TIỂU LUẬN:KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO pdf

Cùng với sự phát triền vượt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đóan bệnh ngày nay có thể giúp ta chẩn đóan nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh do virus.. Tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỚP: DH06SH

SEMINAR

KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO

Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGS TS Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Trần Lâm Thanh

MSSV: 06126131

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009

Chương 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chăn nuôi gà là nghề sản xuất truyền thống lâu đời và chiếm vị trí quan trọng thứ hai (sau chăn nuôi lợn) trong toàn ngành chăn nuôi của Việt Nam Hằng năm, cung cấp khoảng 350-450 ngàn tấn thịt và hơn 2,5-3,5 tỷ quả trứng Tuy nhiên, chăn nuôi gà của nuớc ta vẫn còn trong tình trạng sản xuất nhỏ, phân tán, lạc hậu, năng suất thấp, dịch bệnh nhiều, sản phẩm hàng hoá còn nhỏ bé Bình quân sản lượng thịt xẻ, trứng/nguời chỉ đạt 4,5 -

5,4kg/nguời/năm và 35 trứng/nguời/năm

Trong vài thập kỷ qua, mặc dù công tác chọn giống đã cải thiện một cách đáng kể thành tích sản xuất, chăn nuôi gà như: tăng trưởng nhanh hơn, hiệu quả sử dụng thức ăn cao hơn, khả năng sản xuất thịt tốt hơn, tỷ lệ thịt ngực cao hơn nhưng sự tăng nhanh về năng suất sản xuất đã không đi cùng với việc tăng khả năng miễn dịch, dẫn đến gà bị mắc nhiều bệnh về rối loạn chuyển hóa và nhiều bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ chết tăng cao

Trong đó, có thể kể đến Infectious bursal disease virus (IBDV), một lọai virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1, chúng có khả năng phá huỷ túi Fabracius, do đó làm giảm khả năng miễn dịch của gà Nhiều báo cáo khoa học đã cho biết: gà ở giai đọan từ 1-12 tuần tuổi, rõ nhất là ở giai đọan 3-6 tuần tuổi đều có khả năng mắc bệnh Gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi mắc bệnh

không biểu hiện triệu chứng nhưng sẽ làm gà suy giảm miễn dịch Tỷ lệ mắc bệnh là 100%, tỷ lệ chết từ 10-50% hoặc cao hơn nếu kết hợp với các bệnh khác

Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và

không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kỳ phương thuốc nào mà chỉ có thể khắc phục bằng biện pháp phòng trừ Vì vậy thiệt hại do IBDV gây ra là rất đáng kể đối với chăn nuôi gà của các nước lớn trên thế giới nói chung và của Việt Nam nói riêng

Cùng với sự phát triền vượt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đóan bệnh ngày nay có thể giúp ta chẩn đóan nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh do virus Khởi phát từ các vấn đề nêu trên,

trong giới hạn của bài seminar này em xin thực hiện nội dung “ Kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán virus Gumboro”

TP HCM, Tháng 10/2009 Nguyễn Trần Lâm Thanh

Chương 2

TỔNG QUAN II.1 Giới thiệu tổng quát về bệnh Gumboro:

disease virus (IBDV)

Trong những năm gần đây, nhiều chủng rất độc của IBDV (vvIBDV)

đã được phát hiện, chúng là nguyên nhân gây chết đồng loạt ở gà, bệnh đã xuất hiện ở châu Âu, châu Mỹ Latinh, Đông Nam Á, Châu Phi và Trung Đông

II.1.2 Hệ thống miễn dịch ở gia cầm:

Đây là một hệ thống phức tạp, hoàn thiện cả về chức năng và cấu trúc, phân bố khắp cơ thể, bao gồm cơ quan, những yếu tố tế bào và những yếu tố dịch thể

Cũng như ở động vật có vú, năng lực miễn dịch của gia cầm phát triển thông qua hệ thống lympho Cơ quan của hệ miễn dịch được chia thành cơ quan lympho sơ cấp và thứ cấp

+ Túi Fabricius (viết tắt là túi F) và tuyến ức là cơ quan lympho

sơ cấp trong đó các tiền lympho bào phát triển thành các lympho bào miễn dịch

+ Những tổ chức lympho thứ cấp là lách, tủy xương, tuyến Harderian, tuyến quả thông (pineal gland) và các mô lympho gắn với bề mặt niêm mạc như niêm mạc khí quản, niêm mạc ruột và những cụm biệt hóa của những tế bào lympho thuộc các cơ quan khác nhau

