CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT GEN pdf

 Thông thường trong chuẩn đoán vi khuẩn thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập trên một số môi trường chuyên biệt và xác định vi khuẩn thông qua các phản ứng sinh hóa… Nhưng do đối t

CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN

LISTERIA BẰNG KỸ THUẬT

GEN

GVHD: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Phạm Ngọc Hà

I Đặt vấn đề

II Nội dung

II.1 Đôi nét về Listeria

II.2 Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes

II.3 Chuẩn đoán Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật gene

III Kết luận

IV Tài liệu tham khảo

I Đặt vấn đề

 Trong số sáu loại Listeria, chỉ có Listeria

monocytogenes gây bệnh Listeriosis rất phổ

biến ở cả người và động vật Đây là một loại

bệnh thực sự nguy hiểm vì nó có thể dẫn đến tử vong, đặc biệt là đối với những người có hệ

miễn dịch yếu như phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh, người già yếu

 Listeria monocytogenes tồn tại trong thực

phẩm nên rất dễ lây nhiễm cho người đòi hỏi

 Thông thường trong chuẩn đoán vi khuẩn

thường áp dụng kỹ thuật nuôi cấy phân lập trên một số môi trường chuyên biệt và xác định vi

khuẩn thông qua các phản ứng sinh hóa…

Nhưng do đối tượng thao thác là trên thực phẩm nên sử dụng phương pháp truyền thống là rất

khó khăn, tốn kém và mất thời gian Nhờ vậy mà các kỹ thuật gene với những ưu điểm nổi trội

như nhanh, nhạy, chính xác đã được sử dụng

để chuẩn đoán Listeria monocytogenes.

II Nội dung

II.1.Đôi nét về Listeria

Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae

gồm những trực khuẩn nhỏ, không sinh bào tử, có lông ở một đầu nên có thể di động, gam dương, có phản ứng catalase dương tính, oxydase âm tính

Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có khả năng lên men đường Giống này gồm nhiều loài gây bệnh cho gia

súc và người, trong đó có loài Listeria

monocytogenes là loài gây bệnh sảy thai truyền

Phân loại: giống Listeria bao gồm 6 loài

II.2 Giới thiệu chung về Listeria

motocytogenes

Phân bố và cách lây lan

 L monocytogenes được phân bố rất rộng rãi, nó

có trong đất, nước, phân, dịch tiết đường sinh

dục và niêm mạc mũi của động vật khỏe

 Bệnh thể hiện ở nhiều dạng và sự lây truyền của

vi khuẩn có khác nhau Nếu như ở dạng phủ

tạng, sự lây nhiễm qua đường ăn uống Nếu

như ở dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua

đường mắt và mũi

Hình thái và nhuộm màu

 L monocytogenes gồm những trực khuẩn ngắn, hai

đầu tròn, Gram dương Trong môi trường nuôi cấy, khi tế

bào còn non L.monocytogenes được tìm thấy ở dạng

trực khuẩn Nhưng trễ hơn dạng hình cầu (0,5×1-2 µm) lại chiếm ưu thế, đôi khi vi khuẩn xếp thành chuỗi

ngắn(dễ nhầm với Streptococcus), lúc này chiêm mao

dài 6-20 µm Vi khuẩn không sinh bào tử, không tạo giáp

mô, có khả năng di động Ở 20-25 0 C vi khuẩn di động mạnh nhất Ở 37 0 C vi khuẩn di động nhờ một chiêm

mao ở đầu.

 Khi nhuộm từ mô bệnh hoặc dịch nuôi cấy, đôi khi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp chuỗi dễ

nhầm với Streptococci Trong trường hợp này có

thể dùng phản ứng Catalase để phân biệt Trong canh 3-6 giờ ở 370C vi khuẩn có dạng trực, nuôi cấy 3-5 ngày vi khuẩn có dạng dài 6-20 µm hay

hơn(đặc biệt chủng R) Sự di động của Listeria dùng để phân biệt với Erysipelothrix.

Đặc tính nuôi cấy và yêu cầu tăng

trưởng

• Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiệm yếm khí Nhiệt độ thích hợp 30-370C, pH 7,2-7,4 phát triển trên môi trường nhưng thường sử dụng

môi trường thạch máu trong điều kiện 5-10%

CO2 cho khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng, đường kính 0,5-1mm và gây dung huyết

• Trên môi trường Trytose agar tạo khóm sáng,

trắng mờ và có màu xanh lam (màu blue-green) khi quan sát dưới ánh sáng nghiêng

• Trên môi trường LSA (Listeria selective agar) tạo vòng đen quanh khóm do sự phân giải Esculin sau 24-48 giờ

• Môi trường Gelatin không gây tan chảy

Đặc tính sinh hóa

Lên men chậm các loại đường như glucose,

rhamnose, salicin, levulose Không lên men

mannitol, xylose, lactose, saccarose Phản ứng Catalaza dương tính

Sức đề kháng

 Vi khuẩn bị diệt ở 600C trong 30 phút và 720C

trong 15 giây Vi khuẩn đề kháng với sự khô

hạn Có thể sống sót trong thực phẩm và đất

nhưng bị diệt bởi những chất sát trùng thông

thường

 Nhay cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng

tetracycline cho kết quả tốt nhất Người ta có thể kết hợp giữa Trimethoprim với Sulphamethazol trong điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones Erythromycine, ampicillin được dùng trong điều trị bệnh cho người

