Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kit xét nghiệm chẩn đoán SARS cov 2 được sử dụng phổ biến ở việt nam

2.1 Sinh phẩm xét nghiệm khẳng định SARS-Cov-2 được 2.4 Chu trình nhiệt chạy bằng kit Sao Thái Dương 32 3.1 Bảng so sánh chỉ số của các bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán 50 3.7 Bảng kết quả c

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2022

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn Thạc sĩ, Tôi đã nhận được sự quan tâm, động viên, hướng dẫn tận tình của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè Để hoàn thành luận văn này, Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Toàn thể quý Thầy Cô trong khoa Hóa – Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô- TS Nguyễn Thị Minh Xuân, Cô đã hết lòng hướng dẫn, động viên, quan tâm và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Cảm ơn Ban Giám đốc Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Quảng Nam đã cho phép

và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện các thử nghiệm tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử của Trung tâm Cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của ThS Nguyễn Trường Duy và các anh chị khoa Xét nghiệm trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Thời gian vừa qua, gặp rất nhiều khó khăn trong quá trình nghiên cứu vì đại dịch Covid-19, luận văn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót, Tôi rất mong nhận được những

ý kiến đóng góp của quý Thầy Cô

Xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2022

Học viên thực hiện

Vũ Ngọc Hoàng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “ Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán SARS-CoV-2 được sử dụng phổ biến ở Việt Nam” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Thị Minh Xuân Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Người cam đoan

Vũ Ngọc Hoàng

ĐÁNH GIÁ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA 2 BỘ KIT XÉT NGHIỆM CHUẨN

ĐOÁN SARS-COV-2 ĐƯỢC SỬ DỤNG PHỔ BIẾN Ở VIỆT NAM

Học viên: Vũ Ngọc Hoàng Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8420201 Khóa: K40 Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN

Tóm tắt – Kể từ khi xuất hiện vào cuối năm 2019 đến nay, virus SARS-CoV-2

gây dịch COVID-19 đã khiến hơn 450 triệu người trên thế giới mắc bệnh, cướp đi sinh mạng của hơn 6 triệu người, gây ra một cuộc khủng hoảng y tế nghiêm trọng trên toàn cầu Các nhà khoa học trên toàn thế giới không ngừng nghiên cứu để tìm ta công cụ phát hiện và chuẩn đoán virus SARS-CoV-2 Cho đến nay, thì chẩn đoán phân tử dựa trên nucleic acid (xét nghiệm phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)) vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán sớm SARS-CoV-2 Tại Việt Nam, hiện đã có

2 nhà sản xuất cung cấp tự chủ các bộ kit xét nghiệm COVID-19 và đã được đưa vào sử dụng ở các phòng sàng lọc bệnh đó là: Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á với bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR và Công ty cổ phần Sao Thái Dương với

bộ kít one-Step RT-PCR Covid-19 Kit Thái Dương Nghiên cứu này nhằm đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kít trong điều kiện thực tiễn, đánh giá sự ảnh hưởng của các yếu tố thường gặp trong phòng xét nghiệm Kết quả cho thấy 2 bộ kít đều có tính hiệu dụng cao với khả năng phòng trừ ngoại nhiễm sản phẩm PCR, việc nhiễm máu vào mẫu là không ảnh hưởng tới kết quả phân tích, giá trị chu kỳ ngưỡng Ct (cycle threshold) chỉ tăng từ 4-6 chu kỳ khi tiến hành gộp mẫu lớn (1 mẫu dương và 14 mẫu âm) Các giá trị

Ct từ 2 bộ kit của Việt Nam sản xuất là tương đối gần với giá trị Ct được kiểm nghiệm bằng kit WHO trên cùng một mẫu kiểm nghiệm Trên cùng một mẫu kiểm nghiệm có

sự khác biệt về giá trị Ct ở 2 bộ kit (p<0.01), tuy nhiên sự khác biệt này là không đáng

kể, chỉ từ 1-2 Ct và thấp hơn ở kit Sao Thái Dương Từ đó khẳng định hiệu quả sử dụng của các kit sàng lọc SARS-CoV-2 trong điều kiện thực tế ở phòng xét nghiệm Đề tài là luận văn tốt nghiệp thạc sĩ ngành Công nghệ sinh học, được thực hiện từ tháng 06/2021 đến 01/2022 Vào cuối tháng 12 năm 2021, một loạt các hành vi sai phạm liên quan đến giá, giấy phép đăng ký lưu hành v.v… về kit test COVID-19 của công ty cổ phần Việt

Á đã được Bộ Công An công bố Sự việc này ảnh hưởng không nhỏ đến tính thời sự của

đề tài, tuy nhiên với mong muốn nhìn nhận các giá trị khoa học và tính hiệu dụng của

bộ kit, các kết quả thu được trong khi thực hiện đề tài vẫn cần được công bố

Từ khóa – Virus 2, Realtime RT-PCR; Kít xét nghiệm

SARS-CoV-2; COVID-19

COMPARISON THE USING VALUE OF 2 COMMONLY USED SARS-COV-2 DIAGNOSTIC TEST KITS IN VIETNAM

Abstracts- Since appearing at the end of 2019, the SARS-CoV-2 virus causing the

COVID-19 epidemic has sickened more than 450 million people around the world, claimed the lives of more than 6 million people, caused a serious global health crisis Scientists around the world are constantly working to find tools to detect and diagnose the SARS-CoV-2 virus To date, nucleic acid-based molecular diagnosis (reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) test) is still considered the gold standard for early diagnosis of SARS-CoV-2 In Vietnam, there are currently two manufacturers that independently supply COVID-19 test kits and have been put into use

in disease screening: Viet A Technology Joint Stock Company with the kit LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR and Sao Thai Duong Joint Stock Company with one-Step RT-PCR Covid-19 Kit Thai Duong This study aims to evaluate the use value of two kits in practical conditions, to assess the influence of factors commonly encountered

in the laboratory The results show that both kits are highly effective with the ability to prevent contamination of PCR products, the contamination of blood in the sample does not affect the analysis results, the cycle threshold value Ct (cycle threshold) only increased from 4-6 cycles when conducting large sample pooling (1 positive and 14 negative samples) The Ct values from the two kits manufactured in Vietnam are relatively close to the Ct values tested by the WHO kit on the same test sample On the same test sample, there was a difference in Ct value in 2 kits (p<0.01), but this difference was not significant, only 1-2 Ct and lower in Sao Thai Duong kit Thereby confirming the effectiveness of the SARS-CoV-2 screening kits in actual laboratory conditions This work is the master's thesis in Biotechnology, conducted from June 2021 to January

2022 At the end of December 2021, a series of violations related to prices, circulation registration licenses, etc about the COVID-19 test kit of Viet A Joint Stock Company were announced by the Ministry of Public Security This incident has a significant influence on the topicality of the study, but with the desire to recognize the scientific values and effectiveness of the kit, the results obtained during the implementation of the study still need to be published

Key words- SARS-CoV-2 virus, Realtime RT-PCR; SARS-CoV-2 test kit; COVID-19

MỤC LỤC

Trang

1.2 Tình hình dịch bệnh Covid-19 trong nước và thế giới 7

1.2.1 Tình hình dịch bệnh Covid-19 trên thế giới 7

1.4 Real Time RT-PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm

1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật Real Time RT-PCR 14

1.5 Ngoại nhiễm sản phẩm PCR, gây dương tính giả trong phòng xét nghiệm sinh

1.5.1 Vấn đề ngoại nhiễm sản phẩm PCR và khả năng phòng ngừa ngoại nhiễm

sản phẩm PCR của các bộ kít xét nghiệm SARS-CoV-2 19

1.5.2 Cách khử nhiễm và loại bỏ dương tính giả trong phản ứng PCR tại phòng

1.6 Sự tương tác của các thành phần trong máu đối với phản ứng PCR 21

1.7 Giới thiệu về 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán SARS-CoV-2 do Việt Nam sản

1.7.1 Bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR của Công ty Cổ phần

1.7.2 Bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai Duong của công ty cổ phần

2.3.1 Xét nghiệm mẫu bằng phản ứng Realtime RT- PCR 29

2.3.3 Phương pháp gây nhiễm trong việc đánh giá khả năng phòng ngừa ngoại

3.1 Đánh giá quy trình thực hiện, thời gian tiến hành và chi phí của 2 bộ kit 36 3.2 So sánh chu kỳ ngưỡng (Ct) và CV trên cùng một mẫu dương tính được chuẩn

3.3 Đánh giá khả năng phòng ngừa ngoại nhiễm sản phẩm PCR của 2 bộ kit 45 3.4 Khảo sát sự thay đổi về số chu kỳ nhiệt khi gộp 4, gộp 9, gộp 14 mẫu âm tính

3.5 Kiểm tra sự tương tác của phản ứng RT-PCR do nhiễm mẫu máu 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

KẾT LUẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN (Bản sao) 63

2.1 Sinh phẩm xét nghiệm khẳng định SARS-Cov-2 được

2.4 Chu trình nhiệt chạy bằng kit Sao Thái Dương 32

3.1 Bảng so sánh chỉ số của các bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán

50

3.7 Bảng kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR mẫu gây

3.8 Bảng kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR mẫu gây

nhiễm máu bằng bộ kít Sao Thái Dương 52 PL1.1 Kết quả Ct của các mẫu được chiết tách bằng các bộ kít

Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của virion SARS ‑ CoV

‑ 2 (màu đỏ) được phân lập từ một bệnh nhân trong đại dịch COVID-19.

3.2 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR của 3 mẫu thử

3.3 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR của 3 mẫu thử

3.4 Biểu đồ so sánh giá trị Ct trung bình của các mẫu khi

3.5 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR đối với mẫu

3.6 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR đối với mẫu

gây nhiễm loại 2 bằng bộ kít Sao Thái Dương 48

PL2.1

Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít Việt Á khi gộp 4, gộp 9, gộp 14 mẫu âm tính với 1 mẫu dương tính Sar-CoV- 2

70

PL2.2 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL2.3 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL2.4 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL2.5 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL2.6 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL2.7 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL2.8 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL2.9 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL2.10 Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR bằng bộ kít

PL3.1

Phổ phát xạ và sự chồng chéo quang phổ của bốn loại thuốc nhuộm huỳnh quang thường được sử dụng (FAM, HEX, ROX và Cy5)

66

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đại dịch COVID-19, là một đại dịch đang diễn ra trên phạm vi toàn cầu do Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) gây ra SARS-CoV-2 có tên đầy đủ là hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng coronavirus 2 để phân biệt với SARS-CoV-1 diễn ra vào năm

2002 cũng bắt nguồn từ Trung Quốc Cho đến nay vẫn chưa có thuốc và cách chữa trị hữu hiệu đối với COVID-19 Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các triệu chứng của bệnh có thể không xuất hiện trong 2 tuần bị nhiễm virus, tuy nhiên người bệnh vẫn có thể lây lan virus trong thời gian này.[1]

Để ngăn chặn sự lây lan, các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới đang làm việc suốt ngày đêm nhằm phát triển các công cụ đáng tin cậy để chẩn đoán sớm SARS-CoV-2, cũng như để hiểu được con đường và cơ chế lây nhiễm của chúng Hiện nay, chẩn đoán phân tử dựa trên nucleic acid (xét nghiệm phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)) được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán sớm SARS-CoV-2.[2] Phát hiện huyết thanh học dựa trên kháng thể không hiệu quả cho mục đích chẩn đoán sớm, nhưng

là một công cụ tiềm năng cho các xét nghiệm huyết thanh, cung cấp cho mọi người chứng chỉ miễn dịch để loại bỏ nhiễm COVID-19.[3]

Trong tình hình chung của thế giới và nhu cầu cấp thiết tại Việt Nam, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã tiến hành nghiên cứu phát triển các kit sàng lọc nhanh COVID-

19 Trong đó 2 bộ kit đã được Bộ Y tế cấp phép sử dụng trong các phòng xét nghiệm COVID-19 ở Việt Nam hiện nay là bộ kit của công ty Việt Á và công ty Sao Thái Dương Nhằm khẳng định tính hiệu dụng của 2 bộ kit trong thực tế sử dụng ở các phòng xét nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán SARS-CoV-2 được sử dụng phổ biến ở Việt Nam”

2 Tính cấp thiết của đề tài

Đại dịch COVID 19 được xác định lần đầu tiên vào tháng 12 năm 2019 tại Vũ Hán, Trung Quốc Trong 50 ngày đầu tiên của đại dịch, mặc dù virus đã lây lan sang hai quốc gia khác bên ngoài Trung Quốc, nhưng hầu hết cộng đồng toàn cầu không đặc biệt lo lắng, vì nhận thức rằng chỉ những người đã tiếp xúc với chợ hải sản ở Vũ Hán, nơi trường hợp đầu tiên được cho là đã xảy ra, có xác suất nhiễm bệnh cao nhất [4] Tổ chức

Y tế Thế giới tuyên bố “Tình trạng Khẩn cấp Quốc tế về Sức khỏe Cộng đồng” vào ngày

20 tháng 1 năm 2020 và sau đó là đại dịch vào ngày 11 tháng 3 năm 2020 Tổng cộng

192 quốc gia và vùng lãnh thổ đã có ít nhất một trường hợp nhiễm COVID-19 cho đến nay.Tính đến ngày 11 tháng 3 năm 2022, hơn 450 triệu trường hợp đã được xác nhận, với hơn 6,01 triệu trường hợp tử vong do COVID-19, khiến nó trở thành một trong những đại dịch chết chóc nhất trong lịch sử Việt Nam được coi là một trong các quốc gia đã khống chế tốt đại dịch COVID-19 trong giai đoạn đầu Tính đến ngày 11/3/2022,

đã có 5,26 triệu người mắc bệnh, số ca tử vong do COVID-19 là hơn 43 nghìn ca đã được công bố Bên cạnh các công tác tuyên truyền, chính sách cách ly tập trung, giãn cách xã hội, một trong những đóng góp lớn trong việc khống chế sự lây lan của dịch bệnh đó là công tác xét nghiệm chẩn đoán bệnh sớm

Các phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra sự hiện diện của SARS-CoV-2 là xét nghiệm nucleic acid thông qua phản ứng RT-PCR,[5] để phát hiện sự hiện diện của các đoạn RNA của virus.[6] Vì các xét nghiệm này phát hiện RNA của virus lây nhiễm, nên

"khả năng xác định thời gian lây nhiễm của bệnh nhân bị hạn chế." Xét nghiệm này thường được thực hiện trên các mẫu dịch mũi họng được lấy bằng tăm bông; tuy nhiên, cũng có thể sử dụng dịch phết hầu họng hoặc mẫu đờm.[7] Kết quả thường có trong vòng vài giờ.[8] WHO đã công bố một số quy trình xét nghiệm cho căn bệnh này

Để làm chính xác hóa các bước trong quy trình xét nghiệm và làm giảm thiểu công việc cho các xét nghiệm viên, các bộ kit cho việc tách chiết và thực hiện phản ứng RT-PCR đã ra đời Trong đó, phổ biến nhất là các bộ kit do WHO công bố Tuy nhiên, giá thành các bộ kit này khá cao (trên 1 triệu đồng) Với lượng lớn mẫu cần được xét nghiệm mỗi ngày, chi phí cho các bộ kit xét nghiệm này là một gánh nặng không nhỏ cho hệ thống y tế công, và hiện chỉ được sử dụng ở Việt Nam như một test khẳng định Chúng

ta hiện đã có 2 nhà sản xuất lớn cung cấp tự chủ các bộ kit xét nghiệm COVID-19, và

đã được đưa vào sử dụng ở các phòng sàng lọc bệnh, bao gồm:

- Một là của Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á Đây là sản phẩm được Bộ Khoa học và công nghệ đặt hàng nghiên cứu và sản xuất từ đầu vụ dịch Covid-19, ra mắt ngày 5-3-2020 và đã được Bộ Y tế cấp phép sử dụng tại Việt Nam Nhà sản xuất kit cho biết

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã đánh giá bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st rPCR kít do công ty Việt Á sản xuất theo Quy trình Danh sách sử dụng khẩn cấp (EUL)

RT-và cấp mã số EUL 0524-210-00.[9] Tuy nhiên thực tế WHO không chấp nhận loại kit

này.[10] Trên trang thông tin chính thức Bộ Y tế và Chăm sóc Sức khỏe Anh, bộ xét nghiệm của Việt Á không có tên trong danh sách đạt chuẩn Anh và được phép lưu hành trên thị trường Anh.Các thông tin sai sự thật đã làm gia tăng sự nghi ngờ về hiệu quả của bộ kit xét nghiệm từ Việt Á

- Bộ kit thứ 2 là của Công ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất đã được Bộ Y tế Việt Nam cấp số lưu hành vào ngày 7/5/2020 Bộ kit là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine và sinh phẩm y tế và Đại học Bách khoa Hà Nội, sau đó chuyển giao công nghệ cho công ty cổ phần Sao Thái Dương Mặc dù RT-PCR là tiêu chuẩn vàng để phát hiện nucleic acid, phương pháp này rất nhạy cảm nên đôi khi có thể dẫn đến kết quả giả Phương pháp này đòi hỏi có đủ nồng độ RNA virus trong mẫu bệnh nhân để phân tích.[11] Đây có thể là một nhược điểm lớn vì nồng độ của RNA virus không nhất quán và không thể kiểm soát được lượng của chúng để đáp ứng việc phân tích mẫu vật Cả 2 bộ kit của Việt Nam đều công bố ngưỡng phát hiện 5 copies/phản ứng Ngoài ra, không có phương pháp lấy mẫu tự động và liên tục, mức độ hiệu quả phụ thuộc vào trình độ của người lấy mẫu cùng với những khó khăn trong việc thu thập tăm bông Việc lấy mẫu không chính xác lần lượt dẫn đến kết quả dương tính giả và âm tính giả.[12][13] Sau khi lấy mẫu, một vấn đề chính khác liên quan đến RT-PCR là sự phức tạp trong các thao tác và chúng đòi hỏi kỹ thuật viên phải

có trình độ cao để thực hiện các bước tách chiết RNA phức tạp và thực hiện phản ứng PCR Sự lây nhiễm chéo hoặc phản ứng chéo là một nhược điểm lớn khác liên quan đến RT-PCR, có thể dẫn đến một số kết quả xét nghiệm âm tính giả và dương tính giả.[14] Các vấn đề này cần được làm rõ trong các thử nghiệm lâm sàng đối với các kit xét nghiệm COVID-19 Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có các công bố nào đánh giá đến hiệu quả của 2 bộ kit được sản xuất tại Việt Nam trong việc khắc phục những nhược điểm của RT-PCR như đã được đề cập ở trên

3 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài nhằm mục đích: “Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán SARS-CoV-2 bằng kỹ thuật Real-Time RT-PCR được sử dụng phổ biến ở Việt Nam là kit của công ty cổ phần công nghệ Việt Á và của công ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất, nhằm khẳng định hiệu quả sử dụng của các kit sàng lọc trong điều kiện thực tế ở phòng xét nghiệm”

Mục tiêu cụ thể của đề tài bao gồm:

- Đánh giá về giá cả, và sự thuận lợi trong thao tác cho các kỹ thuật viên trong điều kiện thực tiễn

- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thường gặp trong phòng xét nghiệm: như sự mất mẫu do quá trình tách chiết khi sử dụng các bộ kit tách chiết khác nhau, sự ảnh hưởng do ngoại nhiễm sản phẩm

- Đánh giá khả năng sử dụng 2 bộ kit trong trường hợp thực hiện việc gộp mẫu với

số lượng mẫu gộp khác nhau

- Đánh giá việc nhiễm máu có thể xảy ra trong quá trình lấy mẫu đến sự phát hiện SARS-Cov-2 của 2 bộ kit

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

➢ Mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân được lấy mẫu và xét nghiệm SARS- CoV-

2 tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử thuộc Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Quảng

Nam

➢ 2 Bộ Kit xét nghiệm chuẩn đoán SARS- CoV- 2:

+ Bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR của Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á

+ Bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai Duong của công ty cổ phần Sao Thái Dương

+ Bộ sinh phẩm xét nghiệm chuẩn đoán Kit COVID-19 được đề nghị của tổ chức

y tế thế giới (WHO)

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Các nghiên cứu này được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm nhằm đánh giá lại

và so sánh hiệu quả của 2 bộ kit với những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả PCR nhưng vẫn chưa được công bố bởi các nhà sản xuất

RT-5 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong việc lấy mẫu, bảo quản mẫu, gộp mẫu và xét nghiệm mẫu bằng phản ứng Realtime RT- PCR nhằm phát hiện virus SARS- CoV- 2 được Bộ Y tế quy định

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đề tài sử dụng các phương pháp và công cụ sinh học phân tử hiện đại như Reverse transcription- polymerase chain reaction trên máy… Kết quả thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm chuyên dụng nhằm đưa ra kết quả có độ tin cậy cao Ngoài ra, các kết quả của đề tài cung cấp thêm các thông tin khoa học có giá trị về 2 bộ kit sàng lọc SARS-CoV-2 được phát triển ở Việt Nam, bao gồm: khả năng bảo tồn mẫu, khả năng loại bỏ sự ngoại nhiễm sản phẩm, và loại bỏ sự ức chế phản ứng PCR do việc nhiễm mẫu máu tồn tại trong quá trình lấy mẫu

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Các thông tin khoa học được cung cấp trong đề tài nhằm đưa ra các khuyến cáo trong việc sử dụng các bộ kit ở điều kiện thực tế, và trong quá trình đánh giá kết quả thu nhận được, từ đó đảm bảo tính chính xác của các kết quả xét nghiệm Đồng thời, các phân tích sâu hơn về giá cả, sự thuận lợi trong thao tác và khả năng sử dụng các bộ kit trong trường hợp gộp mẫu sẽ là các căn cứ cho việc lựa chọn bộ kit chuẩn đoán SARS-CoV-2 cho mục đích sàng lọc ban đầu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại dịch COVID-19

Đại dịch COVID-19 là một đại dịch bệnh truyền nhiễm với tác nhân

là virus SARS-CoV-2 và các biến thể của nó đang diễn ra trên phạm vi toàn cầu.[15] Khởi nguồn vào cuối tháng 12 năm 2019 với tâm dịch đầu tiên tại thành phố Vũ Hán thuộc miền Trung Trung Quốc đại lục, bắt nguồn từ một nhóm người mắc viêm phổi không rõ nguyên nhân Giới chức y tế địa phương xác nhận rằng trước đó họ đã từng tiếp xúc, chủ yếu với những thương nhân buôn bán và làm việc tại chợ bán buôn hải sản Hoa Nam Các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu và phân lập được một chủng coronavirus mà Tổ chức Y tế Thế giới lúc đó tạm gọi là 2019-nCoV, có trình tự gen giống với SARS-CoV trước đây với mức tương đồng lên tới 79,5%.[16][17][18]

Các ca nghi nhiễm đầu tiên ở Vũ Hán được báo cáo vào ngày 31 tháng 12 năm

2019 Trường hợp tử vong do SARS-CoV-2 đầu tiên xảy ra ở Vũ Hán vào ngày 9 tháng

1 năm 2020.[19] Các ca nhiễm virus đầu tiên được xác nhận bên ngoài Trung Quốc bao gồm hai người phụ nữ ở Thái Lan và một người đàn ông ở Nhật Bản.[20] Sự lây nhiễm virus từ người sang người đã được xác nhận cùng với tỷ lệ bùng phát dịch tăng vào giữa tháng 1 năm 2020 Ngày 23 tháng 1 năm 2020, chính phủ Trung Quốc quyết định phong tỏa Vũ Hán, toàn bộ hệ thống giao thông công cộng và hoạt động xuất - nhập khẩu đều

bị tạm ngưng

Ngày 11 tháng 3 năm 2020, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ra tuyên bố gọi

"COVID-19" là "Đại dịch toàn cầu".[21]

Chính phủ các quốc gia trên thế giới đã tiến hành phản ứng đáp trả nhằm bảo vệ sức khỏe người dân cũng như các nhóm cộng đồng trên toàn cầu, bao gồm: hạn chế đi lại, phong tỏa kiểm dịch, ban bố tình trạng khẩn cấp, sử dụng lệnh giới nghiêm, tiến hành cách ly xã hội, hủy bỏ các sự kiện đông người, đóng cửa trường học và những cơ

sở dịch vụ, kinh doanh ít quan trọng, khuyến khích người dân tự nâng cao ý thức phòng bệnh, đeo khẩu trang, hạn chế ra ngoài khi không cần thiết, đồng thời chuyển đổi mô hình hoạt động kinh doanh, học tập, làm việc từ truyền thống sang trực tuyến Ví dụ: phong tỏa để kiểm dịch toàn bộ tại Ý và tỉnh Hồ Bắc của Trung Quốc; các biện pháp giới nghiêm khác nhau ở Trung Quốc và Hàn Quốc; phương pháp sàng lọc tại các sân

bay và nhà ga; hạn chế hoặc hủy bỏ các hoạt động du lịch tới những khu vực, vùng, quốc gia có nguy cơ nhiễm dịch bệnh ở mức cao Ngoài ra, các trường học cũng đã phải đóng cửa trên toàn quốc hoặc ở một số vùng tại hơn 160 quốc gia, ảnh hưởng đến 87% học sinh, sinh viên trên toàn thế giới, tính đến ngày 28 tháng 3 năm 2020.[22]

Những ảnh hưởng trên toàn thế giới của đại dịch COVID-19 hiện nay bao gồm: thiệt hại sinh mạng con người, sự bất ổn về kinh tế và xã hội,[23] tình trạng bài ngoại và phân biệt chủng tộc đối với người gốc Trung Quốc và Đông Á, việc truyền

bá thông tin sai lệch trực tuyến và vũ khí sinh học.[24]

1.2 Tình hình dịch bệnh Covid-19 trong nước và thế giới

1.2.1 Tình hình dịch bệnh Covid-19 trên thế giới

Tính đến ngày 11/3/2022, chạm ngưỡng 2 năm sau khi Tổ chức Y tế thế giới tuyên

bố COVID-19 là “đại dịch toàn cầu”, thế giới có hơn 450 triệu ca mắc, 6,01 triệu ca tử vong

Trong đó, Mỹ ghi nhận 79,3 triệu ca mắc (961.000 ca tử vong); Ấn Độ - 43 triệu (515.000); Brazil - 29,2 triệu (653.000); Pháp - 22,5 triệu (137.000); Anh - 19,4 triệu (163.000) Iran đứng đầu châu Á với 7,1 triệu ca mắc (138.000 ca tử vong) Indonesia đứng đầu ở Đông Nam Á với 5,8 triệu ca mắc (151.000 ca tử vong).[25]

1.2.2 Tình hình dịch bệnh Covid-19 trong nước

Tại Việt Nam, ngày 11/3/2020, khi Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố

COVID-19 là "đại dịch toàn cầu" thì Việt Nam mới chỉ ghi nhận 39 F0, chủ yếu liên quan chùm

ca Vũ Hán và chùm ca từ chuyến bay Anh - Việt Nam đầu tháng 3-2020

Một năm sau, ngày 11/3/2021, chúng ta ghi nhận 2.533 bệnh nhân COVID-19, trong đó có 1.585 ca mắc do lây nhiễm trong nước

Hai năm sau, tính đến sáng 11/3/2022, Việt Nam có hơn 5,26 triệu ca nhiễm, đứng thứ 20/225 quốc gia và vùng lãnh thổ, còn tính về số ca mắc trên 1 triệu dân thì nước ta đứng thứ 130 (bình quân cứ 1 triệu người có 53.253 ca mắc) [25]

1.3 Tổng quan về virus SARS-CoV-2

1.3.1 Tên gọi

Virus corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2, viết tắt SARS-CoV-2 (tiếng

Anh: Severe acute respiratory syndrome corona virus 2),[26] trước đây có tên là virus corona mới 2019 (2019-nCoV) và cũng được gọi là virus corona ở người 2019 (HCoV-