Các tổ chức lympho này được đặt ở những vị trí quan trọng để khi những kháng nguyên như vi khuẩn bệnh đi vào cơ thể qua da hay qua các bề mặt niêm mạc có thể bị tóm gọn rồi bị tiêu diệt

Sự phát triển của hệ thống miễn dịch xảy ra chủ yếu trong quá trình

phát triển của phôi Các cơ quan miễn dịch và các globulin miễn dịch thành

thục trong các cơ quan miễn dịch bị chi phối bởi nhiều yếu tố, ngoài yếu tố

di truyền, thức ăn cũng là một yếu tố quan trọng

II.1.3 Vai trò của túi Fabricius trong hệ thống miễn dịch gia

cầm:

II.1.3.1 Cấu tạo:

Túi Fabricius là tổ chức lympho dạng túi, nằm liền sát lổ huyệt của gia

cầm Túi được cấu tạo từ biểu mô có nếp gấp, bao gồm khoảng 12.000 nang

lympho Trọng lượng của túi thay đổi tùy theo tuổi Về mặt cấu tạo vi thể,

mỗi nang lympho gồm 2 phần riêng biệt nhau: phần vỏ và phần tủy

+ Phần vỏ: chứa một số lượng lớn lymphocytes, lymphoblaste

đang trong thời kỳ gián phân, các đại thực bào, hệ thống mạch máu bao gồm

các động - tĩnh mạch nhỏ, các mao mạch

+ Phần tủy: chứa các lymphocyte, các đại thực bào, bạch cầu và

các tế bào mầm

II.1.3.2 Sự phát triển:

Sau giai đoạn phát triển phôi, khi gà nở, túi Fabricius tiếp tục phát

triển cho đến tận tuần tuổi thứ 6 hay tuần tuổi thứ 12 tùy theo giống, giới

tính và điều kiện chăn nuôi, sau đó túi bắt đầu thoái hóa

Quan sát vi thể sự thoái hóa của túi Fabricius từ tuần tuổi thứ 24,

người ta ghi nhận được một số dấu hiệu đặc trưng như sau:

+ Lớp biểu mô teo lại và tróc ra

+ Các nếp gấp mất dần

+ Phần tủy thoái hóa và sự xuất hiện các nang

+ Sự phát triển của các mô liên kết của bộ khung

+ Sự xâm nhập của các heterophile, macrophage trong các vùng hoại tử

Sự tiến hóa của túi Fabricius được kiểm soát bởi các hormone của các

cơ quan khác nhau với hiệu ứng kích thích hoặc kềm hãm Bệnh tật và một

số yếu tố khác từ bên ngoài cũng ảnh hưởng đến sự tiến hóa của túi

II.1.3.3 Vai trò của túi Fabricius trong sự miễn nhiễm:

Từ những tế bào nguồn có bên trong túi Fabricius, trong giai đọan

phát triển phôi (khoảng từ ngày thứ 8 đến 15) những tế bào này sẽ tự dị biệt

dưới tác động của quá trình tiếp xúc với các tế bào lưới biểu mô và sự hiện

diện của các chất chiết xuất polypeptide trong túi Fabricius, hình thành nên

các tế bào có mang kháng thể ( IgM - ngày thứ 12, IgG - ngày thứ 14, IgA - ngày thứ 16)

Những tế bào miễn dịch này sẽ di chuyển ra khỏi túi Fabricius trong suốt thời kỳ phát triển sau phôi và cuối thời gian này để đi đến các cơ quan ngoại vi ( lách, ruột….)

II.1.4 Infectious bursal disease virus (IBDV)

IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA dạng cuộn tròn, thuộc loài

Avibirnavirus của họ Birnaviridae

IBDV có dạng khối, nhiều góc cạnh, kích thước 55-65nm, là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài

IBDV có 2 dạng serotypes khác biệt , nhưng chỉ có serotype 1 là

nguyên nhân gây ra bệnh cho gia cầm Có ít nhất là 6 lọai kháng nguyên phụ của IBDV serotype 1 đã được phát hiện trong phản ứng trung hòa trong ống nghiệm Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên phụ này thường được gọi là các biến thể, chúng là nguyên nhân gây ra tỷ lệ tử vong cao ở gà khỏang 60-100% Với sự phát triển vượt bậc của sinh học phân tử như là phản ứng phiên mã ngược chuỗi polypedtide (RT-PCR) và kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình đa hình (RFLP), nó đã trở thành một khả năng để phát hiện các vvIBDV, để phân biệt chủng IBDV, và sử dụng thông tin như vậy trong nghiên cứu các dịch tễ học phân tử của virus