Cấu trúc kháng nguyên và độc tố

Cấu trúc kháng nguyên của L.monocytogenes

phức tạp, được chia thành 16 serotype căn bản dựa trên kháng nguyên O và H

 Kháng nguyên O: Bền với nhiệt được chia thành 14 loại, ký hiệu 1-14

 Kháng nguyên H: Không bền với nhiệt, chia làm 4 loại:a, b, c, d Hiện nay có 3 chủng là

ANTIGENS O(HEAT STABLE) H(HEAT LABILE) 1a

1b I, II, (III)I, II, (III) A, BA, B, C

(III), VI, VIII (III), V, VI, VIII, IX)

Cơ chế gây bệnh

Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng vi

khuẩn Listeria lây lan từ tế bào này sang tế bào

khác trong cơ thể con người Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ

tế bào và đẩy sang tế bào liền kề Khi đó vi

khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề

đó

 Giáo sư Ireton và nhóm của ông đã phát hiện ra một quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh

 Màng tế bào, hay lớp ngoài cùng của những tế bào khỏe mạnh thông thường căng ra Tình

trạng căng đó được kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm bệnh liền kề

 Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của giáo sư Ireton phát hiện ra rằng một loại pro-tê-in trong vi

khuẩn Listeria gọi là InIC xuất hiện làm giảm đi

độ căng của màng tế bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đó

Chẩn đoán bằng phương pháp truyền

Tình hình dịch bệnh Listeriosis

• Ca đầu tiên của bệnh Listeriosis đã được nói đến

cách nay 70 năm, nhưng phải đợi đến những năm 1980

vi khuẩn L monocytogenes mới được chính thức xác

nhận là tác nhân gây ra bệnh ngộ độc từ thực phẩm.

• Từ tháng một đến tháng tám năm 1985, tại Mỹ có một đợt bùng phát khác với 142 ca nhiễm bệnh

• Năm 1999, loài L monocytogenes đặc biệt cực độc đã

tiến triển báo động các viên chức y tế và họ buộc những nhà sản xuất thực phẩm phải giải quyết vấn đề.

• Năm 2002, đợt bùng phát dịch bệnh Listeriosis ở nhiều

bang ở Mỹ – một căn bệnh nguy hiểm do vi khuẩn

Listeria gây ra -đã xác nhận có 46 ca nhiễm bệnh, 7 ca

tử vong và 3 ca hỏng bào thai.

• Mặc dù “quy định tạm thời” đối với các sản phẩm thịt và thịt gia cầm chế biến sẵn phát hành năm 2003 giúp kiểm soát sự bùng phát vi khuẩn, nhưng rõ ràng đã không thể loại bỏ được bệnh hoàn toàn Theo Trung tâm y tế dự

phòng CDC, ước tính 2.500 người bị bệnh Listeriosis

nặng mỗi năm, trong số đó có 500 người tử vong Người

có nguy cơ cao có thể mắc bệnh này sau khi ăn thực

phẩm thậm chí chỉ nhiễm vài con vi khuẩn.

• Năm 2008 ổ dịch Listeriosis ở Canada nguyên nhân từ

nhà máy Maple Leaf Foods ở Toronto, Ontario làm hai

II.3 Chuẩn đoán Listeria

monocytogenes bằng kỹ thuật gene

Dựa tên 3 gene: gene DTH-18, gene listeriolysin O (hly A)

và iap

Phân lập L.monocytogenes từ phô mai

• 25g phô mai đồng nhất với 225ml dung dịch

tăng sinh Listeria(LEB)-làm giàu mẫu lần 1 =>

Lấy 0,1ml chuyển qua 10ml canh Fraser (Oxoid)

và ủ 24 giờ ở 300C – làm giàu mẫu lần 2=>thu nhận tế bào bằng IMS => Lấy 10µl để thực hiện phản ứng PCR

• Sản phẩm tạo thành được điện di trên gel

agarose 1% nhuộm ethidium bromide hoặc

được lọc bằng Z-probe(Bio-Rad) và lai với DNA probe mã hóa cho gene DTH-18 Probe

listeriolysin O được đánh dấu sử dụng trong

PCR Điều kiện tương tự như miêu tả ở trên

ngoại trừ 100µl thể tích phản ứng chứa 90µM

dNTP và 10µM digoxigenin-dUTP PCR dựa trên gene listeriolysin O dùng để xác định kiểu huyết thanh 4a

Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR từ

mẫu phô mai có chứa Listeria monocytogenes

sau khi đã làm giàu mẫu (A) 1µl mẫu (lane 1 đến lane 4), 2µl mẫu (lane 8 đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu.