19 hoặc hCoV-19), là một chủng coronavirus gây ra bệnh viêm đường hô hấp cấp do virus corona 2019 (COVID-19),[27] xuất hiện lần đầu tiên vào tháng 12 năm 2019, trong đợt bùng phát đại dịch COVID-19 ở thành phố Vũ Hán, Trung Quốc và bắt đầu lây lan nhanh chóng, sau đó trở thành một đại dịch toàn cầu Vào ngày 12 tháng 1 năm 2020,

nó được Tổ chức Y tế Thế giới gọi tên là 2019-nCoV, dựa trên một phương thức đặt tên cho virus corona mới.[28][29] Đến ngày 11 tháng 2 năm 2020, Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) quyết định đặt tên chính thức cho chủng virus corona mới này là SARS-CoV-2 khi họ phân tích rằng nó cùng loài với virus SARS từng gây ra đại dịch năm 2003 nhưng là một chủng khác của loài.[30][31] Virus này là một loại virus corona RNA sợi đơn dương tính, có thể hoạt động như ARN thông tin (mRNA) và có thể được dịch mã trực tiếp thành protein của virus bởi ribosome của tế bào chủ Trong khoảng thời gian đầu của đại dịch COVID-19, các nhân viên nghiên cứu đã phát hiện chủng virus này sau khi họ tiến hành đo lường kiểm tra axit nucleic và dò tra trình tự bộ gen ở mẫu vật lấy từ người bệnh.[32]

Virus corona đã biết gây ra cảm mạo cùng với các triệu chứng khá nghiêm trọng giống như Hội chứng hô hấp Trung Đông (MERS) và Hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng (SARS) SARS-CoV-2 là phân dạng của virus corona mà từ trước đây chưa bao giờ phát hiện ở trong cơ thể người.[33] Tháng 12 năm 2019 tới nay, thành phố Vũ Hán của tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc liên tục trông coi tra xét bệnh cúm trải rộng và bệnh tật tương quan, phát hiện nhiều trường hợp bệnh viêm phổi mang tính virus nổi dậy, tất cả cùng chẩn đoán là viêm phổi mang tính virus/truyền nhiễm phần phổi.[34] Ủy ban Sức khỏe

Vệ sinh Nhà nước Trung Quốc nhận định đây là bệnh truyền nhiễm loại B.[35]

Trong thời gian bùng phát dịch virus corona 2019, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO)

ban đầu đề nghị sử dụng tên chỉ định tạm thời "2019-nCoV" (tiếng Anh: 2019 novel coronavirus – virus corona mới 2019) để gọi cho chủng virus này Tuy nhiên, điều này

dẫn đến một mối lo ngại, rằng việc không có tên chính thức có thể sẽ khiến việc sử dụng tên không chính thức một cách cố định và thường xuyên trong giao tiếp chung, virus này cũng thường được gọi là "virus corona mới", "virus corona Vũ Hán", "virus Vũ Hán" hoặc chỉ đơn giản là "virus corona".[36] Theo hướng dẫn của WHO năm 2015 về việc đặt tên virus và bệnh, Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) thông báo rằng

họ sẽ là cơ quan đặt tên chính thức cho các virus mới.[37]

Ngày 11 tháng 2 năm 2020, Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) đã công

bố tên "severe acute respiratory syndrome coronavirus 2" (tạm dịch "virus corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2") và ký hiệu viết tắt là SARS-CoV-2 để ám chỉ chủng virus trước đây gọi là 2019-nCoV.[38] Trước đó cùng ngày, WHO đã chính thức đổi tên căn bệnh do chủng virus gây ra từ "bệnh hô hấp cấp do 2019-nCoV" thành bệnh virus corona 2019 (COVID-19) (coronavirus disease 2019) Để tránh nhầm lẫn với bệnh SARS, căn bệnh trong dịch SARS năm 2003, WHO đôi khi gọi virus này là "virus COVID-19" hoặc "virus gây ra bệnh COVID-19" khi giao tiếp với công chúng.[39]

1.3.2 Virus SARS-CoV-2

1.3.2.1 Cấu trúc

Mỗi virion SARS-CoV-2 có đường kính 60–140 nanomet (2,4 × 10−6–5,5 × 10−6

in); [40]. SARS-CoV-2 bao gồm và 4 loại protein cấu trúc khác nhau: N, S, E và M Protein N, hoặc nucleocapsid, bao bọc bộ gen, trong khi các protein S (gai), E (vỏ) và

M (màng) bao gồm lớp vỏ kép lipid xung quanh [41] Đặc biệt là protein S, cho phép virus lây nhiễm vào tế bào thông qua thụ thể ACE-2 trên màng tế bào và sau đó dung hợp với màng Điều này làm cho cấu trúc protein này và thụ thể tế bào chủ của nó trở thành mục tiêu lý tưởng cho các phương pháp điều trị

Hình 1.1: Minh họa cắt ngang của virus SARS-CoV-2 và bộ gen của nó [42]

1.3.2.2 Bộ gene

Tính đến đầu năm 2022, khoảng 7 triệu bộ gen SARS-CoV-2 đã được giải trình tự

và gửi vào cơ sở dữ liệu công cộng và 800.000 hoặc hơn thế nữa được bổ sung mỗi tháng [43]

SARS-CoV-2 có bộ gen RNA mạch đơn, tuyến tính, cảm nhận dương, dài khoảng 30.000 base [44] Bộ gen của virus là RNA sợi dương có thể hoạt động như RNA thông tin (mRNA) và được dịch mã trực tiếp thành protein trong tế bào chủ của chúng Các chất trung gian RNA sợi âm cũng được tạo ra bởi các CoV đóng vai trò như khuôn mẫu cho: tổng hợp RNA bộ gen sợi dương, sau đó được đóng gói bởi các protein cấu trúc để lắp ráp virion con; và các bản phiên mã RNA dưới hệ gen Bộ gen của nó có khuynh hướng ít các nucleotide cytosine (C) và guanine (G), giống như các coronavirus khác

Bộ gen có thành phần cao nhất là U (32,2%), tiếp theo là A (29,9%), và thành phần tương tự của G (19,6%) và C (18,3%) [44] Sự sai lệch nucleotide phát sinh từ sự đột biến của guanines và cytosine tương ứng thành adenosine và uracils [45] Sự đột biến của dinucleotide CG được cho là phát sinh để tránh cơ chế bảo vệ liên quan đến protein kháng virus kẽm của tế bào (zinc finger antiviral protein), [46] và làm giảm năng lượng

để tháo liên kết bộ gen trong quá trình sao chép và dịch mã (cặp base adenosine và uracil thông qua hai liên kết hydro, cytosine và guanin qua ba) Việc cạn kiệt các dinucleotide

CG trong bộ gen của nó đã khiến virus có xu hướng sử dụng các tần suất codon xuất hiện trong bộ gen đáng chú ý Ví dụ: sáu codon khác nhau của arginine có tần số xuất hiện là AGA (2,67), CGU (1,46), AGG (0,81), CGC (0,58), CGA (0,29) và CGG (0,19)

Xu hướng thiên vị sử dụng codon tương tự cũng được thấy ở các coronavirus khác liên quan đến SARS [47]

1.3.2.3 Chu kỳ nhân bản của virus

Nhiễm virus bắt đầu khi các phần tử virus liên kết với các thụ thể tế bào trên bề mặt vật chủ Các thí nghiệm mô hình protein trên protein đột biến của virus đã sớm gợi

ý rằng SARS ‑ CoV ‑ 2 có đủ ái lực với enzym chuyển đổi angiotensin 2 (ACE2) trên tế bào người để sử dụng chúng như một cơ chế xâm nhập tế bào [41] Đến ngày 22 tháng 1 năm 2020, một nhóm ở Trung Quốc làm việc với bộ gen virus đầy đủ và một nhóm ở Hoa Kỳ sử dụng phương pháp di truyền ngược một cách độc lập và đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng ACE2 có thể hoạt động như một thụ thể đối với SARS ‑ CoV ‑ 2 Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng SARS ‑ CoV ‑ 2 có ái lực với ACE2 của người cao hơn so với

virus SARS ban đầu [41] SARS ‑ CoV ‑ 2 cũng có thể sử dụng basigin để hỗ trợ quá trình xâm nhập tế bào [48]

Protein, serine 2 (TMPRSS2), protease xuyên màng, là yếu tố cần thiết cho sự xâm nhập của SARS ‑ CoV ‑ 2. [49] Protein neuropilin 1 (NRP1) của tế bào chủ có thể hỗ trợ virus xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng cách sử dụng ACE2 Sau khi virion SARS ‑ CoV ‑ 2 gắn vào tế bào đích, TMPRSS2 của tế bào sẽ cắt mở protein đột biến của vi rút,

để lộ một peptid dung hợp trong tiểu đơn vị S2 và thụ thể chủ là ACE2 Sau khi dung hợp, một endosome hình thành xung quanh virion, ngăn cách nó với phần còn lại của tế bào chủ Virion thoát ra khi độ pH của endosome giảm xuống hoặc khi cathepsin, một cysteine protease của vật chủ, phân cắt nó Sau đó, virion giải phóng RNA vào tế bào

và buộc tế bào sản xuất và phổ biến các bản sao của vi rút, vi rút lây nhiễm sang nhiều

tế bào hơn

1.3.3 Phát sinh loài và các biến thể

SARS ‑ CoV ‑ 2 thuộc họ virus khá lớn được gọi là coronavirus [44] Nó là một loại

vi rút RNA sợi đơn (+ ssRNA) cảm nhận dương tính, với một đoạn RNA tuyến tính duy nhất Coronavirus lây nhiễm sang người, các động vật có vú khác, bao gồm cả gia súc

và động vật đồng hành, và các loài gia cầm [10] Coronavirus ở người có khả năng gây ra các bệnh từ cảm lạnh thông thường đến các bệnh nặng hơn như hội chứng hô hấp Trung Đông (MERS, tỷ lệ tử vong ~ 34%) SARS-CoV-2 là loại coronavirus được biết đến thứ bảy lây nhiễm sang người, sau 229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV và SARS-CoV ban đầu [6].