Bộ gen IBDV chứa 2 mạch: mạch A và mạch B, được bao bọc trong một vỏ capsid Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer Mỗi

capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP)

+ Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1 VP1 là protein có hoạt tính enzym RNA- polymerase Enzym xúc tác quá trình tổng họp RNA của virus

+ Mạch A lớn hơn (3.2kb) bao gồm 2 cấu trúc gen tổng hợp protein Cấu trúc thứ nhất là một khung đọc mở đa gen ( poly-cistronic open reading frame) mã hóa cho một “tiền protein” có phân tử lượng 110 kDa mà trong quá trình kế tiếp sẽ được phân cắt thành các protein cấu trúc có tên gọi VP2, VP3, VP4 Ngoài ra, mạch A còn mã hóa cho một protein khác có tên

là VP5 Đây là 1 protein có trọng lượng phân tử khá bé (17kDa) mới được phát hiện gần đây, có chức năng trong quá trình điều hòa sao chép và tổng hợp protein

Bằng các phương pháp miễn dịch học và phương pháp gây bệnh trên động vật thí nghiệm, VP2 đã được chứng minh là protein kháng nguyên bảo

vệ vật chủ vì kích thích tạo kháng thể, đồng thời cũng là yếu tố độc lực của IBDV Sự biến đổi bất kỳ một acid amin nào trong VP2 về nguyên tắc đều

có thể dẫn đến sự thay đổi nhất định của tính kháng nguyên và khả năng gây

bệnh của virus Tuy nhiên có 1 một vùng hẹp trong cấu trúc của VP2 được gọi là ”vùng siêu biến đổi”, chịu trách nhiệm đặc biệt về tính kháng nguyên

và kích thích cơ thể tạo kháng thể tham gia phản ứng trung hòa virus Sự khác nhau ở trình tự nu của gen quy định sự tổng hợp VP2, hay cụ thể hơn là khác nhau ở vùng siêu biến đổi nên vùng này được chọn làm đích để so

sánh, chẩn đoán, phân tích đặc tính kháng nguyên gây miễn dịch của các chủng IBDV

VP3 kích thích cơ thể sản sinh kháng thể kết tủa mà IBDV ở các

nhóm thuộc các serotypes 1 và 2 đều kích thích sản sinh được Vì vậy, VP3

dễ cho phản ứng kết tủa chéo, chỉ có tác dụng nhận biết IBDV đơn thuần và phân biệt sơ bộ với các virus khác Do đó VP3 được sử dụng làm kháng nguyên kết tủa để phân biệt IBDV với các virus khác Trong khi VP2 dùng

để phân biệt các chủng và tính độc lực của các chủng IBDV

VP4 có chức năng protease cắt rời tiền protein tạo nên các protein độc lập

VP5 không chỉ có vai trò điều hòa trong sự tổng hợp ARN mà còn có vai trò trong tiến triển gây bệnh do một số thực nghiệm đã chứng minh: nếu virus thiếu thành phần hay khiếm khuyết thành phần VP5 thì có khả năng mất một phần hay hoàn toàn tính gây bệnh

IBDV có sức đề kháng hoàn toàn với Ether, Chloroforn, nhưng kém

đề kháng với Formalin và Chloramin Virus có sức chịu nhiệt tốt, có thể sống sót sau khi xử lý nhiệt ở nhiệt độ 56OC trong 5h hoặc ở nhiệt độ 37 OC hàng ngày, do vậy khử trùng nhiệt tốt nhất đối với virus là bằng cách đun sôi

Các loại hóa chất và thuốc sát trùng phải ở nồng độ cao (1% trở lên) mới có khả năng tác dụng Chỉ có hóa chất chứa ion Clo và Iod tự do như hợp chất Chloramin, Iodine hoặc Formalin nồng độ cao (1% trở lên) mới tiêu diệt được chúng

II.1.5 Những đặc điểm của bệnh Gumboro:

II.1.5.2 Phương thức truyền lây:

Bệnh có thể lây gián tiếp qua trứng, qua không khí, hoặc thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi nhiễm mầm bệnh

Bệnh lây lan trực tiếp giữa gà mang mầm bệnh và gà khỏe do tiếp xúc

II.1.5.3 Cơ chế lây bệnh của IBDV:

Virus tấn công vào các tế bào lympho đặc biệt là các tế bào lympho B Đối với những gà con khoảng 2-8 tuần tuổi có hoạt động của túi Fabricius cao thì có khả năng mắc bệnh cao hơn Đối với gà hơn tám tuần tuổi thì có khả năng kháng lại và không có những biểu hiện lâm sàng, trừ khi bị nhiễm bởi chủng độc lực cao

Sau khi xâm nhiễm, virus này phá hủy các nang lympho của túi

Fabricius cũng như các tế bào lympho B thứ cấp như GALT, CALT, BALT, tuyến Harderian,….bệnh cấp tính và dẫn đến tử vong là do hiện tượng

“necrotizing”của những virus trên mô chủ

II.1.5.4 Triệu chứng:

Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày

Sau khi IBDV xâm nhập vào túi Fabracius gà sẽ có những biểu hiện:

+ Đàn gà uống nhiều nước, sào xạc khi có tiếng động lạ hay khi

có người bước vào chuồng

+ Cơ vùng hậu môn co bóp nhanh, mạnh, gà có phản xạ như muốn đi ngoài nhưng không thực hiện được, gà có biểu hiện đi giật lùi

+ Sau đó gà sốt cao, uống nhiều nước dẫn đến rối loạn tiêu hoá,

gà tiêu chảy mạnh, viêm hoại tử ruột

+ Phân gà trắng loãng, lúc đầu có màu trắng ngà sau chuyển sang vàng trắng, trắng nhớt đôi khi lẫn máu

+ Bệnh tiến triển rất nhanh chỉ sau 6-8 giờ kể từ con ốm đầu tiên, đàn gà căn bản đã thay đổi về mặt thể trạng, chúng trở nên xơ xác, xù lông, run rẩy, yếu dần rồi chết

Gà bắt đầu chết từ ngày thứ 3 sau khi phát bệnh, tỉ lệ chết tăng nhanh, sau 5 - 7 ngày thì ngưng, những con còn sống sót khỏi bệnh Tỉ lệ chết

thường thấp, nhưng nếu điều kiện chăn nuôi kém tỉ lệ chết có thể lên đến 30% hoặc cao hơn

Hình: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lông Hình: Gà tiêu chảy phân loãng trắng

II.1.5.5 Bệnh tích:

Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô

Túi Fabricius ở giai đầu sưng rất to, xung quanh túi có thủy thũng mạnh đặc biệt ở vùng cuống túi tiếp giáp với trực tràng, túi chuyển từ màu vàng sáng sang trắng đục, túi dễ cấu, dễ bục, các nếp múi khế sưng to không

rõ nét, nhiều trường hợp túi xuất huyết ở dạng lấm tấm đinh ghim hoặc kéo dài thành vật ở niêm mạc túi Điển hình tiếp theo là xung xuất huyết hệ cơ, nếu xung huyết khi lột da, cơ khô nhanh và có màu thẫm Nếu xuất huyết, khi lột da và quan sát thấy có dạng vệt xuất huyết, có khi chạy dài thành từng tia xuyên suốt chiều dài sợi cơ

Ngoài ra lách sưng nhẹ, thận sưng căng nhưng bệnh tích ở thận

không được coi là điển hình Một điều cần chú ý là cá biệt có trường hợp thấy xuất huyết ở dạ dày tuyến nên dễ nhầm với bệnh gà rù

Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5,6,7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 8 thì chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu

II.1.5.6 Phòng bệnh:

Chủ yếu là dùng vaccin phòng bệnh Gumboro (tiêm cho gà lúc 1 tuần tuổi, cần tiêm phòng cho đàn gà bố mẹ để tạo miễn dịch thụ động cho gà con trong những ngày đầu mới nở), loại bỏ gà có triệu chứng lâm sàng ngay sau

khi chủng vaccin để loại bỏ mầm bệnh

Vệ sinh chuồng trại sạch sẽ, vệ sinh thức ăn, nước uống tránh nhiễm

mầm bệnh Tiến hành ủ phân để tiêu diệt mầm bệnh

Định kỳ mỗi tuần sát trùng chuồng trại

Trong quá trình nuôi cung cấp thêm các sản phẩm bổ sung chất dinh dưỡng, vitamin, chất điện giải nhằm tăng cường sức đề kháng bệnh, chống stress…

II.1.5.7 Điều trị:

Bệnh do virus gây ra do đó không có thuốc đặc hiệu để điều trị, khi đàn gà phát bệnh biện pháp chủ yếu để giảm tỉ lệ chết là tăng cường sức đề kháng bằng việc nuôi dưỡng, quản lý, chăm sóc, cung cấp đầy đủ chất điện giải, vitamin