(B) kết quả PCR sau khi thực hiện miễn dịch từ phân tách(IMS) của 100µl mẫu

Listeria (lane 1 đến lane 4)

Trước khi làm giàu mẫu, 25g phô mai phân tích chứa 0 (Bảng A,lane 1 và 8 Bảng B, lane 1), 0.4 (Bảng A, lane 2 và 9 Bảng B, lane 2), 4 (Bảng A, lane 3 và 10 Bảng B, lane 3), 40

( Bảng A, lane 4 và 11 Bảng B, lane 4) CFU/g

phô mai Lane 6 không chứa L

Sản phẩm của phản ứng khuếch đại PCR

từ mẫu phô mai được làm giàu lần 1

và 2.

1µl mẫu (lane 1 đến lane 4), 2µl mẫu (lane 8 đến lane 11) từ dung dịch làm giàu mẫu lần 2.

Kết quả thực hiện PCR sau IMS của 100µl mẫu Listeria (lane 1 đến 4)

Trước khi làm giàu mẫu, 25g phô mai phân tích chứa 0 (Bảng A,lane 4 và 11 Bảng B, lane 4), 1 (Bảng A, lane 1 và

10 Bảng B, lane 1), 10 (Bảng A, lane 2

và 9 Bảng B, lane 2), 100 ( Bảng A, lane 3 và 8 Bảng B, lane 3) CFU/g

phô mai Lane 6 không chứa L

monocytogenes Sự kiểm tra khẳng

định chứa 0,05µg DNA

Sự định lượng L.monocytogenes với

ngược:5’-CACTGCATCTCCGTGGTACTAA-Được sử dụng để khuếch đại đoạn 113bp của

gene hly A(Nogva et al,2000)

Định lượng Real-Time PCR được thực hiện bởi máy luân nhiệt M×3005(Stratagene, La Jolla,

CA, USA) trong 25µl thể tích cuối chứa 9,5µl

mẫu DNA, 300mM mồi xuôi và mồi ngược(DNA Technology, Arhus, Denmark) và 12,5µl 2×High power SWBR Green PCR Master M(Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA)

PCR bao gồm 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước biến tính ở 950C/15 giây,bắt cặp/ kéo dài ở

600C-60 giây Phân tích melt-curve giữa 55-950C

để kiểm tra sự đặc hiệu của phản ứng khuếch đại Đường cong chuẩn được xây dựng từ các nồng độ pha loãng của tế bào vi khuẩn và quan sát chu kỳ ngưỡng Ct

Xác định và phân tích sự khác nhau

của các loài Listeria bằng Multiplex

PCR

Sử dụng gen iap Thiết kế 5 mồi khác nhau để

xác định các loài Listeria bằng Multiplex

• Ino 2[5’-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3’]

Khuếch đại đoạn gene của L.innocua dài 870bp

• Siwi 2[5’-TAACTGAGGTAGCGAGCGAA-3’]

Khuếch đại đoạn gene của nhóm L.ivanovii,

L.seeligeri và L.welshimeri dài 1,2kb.

Xác đinh và phân biệt các loài Listeria dựa trên

Multiplex PCR chứa 5 primers MugraI, MonoA, Ino2, and Siwi2, and Lis1B (Lis-Mix) Thực hiện phản ứng trong 30 chu kỳ (biến tính ở 95°C/15 giây, bắt cặp 58°C/30 giây, kéo dài

720C/45 giây) với lane 1 chuẩn

III: Kết luận

• Càng ngày có nhiều nguy cơ gây hại cho sức

khỏe của con người và vật nuôi, Listeriosis là

một trong những nguy cơ nguy hiểm và nó càng đáng quan tâm hơn khi nguyên nhân xảy ra hiện diện ở khắp mọi nơi đặc biệt là trong thức ăn

của con người Sử dụng phương pháp truyền

thống để nhận biết sự tồn tại của Listeria đòi hỏi

phải thực hiện các phản ứng sinh hóa như lên men đường, CAMP…trong phòng thí nghiệm và tiến trình này cần thời gian tối thiểu là 7 ngày

Điều này không đáp ứng được yêu cầu trong

chẩn đoán bệnh nhất là khi bộc phát dịch bệnh Với sự ra đời và được cải tiến từng bước kỹ

thuật PCR là phương pháp nhanh, nhạy, chính

xác để xác định vi khuẩn Listeria nói chung và L.monocytogenes nói riêng Mặt khác hiệu quả

của PCR còn được tăng lên rất nhiều lần khi sử dụng kết hợp với phương pháp IMS Thêm vào

đó cải tiến PCR ta có được Multiplex PCR

phương pháp này cho phép ta phân biệt rõ ràng

giữa các loài Listeria, vì cho dù chỉ có

L.monocytogenes là tác nhân gây bệnh thực sự

nguy hiểm nhưng trên thực tế sự tồn tại của loài này không nhiều thì ít cũng có liên quan đến sự

IV Tài liệu tham khảo

2 Tô Minh Châu- Trần Thị Bích Liên(2001) Vi

khuẩn và nấm gây bệnh trong thú y.

5.

http://www.khoahoc.net/baivo/nguyenthuongchanh/ 130907-vikhuanlisteria.htm

7

http://www.pasteur-hcm.org.vn/tinchitiet.jsp?ma_b v

=146