2017) tìm thấy biểu hiện K4 liên

quan với tiên lượng sống còn không tái phát và với

tiên lượng sống còn không bệnh ung thư (p < 0,05):

biểu hiện K4 cao dự đoán tiên lượng sống còn thuận

lợi cho bệnh nhân3 Một số nghiên cứu báo cáo độ

ác tính mô học tăng tỉ lệ nghịch với tỉ lệ K4 dương

tính1 Trong nghiên cứu này, mặc dù tỉ lệ K4 dương

tính giảm dần từ nhóm có độ ác tính thấp nhất grad

1 (7,1%), tiếp theo là grad 2 (5,9%) đến thấp nhất

trong nhóm grad 3 (4,5%) nhưng sự khác biệt này

không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Mặt khác, tình

trạng biểu hiện K4 trong UTNMM không khác biệt rõ

giữa các độ tuổi, giữa nam và nữ, thói quen nguy

cơ, vị trí bướu, tình trạng di căn hạch, giai đoạn ung

thư (p > 0,05) Điều này cho thấy tính nhất quán về

tình trạng mất biểu hiện K4 trong UTNMM, gợi ý K4

có thể là một dấu ấn sinh học chẩn đoán UTNMM có

tính độc lập cao-bất kể tuổi, giới, thói quen nguy cơ,

vị trí, giai đoạn lâm sàng cũng như độ ác tính mô

học của ung thư Kết quả này cũng gợi ý bất thường

K4 xảy ra sớm trong quá trình sinh ung thư, và khi

đã thành ung thư thì K4 không bị ảnh hưởng bởi các

yếu tố như tình trạng di căn hạch, giai đoạn ung thư

Sự hằng định này của K4 có thể là một yếu tố thuận

lợi để nhận diện ung thư cho dù tình huống nào

KẾT LUẬN

Nghiên cứu tìm thấy biểu hiện keratin 4 trong

ung thư niêm mạc miệng giảm nhiều so với trong

niêm mạc miệng bình thường Nhuộm hóa mô miễn

dịch keratin 4 có thể giúp phân biệt mô niêm mạc

miệng lành-ác về mặt sinh học một cách khách quan

và rõ ràng, nhận diện niêm mạc miệng bình thường

để xác định rìa diện cắt an toàn Tuy nhiên, cần

nhiều nghiên cứu với qui mô lớn hơn, theo dõi sau

điều trị nhằm xác định và ứng dụng các giá trị chẩn

đoán và tiên lượng của keratin 4 trên thực tế lâm

sàng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bloor BK, Seddon SV, Morgan PR (2001), “Gene

expression of differentiation-specific keratins in

oral epithelial dysplasia and squamous cell

carcinoma”, Oral Oncol, 37, pp.251-261

2 Depondt J, Shabana AH, Sawaf H, Gehanno P, Forest N (1999), “Cytokeratin alterations as diagnostic and prognostic markers of oral and pharyngeal carcinomas: a prospective study”, Eur J Oral Sci, 107, pp.442-454

3 Enokida T, Fujii S, Takahashi M, Higuchi

expression profiling to predict recurrence of advanced squamous cell carcinoma of the tongue: discovery and external validation”, Oncotarget, 8(37), pp.61786-61799

4 Fulzele A, Malgundkar SA, Govekar RB, Patil A, Kane SV, Chaturvedi P, et al (2013), “Proteomic profile of keratins in cancer of the gingivo buccal complex: consolidating insights for clinical applications”, J Proteomics, 91, pp.242-258

5 Karantza V (2011), “Keratins in health and cancer: more than mere epithelial cell markers”, Oncogene, 30, pp.127-138

keratins: biology and pathology”, Histochem Cell Biol, 129, pp.705-733

7 Ohkura S, Kondoh N, Hada A, Arai M, Yamazaki

Y, et al (2005), “Differential expression of the keratin-4, -13, -14, -17 and transglutaminase 3 genes during the development of oral squamous cell carcinoma from leukoplakia”, Oral Oncol, 41, pp.607-613

8 Sakamoto K, Aragaki T, Morita K, Kawachi H, Kayamori K, et al (2011), “Down-regulation of keratin 4 and keratin 13 expression in oral squamous cell carcinoma and epithelial dysplasia: a clue for histopathogenesis”, Histopathology, 58, pp.531-542

9 Schaaij-Visser TB, Bremmer JF, Braakhuis BJ., Heck AJ, Slijper M, et al (2010), “Evaluation of cornulin, keratin 4, keratin 13 expression and grade of dysplasia for predicting malignant progression of oral leukoplakia”, Oral Oncol, 46, pp.123-127

10 Schaaij-Visser TB, Graveland AP, Gauci S, Braakhuis BJ, Buijze M, et al (2009),

“Differential proteomics identifies protein biomarkers that predict local relapse of head and neck squamous cell carcinomas”, Clin Cancer Res, 15, pp.7666-7675

11 Scully C, Bagan J (2009), “Oral squamous cell carcinoma overview”, Oral Oncol, 45, pp.301–

308

12 Takashima M, Kawachi H, Yamaguchi A, Nakajima Y, Kitagaki K, et al (2012), “Reduced

expression of cytokeratin 4 and 13 is a valuable

marker for histologic grading of esophageal

squamous intraepithelial neoplasia”, J Med Dent

Sci, 59, pp.17-28

13 Van der Velden LA, Schaafsma HE, Manni JJ,

Ruiter DJ, Ramaekers FCS, Kuijpers W (1997),

“Cytokeratin and vimentin expression in normal

epithelium and squamous cell carcinomas of the

larynx”, European Archives of Oto-Rhino-Laryngology, 254, pp.376-383

14 Warnakulasuriya S (2009), “Global epidemiology

of oral and oropharyngeal cancer”, Oral Oncol,

45, pp.309-316