Giống như coronavirus liên quan đến SARS có liên quan đến đợt bùng phát SARS năm 2003, SARS ‑ CoV ‑ 2 là một thành viên của chi Sarbecovirus (dòng beta-CoV B)

[6] Các coronavirus trải qua quá trình tái tổ hợp thường xuyên Cơ chế tái tổ hợp ở virus RNA không phân đoạn như SARS-CoV-2 nói chung là bằng cách sao chép lựa chọn sao chép, trong đó vật liệu gen chuyển từ một phân tử khuôn RNA này sang một phân tử khuôn mẫu RNA khác trong quá trình sao chép [9] Chuỗi RNA SARS-CoV-2 có chiều dài xấp xỉ 30.000 base, [44] tương đối dài đối với coronavirus — do đó mang bộ gen lớn nhất trong số tất cả các họ RNA Bộ gen của nó gần như đầy đủ bao gồm các trình tự

mã hóa protein, một đặc điểm chung với các coronavirus khác

Hình 1.2: Hình ảnh hiển vi điện tử truyền qua của virion SARS ‑ CoV ‑ 2 (màu đỏ) được phân lập từ một bệnh nhân trong đại dịch COVID-19

Có hàng nghìn biến thể của SARS-CoV-2, có thể được nhóm lại thành các nhóm lớn hơn nhiều Một số danh pháp phân nhánh khác nhau đã được đề xuất Nextstrain chia các biến thể thành năm nhóm (19A, 19B, 20A, 20B và 20C), trong khi GISAID chia chúng thành bảy (L, O, V, S, G, GH và GR) [50]

Một số biến thể đáng chú ý của SARS-CoV-2 đã xuất hiện vào cuối năm 2020 Tổ chức Y tế Thế giới hiện đã tuyên bố năm biến thể cần quan tâm, đó là: [51]

• Alpha: Lineage B.1.1.7 xuất hiện ở Vương quốc Anh vào tháng 9 năm 2020, với bằng chứng về khả năng lây truyền và độc lực gia tăng Các đột biến đáng chú ý bao gồm N501Y và P681H

• Beta: Lineage B.1.351 xuất hiện ở Nam Phi vào tháng 5 năm 2020, với bằng chứng về khả năng lây truyền gia tăng và thay đổi tính kháng nguyên, với một số quan chức y tế công cộng đưa ra cảnh báo về tác động của nó đối với hiệu quả của một số loại vắc xin Các đột biến đáng chú ý bao gồm K417N, E484K và N501Y

• Gamma: Lineage P.1 xuất hiện ở Brazil vào tháng 11 năm 2020, cũng với bằng chứng về khả năng lây truyền và độc lực gia tăng, cùng với những thay đổi về tính kháng nguyên Mối quan tâm tương tự về hiệu quả của vắc-xin cũng đã được nêu ra Các đột biến đáng chú ý cũng bao gồm K417N, E484K và N501Y

• Delta: Lineage B.1.617.2 xuất hiện ở Ấn Độ vào tháng 10 năm 2020 Cũng có bằng chứng về sự gia tăng khả năng lây truyền và thay đổi tính kháng nguyên

• Omicron: Lineage B.1.1.529 xuất hiện ở Botswana vào tháng 11 năm 2021

Các biến thể đáng chú ý khác bao gồm 6 biến thể khác do WHO chỉ định đang được điều tra và Cụm 5, xuất hiện trong số chồn ở Đan Mạch và dẫn đến chiến dịch diệt chồn khiến nó gần như tuyệt chủng [51]

1.4 Real Time RT-PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm SARS-CoV-2 bằng kỹ thuật Real Time RT-PCR

1.4.1 Real Time RT-PCR

Tế bào, ở tất cả các sinh vật điều hòa sự biểu hiện gen bằng chu kỳ phiên mã gen (RNA sợi đơn): Số lượng gen biểu hiện trong tế bào có thể được đo bằng số lượng bản sao phiên mã RNA của gen đó có trong mẫu Để phát hiện và định lượng rõ ràng sự biểu hiện gen từ một lượng nhỏ RNA, cần phải khuếch đại bản sao gen Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một phương pháp phổ biến để khuếch đại DNA; đối với PCR dựa trên RNA, mẫu RNA đầu tiên được phiên mã ngược thành DNA bổ sung (cDNA) với enzym phiên mã ngược, nên còn được gọi là PCR phiên mã ngược (RT-PCR, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

Tiếp theo, để khuếch đại một lượng nhỏ DNA, phương pháp tương tự được sử dụng như trong PCR thông thường cần có khuôn mẫu DNA, ít nhất một cặp mồi cụ thể, deoxyribonucleotide triphosphat, dung dịch đệm thích hợp và DNA polymerase bền nhiệt Một chất được đánh dấu bằng fluorophore được thêm vào hỗn hợp này trong một máy tuần hoàn nhiệt có chứa các cảm biến để đo huỳnh quang của fluorophore sau khi

nó đã được kích thích ở bước sóng yêu cầu cho phép đo tốc độ tạo ra cho một hoặc nhiều sản phẩm cụ thể Điều này cho phép đo tốc độ tạo ra sản phẩm khuếch đại ở mỗi chu kỳ PCR Do đó, dữ liệu được tạo ra có thể được phân tích bằng phần mềm máy tính để tính toán biểu hiện gen tương đối (hoặc số bản sao mRNA) trong một số mẫu PCR định lượng cũng có thể được áp dụng để phát hiện và định lượng DNA trong các mẫu để xác định sự hiện diện và sự phong phú của một chuỗi DNA cụ thể trong các mẫu này [5]

Phép đo này được thực hiện sau mỗi chu kỳ khuếch đại, và đây là lý do tại sao phương pháp này được gọi là PCR thời gian thực (realtime PCR, tức là PCR tức thì hoặc đồng thời)

PCR định lượng và microarray DNA là những phương pháp hiện đại để nghiên cứu sự biểu hiện gen Các phương pháp cũ hơn đã được sử dụng để đo mức độ phong phú của mRNA: hiển thị khác biệt, xét nghiệm bảo vệ RNase và Northern blot Phương pháp Northern blotting thường được sử dụng để ước tính mức độ biểu hiện của một gen

trong một mẫu Trong phương pháp này, RNA tinh khiết được tách bằng điện di trên gel agarose, được chuyển sang chất nền rắn (chẳng hạn như màng nylon), và được thăm dò bằng đầu dò DNA hoặc RNA cụ thể bổ sung cho gen quan tâm Mặc dù kỹ thuật này vẫn được sử dụng để đánh giá sự biểu hiện của gen, nhưng nó đòi hỏi lượng RNA tương đối lớn và chỉ cung cấp thông tin định tính hoặc bán định lượng về mức độ mRNA [4]

Sai số ước tính phát sinh từ các biến thể trong phương pháp định lượng có thể là kết quả của tính toàn vẹn của DNA, hiệu quả của enzyme và nhiều yếu tố khác Vì lý do này, một số hệ thống tiêu chuẩn hóa (thường được gọi là phương pháp chuẩn hóa) đã được phát triển Một số đã được phát triển để định lượng tổng số biểu hiện gen, nhưng phổ biến nhất là nhằm định lượng gen cụ thể đang được nghiên cứu liên quan đến một gen khác được gọi là gen bình thường hóa, được chọn cho mức độ biểu hiện gần như không đổi Những gen này thường được chọn từ các gen quản lý vì các chức năng của chúng liên quan đến sự sống còn cơ bản của tế bào thường bao hàm sự biểu hiện gen [8] Điều này cho phép các nhà nghiên cứu báo cáo một tỷ lệ cho sự biểu hiện của các gen quan tâm chia cho sự biểu hiện của bộ chuẩn hóa đã chọn, do đó cho phép so sánh với gen trước đó mà không thực sự biết mức độ biểu hiện tuyệt đối của nó

Các gen bình thường hóa được sử dụng phổ biến nhất là các gen mã hóa các phân

tử sau: tubulin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, albumin, cyclophilin và RNA ribosome, -actin [52]

1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng kết quả xét nghiệm SARS-CoV-2 bằng kỹ thuật Real Time RT-PCR

Phương pháp xét nghiệm bằng kĩ thuật Realtime RT-PCR được coi là tiêu chuẩn vàng để khẳng định ca bệnh nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, các phòng xét nghiệm cần lưu ý các yếu tố kĩ thuật có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Các nguyên nhân gây âm tính giả có thể do chất lượng mẫu không đạt, thời gian lấy mẫu, hay hóa chất sử dụng Các nguyên nhân gây dương tính giả thường liên quan đến thao tác của kĩ thuật viên cũng như hóa chất, trang thiết bị Nhận định tốt các nguyên nhân này sẽ giúp phòng xét nghiệm làm tốt hơn trong phiên giải kết quả, đồng thời đảm bảo chất lượng xét nghiệm để phục vụ chống dịch hiệu quả hơn Dưới đây là tác động của từng yếu tố có thể dẫn đến kết quả âm tính giả và dương tính giả của xét nghiệm PCR chẩn đoán SARS-CoV-2 [53]

1.4.2.1 Âm tính giả

a) Quá trình trước xét nghiệm:

- Chất lượng bệnh phẩm không đạt: Bệnh phẩm tiêu chuẩn để xét nghiệm PCR thành công là dịch tỵ hầu và dịch họng được lấy đúng phương pháp Các bệnh phẩm đường hô hấp trên khác như dịch rửa tỵ hầu có thể cho tải lượng virus thấp hơn hoặc thậm chí không phát hiện được virus Cần nhấn mạnh là phải lấy đủ bệnh phẩm ở 2 vị trí trên bởi nếu chỉ xét nghiệm duy nhất dịch họng sẽ dẫn đến âm tính giả Ngoài ra dịch tỵ hầu nếu không lấy được ở đúng

vị trí giải phẫu mà chỉ ngoáy được phần ngoài khu vực tiền đình mũi cũng sẽ cho kết quả

âm tính giả Do đó việc đào tạo điều dưỡng viên, kĩ thuật viên lấy mẫu chuẩn xác là cực kỳ quan trọng

- Thời điểm lấy mẫu không phù hợp: Thông thường lấy mẫu ngay khi xuất hiện triệu chứng bệnh, tuy nhiên với những trường hợp nhiễm không triệu chứng thì thời điểm lấy mẫu rất quan trọng Lấy quá sớm (1 - 3 ngày) sau khi phơi nhiễm có thể dẫn tới âm tính giả do virus chưa kịp nhân lên đủ lượng để phát hiện được Ngược lại lấy mẫu quá muộn (thường từ ngày bệnh từ 17 trở đi) cũng sẽ cho kết quả âm tính do lúc này cơ thể đã đào thải hết virus Lúc này thì cần làm thêm xét nghiệm kháng thể IgM - IgG để xác định liệu bệnh nhân đã phơi nhiễm hay chưa Lưu ý rằng đối với COVID-19 thì IgM không phải là marker đặc hiệu cho giai đoạn cấp của bệnh như đối với các tác nhân thông thường khác bởi nhiều bệnh nhân IgM còn xuất hiện muộn hơn cả IgG

- Môi trường bảo quản vận chuyển không đảm bảo: Giai đoạn đầu của dịch, khi môi trường VTM còn chưa phổ biến thì nhiều đơn vị dùng nước muối sinh lý hoặc PBS (phosphat buffer saline) thay thế Bản thân nước muối hay PBS không có chất ức chế PCR, tuy nhiên nếu ống đựng môi trường không đảm bảo, chẳng hạn dính 1 ít heparin hoặc có bột găng tay bám vào hay bất kỳ chất ức chế nào sẽ làm PCR không thực hiện được dẫn tới kết quả âm tính giả Do đó, khuyến cáo nên mua sẵn ống môi trường vận chuyển tiêu chuẩn bởi môi trường này có tác dụng bảo quản virus sống để ngoài PCR còn có thể làm nuôi cấy, phân lập (nước muối hay PBS chỉ có thể dùng cho PCR do virus trong mẫu sẽ chết) b) Quá trình trong xét nghiệm:

- Gộp mẫu quá nhiều: Hiện nay quy định cho phép có thể gộp đến 10 - 20 mẫu cho 1 phản ứng PCR, tuy nhiên với những người làm PCR kinh nghiệm, gộp từ 5 mẫu trở xuống sẽ

an toàn hơn Lý do là vì khi gộp mẫu nghĩa là đã giảm thể tích tách chiết, do đó nguy cơ âm

tính giả, bỏ lọt ca bệnh sẽ cao hơn Thực tế cho thấy với những mẫu Ct tầm 33-35 trở lên thì khi gộp sẽ âm tính

- Hóa chất tách chiết không đảm bảo: Đặc biệt là car- rier RNA do để lâu hoặc bảo quản không đúng cách Theo quy định của nhà sản xuất, carrier RNA sau khi hoàn nguyên, nếu dùng ngay thì cho vào lysis buffer AVL, nếu không dùng ngay phải chia vào các aliquot nhỏ

và cất tủ -20oC, lần sau lấy đủ lượng ra dùng, tránh tan đông nhiều lần Nếu làm không đúng thì hiệu suất thu RNA sẽ bị ảnh hưởng dẫn đến âm tính giả Do đó, để đảm bảo chất lượng thì mẫu nên tách cùng chứng nội tại là EAV là một virus RNA từ hải cẩu (equine) Nếu chứng nội tại cho kết quả tốt thì có thể tin tưởng hiệu suất tách chiết đảm bảo Điều này dễ xảy ra

do kĩ thuật viên mới làm, chưa thạo quy trình nên dễ nhầm thứ tự cho các buffer gồm cồn, AW1 AW2 hoặc rửa lần 2 lẽ ra phải cho AW2 nhưng lại dùng nhầm lọ AW1 Ngoài ra sai sót còn có thể gặp khi quên không thêm cồn vào 2 lọ AW1 và AW2 Thông thường nếu tách ít thì không mấy khi quên nhưng khi tách chiết nhiều và dùng kit mới liên tục thì dễ gây nhầm lẫn giữa buffer của kit cũ và kit mới Để tránh hiện tượng này thì nên cố gắng dùng hết vật tư của kit cũ mới chuyển sang kit mới và các buffer cũ còn thừa thì nên bỏ đi Trong thực tế các phòng thí nghiệm hay dồn buffer thừa lại dẫn tới nhầm lẫn lọ cũ lọ mới Ngoài ra cũng cần đánh dấu lọ nào đã thêm cồn và ngày mở lọ để người dùng sau dễ dàng phân biệt

- Đối với tách chiết hệ thống tự động: (chẳng hạn King Fisher, Magna 24) các hệ thống này thường sử dụng bi từ thu RNA nên hiệu suất thu hồi RNA phụ thuộc máy móc và hóa chất hãng, tuy nhiên thường không tốt bằng tách tay Do đó khuyến cáo nên tách cùng chứng nội tại và chạy PCR cùng để đảm bảo chất lượng xét nghiệm

- Tra mẫu bỏ sót hoặc thiếu thể tích mẫu: tách chiết xong thì sẽ thêm 5 - 10ul RNA khuôn mẫu vào ống mas- ter mix để chạy phản ứng PCR Tuy nhiên nếu chạy nhiều (làm PCR đĩa) mà lại dùng pipette đơn kênh thì rất dễ bỏ sót hoặc hút thiếu thể tích gây âm tính giả Giải pháp cho tình trạng này là dùng pipette đa kênh nếu mẫu được tách chiết tự động Còn nếu mẫu tách tay thì tốt nhất khi tra mẫu nên có 2 người và hạn chế chạy mẫu đêm bởi khi KTV mệt, đếm nhầm thì rất dễ dẫn đến sai sót

c) Quá trình sau xét nghiệm

Sau khi hoàn tất chương trình PCR, một số máy cho phép chỉnh baseline (đường nền) theo đó giá trị Ct value cũng sẽ thay đổi nhất định Nếu chỉnh baseline quá cao sẽ khiến một

số mẫu đang từ dương tính yếu thành âm tính Đối với trường hợp này cần xem cụ thể từng

đồ thị của mẫu nghi ngờ và chạy lại nếu cần Tuy nhiên khuyến cáo không nên chỉnh baseline quá cao, giá trị huỳnh quang cho baseline (trục tung của đồ thị) nên trong khoảng

từ 300 - 500 là vừa Nếu tín hiệu nền quá nhiễu thì cần xem xét thay probe mới bởi probe để lâu hoặc tan đông nhiều lần hoặc không quấn giấy bạc sẽ gây đứt gãy reporter làm tăng huỳnh quang nền dẫn đến nhiễu

1.4.2.2 Dương tính giả

a) Trước xét nghiệm: Do ống môi trường vận chuyển bị nhiễm, khả năng này ít xảy ra nhưng vẫn có thể gặp do ống chứa môi trường vận chuyển khi bảo quản ở phòng xét nghiệm chưa đúng cách (chẳng hạn để chung trong tủ với bệnh phẩm) hoặc chuyển xuống khoa lâm sàng nhưng điều dưỡng viên bỏ quên dẫn đến để lâu khiến chất lượng ống không tốt Để khắc phục thì cần dùng ống còn hạn sử dụng và không phát ống môi trường quá nhiều cho lâm sàng Tốt nhất khi giao nhận môi trường cần kí sổ người giao nhận, ngày giờ và

số lượng ống phát ra để sau này tiện tra cứu

b) Trong xét nghiệm:

- Nhiễm chéo từ mẫu dương cao tách cùng mẻ chạy: Khi tách chiết 24 mẫu cùng nhau, nếu trong mẻ tách có những mẫu tải lượng virus cao mà thao tác pipette lại không tốt, tạo giọt bắn thì rất dễ nhiễm sang các mẫu lân cận Có thể phát hiện được khả năng này khi luôn tách cùng mẫu Mock là mẫu chỉ có nước cất thay vì bệnh phẩm Nếu mẫu mock hay còn gọi là chứng âm tách chiết dương tính thì nên làm lại cẩn thận hoặc thay KTV khác tách chiết Nếu kết quả vẫn dương thì cần thay bộ hóa chất tách chiết mới bởi lúc này khả năng cao là hóa chất dung dịch tách chiết đã bị nhiễm Ngoài hóa chất thì các thiết bị phụ trợ dùng trong tách chiết như máy vortex, máy ly tâm và đặc biệt pipette cũng cần vệ sinh thường xuyên bằng cồn hay dung dịch khử DNA, RNA nhằm loại bỏ nguy cơ nhiễm Môi trường phòng tách chiết cũng phải bật đèn cực tím thường xuyên vừa để đảm bảo an toàn sinh học vừa giảm thiểu nguy cơ nhiễm PCR

- Nhiễm chứng âm hóa chất (NTC control): Chứng âm hóa chất bị nhiễm thường

do hóa chất mở ra mở vào nhiều lần hoặc sử dụng chung pipette với phòng tách chiết hay tra mẫu Khi hiện tượng này xảy ra cần kiểm tra lại cẩn thận và bỏ bộ hóa chất bị nhiễm ngay Tuyệt đối không di chuyển pipette từ phòng sạch (hóa chất) sang phòng tách chiết hay tra mẫu và ngược lại Ngoài ra cần tuân thủ quy trình xét nghiệm là pha mix trước, sau đó mới làm tách chiết và tra mẫu PCR Nếu có quá nhiều mẻ chạy thì nên

phân công người chuyên pha mix, người chuyên tách chiết để giảm thiểu nguy cơ ra vào phòng xét nghiệm không hợp lý dẫn đến sai sót

- Nhiễm chéo từ chứng dương khi tra mẫu: sau khi tách chiết xong, tra mẫu vào đĩa PCR cần thao tác pipette chính xác và cẩn thận Tốt nhất tra mẫu trước, sau đó đậy nắp lại rồi mới thao tác đến chứng dương để giảm thiểu nguy cơ này Đặc điểm của kiểu nhiễm này thường rơi vào các giếng gần vị trí chứng dương nên kĩ thuật viên cần lưu ý chạy lại nếu nghi ngờ

- Nhiễm amplicon trong quá trình chạy PCR: ampli- con là các bản sao DNA được tổng hợp trong quá trình PCR Đối với PCR Real time, các bản sao này được giữ nguyên trong ống phản ứng, tuy nhiên nếu không may ống bị hở nắp (do nhiệt độ cao) hoặc nút không chặt dẫn đến bay hơi thì amplicon sẽ thoát ra ngoài Chỉ cần 1 lượng nhỏ amplicon thoát ra sẽ làm nhiễm máy real - time và môi trường phòng máy Nếu máy realtime bị nhiễm ở block nhiệt thì mẻ chạy xét nghiệm tiếp theo sẽ bị ảnh hưởng nặng nề bởi kiểu nhiễm này thường có đồ thị lên rất sớm và đều nhau ở gần như tất cả các giếng nên không thể nhận định được kết quả Chưa kể việc khắc phục hậu quả do nhiễm amplicon

là tương đối gian nan và cần thời gian để lượng amplicon trong môi trường PXN giảm dần Các giải pháp nhằm giảm thiểu nguy cơ nhiễm amplicon gồm:

+ Tập huấn cẩn thận nhân viên việc đóng chặt nắp ống PCR sau khi tra mẫu xong bởi chỉ cần một người bất cẩn thôi là cả phòng xét nghiệm vất vả

+ Hạn chế chạy máy liên tục, cần cho máy thời gian nghỉ ngơi, tốt nhất 1 đến 2 tiếng giữa các mẻ chạy

+ Vệ sinh phòng máy bằng cồn và dung dịch DNAaway và đèn cưc tím thường xuyên

Dương tính giả do hóa chất để lâu: Thường là do probe giảm chất lượng dẫn đến tín hiệu khó phân biệt giữa nhiễu và đồ thị chuẩn Trường hợp này thường gặp khi ống probe đã tan đông nhiều lần hoặc master mix đã dùng gần hết nên nồng độ probe/mồi bị ảnh hưởng Khác với các trường hợp dương tính giả nêu trên, trường hợp này đồ thị thường xấu và không rõ curve, đôi khi tín hiệu huỳnh quang chỉ ngóc lên chút rồi chạy ngoằn ngoèo Lúc này thì nên mix lại PCR dùng hóa chất mới và chạy lại để xem còn hiện tượng xảy ra nữa hay không Nếu vẫn không quyết định được thì tốt nhất nên tách chiết lại hoặc lấy lại bệnh phẩm Ngoài ra khi phải chạy nhiều mẫu thì các PXN thường

hay pha mix sẵn và để vào tủ âm, nếu bảo quản các mix pha sẵn này không tốt cũng sẽ

có thể gặp dương tính giả vì thường các mix pha sẵn sẽ không được đậy chặt nắp mà chỉ đậy hờ nên dễ bị nhiễm Do đó nên ghi ngày pha mix lên ống, để mix ở nơi tránh ánh sáng trong tủ, đồng thời pha xong nên dùng ngay trong vòng 3 - 5 ngày

1.5 Ngoại nhiễm sản phẩm PCR, gây dương tính giả trong phòng xét nghiệm Sinh học phân tử

1.5.1 Vấn đề ngoại nhiễm sản phẩm PCR và khả năng phòng ngừa ngoại nhiễm sản phẩm PCR của các bộ kít xét nghiệm SARS-CoV-2

Nguyên lý của PCR là khuếch đại DNA, vì vậy các phòng thí nghiệm sử dụng PCR liên tục không sớm thì muộn cũng sẽ bị nhiễm sản phẩm PCR lên tất cả các thiết bị, dụng cụ, hóa chất Người làm thí nghiệm sẽ nhận ra được thảm họa này khi toàn bộ các lần chạy PCR đều ra kết quả dương tính, kể cả khi sử dụng mẫu là nước cất Khi điều này xảy ra thì chỉ có cách bỏ toàn bộ hóa chất, khử nhiễm toàn bộ phòng thí nghiệm… Dù vậy, điều này vẫn sẽ tái diễn sau một khoảng thời gian sử dụng PCR

Hình 1.3: Sơ đồ xử lý sản phẩm PCR ngoại nhiễm bằng UNG

Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức đối với các phòng thí nghiệm sinh học phân tử Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học đã có thể giải quyết vấn đề này một cách khá hữu hiệu, đó là trong thành phần dNTP có bổ sung thêm một ít dUTP Các sản phẩm PCR tạo ra sẽ luôn tồn tại một số vị trí là U thay vì T, các vị trí U này sẽ có thể xử lý phân hủy bằng enzme UNG Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật (template) sẽ không chứa

U, vì vậy ủ PCR mix với enzyme UNG trước khi chạy phản ứng PCR sẽ giúp phân cắt toàn bộ các DNA ngoại nhiễm mà không ảnh hưởng đến template

1.5.2 Cách khử nhiễm và loại bỏ dương tính giả trong phản ứng PCR tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử

Phản ứng PCR thường có độ nhạy rất cao, nhưng chính nhược điểm đó lại khiến

kỹ thuật này dễ xảy ra dương tính giả Trong phòng thí nghiệm, nơi chủ yếu thực hiện phản ứng PCR, bất kỳ sự dương tính giả nào cũng có thể thường xuyên xảy ra không chỉ từ việc nhiễm sản phẩm khuếch đại [54]

Một mao quản bị vỡ hay một khay PCR để bất cẩn ở mép bàn cũng đều khiến phát tán các phân tử sản phẩm khuếch đại Và sau đó sản phẩm này sẽ luôn hiện lên trong bất

kỳ phản ứng PCR nào mà bạn thực hiện Một cách đơn giản mà hiệu quả để loại bỏ việc nhiễm các sản phẩm khuếch đại là lau sạch tất cả mọi thứ, từ thiết bị, khu vực làm PCR đến pipet với chất tẩy (như Giaven,…)

Sodium hypochlorite là một thành phần có trong thuốc tẩy, được biết đến vào năm

1992 với tác dụng bảo vệ hiệu quả, chống lại sự nhiễm sản phẩm DNA khuếch đại bằng cách gây ra “extensive nicking”, do đó có khả năng ngăn chặn các đoạn kích thước 600

bp - sản phẩm của phản ứng PCR [55]

Hiệu quả của thuốc tẩy trong việc khử nhiễm DNA phụ thuộc vào lượng clo tự do

có trong thuốc tẩy đó 0,05-0,5% clo tự do được coi là mức độ khử trùng trung bình và một chất tẩy thương mại (như Clorox) sẽ chứa khoảng 5.84% clo, do vậy việc pha loãng thuốc tẩy 10-100 lần từ nồng độ gốc sẽ cho hiệu quả tốt [55]

Cách thức và thời gian khử nhiễm:

- Cách thức: Phun/ xịt khu vực làm PCR/ thiết bị với 10% thuốc tẩy, sau đó để yên trong 15-30 phút Tiếp theo lau sạch thuốc tẩy bằng nước sạch Vì thuốc tẩy có tính ăn mòn mạnh, nên nó sẽ phá hủy vật liệu nếu không được loại bỏ kỹ với nước sạch

- Thời gian: Quy trình lau rửa này nên được thực hiện trước và sau mỗi lần làm PCR Bạn có thể lên lịch vệ sinh các thiết bị và khu vực làm PCR hàng tuần, đây cũng

là một cách rất hữu hiệu để ngăn chặn việc nhiễm trong phản ứng PCR

Những điểm quan trọng về việc pha loãng và bảo quản thuốc tẩy:

+ Dùng nước sạch để pha loãng thuốc tẩy;

+ Nên pha loãng thuốc tẩy thường xuyên: Hiệu quả của thuốc tẩy sẽ giảm theo thời gian, vì vậy, việc pha loãng thuốc tẩy fresh (tươi) là điều rất cần thiết Nếu không ngửi thấy mùi clo trong thuốc tẩy, thì đã đến lúc cần pha loãng lại chúng, thường thì bảo quản dung dịch thuốc tẩy pha loãng (1:10) trong khoảng 1-2 tuần

+ Pha loãng ở nhiệt độ phòng trong dụng cụ đục màu (tránh ánh sáng), vì nhiệt độ, ánh sáng và oxy có thể góp phần làm phân hủy thuốc tẩy

+ Khi thao tác với thuốc tẩy, cần đảm bảo các nguyên tắc an toàn như: mặc áo blouse, đeo găng tay, kính an toàn, khẩu trang,

1.6 Sự tương tác của các thành phần trong máu đối với phản ứng PCR

Hiện nay, trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, người ta đã phát hiện ra một

số hóa chất có thể ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng này

4 Lactoferrin Máu, sữa, thuốc tăng cường

hệ miễn dịch, thuốc thảo dược,

Những chất ức chế PCR có thể ảnh hưởng đến tốc độ hoặc gây nhiễu phản ứng bằng cách gắn trực tiếp vào DNA/ RNA đích, làm mất hoạt tính enzym DNA polymerase hoặc gây mất tác dụng hoạt hóa của ion Mg2+ trong quá trình phản ứng, … [56]

Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng ức chế phản ứng PCR của các chất

