Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020

Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.Đánh giá lưu hành, vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020.

VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐÁNH GIÁ LƯU HÀNH, VAI TRÕ TRUYỀN BỆNH,

ĐỘ NHẠY CẢM VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG CỦA MUỖI TRUYỀN BỆNH SỐT RÉT Ở VƯỜN QUỐC GIA

BÙ GIA MẬP, NĂM 2020

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH ĐỘNG VẬT HỌC

VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Trần Thị Huyền

ĐÁNH GIÁ LƯU HÀNH, VAI TRÕ TRUYỀN BỆNH,

ĐỘ NHẠY CẢM VỚI HÓA CHẤT DIỆT CÔN TRÙNG CỦA MUỖI TRUYỀN BỆNH SỐT RÉT Ở VƯỜN QUỐC GIA BÙ GIA MẬP, NĂM 2020

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 8420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH

ĐỘNG VẬT HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS TS Trương Xuân Lam

2 TS Nguyễn Văn Dũng

Hà Nội - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm

Học viên

Trần Thị Huyền

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Trương Xuân Lam và TS Nguyễn Văn Dũng đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này Trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo của Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy, hướng dẫn tôi trong quá trình học tập tại đây

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu Cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ quý báu của tập thể Lãnh đạo và các đồng nghiệp Khoa Côn trùng đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian học tập, triển khai nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin được cảm ơn Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Đắk Nông, Trạm y tế xã Quảng Trực, huyện Tuy Đức, tỉnh Đắk Nông

đã giúp tôi trong quá trình thu thập số liệu tại thực địa Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 15 tháng 6 năm 2022

Học viên

Trần Thị Huyền

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

1.1 Nghiên cứu về muỗi Anopheles 3

1.1.1 Nghiên cứu về muỗi Anopheles trên Thế Giới 3

1.1.2 Nghiên cứu về muỗi Anopheles tại Việt Nam 3

1.2 Một số tập tính của muỗi Anopheles 4

1.2.1 Tập tính giao hoan 4

1.2.2 Tập tính tìm vật chủ 5

1.2.3 Tập tính đốt mồi 6

1.2.4 Tập tính trú đậu 6

1.2.5 Tập tính sinh sản 7

1.3 Vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt rét 7

1.3.1 Vai trò truyền bệnh của Anopheles minimus 7

1.3.2 Vai trò truyền bệnh của Anopheles dirus 8

1.3.3 Vai trò truyền bệnh của một số véc tơ phụ ở Việt Nam 9

1.4 Tình trạng kháng hóa chất diệt côn trùng của véc tơ sốt rét 10

1.5 Tình hình sốt rét tại Việt Nam và điểm nghiên cứu 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Mục tiêu 1: 13

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 13

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu: 13

2.1.3 Thiết kế phương pháp nghiên cứu: 14

2.1.4 Đạo đức trong nghiên cứu 21

2.2 Mục tiêu 2: 21

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.2.3 Thiết kế phương pháp nghiên cứu 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thành phần loài, phân bố muỗi Anopheles tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập 29

3.1.1 Thành phần loài, phân bố muỗi Anopheles theo sinh cảnh 29

3.1.2 Bản đồ phân bố muỗi, bọ gậy Anpheles tại điểm điều tra 30

3.1.3 Tỷ lệ các loài muỗi Anopheles theo sinh cảnh 31

3.1.4 Tỷ lệ véc tơ sốt rét tại điểm nghiên cứu 32

3.1.5 Thành phần loài, mật độ muỗi Anopheles ở bìa rừng 33

3.1.6 Thành phần loài, mật độ muỗi Anopheles ở trong rừng 34

3.2 Một số tập tính sinh học muỗi An dirus tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập 34

3.2.1 Hoạt động đốt mồi của An dirus tại bìa rừng 34

3.2.2 Hoạt động đốt mồi của An dirus trong rừng 35

3.2.3 So sánh mật độ muỗi An dirus giữa trong nhà và ngoài nhà tại bìa rừng 35

3.2.4 So sánh mật độ muỗi An dirus giữa trong nhà bìa rừng và trong rừng 36

3.2.5 So sánh mật độ muỗi An dirus giữa ngoài nhà bìa rừng và trong rừng 36

3.2.6 Tập tính ưa đốt máu vật chủ của véc tơ sốt rét 36

3.3 Sinh thái của ổ bọ gậy Anopheles tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập 37

3.4 Độ nhạy cảm của muỗi Anopheles với hóa chất diệt côn trùng 38

3.5 Vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt rét tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập 39

CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN 41

4.1 Một số tập tính của véc tơ sốt rét tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập 44

4.1.1 Tập tính đốt mồi của muỗi An dirus 44

4.1.2 Tập tính ưa thích vật chủ 46

4.1.3 Tập tính đẻ trứng 47

4.2 Độ nhạy cảm của véc tơ sốt rét tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập 48

4.3 Vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt rét tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

KẾT LUẬN 51

1 Thành phần loài, phân bố, tập tính đốt mồi, tập tính ưa đốt vật chủ của muỗi truyền sốt rét tại Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020 51

2 Độ nhạy cảm của muỗi Anopheles với hóa chất diệt côn trùng và vai trò truyền bệnh sốt rét tại điểm nghiên cứu 51

KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ NHỮNG CHỮ

VIẾT TẮT

BNSR Bệnh nhân sốt rét

DDT Dichlorodiphenyltrichloroethane

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay:

Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzym GPS Global Positioning Syste: Hệ thống Định vị Toàn cầu KSTSR Ký sinh trùng sốt rét

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Thành phần loài và phân bố muỗi, bọ gậy Anopheles theo sinh cảnh

29

Bảng 3 2 Thành phần loài và phân bố muỗi, bọ gậy Anopheles theo sinh cảnh

32

Bảng 3.3 Thành phần và tỷ lệ các loài véc tơ sốt rét theo sinh cảnh tại điểm nghiên cứu 32

Bảng 3 4 Thành phần loài, mật độ muỗi Anopheles ở bìa rừng Vườn Quốc Gia Bù Gia Mập 33

Bảng 3 5 Thành phần loài, mật độ muỗi Anopheles trong rừng 34

Bảng 3 6 Hoạt động đốt mồi của muỗi An dirus theo giờ bìa rừng 34

Bảng 3.7 Hoạt động đốt mồi của muỗi An dirus theo giờ trong rừng 35

Bảng 3.8 So sánh mật độ An dirus đốt người trong và ngoài nhà ở bìa rừng 35

Bảng 3.9 So sánh mật độ muỗi An dirus đốt người trong nhà bìa rừng và trong rừng 36

Bảng 3.10 So sánh mật độ muỗi An dirus đốt người ngoài nhà bìa rừng và trong rừng 36

Bảng 3.11 Kết quả xác định máu vật chủ ở véc tơ sốt rét 37

Bảng 3.12 Kết quả điều tra bọ gậy Anopheles tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập 37 Bảng 3.13 Kết quả thử nhạy cảm của muỗi An dirus với hóa chất alphacypermethrin 38

Bảng 3.14 Kết quả mổ muỗi An dirus xác định ký sinh trùng sốt rét 39

Bảng 3.15 Kết quả PCR xác định ký sinh trùng trong muỗi An dirus 40

Bảng 3.16 Số lượng muỗi An dirus nhiễm ký sinh trùng sốt réttheo thời gian thu thập 40

DANH MỤC HÌNH

Trang Hình 2.1 Địa điểm điều tra 13 Hình 3.1 Bản đồ phân bố muỗi, bọ gậy tại bìa rừngVườn Quốc gia Bù Gia Mập 30Hình 3.2 Bản đồ phân bố muỗi, bọ gậy trong rừngVườn Quốc gia Bù Gia Mập 31

Bệnh SR được xác định do muỗi Anopheles truyền Sinka et al (2012) đã

thống kê trên thế giới đến nay phát hiện được 465 loài muỗi Anopheles, trong đó

có 41 loài là véc tơ SR chính, muỗi đốt mồi chủ yếu vào ban đêm [2] Một số nghiên cứu dịch tễ SR ở khu vực Đông Nam Á đưa ra nhận xét là mức độ lan truyền SR thay đổi theo chiều hướng giảm dần từ trong rừng ra bìa rừng và khu vực xa rừng Tại Thái Lan, những người thường xuyên hoạt động và ngủ trong rừng có nguy cơ nhiễm SR cao hơn 12,75 lần so với người chỉ làm việc ở khu dân cư [3] Do đó, việc nghiên cứu thành phần loài muỗi Anopheles, phân bố véc

tơ SR góp phần cung cấp thông tin để áp dụng biện pháp phòng chống véc tơ phù hợp, hiệu quả cho từng vùng

Tại Việt Nam, có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần loài muỗi Anopheles từ những năm đầu thế kỷ 20 đến nay Mathis Leger (1910) công bố

15 loài muỗi Anopheles ở Việt Nam, Toumanoff (1936) đã xác định 19 loài Anopheles ở miền Bắc Trần Đức Hinh (1995) tổng hợp danh sách 58 loài Anopheles và phân tích sự phân bố của muỗi Anopheles theo cảnh quan, độ cao

và theo vùng địa lý tự nhiên [4] Đến nay đã phát hiện được 64 loài muỗi

Anopheles, trong đó có 3 véc tơ SR chính là Anopheles (An.) dirus, An minimus

và An epiroticus [5]

Tại nhiều địa phương Việt Nam, muỗi An dirus và An minimus phát hiện được ở thôn và trong rừng rẫy Mật độ muỗi An dirus đốt người ở rừng, rẫy luôn cao hơn ở thôn Tại Khánh Phú (Khánh Hòa, 2003) muỗi An dirus chiếm tỷ lệ 83,11% ở nhà rẫy và 96,94% ở trong rừng Mật độ muỗi An dirus đốt người

trong rừng là 7,56 con/người/đêm, nhà rẫy là 7,24 con/người/đêm, khu bìa rừng

là 3,55 con/người/đêm và trong thôn là 0,53 con/người/đêm [6] Nhiều nghiên cứu cho thấy người thường xuyên đi rừng, ngủ rẫy có nguy cơ nhiễm SR cao hơn người làm việc khác Tại Đắk Nhau (Bình Phước, 2016) có mối liên quan giữa làm rẫy với nhiễm ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) Người làm rừng và rẫy có nguy cơ mắc SR cao gấp 1,76 lần và 1,37 lần so với nghề khác [7].

Tại Việt Nam khi triển khai Chương trình Phòng chống và loại trừ SR từ năm 2011, hiện nay đã đạt những thành tích đáng kể, tuy nhiên vẫn còn những vùng SR lưu hành nặng Hàng năm Chương trình phòng chống SR vẫn triển khai phun hóa chất tồn lưu trong nhà hoặc tẩm màn tại thôn và phát màn tồn lưu lâu cho đối tượng đi rừng, ngủ rẫy nhưng SR vẫn tồn tại dai dẳng

Một trong những nguyên nhân dẫn tới SR vẫn lưu hành ở một số nơi là các biện pháp phòng chống véc tơ hiện tại chưa đạt được hiệu quả mong muốn Tại khu vực này người dân có tập quán ngủ rừng, ngủ rẫy Các cảnh quan khác nhau giữa trong thôn, trong rẫy và trong rừng dẫn tới phân bố véc tơ SR và lan truyền

SR tại các khu vực này cũng khác nhau

Vì vậy, nghiên cứu thành phần loài muỗi Anopheles, phân bố, một số tập tính

và vai trò của véc tơ sốt rét cũng như tìm kiếm biện pháp, công cụ phòng chống véc

tơ sốt rét vừa khả thi, vừa hiệu quả và phù hợp với từng nhóm đối tượng là cấp bách

và cần thiết Từ đó đưa ra một số khuyến nghị cho Chương trình Phòng chống SR và loại trừ SR nhằm hạn chế khả năng muỗi đốt người sẽ góp phần giảm tỷ lệ mắc và

chết do SR gây ra Do đó chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu:“Đánh giá lưu hành,

vai trò truyền bệnh, độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi truyền sốt rét

ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020”với hai mục tiêu

1 Xác định thành phần loài, phân bố, một số tập tính đốt mồi, tập tính ưa đốt vật chủ của muỗi truyền bệnh sốt rét tại Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020

2 Đánh giá độ nhạy cảm của muỗi Anopheles với hóa chất diệt côn trùng

và vai trò truyền bệnh của muỗi truyền sốt rét tại điểm nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Nghiên cứu về muỗi Anopheles

1.1.1 Nghiên cứu về muỗi Anopheles trên Thế Giới

Họ muỗi Culicidae Meigen, 1818 có 3.528 loài, được chia thành 2 phân họ

là Culicinae Meigen, 1818; Anophelinae Grassi, 1900 Phân họ Anophelinae

được chia thành 3 giống là Anopheles Meigen, 1818; Bironella Theobald, 1905;

Chagasia Cruz, 1906 Các loài muỗi có khả năng truyền SR gọi là véc tơ SR đều

thuộc giống Anopheles [8] Ross R tại Ấn Độ (1997) và các nhà SR của Italia (1998) là Grassi G B., Bignami A., Bastianelli G., Celli A., Golgi C và Marchiafava E chứng minh SR ở người do muỗi truyền, đó là loài Anopheles [9] Đầu thế kỷ 20 Watson M là nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu biện pháp phòng chống muỗi [10]

Sinka M và cộng sự (2012) đã tổng hợp 465 loài Anopheles trên thế giới, trong đó có khoảng 70 loài có khả năng truyền bệnh SR ở người và có 41 loài là véc tơ SR chính [2] Ở các vùng địa lý khác nhau có những loài muỗi truyền SR

khác nhau Ở Châu Phi véc tơ SR chính là An gambiae, An funestus, An

arabiensis, An males, An merus, An moucheti, An nili; Châu Mỹ có An albimanus, An albitarsis, An aquasalis, An darlingi, An freeborni, An marajoara, An nuneztovari, An pseudopunctipennis, An quadrimaculatus ;

Châu Âu có An atroparvus, An labranchiae, An messeae, An sacharovi,

An sergentii, An superpictus; Châu Á có An aconitus, An annularis, An balabacensis, An barbirostris, An culicifacies, An dirus, An farauti, An flavirostris, An fluviatilis, An koliensis, An lesteri, An leucophyrus, An maculatus, An minimus, An punctulatus, An sinensis, An stephensi, An supictus, An sundicus [11]

1.1.2 Nghiên cứu về muỗi Anopheles tại Việt Nam

Đầu thế kỷ 20, Mathis Leger (1910) tổng hợp 15 loài Anopheles ở Việt Nam, Toumanoff (1936) đã tổng hợp 19 loài Anopheles ở miền Bắc Galliard và Đặng Văn Ngữ (1946) đã xây dựng bảng định loại muỗi Anopheles gồm 22 loài

ở Việt Nam Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng (1968) đã xuất bản khoá định loại muỗi Anopheles ở Việt Nam gồm 32 loài Nguyễn Đức Mạnh (1988)

đã tổng kết các nghiên cứu về muỗi SR ở Tây Nguyên từ 1976 đến 1983 tổng hợp danh sách gồm 38 loài Anopheles phân bố theo độ cao và sinh cảnh [12]

Trần Đức Hinh (1997, 1995) tổng hợp danh sách 58 loài Anopheles và 1 dạng sp trên toàn quốc Tác giả phân tích sự phân bố của muỗi Anopheles theo cảnh quan, độ cao, vùng địa lý tự nhiên và có một số nhận xét về phân bố: 5 loài gặp ở mọi vùng tự nhiên, 20 loài chỉ phát hiện ở vùng núi đồi, 2 loài chỉ phân bố

ở vùng nước lợ, 29 loài chỉ gặp ở một số khu địa lý nhất định [13],[14] Trần Đức Hinh (1997) đã điều tra véc tơ SR tại 96 điểm thuộc 31 tỉnh trên toàn quốc

nhận thấy An maculatus là một phức hợp ít nhất 4 loài, nâng tổng số muỗi

Anopheles ở Việt Nam lên 59 loài [13]

Hồ Đình Trung (2005) đã tổng hợp danh sách 59 loài Anopheles, chưa kể

một số là phức hợp đồng hình gồm nhiều loài thành viên như An minimus có 2 loài, An maculatus có ít nhất 10 loài [15]

Đến nay tại Việt Nam đã xác định được có 63 loài muỗi Anopheles Trong

đó có 3 véc tơ chính truyền SR là An dirus, An minimus và An epiroticus Một

số véc tơ phụ như An aconitus, An jeyporiensis, An maculatus, An sinensis,

An subpictus, An vagus Ngoài ra một số loài Anopheles khác nghi ngờ là véc

tơ SR như An lesteri, An nimpe, An interruptus, An culicifacies [5]

Vũ Đức Chính (2011) đã xây dựng bản đồ phân bố muỗi An dirus,

An minimus, An epiroticus, An jeyporiensis, An aconitus, An maculatus,

An supictus, An sinensi và An vagus tại Việt Nam [16]

1.2 Một số tập tính của muỗi Anopheles

1.2.1 Tập tính giao hoan

Anopheles trưởng thành, sau khi lột xác từ quăng và thành thục, chúng tìm kiếm bạn tình, thường vào lúc chập tối Nếu lột xác xuất hiện vào buổi chiều, thì giao phối tiến hành vào vài giờ sau đó, nhưng nếu lột xác xuất hiện vào lúc đêm thì giao phối vẫn thực hiện vào buổi tối sau đó Các cá thể đực tập trung lại thành từng đám vào lúc tối thường trên ngọn của các cây bụi hay những đồ vật khác, trong khi đó các cá thể cái xâm nhập vào những đám muỗi đực này Mỗi cá thể

cái nhanh chóng chộp lấy một con đực và thành cặp thoát ra khỏi đám muỗi đực

Wharton (1953) khảo sát sự tập trung thành đám của An philippinensis, An indiensis,

An vagus, An kochi và An maculatus ở Tampin, Malaya; các đám An maculatus

tập trung ở độ cao 5 - 6 mét, chúng ở cao hơn so với các loài khác Quraishi

(1965) ước tính vào buổi tối mỗi đám muỗi 500 - 600 cá thể đực An stephensi var mysorensis thì có khoảng 400 lần muỗi ghép cặp

1.2.2 Tập tính tìm vật chủ

Muỗi sau khi giao phối, các cá thể cái tìm vật chủ để đốt máu, quá trình này rất quan trọng cho việc tạo trứng của muỗi Những thí nghiệm trong phòng thí nghiệm đã chỉ ra rằng các yếu tố quan trọng như vật chủ thích hợp, nhiệt độ,

độ ẩm,… quyết định sự đốt máu của muỗi Nhưng những hoạt động này trong tự nhiên như thế nào vẫn chưa được biết đến [5] Những yếu tố nhìn thấy bằng mắt thường như sự di chuyển của vật chủ thì quan trọng đối với những loài Aedes đốt ban ngày, nhưng ít quan trọng đối với Anopheles đốt ban đêm Có nhiều bằng chứng về sự tìm vật chủ trong tự nhiên bao gồm một chuỗi các phản ứng liên tục

để trả lời các kích thích khác nhau (Clements, 1963), ví dụ như sự trú đậu trước khi đốt mồi đã khảo sát ở nhiều loài thuộc Anopheliae và Culicinae, ở những loài này các cá thể cái trú đậu gần vật chủ trong vài phút hay vài giờ trước khi tấn công và đốt mồi (Wharton, 1962)

Dường như các cá thể cái Anopheles bị hấp dẫn bởi vật chủ dựa vào sự kích thích từ vật chủ, có thể là mùi hay CO2 được cảm nhận thông qua râu Những kích thích này từ vật chủ bay theo hướng gió, và muỗi Anopheles thường

có ở chiều gió thổi từ vật chủ (Bertram, 1956) Về khoảng cách như thế nào mà kích thích này ảnh hưởng đến muỗi vẫn chưa được biết tới, nhưng có thể là 10 thước hay 1 dặm, các nhân tố như kích thước vật chủ và nồng độ CO2 thải ra, nồng độ mùi, sự di chuyển trong không khí và các điều kiện khí quyển khác, tất

cả các yếu tố đó đều ảnh hưởng đến khoảng cách mà muỗi cảm nhận được kích thích từ vật chủ Trước khi muỗi đói tới phạm vi có kích thích này thì nó bay tìm kiếm ngẫu nhiên Một giai đoạn dễ dàng nhận thấy ở muỗi mà có thể bắt chúng được nhiều xung quanh các vật chủ mà chúng ưa thích, như chúng trú đậu trên những cây cỏ gần chuồng gia súc Những nghiên cứu về sự trú đậu trước khi đốt

mồi có thể là cả sinh lý và tập tính của chúng; những nghiên cứu trước đó cho hay muỗi có hoóc môn để làm thay đổi từ trạng thái bay sang trạng thái trú đậu,

và từ trạng thái trú đậu sang trạng thái bay để tấn công vật chủ

Trong khi đó, phải chăng sự kích thích từ vật chủ phải đạt đến một nồng

độ thấp nhất hay một ngưỡng nào đó để đủ phản ứng từ muỗi, hơn nữa ngưỡng này tối thiểu là mùi vật chủ đặc biệt và biến đổi tuỳ thuộc vào từng loài muỗi hay những vật chủ của chúng Ví dụ, sức lan toả của mùi từ một con bò thì 5 thước

đủ để hấp dẫn muỗi An kochi và An vagus đang trú đậu gần đó Những muỗi

đói cần có một giai đoạn bay phân tán tự do trước khi phản ứng với kích thích từ vật chủ, và chúng hướng về nơi trú đậu và khu vực sinh sản trước khi trả lời kích thích vật chủ hay bắt đầu tìm kiếm vật chủ

1.2.3 Tập tính đốt mồi

Sau khi rình mồi, chúng lập tức tấn công vật mồi ở vị trí thích hợp trên cơ thể vật mồi như những chỗ ấm, ẩm, có mùi và CO2 Thông thường khi chúng bắt đầu tiếp xúc với vật chủ, thì một loạt kích thích cần thiết trước khi chúng thực hiện đốt máu Những kích thích này ảnh hưởng một cách liên tục đến những thụ cảm ở bàn chân, bao môi, môi trên… phối hợp với nhau giúp chúng thực hiện việc đốt mồi Muỗi đực không hút máu mà chúng chỉ hút nhựa cây, hay mật hoa

để sinh sống Những muỗi cái chủ yếu hút máu người và động vật sống, cũng hút nước đường nhưng rất ít [5]

Một loài muỗi được coi là đốt mồi trong nhà (endophagic) khi chúng chủ yếu đốt máu trong nhà, hay đốt mồi ngoài nhà (exophagic) khi chúng chủ yếu đốt máu ngoài nhà

1.2.4 Tập tính trú đậu

Sau khi đốt máu, những muỗi cái bụng no máu, chúng thường tìm nơi trú đậu để tiêu máu ở gần vật chủ, đồng thời dịch thừa bị đào thải ra ngoài qua lỗ hậu môn Cũng có khi chúng quay trở lại chỗ trú đậu trước khi đốt mồi Nếu chúng đốt người trong nhà thì chúng thường đậu trên tường trong phòng, điều này có ý nghĩa trong việc phun hoá chất tồn lưu trên tường do đó chúng sẽ tiếp xúc với hoá chất

Theo định nghĩa, các loài trú đậu trong nhà (endophilic) là những loài trú đậu trong nhà ở của người hay chuồng gia súc để thực hiện quá trình tiêu máu và phát triển trứng (quá trình tiêu sinh), còn những loài khác không trú đậu trong nhà ở của người hay chuồng gia súc để thực hiện quá trình tiêu máu và phát triển trứng là những loài trú đậu ngoài nhà (exophilic) [5].

1.2.5 Tập tính sinh sản

Sau khi đốt no máu ở đêm thứ nhất, sau 2 đêm chúng đẻ trứng, tức là đẻ trứng sau 48 giờ đốt máu Muỗi cái tìm chỗ đẻ trứng thích hợp, hầu như chúng cũng phản ứng liên tục với hàng loạt các kích thích cũng giống như khi chúng tìm kiếm đốt máu, dĩ nhiên các kích thích này khác nhau Trứng muỗi Anopheles được đẻ xuống nước, trứng có phao hai bên và nổi rời rạc trên mặt nước

Muỗi cái thường chỉ giao phối một lần, nhưng đẻ trứng suốt đời theo từng đợt Để làm được như vậy đa số muỗi cái cần phải đốt máu Việc đồng thời tiêu máu và phát triển trứng cần khoảng 2 - 3 ngày ở vùng nhiệt đới và lâu hơn ở vùng khí hậu ôn hoà Muỗi cái khi có trứng, bay tìm nơi thích hợp để đẻ Sau đó lại hút máu và đẻ một lứa trứng khác Chu trình này cứ lặp lại cho đến khi muỗi chết

Bọ gậy của véc tơ chủ yếu ở các con suối, mạch nước, suối nhỏ, hốc cây, hốc đá đọng nước có ánh sáng rọi trực tiếp hoặc không trực tiếp Bọ gậy còn bắt được ở mương nước ruộng bậc thang, hốc đá và ở những bể xi măng ở ven sông (Toumanoff, 1937), đôi khi bắt được ở các giếng ven suối [5] Ngoài ra, bọ gậy

của một số loài như An epiroticus, An subpictus phát triển ở thủy vực nước lợ

ven biển

1.3 Vai trò truyền bệnh của véc tơ sốt rét

1.3.1 Vai trò truyền bệnh của Anopheles minimus

Nghiên cứu của các tác giả Muirhead Thomson (1941), Chacrabakti (1957), Das (1985), Dutta (1987), Dev (1996) khẳng định vai trò truyền SR của

An minimus sl ở nhiều nước Đông Nam Á và Nam Á [17] Ở Ấn Độ một số nghiên cứu từ lâu như Muirhead Thomson (1941), Chacrabakti AK.(1957) đã

khẳng định vai trò véc tơ truyền sốt rét của An minimus ở nhiều vùng thuộc

nước này Tại bang Orissa (miền trung đông Ấn Độ) theo nghiên cứu từ

2001 - 2005 của Shahu và cộng sự (2008) thấy rằng An minimus chỉ chiếm

9% trong thành phần 19 loài muỗi Anopheles nhưng tỷ lệ nhiễm thoa trùng của

loài này là 1,4% và An fluviatilis (cũng thuộc series Myzomya) là 0,9% [18]

Ở Thái Lan, Ismail và cộng sự (1974,1975, 1978) nghiên cứu những quần

thể An.minimus vùng bìa rừng thấy chúng có 2 đỉnh phát triển vào đầu và cuối

mùa mưa, loài này là trung gian chính truyền bệnh sốt rét ở vùng rừng núi Thái Lan Tỷ lệ đốt người ngoài nhà cao hơn trong nhà từ 4,4 đến 5,8 lần [19]

Ratanatham và cộng sự (1988) nghiên cứu vai trò truyền bệnh của An minimus ở

huyện Pakchong tỉnh Nakhon Ratchasima, Thái Lan thấy tỷ lệ nhiễm Oocyste là 0,4% (mổ 1518 dạ dày muỗi), thoa trùng 0% (mổ tuyến nước bọt 1580 muỗi) [20]

Kết quả mổ tuyến nước bọt và ELISA xác định thoa trùng trong muỗi thu thập từ một số điểm ở Việt Nam cũng đã khẳng định vai trò truyền bệnh của loài này [21] Vũ Thị Phan (1975) đã tổng kết số liệu chứng minh vai trò truyền bệnh

của An minimus trong các vụ dịch sốt rét ở đồng bằng miền Bắc Việt Nam [22]

Ở Tây Nguyên, miền Trung, An minimus truyền SR quanh năm, trong đó có 2

đỉnh là các tháng 3, 4, 5 và 9, 10, 11 Kết quả mổ muỗi từ 1976-1986 cho thấy

An minimus nhiễm nang trùng (oocyste) 3,72%, nhiễm thoa trùng (sprozoite)

1,12% [12] Kết quả ELISA muỗi An minimus thu thập từ 2001-2003 ở Trà My

tỉnh Quảng Nam nhiễm thoa trùng là 2,86%, ở xã Chư Sê, tỉnh Gia Lai là 1,15% [23] Tại điểm nghiên cứu Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà kết quả mổ trực tiếp

An minimus nhiễm nang trùng là 1,32%, thoa trùng là 3,58%; kết quả ELISA là

8,37% (1993-1995) Nói chung An minimus có tỷ lệ nhiễm thoa trùng cao và là

véc tơ truyền SR mạnh Tác giả cũng đã tính được chỉ số khả năng truyền bệnh

(Vectorial Capacity -VC) của An minimus tại đây ở thời điểm này là 1,6 (trong khi của An dirus cũng là véc tơ chính chỉ là 0,28) [24] chứng tỏ mức độ nguy

hiểm của An minimus là rất cao

1.3.2 Vai trò truyền bệnh của Anopheles dirus

An dirus đã được xác định là véc tơ truyền bệnh sốt rét quan trọng vùng

Đông Nam Á, nhất là vào mùa mưa Mức độ nguy hiểm của loài này cao do những nguyên nhân chủ yếu là ưa đốt máu người, dễ nhiễm ký sinh trùng và có tuổi thọ cao cho nên chỉ cần một quần thể nhỏ cũng có thể duy trì SR lưu hành

nặng trong một cộng đồng [25] Tỷ lệ nhiễm thoa trùng của An dirus cũng thay

đổi theo mùa, chẳng hạn ở một điểm miền nam Myanmar tỷ lệ thoa trùng giữa mùa mưa là 3%, cuối mùa mưa là 5% và mùa khô lạnh là 8,3% [26],[25] Tuy

rằng về mùa khô lạnh tỷ lệ thoa trùng trong muỗi An dirus cao nhưng ngược lại

mật độ quần thể của chúng lại rất thấp

Tại Banglades, 3,8% An dirus nhiễm thoa trùng là tỷ lệ cao nhất trong các

loài Anopheles bắt được ở đây Người ta đã tính được trung bình khoảng 31%

muỗi An dirus đốt máu sống đủ thời gian để nhiễm ký sinh trùng P falciparum

Mặc dù mật độ ít hơn 10 con muỗi đốt một người trong một đêm nhưng tổng cộng một người dân có thể bị hơn 200 con muỗi nhiễm trùng đốt trong 2 năm [27]

Ở Việt Nam cho đến nay tỉ lệ nhiễm thoa trùng phát hiện bằng phương pháp

mổ tuyến nước bọt ở An dirus cao nhất được ghi nhận ở các thời điểm từ 1993 đến

1995 là 3,98%; vào tháng 2/2004 tỷ lệ này là 4,5% tại xã Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà [28] Phát hiện bằng phương pháp ELISA 8,53% (1993-1995) [29],[21],[28] Trương Văn Có và cộng sự đã tổng kết kết quả ELISA trong khoảng thời gian 2001-

2003 thấy tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng SR của An dirus ở Vân Canh, tỉnh Bình Định

thay đổi theo mùa và cao nhất trong các tháng 10, 11 tương ứng là 2,06 % và 2,94% [24] Những vùng rừng núi ở Việt Nam có mặt của An dirus thì đồng thời cũng thường có mặt của An minimus Về mùa mưa quần thể An dirus có điều kiện phát triển mạnh và giữ vai trò chính, nhưng về mùa khô thì vai trò của An minimus lại trội hơn Hai véc tơ này cùng nhau hợp lực truyền bệnh làm cho sự lan truyền xảy ra gần

như quanh năm [21] Kết quả theo dõi 3 năm (2002 - 2004) về khả năng truyền bệnh

ở các sinh cảnh khác nhau tại Khánh Vĩnh, Khánh Hoà các tác giả đã tính được chỉ số

nhiễm ở trong rừng, bìa rừng và tại thôn bản của An dirus (Entomological

Inoculation Rate - EIR) trong rừng là 46,4; bìa rừng là 18,1; ở tại thôn chỉ là 0,32 [28] Điều này càng chứng tỏ mức độ lan truyền SR trong rừng do An dirus

1.3.3 Vai trò truyền bệnh của một số véc tơ phụ ở Việt Nam

Mặc dù vai trò truyền bệnh của các véc tơ chính An minimus, An dirus,

An epiroticus ở Việt Nam đã rất rõ ràng, nhưng có bằng chứng chứng minh rằng

các véc tơ phụ cũng góp phần truyền bệnh bởi chúng có kết quả ELISA dương

tính như An aconitus (0,46%), An jeyporiensis (0,15%), An maculatus (8,1%),

An vagus (1,09%) (Trần Đức Hinh và cộng sự, 1997) [13]

Khi điều kiện môi trường thay đổi có thể những véc tơ phụ này có điều kiện phát triển thuận lợi và vai trò truyền bệnh của chúng có thể tăng lên

1.4 Tình trạng kháng hóa chất diệt côn trùng của véc tơ sốt rét

Ngoài nước:

Thống kê tới năm 1998 đã có 504 loài côn trùng và ve bét kháng với một hoặc nhiều nhóm hoá chất Trong số các loài này có khoảng 60% là côn trùng nông nghiệp còn 40% là côn trùng y học và kí sinh trùng thú y [30]

Đối với muỗi, lần đầu tiên vào năm 1947 được thông báo Cx

tritaeniorhynchus và Ae solicitans đã kháng DDT Năm 1976 Tổ chức Y tế Thế giới

(WHO) thông báo có 43 loài muỗi kháng DDT và 10 năm sau (năm 1986) số loài kháng đã tăng lên tới 51 loài, trong đó có 34 loài là véc tơ SR [31] Sự kháng DDT của muỗi lan rộng nhiều nơi trên thế giới làm kém hiệu quả phòng chống véc tơ dẫn tới việc phải tìm hoá chất thay thế Nhiều hoá chất có khả năng diệt muỗi đã được đưa ra thử nghiệm và đem lại kết quả tốt, đã được WHO khuyến cáo sử dụng trong chương trình phòng chống SR Sau thời gian sử dụng không lâu, vấn đề mới lại nảy sinh khi các hoá chất này cũng dần dần bị các véc tơ kháng Theo thống kê năm 1991 đã phát hiện 55 loài muỗi kháng hoá chất, trong

đó có 53 loài kháng DDT, 27 loài kháng photpho hữu cơ, 17 loài kháng carbamat, 10 loài kháng pyrethroid tổng hợp Chỉ sau một năm, tới năm 1992 WHO đã công bố 72 loài muỗi kháng hoá chất, trong đó 69 loài kháng DDT, 38 loài kháng photpho hữu cơ, 17 loài kháng cả 3 loại hoá chất trên Sự kháng hoá chất của muỗi ngày càng tăng cả về số lượng loài, mức độ và kháng chéo với nhiều hoá chất Đến năm 2000 đã có khoảng 100 loài muỗi kháng hoá chất trong

đó hơn 50 loài Anopheles [32] Một trong những lý do dẫn đến sự kháng hoá chất ngày càng nhanh, trầm trọng và lan rộng hơn là việc sử dụng hoá chất tràn lan trong nông nghiệp và trong y tế

An vagus và An sinensis ở miền Trung [33],[34] Kháng DDT cũng được phát

hiện ở An sundaicus, An subpictus, An vagus, An sinensis, An peditaeniatus

tại một số địa phương thuộc Nam Bộ [35] Nói chung các nghiên cứu trước năm

1996 ở Việt Nam đều có nhận xét là một số véc tơ SR kháng DDT nhưng vẫn còn nhạy với các hóa chất nhóm pyrethroid Một số nghiên cứu gần đây cho thấy

véc tơ chính miền rừng núi An dirus có thể kháng với pyrethroid, An minimus cũng một số điểm tăng sức chịu đựng (nay gọi là có thể kháng), An epiroticus

nhiều nơi ở miền Tây Nam bộ đã kháng cao với pyrethroid [36]

Năm 2013, Viện Sốt rét Ký sinh trùng - Côn trùng trung ương đã xây dựng được các bản đồ nhạy cảm của 9 loài véc tơ sốt rét với 6 loại hóa chất diệt côn trùng ở Việt Nam từ 2003 - 2012 Trong đó, 49/132 điểm thử kháng với alphacypermethrin; 59/126 điểm thử kháng với lambdacyhalothrin; 4/10 điểm thử kháng với deltamethrin; 34/77 điểm thử kháng với permethrin; 16/59 điểm thử kháng với DDT và 1/6 điểm thử kháng với etofenprox [37]

Khi một quần thể muỗi nào đó kháng với nhiều nhóm hoá chất thì việc lựa chọn biện pháp phòng chống trở nên rất khó khăn Như vậy kháng hoá chất của véc tơ SR là vấn đề lớn, trầm trọng và có tính phổ biến trên toàn cầu mà WHO

và các chương trình quốc gia phòng chống SR phải đương đầu Chính vì thế nghiên cứu cơ chế kháng hoá chất của muỗi và tìm giải pháp chống kháng là hướng nghiên cứu quan trọng để nâng cao hiệu quả của công tác phòng chống véc tơ SR

1.5 Tình hình sốt rét tại Việt Nam và điểm nghiên cứu

Năm 2019, toàn quốc có 5887 bệnh nhân sốt rét giảm 14,31% so với năm

2018, số ký sinh trùng sốt rét giảm 3,08% Số lượng bệnh nhân sốt rét trong các tháng năm 2019 giảm thấp ở các tháng 4, tháng 9 và tháng 12 Trong 2 năm gần đây, BNSR giảm vào tháng 12 sau chu kỳ tăng từ tháng 10 và tháng 11 Trong

năm 2019, BNSR cao nhất ở tháng 11, tuy nhiên chênh lệch giữa các tháng không nhiều, tăng giảm trong khoảng 100 trường hợp giữa các tháng

Số lượng KSTSR 10 tỉnh cao nhất chiếm 91,77% tổng số KST toàn quốc (4.281/4.665): Gia Lai 1.763 trường hợp, Phú Yên 673 trường hợp, Đắk Lắk 648 trường hợp, Bình Phước 330 trường hợp, Bình Thuận 307 trường hợp, Lâm Đồng

188 trường hợp, Đắk Nông 126 trường hợp, Khánh Hòa 95 trường hợp, Quảng Nam 79 trường hợp, Quảng Trị 72 trường hợp Trong đó, KSTSR tập trung chủ yếu ở 3 tỉnh chiếm 66,11% (3.084/4.665) là: Gia Lai, Phú Yên và Đắk Lắk

Tại tỉnh Đắk Nông và Bình Phước là tỉnh có Vườn Quốc Gia Bù Gia Mập Mặc dù sốt rét năm 2019 đã giảm hơn 40% tại Đắk Nông và 70% tại Bình Phước, tuy nhiên khu vực Vườn quốc gia Bù Gia Mập vẫn là một điểm nóng về sốt rét Tại đây, người dân vẫn đi rừng ngủ rẫy, vào rừng Quốc gia Bù Gia Mập

để khai thác lâm sản, dân giao lưu biên giới còn cao, việc quản lý bệnh nhân trên các đối tượng di biến động gặp khó khăn (theo Báo cáo kết quả phân vùng dịch

tễ sốt rét năm 2019)

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu 1:

Xác định thành phần loài, phân bố, một số tập tính đốt mồi, tập tính ưa đốt vật chủ của muỗi truyền bệnh sốt rét tại Vườn quốc gia Bù Gia Mập, năm 2020

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Các loài muỗi, bọ gậy thuộc giống Anopheles tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu:

- Thời gian: Từ tháng 3 đến tháng 12 năm 2020 Điều tra 02 đợt: tháng 5 và tháng 11 năm 2020

- Địa điểm nghiên cứu: Vườn quốc gia Bù Gia Mập

Hình 2.1 Địa điểm điều tra

Vườn quốc gia Bù Gia Mập nằm ở phía Đông Bắc tỉnh Bình Phước, trên địa bàn xã Bù Gia Mập, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước, tại vị trí cực Bắc của tỉnh Phía Đông vườn quốc gia này là tỉnh Đắk Nông, phía Tây Bắc là biên giới Việt Nam - Campuchia Vườn quốc gia Bù Gia Mập có tổng diện tích 26.032 ha, nhưng trong đó diện tích rừng tự nhiên là 21.376 ha, bao gồm: 388 ha rừng giàu, 2.798 ha rừng trung bình, 1.692 ha rừng nghèo, 5.064 ha rừng hỗn

giao và 11.434 ha rừng tre nứa Vùng đệm vườn quốc gia có diện tích 15.200 ha gồm 7.200 ha thuộc tỉnh Bình Phước và 8.000 ha của tỉnh Đắk Nông Các sông, suối khá nhiều, nhưng đa phần có lưu vực hẹp, độ dốc lòng sông lớn, lưu lượng dòng chảy phụ thuộc nhiều vào chế độ mưa Các điều kiện tại điểm nghiên cứu

thuận lợi cho sự phát triển của muỗi, đặc biệt véc tơ chính An dirus

Một số khái niệm trong luận văn:

- Sinh cảnh rừng: là khu vực thảm thực vật chưa bị chặt phá

- Sinh cảnh bìa rừng hoặc rìa rừng: là vùng chuyển tiếp (vùng đệm) từ một khu vực rừng hoặc rừng đến các cánh đồng hoặc các không gian mở khác

- Sinh cảnh rẫy: là khu vực người dân phát rừng trồng cây công nghiệp hoặc cây nông nghiệp, tại một số rẫy người dân làm nhà tạm để ở

- Ổ nước ven suối: là những vũng nước đọng ở hai bên bờ suối

- Ổ nước ven đường: là những vũng nước đọng ven đường đi

- Suối: là dòng nước chảy tự nhiên

2.1.3 Thiết kế phương pháp nghiên cứu:

a Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang xác định thành phần loài phân bố, một số tập tính đốt mồi, tập tính ưa đốt vật chủ, tập tính đẻ trứng của muỗi truyền bệnh sốt rét, phân bố của bọ gậy theo thủy vực tại Vườn quốc gia Bù Gia Mập

b Cỡ mẫu nghiên cứu:

Thu thập toàn bộ các mẫu muỗi, bọ gậy Anopheles

c Phương pháp chọn mẫu:

- Chọn chủ đích các điểm điều tra:

+ Trong rừng: chọn 3 vị trí trong rừng để bắt muỗi bằng bẫy màn Vị trí các điểm bắt muỗi gần suối nước chảy, khoảng cách giữa các điểm điều tra tối thiểu 100 mét Điều tra bọ gậy dọc theo suối và các ổ nước gần khu vực điều tra được muỗi

+ Bìa rừng: chọn 3 nhà để mồi bắt muỗi trong nhà và 3 vị trí ngoài nhà để bắt muỗi bằng bẫy màn, chọn 5 nhà để đặt bẫy đèn, điều tra muỗi ở chuồng gia súc, soi trong nhà ban ngày Điều tra bọ gậy dọc theo suối và các ổ nước gần khu vực điều tra được muỗi

d Nội dung nghiên cứu

- Xác định thành phần loài, phân bố của muỗi Anopheles trong rừng và bìa rừng: + Điều tra muỗi được tiến hành theo quy trình của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng trung ương, thời lượng điều tra là 6 đêm/đợt điều tra Các phương pháp điều tra: bẫy màn bằng mồi người trong rừng, bẫy màn bằng mồi người ngoài nhà và bẫy màn bằng mồi người trong nhà từ 18 đến 24 giờ, soi chuồng gia súc từ 19 đến 23 giờ, bẫy đèn trong nhà từ 18 giờ hôm trước đến 6 giờ sáng hôm sau (nhà đặt bẫy không trùng với nhà mồi bắt muỗi), soi trong nhà ban ngày từ 7 - 10 giờ sáng soi 30 nhà/buổi

+ Định loại muỗi bằng hình thái Bảng định loại Anopheles ở Việt Nam

- Đánh giá tập tính sinh học của muỗi Anopheles:

+ Tập tính đốt mồi theo thời gian trong đêm + Tập tính đốt mồi theo vị trí trong nhà, ngoài nhà + Tập tính đẻ trứng

+ Tập tính ưa thích vật chủ

- Điều tra bọ gậy: Điều tra các ổ bọ gậy tại khu vực nghiên cứu sau khi điều tra muỗi Điều tra bọ gậy trong khu vực bán kính 300 mét từ điểm bắt được muỗi Điều tra tất cả ổ nước trong điểm nghiên cứu Mô tả sinh cảnh ổ bọ gậy Anopheles: Ánh sáng, đo độ pH, nhiệt độ nước, quan sát tình trạng nước (chảy, tĩnh; trong, đục; độ sâu, diện tích; đáy là cát, sỏi, đất, bùn ; thực vật thuỷ sinh) Qua đó xác định:

+ Thành phần loài bọ gậy Anopheles + Số lượng, mật độ bọ gậy Anopheles

+Phân bố bọ gậy Anopheles

- Xác định máu vật chủ trong muỗi bằng phương pháp khuếch tán trên thạch theo quy trình của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trung trung ương Kết quả thu được sẽ cho thông tin về tập tính ưu thích vật chủ của muỗi

e Các biến số trong nghiên cứu

- Các loài muỗi bọ gậy Anopheles

- Số liệu từ các phương pháp thu thập muỗi: bẫy màn bằng mồi người ngoài nhà, bẫy màn bằng mồi người trong nhà, bẫy màn bằng mồi người trong rừng; soi chuồng gia súc; bẫy đèn trong nhà; soi trong nhà ban ngày

- Số lượng muỗi, bọ gậy theo các phương pháp thu thập

- Các yếu tố môi trường của ổ bọ gậy

- Số lượng muỗi mổ xác định máu vật chủ

f Phiếu thu thập số liệu nghiên cứu

Biểu mẫu thu thập số liệu thành phần loài muỗi Anopheles gồm: Địa điểm, tọa độ, tên loài muỗi, số lượng muỗi, phương pháp điều tra

Biểu mẫu xác định máu vật chủ trong muỗi

Số muỗi bắt được Mật độ muỗi =

(con/giờ/người) Số người bắt x số giờ bắt + Mật độ các loài Anopheles thu thập bằng phương pháp soi trong nhà ban ngày được tính bằng công thức:

Số muỗi bắt được Mật độ muỗi =

(con/nhà) Tổng số nhà soi + Mật độ các loài Anopheles thu thập bằng phương pháp bẫy đèn được tính bằng công thức:

Số muỗi bắt được Mật độ muỗi =

(con/bẫy/đêm) Số bẫy x số đêm bắt

h Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

- Kỹ thuật điều muỗi:

Điều tra muỗi được tiến hành theo quy trình của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trung trung ương [5] gồm có bẫy màn bằng mồi người ngoài nhà, bẫy màn bằng mồi người trong nhà, bẫy đèn trong nhà, soi muỗi trú đậu trong nhà ban ngày, soi chuồng gia súc ban đêm ở thôn, ở nhà rẫy và trong rừng

Phương pháp bẫy màn bằng mồi người ngoài nhà: Thời gian điều tra từ 18 giờ đến 24 giờ Tại mỗi điểm điều tra chọn 3 nhà để mồi, mỗi nhà có 1 người mồi ngoài nhà Bẫy màn bằng mồi người ở ngoài nhà thì ngồi cách nhà khoảng

30 - 50 m và không ngồi gần chuồng gia súc Điểm trong rừng chọn 3 vị trí mồi, mỗi vị trí có 2 người mồi Muỗi bắt được để riêng theo từng giờ Dùng dây cao

su buộc các tube đựng muỗi bắt được trong cùng một giờ với nhau

Phương pháp bẫy màn bằng mồi người trong nhà: Thời gian điều tra từ 18 giờ đến 24 giờ Tại mỗi điểm điều tra chọn 3 nhà để mồi, mỗi nhà có 1 người mồi trong nhà Khi mồi người ngồi mồi quần được xắn lên quá gối để lộ 2 chân

ra, ngồi yên chờ muỗi đến, cứ một vài phút lại dùng đèn pin soi xem có muỗi đậu lên chân thì bắt Khi phát hiện muỗi đậu lên chân, một tay cầm đèn pin soi, tay kia cầm tube bắt muỗi

Phương pháp bẫy đèn trong nhà: Đặt bẫy đèn trong nhà, thời gian từ 18 giờ hôm trước đến 6 giờ sáng hôm sau Mỗi nhà treo 1 bẫy đèn, những nhà này không trùng với nhà mồi bắt muỗi Treo bẫy đèn nên cách xa nguồn sáng khác

và cách mặt đất khoảng 1,5 m, cách giường ngủ khoảng 0,5 m Thu lồng bẫy vào

6 giờ sáng, người thu lồng bẫy cần ghi rõ số nhà, số bẫy, đặc điểm nơi đặt bẫy,

số người ngủ tối hôm đó

Phương pháp soi muỗi trú đậu trong nhà ban ngày: Soi bắt muỗi tại 30 nhà, thời gian từ 7 giờ đến 10 giờ Chọn những nhà kín gió, ở bìa thôn, gần thủy vực là nơi sinh sống của bọ gậy và quăng Cán bộ điều tra dùng đèn pin soi lần lượt các vị trí trong nhà, bắt đầu từ cửa vào và đi theo chiều kim đồng hồ Soi toàn bộ bề mặt tường vách và các vật dụng trong nhà Đặc biệt chú ý soi tìm muỗi đậu trên quần áo treo trong nhà, góc tủ, mái nhà từ 2m trở xuống

Phương pháp soi chuồng gia súc ban đêm: Thời gian bắt muỗi từ 19 giờ đến 23 giờ Chọn chuồng có nhiều trâu bò, gần thủy vực, gần rừng, kín gió Chuồng có mái lợp, xung quanh có gióng bằng tre hoặc gỗ để giữ không cho trâu

bò ra khỏi chuồng Bắt muỗi đang đốt máu trên trâu bò hoặc bắt muỗi đang đậu trên cây, cỏ, hàng rào, gióng xung quanh chuồng và mái của chuồng

Sử dụng máy định vị xác định tọa độ tất cả các điểm thu thập muỗi Sử dụng phần mền QGIS để xây dựng bản đồ phân bố véc tơ SR theo các cảnh quan điều tra

Mỗi mẫu muỗi sau khi định loại được bảo quản trong một ống eppendorf

có ghi mã số, mã số này được ghi vào biểu mẫu về địa điểm thu thập, phương pháp thu thập, thời gian thu thập, loài muỗi Các ống eppendorf được để trong túi có selicagel giữ cho muỗi khô, mang về phòng thí nghiệm tiến hành phân tích Muỗi thu thập được định loại dựa vào đặc điểm hình thái theo Bảng định loại Anopheles ở Việt Nam (Muỗi - Quăng - Bọ gậy) của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng trung ương (2008) [38]

Kỹ thuật điều tra bọ gậy:

Người điều tra đi dọc các thủy vực như suối, mương nước… trong thôn và rừng, rẫy, dùng bát múc nước ở các ổ nước đọng dưới tán lá cây Mỗi ổ nước múc khoảng 10 bát, dùng ống hút hút bọ gậy cho vào túi đựng bọ gậy Ghi mã số

ổ bọ gậy lên túi và ghi mã số ổ bọ gậy, ngày điều tra, địa điểm điều tra, đặc điểm sinh cảnh của nơi thu thập bọ gậy vào sổ ghi, chụp ảnh ổ bọ gậy

- Kỹ thuật định loại muỗi:

Theo kỹ thuật thường quy của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng trung ương [5]:

+ Quan sát, đối chiếu đặc điểm trên mẫu vật muỗi so với đặc điểm nêu trong khóa định loại

+ Dùng lúp tay đặt gần sát vào con muỗi, cách mắt người định loại 20 - 30

cm, di chuyển lúp từ từ xa dần con muỗi đến khi nhìn thấy rõ nhất các đặc điểm trên cơ thể muỗi, quan sát kỹ các đặc điểm và so sánh với các đặc điểm mô tả trong khóa định loại Chú ý lựa chọn góc quan sát và tư thế của muỗi hoặc

màucủa vật làm nền cho phù hợp để thấy được hình ảnh rõ nét nhất Để nhận dạng những đặc điểm hình thái nhỏ có thể dùng kính lúp hai mắt

+ Dùng bút viết kính ghi tên loài muỗi trên tube hoặc ghi nhãn bằng bút chì rồi cho nhãn vào tube đựng mẫu vật muỗi vừa định loại Sau khi định loại xong ghi số lượng từng loài, từng phương pháp bắt, giờ bắt vào biểu mẫu in sẵn

- Kỹ thuật xác định máu vật chủ trong muỗi bằng phương pháp khuếch tán trên thạch:

+ Chuẩn bị kháng huyết thanh: pha kháng huyết thanh theo tỷ lệ được ghi trên hướng dẫn đính kèm

+ Chuẩn bị máu muỗi: muỗi từ các phương pháp soi trong nhà ban ngày và bẫy đèn Các mẫu muỗi chứa máu vật chủ được giữ trong Beem Capsult: Mỗi một phần thân muỗi được lấy ra khỏi Beem Capsult cũng được cho vào trong một ống eppendoft, ngâm trong 1 ml dung dịch PBS, sử dụng chày nghiền nghiền phần thân muỗi thành một dung dịch đồng nhất sau đó ly tâm 10.000 vòng phút trong 5 phút và thu lấy phần nổi để làm thí nghiệm

+ Chuẩn bị gel agarose: cân 0,9 g agarose thêm vào 99,1 ml dung dịch barbiton buffer pH = 8,6; được 100 ml dung dịch 0,9% agarose Đun sôi dung dịch này trên máy khuấy từ có gia nhiệt hoặc lò vi sóng, rồi để dung dịch nguội tới khoảng 600C Lấy 5 ml dung dịch này nhỏ từ từ vào giữa tấm kính có kích thước 7,5 x 2,5 cm; hoặc 12 ml dung dịch đối với tấm kính có kích thước 10 cm

x 5 cm để tạo thành một lớp thạch dày khoảng 1 cm trên toàn bộ bề mặt của tấm kính Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng ít nhất 5 phút, sau đó để vào trong tủ lạnh giữ ở 40C ít nhất 2 giờ trước khi sử dụng Nếu cho các tấm kính này vào trong hộp, có nắp kín, tránh bay hơi nước thì các tấm thạch này có thể giữ được trong khoảng 3 tuần

+ Đục lỗ trên thạch: dùng ruột bút bi hoặc ống hút loại nhỏ tạo thành các lỗ nhỏ có đường kính khoảng 1 mm trên mặt thạch: lỗ ở giữa là để nhỏ mẫu máu muỗi, các lỗ xung quanh là để nhỏ các kháng nguyên của các loại vật chủ, khoảng cách từ lỗ giữa đến lỗ xung quanh khoảng 3 mm Thông thường với mỗi

lỗ nhỏ máu muỗi xung quanh thường có khoảng 6 lỗ để kháng nguyên của các

vật chủ khác nhau (thường là kháng nguyên của người, bò, trâu, gà, lợn, chó các loài vật chủ có mặt tại địa điểm thu thập mẫu)

+ Nhỏ 20 μl dung dịch máu muỗi vào lỗ giữa, mỗi lỗ bên nhỏ 10 μl dung dịch kháng nguyên Các dung dịch này sẽ khuếch tán qua thạch và sau khoảng 4-5 giờ

ta có thể quan sát được các trường hợp dương tính các mẫu dương tính sẽ tạo thành các vạch giống hình móng tay ở khoảng giữa lỗ trung tâm và lỗ xung quanh

- Kỹ thuật vẽ bản đồ phân bố ổ bọ gậy, muỗi:

+ Sử dụng phần mềm QGIS phiên bản 2.18 được tải miễn phí trên trang:

https://qgis.org/en/site/ QGIS là phần mềm biên tập bản đồ dựa trên mã nguồn

mở cho phép sử dụng miễn phí

+ Dữ liệu bản đồ hành chính Việt Nam gồm các lớp: Tỉnh, huyện, xã để làm bản đồ nền Dữ liệu này được tải miễn phí từ GADM (www.gadm.org), phiên bản 3.4, phát hành tháng 4/2018 Vẽ thêm vào bản đồ các thủy vực: sông, suối,

hồ, ao, kênh dẫn nước, thảm thực vật, khu dân cư, nhà rẫy bằng số hóa ảnh vệ tinh của Google

+ File Excell dữ liệu đã được làm sạch về vị trí ổ bọ gậy, muỗi sẽ được đưa vào phần mềm để được lớp dữ liệu mới

+ Mở bảng tính chất của số liệu và thể hiện các ký hiệu, màu sắc của các điểm phân bố véc tơ

+ Biên tập bản đồ và in theo tỷ lệ mong muốn

i Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu

Trước khi tiến hành nghiên cứu cán bộ nghiên cứu được tấp huấn, người bắt muỗi được hướng dẫn kỹ thuật bắt muỗi

Trong khi bắt muỗi, người bắt muỗi phải tuân thủ các quy định về thời gian, không uống rượu, bia… Số liệu sau khi nhập sẽ được kiểm tra lại bởi người khác

j Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:

Số liệu điều tra ổ bọ gậy sẽ được nhập vào phần mềm Microsoft Office Exel, sau đó làm sạch và phân tích số liệu Các điểm điều tra bọ gậy được xác định tọa độ địa lý (kinh độ, vĩ độ) tại vị trí điều tra Các tọa độ và số liệu thu thập

được vẽ bản đồ dựa vào phần mềm QGIS Mỗi điểm hiển thị trên bản đồ sẽ có một biểu tượng thích hợp, màu sắc cụ thể để thể hiện đặc điểm ổ bọ gậy Thông tin chi tiết của ổ bọ gậy của mỗi điểm sẽ được hiển thị trong bảng thuộc tính Bản đồ bọ gậy được ghép với vị trí các điểm điều tra bắt được muỗi để có bản đồ phân bố muỗi, bọ gậy hoàn chỉnh

Phân tích bằng phần mềm SPSS

2.1.4 Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt các Quy định trong nghiên cứu y, sinh học: -Nghiên cứu đã được Hội đồng đạo đức của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương thông qua trước khi thực hiện

- Trước khi tham gia nghiên cứu người mồi bắt muỗi được thông báo mục đích, nội dung của nghiên cứu Đảm bảo người tham gia nghiên cứu một cách tự nguyện Những người này có thể ngừng tham gia nghiên cứu bất kỳ lúc nào

-Người mồi bắt muỗi được trả tiền công, nếu bị mắc SR được điều trị miễn phí tại Trạm Y tế xã

- Đảm bảo bí mật thông tin liên quan đến đối tượng nghiên cứu Thông tin thu được sẽ được lưu giữ ở những nơi an toàn Tất cả thông tin thu thập được chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu

2.2 Mục tiêu 2:

Đánh giá độ nhạy cảm của muỗi Anopheles với hóa chất diệt côn trùng và vai trò truyền bệnh của muỗi truyền sốt rét tại điểm nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Muỗi Anopheles tại khu vực điều tra

- Ký sinh trùng sốt rét trong muỗi

2.2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 3 đến tháng 12 năm 2020

- Địa điểm nghiên cứu: Vườn Quốc gia Bù Gia Mập

2.2.3 Thiết kế phương pháp nghiên cứu

a Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu phân tích thực nghiệm tại thực địa và phòng thí nghiệm:

- Đánh giá độ nhạy cảm của muỗi Anopheles: Sử dụng muỗi đã thu thập

được từ mục tiêu 1 để thử nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng theo WHO

- Xác định vai trò truyền bệnh của muỗi Anopheles bằng kỹ thuật mổ muỗi xác định ký sinh trùng và kỹ thuật PCR xác định ký sinh trùng trong muỗi

b Cỡ mẫu nghiên cứu:

- Thử nhạy cảm ít nhất 01 loài (ưu tiên véc tơ chính An dirus) với 01 hóa

chất (alphacypermethrin) Thu thập đủ 150 mẫu muỗi của 01 loài để thử cho 01 hóa chất

- Tối thiểu 100 mẫu muỗi để xác định ký sinh trùng sốt rét

c Phương pháp chọn mẫu:

Muỗi cho thử nhạy cảm là muỗi thu thập từ các phương pháp Bẫy màn bằng mồi người trong nhà, ngoài nhà và soi chuồng gia súc ban đêm Muỗi sau khi thu thập được hút nước đường Glucose 10% để đảm bảo độ đồng đều Trước khi thử nghiệm phải lựa chọn những con muỗi khỏe, đủ chân cánh

d Nội dung nghiên cứu

- Xác định độ nhạy cảm của muỗi với một số hóa chất diệt côn trùng bằng phương pháp thử sinh học theo quy trình của WHO (2016)

- Xác định thoa trùng trong muỗi bằng kỹ thuật mổ muỗi xác định thoa trùng theo quy trình của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trung trung ương Tiến hành mổ muỗi tại thực địa

- Xác định KSTSR bằng kỹ thuật PCR theo quy trình của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trung trung ương tại phòng thí nghiệm

e Phương pháp xác định biến số và đo lường biến số

- Số lượng muỗi nhiễm ký sinh trùng

- Số lượng muỗi ngã trong thời gian 1 giờ tiếp xúc với hóa chất, số muỗi chết sau 24 thời theo dõi của thử nhạy cảm

- Số lượng muỗi sống, chết sau 24 giờ thử nhạy cảm

f Phiếu thu thập số liệu nghiên cứu

Biểu mẫu kết quả mổ muỗi xác định ký sinh trùng

Biểu mẫu thử nhạy cảm in sẵn Biểu mẫu gồm các thông tin như: thời gian, địa điểm, loài muỗi thử, hóa chất thử nghiệm, số lượng muỗi ngã theo thời gian, tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ thử nghiệm

g Các chỉ số đánh giá

- Tỷ lệ thoa trùng được tính theo công thức sau:

Số lượng muỗi có ký sinh trùng

Tỷ lệ thoa trùng = x 100

Tổng số muỗi được mổ

- Thử nhạy cảm của muỗi có 3 mức độ đánh giá: Nhạy cảm, có thể kháng

và kháng dựa trên tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ thử

h Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

Bước 2 Cho muỗi vào ống nghỉ

Cho 25 con muỗi vào một ống nghỉ, trong đó có 04 ống thử và 02 ống đối chứng

Bước 3 Muỗi nghỉ trước khi tiếp xúc với giấy tẩm hoá chất

Sau khi đã cho đủ muỗi vào 06 ống, để ống nghỉ ở tư thế thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên trên trong thời gian 1 giờ

Bước 4 Chuẩn bị ống tiếp xúc

Cho vào mỗi ống tiếp xúc một tờ giấy tẩm hoá chất cần thử: cuộn tờ giấy tẩm thành hình trụ và lồng vào ống tiếp xúc Dùng kẹp bằng đồng để giữ cho tờ giấy ép sát vào thành ống

Bước 5 Chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc

Lắp ống tiếp xúc vào tấm đế của ống nghỉ (trong ống nghỉ đã có muỗi) Thổi hết sức nhẹ nhàng vào ống nghỉ để muỗi bay từ ống nghỉ sang ống tiếp xúc

Bước 6 Muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hoá chất

Để ống tiếp xúc (có muỗi ở trong) ở vị trí thẳng đứng với đầu ống có lưới hướng lên phía trên trong thời gian là 60 phút, ghi lại số muỗi ngã theo biểu mẫu

Bước 7 Chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ

Ngay sau khi kết thúc thời gian tiếp xúc, chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống nghỉ

Bước 8 Muỗi nghỉ sau tiếp xúc

Giữ ống nghỉ trong vòng 24 giờ ở nơi tách biệt, mát mẻ với nhiệt độ điều kiện nhiệt độ 250C ± 20C và độ ẩm là 80% ± 10% Ghi nhiệt độ tối đa và tối thiểu ở nơi để ống nghỉ trong khoảng thời gian theo dõi (24 giờ)

+ Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng > 20%, hủy bỏ kết quả và làm lại thử nghiệm

+ Nếu tỷ lệ muỗi đối chứng chết trong khoảng 5%- 20%, tỷ lệ muỗi chết được điều chỉnh theo công thức Abott

+ Nếu tỷ lệ muỗi chết trong lô đối chứng < 5%, giữ nguyên tỷ lệ chết quan sát

- Kỹ thuật mổ muỗi tìm thoa trùng trong tuyến nước bọt [36]:

Chuẩn bị mẫu:

+ Gây mê hoặc giết muỗi cái trưởng thành bằng Chloroform

+ Định loại và ghi chép các thông tin về muỗi được mổ

+ Cắt phần cánh và chân muỗi (có thể cho vào ống Beem capsult nhỏ, đánh dấu và giữ thông tin và sử dụng phần này để định loại bằng PCR)

+ Sau đó có thể mổ tuyến nước bọt theo phương pháp: Đặt muỗi lên lam kính, để phần đầu về phía tay phải, dùng kim nhọn cắt bỏ phần đầu đi, nhỏ một giọt nhỏ nuớc muối sinh lý gần với phía trước ngực của muỗi Dùng kim đầu tù

ở tay trái giữ chặt phần ngực, từ từ ấn phần ngực muỗi bằng kim ở tay phải để

đẩy tuyến ra khỏi ngực Dùng kim nhọn chuyển tuyến nước bọt vào giọt nước muối đã chuẩn bị từ trước, bỏ phần thân muỗi vào Beem capsult trên Đặt lam men có kích thước 18 x 18 mm lên trên tuyến nước bọt

+ Kiểm tra kết quả sau khi mổ: Sau khi phủ lam men lên tuyến nước bọt, dùng kim mổ gõ nhẹ đều lên trên lam men, để làm vỡ tuyến nước bọt, giải thoát thoa trùng Soi kiểm tra kết quả dưới vật kính 40 X Thoa trùng được ghi nhận có hình con thoi, mảnh, khúc xạ ánh sáng, đôi khi chúng chuyển động ngọ nguậy chậm

+ Chuẩn bị Giêm sa để nhuộm: Pha 5 ml dung dịch Giêm sa mẹ với 95 ml dung dịch đệm PBS pH = 7,2

+ Nhuộm tiêu bản thoa trùng: Dùng đầu kim, nhẹ nhàng tách lam men ra và lật ngược nó lại để mặt ướt lên trên, dùng gôm gắn tạm thời lam men này lên trên bề mặt lam kính Bằng cách này sẽ giữ được những thoa trùng dính trên lam men và nhuộm màu chúng Dùng bút chì mỡ khoanh tròn vùng có thoa trùng ở mặt trái của lam để đánh dấu, để lam khô tự nhiên Cố định tiêu bản bằng cách nhúng toàn bộ lam vào dung dịch methanol vài giây Nhuộm bằng dung dịch Giêm sa 5% trong 30 phút Rửa sạch thuốc nhuộm và kiểm tra dưới kính hiển vi vật kính dầu Thoa trùng sẽ có hình con thoi mảnh bắt màu xanh nước biển ở giữa có nhân (điểm nhiễm sắc thể màu đỏ)

+ Làm tiêu bản cố định: Sau khi rửa bằng dung dịch đệm để lam tiêu bản khô

tự nhiên Nhỏ một giọt gôm gắn như Euparal, DPX vào vị trí có tiêu bản Lật ngược lammen áp vào phần có thoa trùng và để nó khô tự nhiên

- Kỹ thuật xác định ký sinh trùng trong muỗi bằng PCR

Quy trình kỹ thuật tách chiết ADN từ mẫu muỗi trưởng thành

+ Làm tan đá dung dịch EB ở nhiệt độ 65oC trên máy lắc ủ nhiệt khô trong 5 phút

+ Ly tâm ống đựng mẫu ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 giây

+ Cho từ từ 50 µl dung dịch tách chiết EB vào ống đựng mẫu, nghiền mẫu bằng chày nghiền chuyên dụng

+ Ly tâm ống đựng mẫu ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 giây

+ Ủ mẫu ở 65oC trên máy lắc ủ nhiệt khô với tốc độ lắc 900 chu kỳ/phút trong

30 phút

+ Ly tâm mẫu ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 giây

+ Chuyển ống đựng mẫu vào giá đựng mẫu lạnh

+ Cho từ từ 7 µl Kac 8M vào ống đựng mẫu, trộn nhẹ dung dịch bằng

Micropipet theo vòng tròn từ trên xuống dưới đáy ống

+ Chuyển giá lạnh đựng mẫu vào ngăn đá trong 30 phút

+ Lấy giá lạnh đựng mẫu ra khỏi ngăn đá

+ Ly tâm các ống đựng mẫu ở 4oC với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 20 phút + Chuyển dịch nổi sang ống nhựa 1,5ml mới đã ghi ký hiệu mẫu tương ứng + Cho 100 µl cồn Ethanol tuyệt đối lạnh vào ống đựng mẫu

+ Chuyển giá đựng mẫu vào ngăn đá trong 5 phút

+ Ly tâm ống đựng mẫu ở 4oC với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 20 phút + Dùng Micropipet hút bỏ dịch nổi

+ Cho 150 µl cồn Ethanol 70% lạnh vào ống đựng mẫu

+ Ly tâm các ống đựng mẫu ở 4oC với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 5 phút + Dùng Micropipet hút bỏ dịch nổi

+ Cho 150 µl cồn Ethanol tuyệt đối lạnh vào ống đựng mẫu

+ Ly tâm ống đựng mẫu ở 4oC với tốc độ 13.200 vòng/phút trong 5 phút + Dùng Micropipet hút bỏ hoàn toàn dịch nổi

+ Mở các nắp ống đựng mẫu, để khô ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

+ Hòa tan ADN bằng 50 µl dung dịch TE

+ Bảo quản ADN thu được ở nhiệt độ dưới - 200C cho đến khi sử dụng

Quy trình phát hiện ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật realtime PCR

- Hệ mồi và đầu dò sử dụng cho kỹ thuật qPCR được trình bày ở bảng sau:

P.vivax

Vix-F ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT Viv-R TAATTTACTCAAAGTAACAAGGACTTCCAA Vix-Probe HEX-TCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGT-BHQ1

P.malariae

Mal-F GTAATGCTTTGTATATTTATAACAAAGTTG Mal-R CTCAAAGTAACAAAATTCCCATGCATAA Mal-Probe NED - ATAATAAGAACGCAT - MGB NFQ

P.ovale

Oval-F ATACMACGTATCTGYTCTTTGC Oval-R ACTCAAAGTAACAAAATCTCCWGTAA Oval-Probe VIC- TCCAAAATGTGTTCTTATTA - MGB NFQ

P.knowlesi

Know-F GCATCATAATCCAGTTTTATG Know-R TACCTTGTACCTAATAATACTTGG

Know-Probe FAM-CAGGGAATAGAGGGTTG-MGB NFQ

-Điều kiện và thành phẩn phản ứng qPCR phát hiện các loài KSTSR:

i Phương pháp kiểm soát nhiễu và sai số trong nghiên cứu

Số liệu thu thập được ghi trên biểu mẫu bằng giấy và máy tính

Tọa độ các điểm điều tra được kiểm tra trùng khớp với địa điểm trên Google map

j Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:

Xử lý và làm sạch số liệu bằng phần mềm Excell Phân tích để đưa ra các chỉ số: Tỷ lệ muỗi chết trong thử nhạy cảm, tỷ lệ nhiễm thoa trùng trong muỗi

k Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt các Quy định trong nghiên cứu y, sinh học

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Thành phần loài, phân bố muỗi Anopheles tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập

3.1.1 Thành phần loài, phân bố muỗi Anopheles theo sinh cảnh

Thành phần loài, phân bố muỗi Anopheles theo sinh cảnh ở Vườn Quốc gia Bù Gia Mập được trình bày tại bảng 3.1

Bảng 3.1 Thành phần loài và phân bố muỗi, bọ gậy Anopheles theo sinh cảnh

ở Vườn quốc gia Bù Gia Mập

T

Sinh cảnh

Muỗi Bọ gậy Muỗi Bọ gậy

10 An tessellatus Theobald, 1901 + - - -

Ghi chú: *

Véc tơ chính; ** Véc tơ phụ ; + ghi nhận; - không ghi nhận

Bảng 3.1 cho thấy tại Vườn Quốc gia Bù Gia Mập đã thu được 11 loài muỗi Anopheles Trong đó, tại bìa rừng đã thu thập được 11 loài muỗi và 4 loài

bọ gậy, trong rừng thu thập được 3 loài muỗi và 1 loài bọ gậy

3.1.2 Bản đồ phân bố muỗi, bọ gậy Anpheles tại điểm điều tra

Vị trí các điểm điều tra có muỗi, bọ gậy Anopheles tại bìa rừng và trong rừng Bù Gia Mập được đánh dấu bằng hệ tọa độ địa lý GPS và được thể hiện tại hình 3.1 và 3.2

Hình 3.1 Bản đồ phân bố muỗi, bọ gậy tại bìa rừngVườn Quốc gia Bù Gia Mập

Hình 3.2 Bản đồ phân bố muỗi, bọ gậy trong rừngVườn Quốc gia Bù Gia Mập

3.1.3 Tỷ lệ các loài muỗi Anopheles theo sinh cảnh

Số lượng muỗi được tính tỷ lệ (%) theo từng loài giữa 02 sinh cảnh điều tra bìa rừng và trong rừng được trình bày tại bảng 3.2 Véc tơ chính truyền sốt rét là

An dirus phân bố cả bìa rừng và trong rừng với tỷ lệ cao hơn các loài khác

(28,57% và 97,95%) Véc tơ chính An minimus phân bố tại bìa rừng với tỷ lệ thấp (0,78%) và véc tơ phụ An maculatus phân bố chủ yếu tại bìa rừng (16,1%) (Bảng

3.2)