Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kit xét nghiệm chẩn đoán SARS cov 2 được sử dụng phổ biến ở việt nam (tt)

Trong đó 2 bộ kit đã được Bộ Y tế cấp phép sử dụng trong các phòng xét nghiệm COVID-19 ở Việt Nam hiện nay là bộ kit của công ty Việt Á và công ty Sao Thái Dương.. Nhằm khẳng định tính h

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số : 8420201

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2022

Công trình được hoàn thành tại TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Xuân

vào ngày 7 tháng 7 năm 2022

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

− Trung tâm Học liệu và truyền thông, Trường Đại học Bách khoa-

ĐHĐN;

− Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN

Trong tình hình chung của thế giới và nhu cầu cấp thiết tại Việt Nam, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã tiến hành nghiên cứu phát triển các kit sàng lọc nhanh COVID-19 Trong đó 2 bộ kit đã được Bộ

Y tế cấp phép sử dụng trong các phòng xét nghiệm COVID-19 ở Việt Nam hiện nay là bộ kit của công ty Việt Á và công ty Sao Thái Dương Nhằm khẳng định tính hiệu dụng của 2 bộ kit trong thực tế sử dụng ở các phòng xét nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán Sars-CoV-2 được sử dụng phổ biến ở Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài nhằm mục đích: “Đánh giá giá trị sử dụng của 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán Sars-CoV-2 bằng kỹ thuật Real-Time RT-PCR được sử dụng phổ biến ở Việt Nam là kit của công ty cổ phần công nghệ Việt Á và của công ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất, nhằm

khẳng định hiệu quả sử dụng của các kit sàng lọc trong điều kiện thực

tế ở phòng xét nghiệm”

Mục tiêu cụ thể của đề tài bao gồm:

- Đánh giá về giá cả, và sự thuận lợi trong thao tác cho các kỹ thuật viên trong điều kiện thực tiễn

- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thường gặp trong phòng xét nghiệm: như sự mất mẫu do quá trình tách chiết khi sử dụng các bộ kit tách chiết khác nhau, sự ảnh hưởng do ngoại nhiễm sản phẩm

- Đánh giá khả năng sử dụng 2 bộ kit trong trường hợp thực hiện việc gộp mẫu với số lượng mẫu gộp khác nhau

- Đánh giá việc nhiễm máu có thể xảy ra trong quá trình lấy mẫu đến sự phát hiện Sars-Cov-2 của 2 bộ kit

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

➢ Mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân được lấy mẫu và xét nghiệm Sars- CoV- 2 tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử thuộc Trung tâm

Kiểm soát bệnh tật Quảng Nam

➢ 2 Bộ Kit xét nghiệm chuẩn đoán Sars- CoV- 2: Bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR của Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á; Bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai

Duong của công ty cổ phần Sao Thái Dương

3.2 Phạm vi nghiên cứu

Các nghiên cứu này được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm nhằm đánh giá lại và so sánh hiệu quả của 2 bộ kit với những yếu tố

có thể ảnh hưởng đến kết quả RT-PCR nhưng vẫn chưa được công bố bởi các nhà sản xuất

4 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong việc lấy mẫu, bảo quản mẫu, gộp mẫu và xét nghiệm mẫu bằng phản ứng Realtime RT- PCR nhằm phát hiện Vi rút Sars- CoV- 2 được Bộ Y tế quy định

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài sử dụng các phương pháp và công cụ sinh học phân tử hiện đại như Reverse transcription- polymerase chain reaction trên máy… Kết quả thu được sẽ được xử lý bằng phần mềm chuyên dụng nhằm đưa ra kết quả có độ tin cậy cao

Ngoài ra, các kết quả của đề tài cung cấp thêm các thông tin khoa học có giá trị về 2 bộ kit sàng lọc Sars-CoV-2 được phát triển ở Việt Nam, bao gồm: khả năng bảo tồn mẫu, khả năng loại bỏ sự ngoại nhiễm sản phẩm, và loại bỏ sự ức chế phản ứng PCR do việc nhiễm mẫu máu tồn tại trong quá trình lấy mẫu

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Các thông tin khoa học được cung cấp trong đề tài nhằm đưa ra các khuyến cáo trong việc sử dụng các bộ kit ở điều kiện thực tế, và trong quá trình đánh giá kết quả thu nhận được, từ đó đảm bảo tính chính xác của các kết quả xét nghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại dịch COVID-19

Đại dịch COVID-19 là một đại dịch bệnh truyền nhiễm với tác

nhân là virus SARS-CoV-2 và các biến thể của nó đang diễn ra trên phạm vi toàn cầu.[15] Khởi nguồn vào cuối tháng 12 năm 2019 với tâm dịch đầu tiên tại thành phố Vũ Hán thuộc miền Trung Trung Quốc đại lục, bắt nguồn từ một nhóm người mắc viêm phổi không rõ nguyên nhân Giới chức y tế địa phương xác nhận rằng trước đó họ đã từng tiếp xúc, chủ yếu với những thương nhân buôn bán và làm việc tại chợ bán buôn hải sản Hoa Nam Các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu và phân lập được một chủng coronavirus mà Tổ chức

Y tế Thế giới lúc đó tạm gọi là 2019-nCoV, có trình tự gen giống với SARS-CoV trước đây với mức tương đồng lên tới 79,5%.[16][17][18]Ngày 11 tháng 3 năm 2020, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ra tuyên

bố gọi "COVID-19" là "Đại dịch toàn cầu".[21]

Những ảnh hưởng trên toàn thế giới của đại dịch COVID-19 hiện nay bao gồm: thiệt hại sinh mạng con người, sự bất ổn về kinh tế và xã hội,[23] tình trạng bài ngoại và phân biệt chủng tộc đối với người gốc Trung Quốc và Đông Á, việc truyền bá thông tin sai lệch trực tuyến và

vũ khí sinh học.[24]

1.2 Tình hình dịch bệnh Covid-19 trong nước và thế giới 1.2.1 Tình hình dịch bệnh Covid-19 trên thế giới

Tính đến ngày 11/3/2022, chạm ngưỡng 2 năm sau khi Tổ chức Y tế thế giới tuyên bố COVID-19 là “đại dịch toàn cầu”, thế giới có hơn 450 triệu ca mắc, 6,01 triệu ca tử vong

1.2.2 Tình hình dịch bệnh Covid-19 trong nước

Tại Việt Nam, tính đến sáng 11/3/2022, Việt Nam có hơn 5,26 triệu

ca nhiễm, đứng thứ 20/225 quốc gia và vùng lãnh thổ, còn tính về số ca mắc trên 1 triệu dân thì nước ta đứng thứ 130 (bình quân cứ 1 triệu người có 53.253 ca mắc) [25]

1.3 Tổng quan về vi rút SARS-CoV-2

1.3.1 Tên gọi

Virus corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2, viết tắt

SARS-CoV-2 (tiếng Anh: Severe acute respiratory syndrome corona virus

2),[26] trước đây có tên là virus corona mới 2019 (2019-nCoV) và cũng được gọi là virus corona ở người 2019 (HCoV-19 hoặc hCoV-19), là một chủng coronavirus gây ra bệnh viêm đường hô hấp cấp do virus corona 2019 (COVID-19),[27] xuất hiện lần đầu tiên vào tháng 12 năm

2019, trong đợt bùng phát đại dịch COVID-19 ở thành phố Vũ Hán, Trung Quốc và bắt đầu lây lan nhanh chóng, sau đó trở thành một đại dịch toàn cầu

1.3.2 Vi rút SARS-CoV-2

1.3.2.1 Cấu trúc

Mỗi virion SARS-CoV-2 có đường kính 60–140 nanomet (2,4 ×

10−6–5,5 × 10−6 in); [40]. SARS-CoV-2 bao gồm và 4 loại protein cấu trúc khác nhau: N, S, E và M Protein N, hoặc nucleocapsid, bao bọc

bộ gen, trong khi các protein S (gai), E (vỏ) và M (màng) bao gồm lớp

vỏ kép lipid xung quanh [41] Đặc biệt là protein S, cho phép virus lây nhiễm vào tế bào thông qua thụ thể ACE-2 trên màng tế bào và sau đó dung hợp với màng Điều này làm cho cấu trúc protein này và thụ thể

tế bào chủ của nó trở thành mục tiêu lý tưởng cho các phương pháp

Bộ gen của nó có khuynh hướng ít các nucleotide cytosine (C) và

guanine (G), giống như các coronavirus khác

1.3.2.3 Chu kỳ nhân bản của virus

Nhiễm virus bắt đầu khi các phần tử virus liên kết với các thụ thể

tế bào trên bề mặt vật chủ Các thí nghiệm mô hình protein trên protein đột biến của virus đã sớm gợi ý rằng SARS‑CoV‑2 có đủ ái lực với enzym chuyển đổi angiotensin 2 (ACE2) trên tế bào người để sử dụng

chúng như một cơ chế xâm nhập tế bào

Protein, serine 2 (TMPRSS2), protease xuyên màng, là yếu tố cần thiết cho sự xâm nhập của SARS ‑ CoV ‑ 2. [49] Protein neuropilin

1 (NRP1) của tế bào chủ có thể hỗ trợ virus xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng cách sử dụng ACE2 Sau khi virion SARS ‑ CoV ‑ 2 gắn vào

tế bào đích, TMPRSS2 của tế bào sẽ cắt mở protein đột biến của vi rút,

để lộ một peptid dung hợp trong tiểu đơn vị S2 và thụ thể chủ là ACE2 Sau khi dung hợp, một endosome hình thành xung quanh virion, ngăn cách nó với phần còn lại của tế bào chủ Virion thoát ra khi độ pH của endosome giảm xuống hoặc khi cathepsin, một cysteine protease của vật chủ, phân cắt nó Sau đó, virion giải phóng RNA vào tế bào và buộc tế bào sản xuất và phổ biến các bản sao của vi rút, vi rút lây nhiễm sang nhiều tế bào hơn

1.3.3 Phát sinh loài và các biến thể

Có hàng nghìn biến thể của SARS-CoV-2, có thể được nhóm lại thành các nhóm lớn hơn nhiều Một số danh pháp phân nhánh khác nhau đã được đề xuất Nextstrain chia các biến thể thành năm nhóm (19A, 19B, 20A, 20B và 20C), trong khi GISAID chia chúng thành bảy (L, O, V, S, G, GH và GR) [50]

Một số biến thể đáng chú ý của SARS-CoV-2 đã xuất hiện vào cuối năm 2020 Tổ chức Y tế Thế giới hiện đã tuyên bố năm biến thể cần quan tâm, đó là: [51]

• Alpha: Lineage B.1.1.7 xuất hiện ở Vương quốc Anh vào tháng 9 năm 2020, với bằng chứng về khả năng lây truyền và độc lực gia tăng Các đột biến đáng chú ý bao gồm N501Y và P681H

• Beta: Lineage B.1.351 xuất hiện ở Nam Phi vào tháng 5 năm

2020, với bằng chứng về khả năng lây truyền gia tăng và thay đổi tính kháng nguyên, với một số quan chức y tế công cộng đưa ra cảnh báo

về tác động của nó đối với hiệu quả của một số loại vắc xin Các đột biến đáng chú ý bao gồm K417N, E484K và N501Y

• Gamma: Lineage P.1 xuất hiện ở Brazil vào tháng 11 năm 2020, cũng với bằng chứng về khả năng lây truyền và độc lực gia tăng, cùng với những thay đổi về tính kháng nguyên Mối quan tâm tương tự về hiệu quả của vắc-xin cũng đã được nêu ra Các đột biến đáng chú ý cũng bao gồm K417N, E484K và N501Y

• Delta: Lineage B.1.617.2 xuất hiện ở Ấn Độ vào tháng 10 năm

2020 Cũng có bằng chứng về sự gia tăng khả năng lây truyền và thay đổi tính kháng nguyên

• Omicron: Lineage B.1.1.529 xuất hiện ở Botswana vào tháng 11 năm 2021

Các biến thể đáng chú ý khác bao gồm 6 biến thể khác do WHO chỉ định đang được điều tra và Cụm 5, xuất hiện trong số chồn ở Đan Mạch

và dẫn đến chiến dịch diệt chồn khiến nó gần như tuyệt chủng [51]

1.4 Vai trò của xét nghiệm và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Sars-CoV-2 bằng kỹ thuật Real Time RT-PCR

1.4.1 Real Time RT-PCR

Tế bào, ở tất cả các sinh vật điều hòa sự biểu hiện gen bằng chu kỳ phiên mã gen (RNA sợi đơn): Số lượng gen biểu hiện trong tế bào có thể được đo bằng số lượng bản sao phiên mã RNA của gen đó có trong

mẫu Để phát hiện và định lượng rõ ràng sự biểu hiện gen từ một lượng nhỏ RNA, cần phải khuếch đại bản sao gen Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một phương pháp phổ biến để khuếch đại DNA; đối với PCR dựa trên RNA, mẫu RNA đầu tiên được phiên mã ngược thành DNA bổ sung (cDNA) với enzym phiên mã ngược, nên còn được gọi là PCR phiên mã ngược (RT-PCR, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

Tiếp theo, để khuếch đại một lượng nhỏ DNA, phương pháp tương

tự được sử dụng như trong PCR thông thường cần có khuôn mẫu DNA,

ít nhất một cặp mồi cụ thể, deoxyribonucleotide triphosphat, dung dịch đệm thích hợp và DNA polymerase bền nhiệt Một chất được đánh dấu bằng fluorophore được thêm vào hỗn hợp này trong một máy tuần hoàn nhiệt có chứa các cảm biến để đo huỳnh quang của fluorophore sau khi

nó đã được kích thích ở bước sóng yêu cầu cho phép đo tốc độ tạo ra cho một hoặc nhiều sản phẩm cụ thể Điều này cho phép đo tốc độ tạo

ra sản phẩm khuếch đại ở mỗi chu kỳ PCR Do đó, dữ liệu được tạo ra

có thể được phân tích bằng phần mềm máy tính để tính toán biểu hiện gen tương đối (hoặc số bản sao mRNA) trong một số mẫu PCR định lượng cũng có thể được áp dụng để phát hiện và định lượng DNA trong các mẫu để xác định sự hiện diện và sự phong phú của một chuỗi DNA

cụ thể trong các mẫu này [5] Phép đo này được thực hiện sau mỗi chu

kỳ khuếch đại, và đây là lý do tại sao phương pháp này được gọi là PCR thời gian thực (realtime PCR, tức là PCR tức thì hoặc đồng thời)

1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng kết quả xét nghiệm bằng kỹ thuật Real Time RT-PCR

Phương pháp xét nghiệm bằng kĩ thuật Realtime RT-PCR được coi

là tiêu chuẩn vàng để khẳng định ca bệnh nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, các phòng xét nghiệm cần lưu ý các yếu tố kĩ thuật có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm Các nguyên nhân gây âm tính giả có thể do chất lượng mẫu không đạt, thời gian lấy mẫu, hay hóa chất sử dụng Các nguyên nhân gây dương tính giả thường liên quan đến thao tác của kĩ thuật viên cũng như hóa chất, trang thiết bị Nhận định tốt các nguyên nhân này sẽ giúp phòng xét nghiệm làm tốt hơn trong phiên giải kết quả, đồng thời đảm bảo chất lượng xét nghiệm để phục vụ chống dịch hiệu quả hơn Dưới đây là tác động của từng yếu tố

có thể dẫn đến kết quả âm tính giả và dương tính giả của xét nghiệm PCR chẩn đoán SARS-CoV-2 [53]

1.5 Ngoại nhiễm sản phẩm PCR, gây dương tính giả trong phòng xét nghiệm Sinh học phân tử.

1.5.1 Vấn đề ngoại nhiễm sản phẩm PCR và khả năng phòng ngừa ngoại nhiễm sản phẩm PCR của các bộ kít xét nghiệm Sars- CoV-2

Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức đối với các phòng thí nghiệm sinh học phân tử Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học đã có thể giải quyết vấn đề này một cách khá hữu hiệu, đó là trong thành phần dNTP có bổ sung thêm một ít dUTP Các sản phẩm PCR tạo ra

sẽ luôn tồn tại một số vị trí là U thay vì T, các vị trí U này sẽ có thể xử

lý phân hủy bằng enzme UNG Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật (template) sẽ không chứa U, vì vậy ủ PCR mix với enzyme UNG trước

khi chạy phản ứng PCR sẽ giúp phân cắt toàn bộ các DNA ngoại nhiễm

mà không ảnh hưởng đến template

1.5.2 Cách khử nhiễm và loại bỏ dương tính giả trong phản ứng PCR tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử

- Cách thức: Phun/ xịt khu vực làm PCR/ thiết bị với 10% thuốc tẩy, sau đó để yên trong 15-30 phút Tiếp theo lau sạch thuốc tẩy bằng nước sạch

- Thời gian: Quy trình lau rửa này nên được thực hiện trước và sau mỗi lần làm PCR Bạn có thể lên lịch vệ sinh các thiết bị và khu vực làm PCR hàng tuần, đây cũng là một cách rất hữu hiệu để ngăn chặn việc nhiễm trong phản ứng PCR

1.6 Sự tương tác của các thành phần trong máu đối với phản ứng PCR

Hiện nay, trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, người ta đã phát hiện ra một số hóa chất có thể ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng này Những chất ức chế PCR có thể ảnh hưởng đến tốc độ hoặc gây nhiễu phản ứng bằng cách gắn trực tiếp vào DNA/ RNA đích, làm mất hoạt tính enzym DNA polymerase hoặc gây mất tác dụng hoạt hóa của ion Mg2+ trong quá trình phản ứng, … [56]

Việc phát hiện và khắc phục ảnh hưởng của các chất ức chế phản ứng PCR cho phép các phòng thí nghiệm sinh học phân tử lựa chọn tốt các mẫu hơn, thu được tỷ lệ khuếch đại thành công cao hơn và hiệu quả của phòng thí nghiệm được cải thiện hơn [56]

1.7 Giới thiệu về 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đoán

SARS-CoV-2 do Việt Nam sản xuất

Việt Nam sản xuất 2 bộ kít xét nghiệm và đã được Bộ Y tế cấp phép

sử dụng trong các phòng xét nghiệm COVID-19 đó là:

+ Một là: Bộ kit của công ty Việt Á (ra mắt ngày 5-3-2020 và đến ngày 24/4/2020, được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận và đánh giá đạt chuẩn quốc tế

+ Hai là bộ kít của Công ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất đã được Bộ Y tế Việt Nam cấp số lưu hành vào ngày 7/5/2020 Bộ kit là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine và sinh phẩm y tế và Đại học Bách khoa Hà Nội, sau đó chuyển giao công nghệ cho công ty cổ phần Sao Thái Dương

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Sơ đồ nghiên cứu