BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG TRỊ NÁM DA CỦA CAO CHI
TỔNG QUAN Y VĂN
Tổng quan về bệnh nám da và điều trị
Nám da là một rối loạn phổ biến của tình trạng tăng sắc tố trên da nhưng thường lại khó điều trị và ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng cuộc sống, khiến người bệnh mất tự tin trong sinh hoạt, giao tiếp hằng ngày Nám da gây lắng đọng melanin mạn tính trong lớp thượng bì, đặc trưng bởi các hạt màu nâu không đều phân bố đối xứng trên các khu vực tiếp xúc với ánh nắng mặt trời của cơ thể, đặc biệt là trên khuôn mặt Các nguyên nhân chính gây ra nám gồm yếu tố di truyền, tiếp xúc mạn tính với tia cực tím (UV) và hormon giới tính nữ Ngoài ra, sự tham gia của quá trình viêm trong phát triển nám cũng được xem xét trong nghiên cứu của Handel và cộng sự (2014) [9] Mỗi yếu tố sẽ gây ra một tình trạng tăng sắc tố riêng biệt, ví dụ tăng sắc tố gây ra bởi chiếu xạ UV mạn tính (photoaging), tăng sắc tố do thuốc (thuốc tránh thai), tăng sắc tố sau viêm (Post-Inflammatory Hyperpigmentation - PIH)
Sơ đồ quá trình hình thành melanin được trình bày trong hình 1.1
Hình 1.1 Sơ đồ quá trình hình thành melanin
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
Bảng 1.1: Thuốc điều trị nám da theo cơ chế bệnh sinh [9]
Hoạt động Cơ chế bệnh sinh Điều trị
Kích hoạt tyrosinnase Tăng tổng hợp melanin Hydroquinone
Acid azelaic Acid glycolic Kem bôi phối hợp giữa retinoid và steroid Ức chế bơm proton
Kích thích các tế bào sừng do UVB
Kích thích sản xuất tế bào sắc tố
Yếu tố tăng trưởng gây ra sự hình thành mạch
Tích luỹ cAMP và phosphoryl hoá CREB
Kiểm soát con đường tổng hợp melanin
Metformin Ảnh hưởng của nội tiết tố
Liên kết estrogen kích hoạt con đường tổng hợp melanin
Theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh da liễu của Bộ Y Tế năm 2015, các thuốc điều trị nám da bao gồm: [11]
- Thuốc làm giảm sắc tố da: hydroquinone, acid azelaic, leucodinin, vitamin
- Kem chống nắng hoặc corticoid
- Uống cloroquin, plaquinil, camoquil (mỗi ngày 1 viên, có thể dùng từ một đến ba tháng)
- Uống thêm các thuốc vitamin C, B, PP, L- cystin liều cao, kéo dài
502 Bad GatewayUnable to reach the origin service The service may be down or it may not be responding to traffic from cloudflared
Tổng quan về mô hình gây tăng sắc tố da trên động vật thử nghiệm
Nghiên cứu của Serra và cộng sự, 1970 thực hiện trên 2 nhóm thỏ giống Black Giant Flemish và giống NewZealand uống Chlorpromazine liều 20-30 mg/kg/ngày trong 3-6 tháng và 30 phút chiếu xạ UV trên vùng da cạo lông mỗi ngày Sau khoảng 3 tuần, vùng da đã cạo lông xuất hiện các khu vực tăng sắc tố riêng biệt Da thỏ New Zealand và những vùng da trắng của thỏ Black Giant Flemish chỉ có biểu hiện ban đỏ nhẹ Các vùng da màu của thỏ Black Giant Flemish có sự tăng sắc tố đáng kể ở lớp biểu bì và cả hạ bì [12]
Nghiên cứu của Flesch và cộng sự, 1949 thực hiện chiếu tia UV trong vòng
15 phút trên 2 nhóm thỏ màu và thỏ trắng cho thấy lượng SH trong dịch chiết từ biểu bì da của thỏ màu giảm đáng kể so với thỏ trắng Điều này do tăng melanin trong lớp biểu bì da của thỏ màu nên ngăn hấp thụ tia UV và làm giảm lượng SH trong melanocyte Trong khi đó, tia UV có thể xuyên qua lớp biểu bì da của thỏ trắng nên lượng SH trong melanocyte không thay đổi [13]
Nghiên cứu của Abbas S và cộng sự, 2019 tiến hành trên chuột không lông SKH-1 được tiếp xúc với benzanthrone liều 25 và 50 mg/kg đơn độc hoặc kết hợp với UVB (50 mJ/cm2) trong 24 giờ Kết quả cho thấy, kết hợp với tia UVB làm tăng tình trạng viêm da SKH-1 do benzanthrone gây ra có thể thông qua trung gian oxy hóa của tín hiệu MAPKs-NF-κB/AP-1, sau đó làm tăng biểu hiện của COX-2 và iNOS và dẫn đến viêm da [14]
1.2.2 Mô hình gây tăng sắc tố bằng hormon
Nghiên cứu của Laugier P.,1979 nhằm kiểm tra tác động của thuốc tránh thai trên núm vú lợn đực bằng cách thoa dung dịch chứa 0,5 mg ethinyloestradiol mỗi ngày Sau 3 tuần, phân tích hình thái các tế bào lớp biểu bì cho thấy có tình trạng tăng gai (acanthosis) và tăng sắc tố mạnh Thuốc có chứa mestranol cũng như các chất proestogen tinh khiết không có tác động này [15]
Nghiên cứu của Jadassohn W, 1970 thực hiện trên các nhóm chuột như sau: sinh lý, đối chứng liều 0,05 mcg hormon (p, p-dioxydiphenylhexane), các nhóm chuột còn lại cho uống lần lượt Noracyclin, Anovlar, Eugynon, Provera và progesteron với liều 0,025 mcg hoặc 0,25 mcg (estrogen) mỗi ngày trong
21 ngày Kết quả cho thấy tất cả các nhóm có chứa estrogen gây tăng gai (acanthosis) và tăng sắc tố của mạnh ở cả 2 liều, hormon là mạnh nhất Phì đại tuyến bã nhờn phát triển ở các nhóm hormon, Noracyclin, Provera và progesterone, Eugynon chỉ với liều 0,025 mcg nhưng không thấy phì đại với liều 0,25 mcg Không thấy phì đại tuyến bã nhờn của Anovlar ở cả hai liều Các kết quả về sắc tố được coi là có ý nghĩa trên lâm sàng với việc điều trị nám [16]
Nghiên cứu của ZHOU Kai-yi và cộng sự, 2014 đã gây nám bằng progesteron liều 12 mg/kg kết hợp với chiếu tia UV một giờ/ngày trong 36 ngày Chuột ICR, giống cái được chia ngẫu nhiên thành nhóm sinh lý, nhóm chứng, nhóm thuốc đối chứng Baixiao dan liều 3 g/kg, nhóm Xiaozheng Wan liều thấp 1 g/kg, nhóm liều trung bình 2 g/kg, nhóm dùng liều cao 4 g/kg Kết quả cho
7 thấy nhóm điều trị làm giảm đáng kể hàm lượng tyrosinase của gan và da so với nhóm chứng [17]
1.2.3 Mô hình gây tăng sắc tố do thuốc
Mô hình kết hợp chất kích thích DOPAJ4C vào khối u melanoma bằng clorpromazine và reserpine thực hiện bởi William và cộng sự, 1970 Trong mô hình này, chuột nhắt trắng Swiss-Webster, giống đực, trọng lượng từ 18-
22 g đã cấy khối u melanoma Chuột được tiêm phúc mô chlorpromazine liều
5 mg/kg/ngày, trong 7 ngày Vào ngày thứ 5, tiêm phúc mô DOPAJ4C (3,93 mCi/mM) Sau ngày thứ 7, chuột có biểu hiện tăng sắc tố da [18]
Mô hình khảo sát cơ sở hóa lý của Clofazimin gây ra sắc tố da thực hiện bởi Rosania và cộng sự, 2017 Trong mô hình này, chuột Balb/c và C57B/6 từ 4-5 tuần tuổi dùng đường uống liều 10 mg/kg/ngày Sau 3-4 tuần dùng thuốc, kết quả cho thấy có kết tủa Clofazimin tích lũy trong các đại thực bào và nhiều nhất ở gan, lá lách Clofazimin gây tăng sắc tố da đáng kể nhưng không hình thành kết tủa trên da [19]
Trong đó, mô hình gây nám da của ZHOU Kai-yi và cộng sự được ứng dụng nhiều để khảo sát tác động của một số thành phần trong điều trị nám da Từ cơ sở khoa học trên, nhóm nghiên cứu đã ứng dụng mô hình gây nám da bằng chiếu tia UV và tiêm progesteron của LV Gao-Hong với một số điều chỉnh để phù hợp với điều kiện thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Dược Lý, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM.
Tổng quan về dược liệu cao Tía tô
Tác dụng dược lý của Tía tô đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới như: tác dụng kháng ung thư in vitro trên nhiều dòng tế bào khác nhau (ung thư da, ung thư bạch cầu, ung thư gan, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư đại tràng) [20], [21], [22], [23], [24], [25]; tác dụng kháng viêm, kháng dị ứng in vivo [26] Ngoài ra, một số tác dụng khác như làm giảm protein niệu và ức chế tăng sinh tế bào giang mạch trên mô hình
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Động vật thí nghiệm
Thỏ cái giống Britist giant, trọng lượng 2-2,5 kg, khoẻ mạnh, không có biểu hiện bất thường Thỏ được nhốt riêng từng con và được nuôi trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm Thỏ được cung cấp
9 đầy đủ thức ăn gồm cám viên do Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp, bổ sung thêm cà rốt và nước uống mỗi ngày Thỏ được cạo lông 2 bên sống lưng 1 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm với diện tích 5 x 7,5 cm.
Dược liệu và phương pháp chiết xuất
Tía tô được thu hái tại Hà Nội, sau đó được nhặt lấy lá, rửa sạch rồi phơi âm can đến khô Xay thô dược liệu đến kích thước khoảng 4 mm để tiến hành chiết xuất và điều chế thành cao
Hình 2.1 Dược liệu Tía tô thu hái tại Hà Nội
Bột lá tía tô được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi là ethanol 50% theo quy trình như sau: làm ẩm 1900 gam bột dược liệu với dung môi trong 20 phút Rửa sạch, tráng cồn, lót bông gòn ở đáy bình chiết Cho dược liệu đã được làm ẩm vào thành từng lớp với lực nén vừa phải, dung môi ngập mặt dược liệu khoảng 3 cm, ngâm lạnh trong 24 giờ Rút dịch chiết với
10 tốc độ khoảng 100 giọt/phút đến khi dịch chiết không còn phản ứng với thuốc thử FeCl3 5% trong ethanol, ép bã và thu dịch chiết Toàn bộ dịch chiết cao toàn phần được thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không 20 lít ở 55°C Dịch sau khi cô quay được lắc phân bố lỏng lỏng với ethylacetat đến không còn phản ứng với FeCl3 nữa thì dừng quá trình lắc phân bố Cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay, tiếp tục loại dung môi đến thể chất cao đặc trên bếp cách thủyở 95 °C Cao đặc được bảo quản nhiệt độ 2-8 °C
2.2.3 Xác định độ ẩm của bột dược liệu và cao chiết EA
Thực hiện theo phương pháp Xác định mất khối lượng do làm khô bằng cách dùng cân sấy ẩm hồng ngoại theo Phụ lục 9.6 DĐVN V
Tiến hành: Cân khoảng 0,50 g đối với cao và 1,0 g đối với bột dược liệu cho lên một miếng giấy nhôm kích thước khoảng 4 × 4 cm, dàn mỏng cao lên hết bề mặt miếng giấy nhôm, đặt vào cân hồng ngoại để đo và đọc kết quả Đánh giá kết quả: thực hiện 3 lần, lấy kết quả trung bình
Xác định hiệu suất chiết
Cân khối lượng bột dược liệu trước khi chiết và cao, sau khi xác định độ ẩm tiến hành xác định hiệu suất chiết cao toàn phần trong cồn 50° và các cao phân đoạn dựa theo công thức:
Hiệu suất chiết = mcao x (100-a)/ mdl x (100-b) mcao: khối lượng cao (g) mdl: khối lượng bột dược liệu trước khi chiết (g) a: độ ẩm cao (%) b: độ ẩm bột dược liệu (%)
Hoá chất và thuốc thử
Bảng 2.1 Danh mục hoá chất và thuốc thử
STT Hoá chất Hãng cung cấp Nước sản xuất
3 BSA (Bovin serum albumin) Sigma-Aldrich Mỹ
4 Progesteron 25 mg/ml Rotexmedica Đức
8 Penicillin/streptomycin Invitrogen Corp Mỹ
11 Dimethyl sulfoxide Xilong Trung Quốc
12 NH4OH Guangdong Trung Quốc
15 Dimethyl sulfoxide Xilong Trung Quốc
17 Na2HPO4 Guangdong Trung Quốc
18 NaH2PO4 Guangdong Trung Quốc
Dụng cụ và trang thiết bị
Bảng 2.2 Danh mục thiết bị
STT Hoá chất Hãng cung cấp Nước sản xuất
1 Bể siêu âm Elma Đức
2 Bếp cách thuỷ WB-14 Memmert Đức
3 Cân kỹ thuật Kem Đức
4 Cân phân tích Kem Đức
5 Cân phân tích độ ẩm MB45 Sartorius Đức
6 Đèn UVA ZW36D17Y-H386 Cnlight Trung Quốc
7 Máy cô quay Heidolph Đức
8 Máy đo pH Orion Thermo
10 Máy ly tâm lạnh CT15E Hitachi Nhật Bản
11 Máy nghiền đồng thể cơ học
12 Máy vortex Genius 3 Ika Đức
13 Các dụng cụ: falcon 15, eppendorf 2 mL, micropipet, multimicropipet, đĩa 96 giếng đáy phẳng, flask, bình định mức, cuvet.
Đánh giá tác động của cao EA trên mô hình thỏ gây nám da bằng tia
Thỏ giống British Giant được chia thành các lô (mỗi lô ít nhất 4 thỏ) như sau:
Lô sinh lý: Thỏ được cạo sạch lông ở vùng da lưng, không chiếu UV và cho uống nước cất trong suốt quá trình thử nghiệm
Lô chứng bệnh: Thỏ được cạo sạch lông ở vùng da lưng, chiếu tia UV 30
13 phút mỗi ngày và tiêm progesteron cách ngày liều 5mg/kg trong 28 ngày
Lô thuốc chứng: Thỏ được cạo sạch lông ở vùng da lưng, chiếu tia UV 30 phút mỗi ngày, tiêm progesteron liều 5 mg/kg cách ngày trong 28 ngày Vào ngày đầu tiên xuất hiện vùng da tăng sắc tố, bôi HQ 4% lên vùng da tăng sắc tố với lượng thích hợp mỗi lần/ngày đến ngày thứ 28
Lô điều trị: Thỏ được cạo sạch lông ở vùng da lưng, chiếu tia UV 30 phút mỗi ngày, tiêm progesteron liều 5 mg/kg cách ngày trong 28 ngày Vào ngày đầu tiên xuất hiện vùng da tăng sắc tố, bôi cao tía tô 5% lên vùng da tăng sắc tố với lượng thích hợp 1 lần/ngày đến ngày thứ 28
Gây nám da trên thỏ: Thỏ được cạo sạch lông ở vùng da lưng Vào ngày thử nghiệm, thỏ được cố định trong hộp thỏ và chiếu UV trong 30 phút lên phần da lưng mỗi ngày Progesteron được tiêm cách ngày với liều 5 mg/kg
Cách bôi cao Tía tô: dùng que nhựa trải đều kem lên da chuột đến khi toàn bộ phần da đã cạo lông được phủ bởi một lớp mỏng cao Tía tô Đợi đến khi kem khô hẳn mới cho chuột trở lại lồng nuôi.
Đánh giá kết quả
Quan sát và chụp hình vùng da đã cạo lông mỗi tuần: cố định thỏ trong hợp, khoảng cách từ máy chụp hình đến vùng da nám là 15 cm Đánh giá cảm quan dựa trên tỷ lệ phần trăm nám được tính dựa vào phần mềm MATLAB, ứng dụng có sẵn color Thresholder để đặt ngưỡng phân chia màu sắc trên nhiều không gian màu khác nhau Hình chụp vùng da gây nám sẽ được chuyển thành hình trắng/đen (trắng = da chưa nám và đen = da nám) Dùng hàm regionprops để tính diện tích vùng nám theo đơn vị pixel, từ đó quy ra:
Tỷ lệ % nám = số đơn vị pixel bị nám/tổng số đơn vị pixel vủa vùng gây nám
Cố định thỏ trên mâm, tiêm bắp (IM) gentamicin liều 12 mg/kg Lấy 1 lượng vừa đủ thuốc tê Lidocain 2,5% thoa đều cho đến khi thấm hoàn toàn, để tiếp xúc 10 – 15 phút Lau sạch thuốc tê bằng dung dịch NaCl 0,9% Dùng dụng cụ cắt da với diện tích 2 cm x 2 cm, rửa sạch bằng dung dịch NaCl 0,9% lau khô bằng giấy lọc Chia làm 2 phần
- Lấy ẳ phần da ngõm vào formol 10% để nhuộm HE
- Lấy ắ da cũn lại ngõm vào formol 10% trong 10 – 15 phỳt, cạo loại bỏ mô mỡ, rửa sạch bằng dung dịch NaCl 0,9%
- Lau khô mẫu da, cân mảnh mô và tiến hành định lượng melanin
Vào cuối thử nghiệm, dùng dụng cụ bấm da để tách phần da lưng (2 x 2 cm) đối xứng qua xương sống, tách mỡ, mô liên kết và cơ bám trên da, rửa bằng NaCl 0,9% lạnh Chia làm 2 phần để phân tích hình thái tế bào và định lượng melanin
Da được bảo quản trong formol 10%, cắt tiêu bản dày 2-3 mm, xử lý, nhuộm bằng hematoxylin – eosin (HE) để phân tích vi thể tại khoa giải phẫu bệnh, bệnh viện Nhi Đồng 1, TP Hồ Chí Minh
Dựa theo phương pháp định lượng của Watts KP và cộng sự [34]
2.7.3.1 Xây dựng đường chuẩn melanin
Chất chuẩn melanin 0,5 mg/ml: cân chính xác 5 mg melanin, cho vào bình định mức 10 ml, thêm NH4OH 1N vừa đủ đến vạch Lắc đều, vortex đến khi tan hoàn toàn thành dung dịch đồng nhất Bảo quản ở 2 - 8 0 C và dùng trong ngày
Xây dựng đường chuẩn melanin: pha loãng dung dịch melanin chuẩn thành dóy nồng độ từ 0 – 14 àg/ml với NaOH 0,1N và nước cất Đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 405 nm bằng máy UV-vis
Chuẩn bị các thành phần phản ứng
Dung dịch MgCl2 5mM trong NaCl 0,5M: cân 2,96g NaCl, cho vào bình định mức 500 mL, thêm nước cất đến vạch Lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn, thêm 0,23 g MgCl2 hoà tan thành dung dịch đồng nhất Đệm Tris HCl 0,05M pH 8: cân chính xác 606 mg Tris HCl và 2,922 g NaCl hoà tan trong 95 ml nước cất, khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn Dùng HCl điều chỉnh đến pH 8, cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch Bảo quản ở 2 – 8 0 C
Dung dịch pronase 2 mg/ml: cân chính xác 200mg pronase cho vào bình định mức 10 ml, thêm nước cất đến vạch Vortex cho đến khi tan hoàn toàn, bảo quản ở 2-8 0 C dùng trong 2 tuần Hút chính xác dung dịch pronase 20 mg/ml cho vô bình định mức 10 ml, thêm Tris HCl 0,05M pH 8 tới vạch, vortex cho đến khi tan hoàn toàn, pha khi dùng
Nghiền đồng thể mảnh mô với 5 ml nước cất, tráng dụng cụ nghiền với 1 ml nước cất Chia đều dịch vào eppendorf, tráng cốc với 1 ml nước cất
Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút, lấy tủa
Thêm 5 ml đệm NaPi 0,1 M pH 6,8 lắc đều và ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút, lấy tủa
Kết tủa được ngâm với chloroform: methanol (2:1) trong 1 phút, hút bỏ dịch Sau đó, kết tử được ngâm với ethanol: ether (3:1) trong 2 phút, hút bỏ dịch để loại lipid
Thêm 7 ml dung dịch MgCl2 5mM trong NaCl 0,15M, lắc đều, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/15 phút, lấy tủa
Cho vào tủa dung dịch Pronase 2 mg/ml pha trong đệm Tris HCl 0,05 M pH8 và ủ hỗn hợp 48 giờ ở 30 0 C, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 15 phút, lấy tủa Thêm 5 ml nước cất, lắc đều, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong
Cho vào tủa 0,5 ml nước cất và 1 ml NaOH 0,1 N, đun cách thuỷ hỗn hợp ở
90 0 C trong 90 phút Để nguội, ly tâm lấy dịch trong Đo độ hấp thu ở bước sóng 405 nm Hàm lượng melanin được tính dưạ vào đường chuẩn với nồng độ 0 – 14 àg.
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0 Các giá trị được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SEM (Standard Error of Mean) Sự khác biệt giữa từng cặp trong lô, giữa các lô được xác định bằng phép kiểm T test và Mann Whitney Khác biệt có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05.
KẾT QUẢ
Chiết xuất cao
Từ 1900 g bột dược liệu lá Tía tô chiết với ethanol 50 0 thu được khối lượng cao toàn phần là 206 gram đạt hiệu suất chiết 12,10%
3.1.2 Cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ lá Tía tô
Sau khi thu được Cao toàn phần từ lá Tía tô với hiệu suất chiết 12,10%, tiến hành lắc phân bố với dung môi phân cực ethylacetat thu được cao chiết phân đoạn ethyl acetat từ lá Tía tô (EA) với khối lượng 35,5 gram đạt hiệu suất 2,24% Kết quả xác định phần trăm (%) mất khối lượng do làm khô bột dược liệu và cao được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Mất khối lượng do làm khô bột dược liệu và cao chiết
Chỉ tiêu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Độ ẩm (%)
Kết quả độ ẩm trung bình sau 3 lần thực hiện bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô của dược liệu là 11% đạt tiêu chuẩn DĐVN V theo chuyên luận lá tía tô, cụ thể: không quá 13% Độ ẩm trung bình của cao toàn phần và cao EA sau khi thực hiện 3 lần đều không quá 20% đạt tiêu chuẩn DĐVN V.
Tác động điều trị nám da của cao Tía tô
3.2.1 Thu được các lô thỏ trong mô hình
3.2.1.1 Khảo sát mô hình thỏ gây nám da bằng tia UV và progesteron
Các dấu hiệu cảm quan trên da thỏ giống British Giant trong thời gian 42 ngày với quy trình chiếu tia UV 30 phút/ngày kết hợp tiêm progesteron liều 5mg/kg cách ngày được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Dấu hiệu cảm quan của thỏ gây nám da bằng tia UV và progesteron
Ngày Dấu hiệu cảm quan
8 Da đỏ, lớp biểu bì bong tróc
12 Xuất hiện vùng nám ở lớp biểu bì
14 Vùng nám đậm, lan rộng
16 Vùng nám đậm tiếp tục lan rộng, kèm lông mọc thưa
20-28 Vùng nám đậm, lan rộng, kèm lông mọc dày
32 Vùng nám bắt đầu nhạt do sắc tố đẩy lên lông
36-40 Vùng nám tiếp tục nhạt dần do sắc tố đẩy lên lông
42 Da dày, lớp biểu bì không sắc tố
Kết quả cho thấy vùng nám bắt đầu xuất hiện sau 12 ngày thử nghiệm, đậm nhất vào ngày thứ 14 và tăng dần cho đến ngày 28 Sau đó, vùng nám nhạt dần Từ kết quả trên, nhóm nghiên cứu tiến hành chia thỏ thành các lô để khảo sát tác động điều trị nám da của cao Tía tô như sau:
Lô sinh lý: Không chiếu UV và cho uống nước cất trong suốt quá trình thử nghiệm
Lô chứng bệnh: Chiếu tia UV 30 phút mỗi ngày và tiêm progesteron cách ngày liều 5mg/kg trong 28 ngày
Lô thuốc chứng: Chiếu tia UV 30 phút mỗi ngày, tiêm progesteron liều 5 mg/kg cách ngày trong 28 ngày Vào ngày đầu tiên xuất hiện vùng da tăng sắc tố, bôi HQ 4% lên vùng da tăng sắc tố với lượng thích hợp mỗi lần/ngày đến ngày thứ 28
Lô điều trị: Chiếu tia UV 30 phút mỗi ngày, tiêm progesteron liều 5 mg/kg cách ngày trong 28 ngày Vào ngày đầu tiên xuất hiện vùng da tăng sắc tố, bôi cao tía tô 5% lên vùng da tăng sắc tố với lượng thích hợp 1 lần/ngày đến ngày thứ 28
3.2.2 Đánh giá kết quả điều trị nám da của cao Tía tô
3.2.2.1 Tỷ lệ phần trăm diện tích vết nám
Kết quả tỷ lệ phần trăm nám của các nhóm thử nghiệm được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Tỷ lệ % nám khảo sát tác động điều trị của cao EA 5%
( * ) p < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý
( # ) p < 0,05, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh
Vào ngày thứ 7, những vùng da thỏ tiếp xúc với tia UV ửng đỏ, lớp biểu bì bong tróc, trong khi da thỏ ở lô sinh lý (không chiếu tia UV) vẫn bình thường trong quá trình thử nghiệm Tiến hành điều trị vùng nám da trên thỏ bằng cao
EA 5% và kem HQ 4% vào thời điểm bắt đầu xuất hiện các đốm sắc tố là ngày thứ 12 của thử nghiệm.Vào ngày 14, vùng nám cả 3 lô cao EA 5%, HQ, chứng bệnh đều mở rộng, đạt diện tích tối đa và cả 3 lô không khác biệt có ý nghĩa thống kê Từ ngày 21, vùng nám ở các lô điều trị giảm rõ rệt, đặc biệt là vào ngày thứ 28 Tỷ lệ phần trăm vùng nám ở nhóm điều trị bằng cao EA 5% và kem HQ 4% lần lượt giảm 59,5% và 44,2% vào ngày thứ 28 so với ngày thứ 14 của thử nghiệm và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lô cao EA 5% và
HQ 4% tại các thời điểm khác nhau của thử nghiệm
Hình 3.1 Quy trình xử lý ảnh dựa trên ứng dụng MATLAB
Hình 3.1 Hình ảnh da thỏ được xử lý thông qua ứng dụng MATLAB (a) Ảnh thô da lưng thỏ; (b) Hình ảnh không bị xóa hiệu ứng “bird eye”; (c) ảnh phóng to với độ phân giải 0,1 mm/pixel; (d) vùng ảnh sau khi phân chia ngưỡng màu sắv với màu trắng thể hiện vùng không chứa sắc tố và màu đen thể hiện vùng có sắc tố.
Đánh giá vi thể
Trong điều kiện bình thường, các hạt melanin đã phân bố rải rác ở lớp hạ bì da thỏ (A), sau tác động của tia UV và progesteron, số lượng các hạt melanin tăng lên (B) và bắt đầu co cụm thành từng đám hạt melanin (C) Phân tích vi thể vào ngày thứ 14 cho thấy sự phân bố hạt melanin trong lớp hạ bì ở vùng da tiếp xúc với tia UV rất dày đặc, tất cả các vùng đều ở mức B và C (Hình 3.2) Ngược lại, ở lô sinh lý chỉ được quan sát thấy rải rác vài hạt melanin trong suốt thí nghiệm Vào ngày 28, mật độ các hạt melanin giảm đáng kể và
20 phân bố thưa thớt trong lớp hạ bị của vùng da thỏ trong nhóm điều trị bằng cao EA 5% và HQ 4% Mật độ các hạt melanin trong nhóm điều trị tương đương nhau và thấp hơn nhóm chứng bệnh có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.4)
Hình 3.2 Sự phân bố melanin trong nang lông ở lớp hạ bì da thỏ
(A) Cấp độ 1; (B) Cấp độ 2; (C) Cấp độ 3
Bảng 3.4 Mật độ các hạt melanin trong lớp hạ bì da thỏ
( * ) p < 0,05, so với lô chứng bệnh
Định lượng melanin
Từ phương trình tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa nồng độ melanin chuẩn và độ hấp thu tương ứng y = 0,0564x + 0,0033 với giá trị R² = 0,993 (Hình 3.3), nồng độ melanin chiết xuất từ các mảnh da của các nhóm thí nghiệm khác nhau được trình bày trong Bảng 3.5
Vào ngày 14, hàm lượng melanin của vùng da tiếp xúc với tia UV tăng lên rõ rệt và không có sự khác biệt đáng kể giữa lô chứng bệnh và hai lô điều trị Bôi lên vùng nám cao EA 5% hoặc kem HQ 4% làm giảm nồng độ melanin lần lượt là 39,9% và 43,2% so với lô chứng bệnh ở cuối thử nghiệm Hơn nữa, nồng độ melanin của hai lô điều trị này không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý
Bảng 3.5 Nồng độ melanin của lô điều trị
Ngày EA 5% HQ 4% Chứng bệnh Sinh lý
* p < 0,05, so với lô chứng bệnh
BÀN LUẬN
Quá trình tổng hợp Melanin bao gồm quá trình hydroxyl hóa L-tyrosine thành DOPA, sau đó chuyển đổi thành DOPA-quinone Quá trình này được xúc tác bởi phản ứng của enzym tyrosinase Vì vậy, sự ức chế hoạt động của tyrosinase sẽ làm giảm sự tổng hợp melanin [35] Nghiên cứu của Hwang và cộng sự khảo sát tác động ức chế tyrosinase và ức chế sinh tổng hợp melanin của 101 chất chiết xuất trên tế bào B16 cho thấy tác dụng của lá Tía tô trong điều trị nám da và Tía tô được xem là nguồn dược liệu đầy tiềm năng để sản xuất dược mỹ phẩm có công dụng làm sáng da đối với làn da nhạy cảm với tia
UV [28] Nghiên cứu in vitro trước đây cho thấy hiệu quả ức chế tyrosinase trên nấm của EA5% dựa trên giá trị IC50 của nó xấp xỉ bằng acid kojic [33] Ngoài ra, các nghiên cứu trước đây cũng đã đánh giá được hiệu quả điều trị của cao chiết toàn phần lá Tía tô như tác động chống oxy hóa , tác dụng chống viêm và ức chế khối u [29], [30], [36]
Nghiên cứu này được thực hiện trên mô hình thỏ được làm tăng sắc tố da bằng cách cho tiếp xúc với tia UV và tiêm progesteron Bức xạ UV giúp tăng cường hoạt hóa tế bào sắc tố, progesteron giúp khuếch đại hiệu ứng của tia
UV để làm tăng số lượng tế bào sắc tố thông qua một số thụ thể hormon
22 steroid sinh dục ở lớp hạ bì và biểu bì, đặc biệt là ở lớp hạ bì Động vật được chọn cho thí nghiệm là thỏ British Giant, da thỏ cho đáp ứng với tia UV bằng cách tăng hàm lượng melanin trong lớp biểu bì và hạ bì [13] Nghiên cứu sử dụng phần mềm MATLAB để đánh giá cảm quan vùng nám da trên thỏ Cuối cùng, tiến hành thực hiện việc định lượng hàm lượng melanin Việc đo hàm lượng melanin được tạo ra từ các tế bào sắc tố là rất cần thiết để đánh giá hiệu quả của các loại thuốc, mỹ phẩm tiềm năng làm sáng da và điều trị rối loạn sắc tố da [37] Nồng độ melanin được xác định ở nhóm điều trị bằng EA 5% và so sánh với nhóm điều trị bằng HQ 4%, một chất ức chế tyrosinase nổi tiếng [38] Kem HQ 4% được chọn làm chất đối chứng vì chúng có cùng đường dùng với cao EA 5% và việc dùng chế phẩm dạng bôi ngoài da cũng là một trong những phương pháp chính trong điều trị nám da [39] Bên cạnh đó, phân tích mô bệnh học cũng cho thấy được sự phân bố của các tế bào sắc tố trong suốt thí nghiệm Kết quả mô bệnh học cho thấy một số lượng lớn các hạt melanin có trong tế bào sắc tố ở lớp hạ bì da thỏ, kết quả của chúng tôi tương tự Forrest và cộng sự [12]
Nhìn chung, nghiên cứu của chúng tôi đã bước đầu cho thấy kết quả đầy hứa hẹn của cao chiết EA 5% trong điều trị rối loạn sắc tố Các thí nghiệm sâu hơn về dược phẩm hoặc mỹ phẩm có thành phần là cao EA 5% nên được lên kế hoạch để phát triển trong tương lai gần để góp phần phát triển các sản phẩm mới có chứa các chất làm sáng da tự nhiên an toàn và hiệu quả, đặc biệt là để điều trị nám da lâu dài.