Việc phát hiện và loại trừ các chất ức chế phản ứng PCR có tác dụng quyết định

sự thành công và chất lượng của phản ứng PCR Vì vậy, đây là một việc làm vô cùng cần thiết đối với những người thực hiện phản ứng này

Có thể phát hiện các chất ức chế PCR bằng cách sử dụng các chứng nội tại internal positive control (IPC) được cung cấp kèm theo bộ Kit của nhà sản xuất Các số liệu thu được của phản ứng Real-time PCR cũng có thể được sử dụng để phát hiện các chất ức chế bằng cách phân tích hiệu quả khuếch đại của mẫu

Việc phát hiện và khắc phục ảnh hưởng của các chất ức chế phản ứng PCR cho phép các phòng thí nghiệm sinh học phân tử lựa chọn tốt các mẫu hơn, thu được tỷ lệ khuếch đại thành công cao hơn và hiệu quả của phòng thí nghiệm được cải thiện hơn

Y tế cấp phép sử dụng trong các phòng xét nghiệm COVID-19 đó là:

+ Một là: Bộ kit của công ty Việt Á (ra mắt ngày 5-3-2020)

+ Hai là bộ kít của Công ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất đã được Bộ Y tế Việt Nam cấp số lưu hành vào ngày 7/5/2020 Bộ kit là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine và sinh phẩm y tế và Đại học Bách khoa Hà Nội, sau đó chuyển giao công nghệ cho công ty cổ phần Sao Thái Dương

Cả 2 bộ kit đều đã được tiến hành thử nghiệm lâm sàng trước khi được đưa vào sử dụng Dưới đây là một vài công bố của các nhà sản xuất bộ kit:

- Bộ kit của Việt Á này đã được Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đánh giá về: độ nhạy (xác định ngưỡng phát hiện tối thiểu thông qua số bản copy của virus SARS-CoV-2); độ đặc hiệu (xác định phản ứng chéo của sinh phẩm với các virus gây viêm đường

hô hấp cấp: SARS-CoV, Cúm A/H1pdm09, A/H3, A/H5, B và các mẫu âm tính khác);

độ ổn định (xác định tính tương thích của sinh phẩm với các hệ thống máy Realtime PCR: ABI-7500 fast, Lifecycle (Roche), CFX-96 (Biorad), Rotorgen (Qiagen)) Các thử nghiệm đánh giá được lặp lại 3 lần/ bộ sinh phẩm Kết quả đánh giá bước đầu cho thấy,

5 bộ test kit của Học viện Quân y có độ nhạy ổn định sau 3 lần lặp lại, có thể phát hiện SARS-CoV-2 (với 5 bản copy).[57]

- Bộ kit của Sao Thái Dương đã tiến hành đánh giá thử nghiệm lâm sàng trên các bệnh phẩm tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương và Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương, bộ kit phát hiện được SAR-COV-2 trên các bệnh phẩm này Bộ sinh phẩm đã được đánh giá trên 166 mẫu bệnh phẩm lâm sàng Giảm thời gian trả lời kết quả 2h; Độ đặc hiệu phân tích 100%; không có phản ứng chéo với 40 tác nhân gây viêm đường hô hấp, Độ chính xác cao 100% với cv tái lặp <5%; Không có nhiễm chéo (Cross contamination) khi thử nghiệm trên panel mẫu dương nồng độ cao và mẫu âm; Độ đặc hiệu lâm sàng 100% (95%CI: 97-100%) [58]

1.7.1 Bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR của Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á

a) Nguyên lý tách chiết

Bộ kít Việt Á sử dụng dung môi hữu cơ cho việc tách chiết và thu hồi RNA [59]

Dung dịch ly giải tế bào sẽ giúp phá vỡ màng tế bào và màng bào quan để giải phóng RNA và các chất nội bào khác Trong khi đó việc sử dụng các dung môi hữu cơ như phenol-chloroform sẽ phân tách RNA khi ly tâm Phenol: chloroform: isoamyl alcohol, bằng cách ly tâm, tạo thành ba lớp, bao gồm lớp hữu cơ bên dưới, lớp ở giữa chứa

protein-DNA, và lớp nước chứa RNA phía trên Pha nước phía trên được thu thập, sau

đó tiến hành kết tủa, rửa sạch và hòa tan trong nước không có RNase để thu được RNA tổng từ mẫu Phương pháp phân tách và thu hồi axit nucleic dựa trên dung môi hữu cơ

sử dụng phenol, chloroform và isoamyl alcohol được coi là phương pháp tiêu chuẩn vàng

và năng suất cao

b) Các gene được sử dụng cho việc phát hiện SARS-CoV-2

Bộ LightPower iVASARS-CoV-2 1stRT-rPCR Kit sử dụng kĩ thuật real-time RT-PCR với TaqMan probe để phát hiện SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm đường hô hấp trên (hỗn hợp dịch mũi họng, dịch súc họng), đường hô hấp dưới (đờm, dịch phế nang,

dịch nội khí quản, dịch màng phổi…) Bộ LightPower iVASARS-CoV-2 rPCR Kit được thiết kế trên vùng gene mục tiêu là gene N của RNA SARS-CoV-2 được thu nhận từ mẫu sau đó được nhân bản bằng kỹ thuật real-time RT- PCR, với TaqMan probe trên kênh

màu FAM đặc hiệu cho SARS-CoV-2 và TEXAS RED cho SARS-like coronavirus

Chứng nội nội sinh (HEX) cho phép kiểm soát toàn bộ quá trình từ tách chiết đến thu nhận kết quả

c) Thành phần bộ kít

+ Bộ hóa chất dùng cho phản ứng real-time RT-PCR (Bảo quản nhiệt độ -20 o C)

iVA SARS-CoV-2 1stRT-rPCR Mix : 2x25 phản ứng

+ Bộ mẫu đối chứng (Bảo quản nhiệt độ -20 o C)

Chứng dương, chứng âm có thể dùng cho bước tách chiết hoặc PCR

+ Bộ kit tách chiết RNA bằng phương pháp tủa

iVAaRNA Extraction Kit M - VA.A92-002B : 50 tests/bộ

Dùng tách chiết RNA từ các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau

1.7.2 Bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai Duong của công ty cổ

phần Sao Thái Dương

a) Nguyên lý tách chiết

Khác với việc tách chiết RNA tổng bằng dung môi hữu cơ như trong kit Việt Á, kit của Sao Thái Dương sử dụng cột (pha rắn) để thu hồi RNA từ mẫu [60a] Tách chiết

RNA bằng phương pháp cột silica là một dạng tách chiết pha rắn để tinh sạch RNA một cách nhanh chóng Trong điều kiện các môi trường đệm khác nhau, RNA sẽ liên kết với màng silica và được giữ lại, còn các thành phần không mong muốn khác được loại bỏ bằng cách ly tâm

Quy trình tách chiết RNA bắt đầu với quá trình ly giải tế bào Một chất đệm bao gồm Guanidine Thiocyanate hoặc các dạng chaotropes khác là được sử dụng để làm giảm các điện tích trên RNA và nước để polyme có thể được tinh chế bằng kỹ thuật pha rắn Chaotropes tạo ra mạch thẳng polyme RNA, phá vỡ liên kết hydro và phá hủy hoạt động của bất kỳ RNA nào có trong dịch phân ly tế bào Do khả năng phá vỡ liên kết hydro, chúng cũng làm ly giải tế bào bằng cách phá hủy lớp kép phospholipid Ethanol sau đó được thêm vào để: giảm lượng nước tổng thể trong mẫu và kết tủa protein Như

đã biết, RNA rất dễ hòa tan trong nước Sau đó, một cột spin (hỗ trợ pha rắn) sau đó được sử dụng để liên kết RNA từ dịch phân ly của tế bào Ban đầu, dung dịch đệm rửa

có nồng độ chaotrope thấp được sử dụng để làm sạch mẫu RNA và loại bỏ các protein trong khi RNA vẫn gắn vào cột Tiếp theo, rửa cột bằng etanol sẽ loại bỏ một số muối chaotropic còn sót lại từ các lần rửa trước Cuối cùng, dung dịch không có muối chaotropic, nước không có RNAse có thể được sử dụng để rửa giải mẫu RNA từ cột

b) Các gene được sử dụng

Bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai Duong được thiết kế trên vùng gene mục tiêu là gene N1, N2 và N3 thuộc vùng vỏ nucleocapsid của RNA SARS-CoV-2 được thu nhận từ mẫu sau đó được nhân bản bằng kỹ thuật real-time RT- PCR, với TaqMan probe trên kênh màu FAM đặc hiệu cho SARS-CoV-2 và TEXAS RED cho SARS-like coronavirus

Chứng nội nội sinh (HEX) cho phép kiểm soát toàn bộ quá trình từ tách chiết đến thu nhận kết quả

Bảng 1.1 Các gene mục tiêu được sử dụng trong bộ kit Sao Thái Dương [60b]

Mồi

và probe

thước amplicon

Mục đích sử dụng

SARS- CoV-2

28351 ngược G 28325–

SARS-CoV-2, SARS-CoV,

và các loài thuộc họ virus Sarbecoviruse -s khác

28768–

28748

Mồi ngược

+ Bộ hóa chất dùng cho phản ứng real-time RT-PCR (Bảo quản nhiệt độ -20 o C)

One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai Duong : 50 phản ứng

+ Bộ mẫu đối chứng (Bảo quản nhiệt độ -20 o C)

Chứng dương, chứng âm có thể dùng cho bước tách chiết hoặc PCR + Bộ kit tách chiết

FavorPrep TM Viral RNA/ Viral Nucleic Acid Mini Kit : 100 preps/bộ

Dùng tách chiết RNA/ DNA từ các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ đồ nghiên cứu