Æ Điều trị bệnh Gumboro phải theo nguyên tắc: hạ sốt + giải độc + trợ lực + chống xuất huyết + loại trừ bội nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác Vì thấy

gà chết chủ yếu do:

+ Sốt cao

+ Ngộ độc urat do thận bị tổn thương

+ Bội nhiễm các loại vi khuẩn khác

+ Mất nước do tiêu chảy quá nặng

Hiệu quả điều trị bệnh cao hay thấp tùy thuộc vào thời điểm mà chúng

ta phát hiện bệnh, nếu phát hiện sớm việc điều trị sẽ mang lại hiệu quả cao

Hình: Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp

giáp giữa mề và tiền mề)

Mặt khác, khi đàn gà mắc bệnh, việc dùng kháng sinh để điều trị càng làm bệnh trở nên trầm trọng và tăng tỉ lệ chết Khi gà bệnh cần cho uống đường glucose và một số loại thuốc hỗ trợ đề kháng như: Vime C

Electrolyte, Vimeperos, Vimix Plus, Vimevit Electrolyte, Aminovit,

Vitaral…

II.2 Enzym - Linked Immunosorbent Assay ( ELISA):

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) – xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym, là một

kỹ thuật sinh hóa hữu ích và mạnh trong việc xác định việc hiện diện cũng như định lượng ở mức ng/ml, pg/ml các chất có trong dung dịch như: huyết thanh, tinh dịch, nước tiểu, dịch huyền phù nuôi cấy Hiện nay ELISA được

sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học sự sống và bệnh học nói chung

II.2.1 Nguyên lý chung của ELISA:

Sử dụng 1 enzym để phát hiện sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên ( Antigen-Ag) và kháng thể (Antibody-Ab) Enzym sẽ chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm có màu, nhờ đó ta sẽ thấy được sự liên kết giữa Ag-Ab

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng Ag trong mẫu nghiên cứu

II.2.2 Một số ứng dụng của ELISA:

Xác định nồng độ của Ab trong huyết thanh;

Kiểm tra sự có mặt của Ag

Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm

Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học …

II.2.3 Các phương pháp ELISA:

Có 3 phương pháp chính gồm: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA sandwich Tất cả các kiểu này đều có thể được sử dụng trong các xét nhiệm được gọi là ELISA cạnh tranh (competition ELISA) hay ELISA kềm hãm (inhibition ELISA)

II.2.3.1 ELISA trực tiếp: gồm các bước chính:

1 Kháng nguyên được pha loãng trong dung dịch đệm (thường là carbonate/bicarbonate ở pH cao 9.6 hay dung dịch PBS trung tính), rồi bổ sung dung dịch vào pha rắn

( trong dung chị đệm không chứa các protein có thể cạnh tranh với kháng nguyên mục tiêu để gắn vào pha rắn)

2 Kháng nguyên sẽ bám thụ động vào bề mặt pha rắn trong quá trình

ủ Tuy nhiệt độ, thời gian ủ là không quan trọng, nhưng việc chuẩn hóa các điều kiện là rất cần thiết, chẳng hạn ta nên ủ ở 37oC

3 Sau khi ủ, ta tiến hành rửa để loại bỏ các kháng nguyên không hấp thụ được vào bề mặt rắn

4 Kháng thể có gắn enzym được bổ sung trực tiếp vào các vị trí

kháng nguyên trên bề mặt rắn Các kháng thể này được pha loãng trong

dung dịch đệm chứa một số cơ chất ức chế sự hấp thu thụ động của protein, nhưng cũng cho phép sự gắn kết miễn dịch Sau khi ủ, kháng thể sẽ gắn vào kháng nguyên của chính nó

5 Rửa lần 2 để loại bỏ các kháng thể không bám, để còn lại trên đĩa là phức hợp kháng nguyên - kháng thể có gắn enzym

6 Bổ sung các cơ chất phù hợp cho enzym đã gắn vào kháng thể Điều này giúp hổ trợ cho phản ứng xúc tác tạo màu của enzym Cuối cùng màu của dung dịch sẽ được xác định qua máy quang phổ trắc quang (

spectrophotometer), đọc tại một bước sóng phù hợp

Ưu điểm của phương pháp: đơn giản nhất

Nhược điểm của phương pháp: độ đặc hiệu bị giới hạn vì thông

thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitop mà trong phương pháp này chỉ sử dụng một kháng thể gắn vào 1 epitop

Tốn công: phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng