sử dụng chất chiết xuất từ cây hoàng kỳ (astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn edwardsiella ictaluri trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

Điều này khiến cho việc nuôi và xuất khẩu cá tra của Việt Nam gặp nhiều khó khăn do danh mục các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong... Chính vì sử dụng thảo dược và các chất chiết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN HỒNG LOAN

SỬ DỤNG CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ CÂY HOÀNG KỲ

(Astragalus membranaceus) ĐỂ PHÒNG BỆNH MỦ GAN DO

VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri TRÊN CÁ TRA

i

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ts Đặng Thị Hoàng Oanh đã giúp

đỡ, động viên và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Xin gửi lời cám ơn đến các thẩy cô của khoa Thủy sản, đặc biệt là các anh chị của

Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản về những lời khuyên quý báu và sự chỉ dẫn tận tình trong quá trình thực hiện đề tài

Chân thành cám ơn các bạn lớp cao học K15A và các em Trần Việt Tiên, Lê Thượng Khởi, Nguyễn Thị Thúy Liễu, Nguyễn Trúc Phương, Nguyễn Hà Giang, Trần Nguyễn Diễm Tú, Lê Hữu Thôi đã giúp đỡ rất nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã chia sẽ những khó khăn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu

Chân thành cảm ơn !

ii

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của cây Hoàng kỳ (Astragalus radix) trong việc phòng bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Cá tra giống có trọng lượng 25 gram được bố trí các nghiệm thức (nghiệm thức 2, 4

và 6) cho ăn thức ăn có bổ sung chiết xuất hoàng kỳ (0,5%) và các nghiệm thức (1,

3 và 5) cho ăn thức ăn bình thường trong 5 tuần Nghiệm thức 3 và 4 được tiêm xin ở tuần thứ 3 Sau 5 tuần, cá ở các nghiệm thức 2, 3, 4 và 5 được gây cảm nhiễm

vắc-vi khuẩn E ictaluri bằng phương pháp tiêm Mỗi tuần thu mẫu 1 lần để xác định các

chỉ tiêu huyết học, phân tích hàm lượng lysozyme và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh Kết quả xác định các chỉ tiêu huyết học ở tất cả các nghiệm thức cho thấy số lượng hồng cầu dao động từ 1,4x106 đến 2,02x106 và khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức có bổ sung hoàng kỳ và nghiệm thức cho ăn thức ăn bình thường Tổng bạch cầu, tế bào lympho, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân tăng đều qua

5 tuần Tuy nhiên sau khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn E ictaluri thì số lượng hồng

cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu đều giảm ở các nghiệm thức nhưng bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính lại tăng Số lượng các chỉ tiêu huyết học của cá cảm nhiễm có bổ sung hoàng kỳ đều cao hơn cá cho ăn thức ăn bình thường và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Kết quả phân tích hàm lượng lysozyme trong huyết thanh cá sau 5 tuần dao động từ 26,43 ±1,21 µg/ml đến 29,65 ±1,16 µg/ml và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) giữa nghiệm thức 3, 4 so với nghiệm thức 1, 2 Sau khi gây cảm nhiễm thì hàm lượng lysozyme ở các nghiệm thức đều giảm tuy nhiên chỉ có nghiệm thức 3 là cao nhất và khác biệt so với nghiệm thức 5 Khả năng diệt khuẩn huyết thanh của cá ở nghiệm thức 2 và 3 cao hơn cá ở nghiệm thức 1 và 5, phần trăm vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh của cá có ăn hoàng

kỳ thấp hơn cá không ăn hoàng kỳ Tỷ lệ sống của cá sau cảm nhiễm với vi khuẩn

E.ictaluri cao nhất ở nghiệm thức 4 và khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm

thức 2 và nghiệm thức 3 Kết quả trên cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ vào khẩu phần

thức ăn làm tăng cường khả năng đề kháng của cá với sự nhiễm vi khuẩn E ictaluri

iii

ABSTRACT

The aim of this study is to determine the influence of the extract of Hoang ky

(Astragalus membranaceus) in the prevention of white patches in the striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) Catfish of weighing 25 grams were selected for

treatments, in which the treatments 2, 4, 6 applied feeding diets containing 0,5% extract of Hoang ky and the treatments 1, 3, 5 feeding normal feed within 5 weeks

The treatments 3 and 4 were vaccinated (i.p.) against E.ictaluri at the 3rd week After 5 weeks of feeding, the injection of bacteria E.ictaluri CAF 258 with density

of 5,4x104 cfu/ml was done in the treatments 2, 3, 4, 5 Samples were weekly collected to determine haematological indicators and to analyze content of lysozyme and bactericidal capacity of serum The results of identifying hematological targets

in all treatments show that the number of red blood cells (RBC) ranged from 1,4x106 to 2,02x106 and were significantly different among the treatments with diets containing Hoang ky’s extract and those with normal feed The number of total leukocytes, lymphocyte, neutrophil and monocyte increased over 5 weeks

However, after infection with the bacteria E.ictaluri the number of the RBC, white

blood cells, lymphocyte, thrombocyte decreased in the treatments, but the number of monocyte and neutrophil increased The number of hematological targets in all fish fed with diets containing Hoang ky are higher than that in fish fed normal feed, and this difference is statistically significant (p <0,05) Results from lysozyme analysis

in serum of fish after 5 weeks ranged from 26,43 ± 1,21 µg / ml to 29,65 ± 1,16 µg /

ml and differed significantly different among the treatments 3,4 and the treatments

1, 2 After causing the susceptibility, content of lysozyme in all the treatments decreased but that in the treatments 3 is highest and different from the treatment 5 Bactericidal ability of serum of fish in the treatments 2 and 3 are higher than that of fish in the treatments 1 and 5 The survival of bacteria after interaction with the serum of fish fed Hoang ky is lower than those fed normal feed The highest

survival of fish after bacterial susceptibility to E.ictaluri was in treatment 4 and

significantly higher than treatments of 2 and 3 The results of this study showed that feeding of Hoang ky’s extract stimulated enhance immune response of catfish and

protection against E ictaluri.

iv

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

CHƯƠNG 1 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 3

2.1.1Tổng quan về nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL 3

2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL 4

2.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi cá tra 6

2.2.1 Hiện trạng sử dụng 6

2.2.2 Hiện trạng kháng thuốc 7

2.2.3 Tồn lưu trong môi trường và sản phầm 8

2.2.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người 9

2.3 Sơ lược các nghiên cứu về thảo dược 10

2.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý cây Hoàng kỳ 15

CHƯƠNG 3 17

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm 17

3.2 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 17

3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn 17

3.3.2 Thí nghiệm xác định LD50 18

3.3.3 Thí nghiệm cho ăn thảo dược 18

3.3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm sau khi cho ăn thảo dược 5 tuần 19

v

3.3.3 Xác định hiệu quả của chiết xuất thảo dược lên sự đề kháng bệnh mủ gan trên cá tra

qua các chỉ tiêu 19

3.4 Quản lý hệ thống thí nghiệm 21

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 4 23

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra 23

4.1.1 Hồng cầu 23

4.1.2 Bạch cầu 24

4.2 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri 30

4.2.1 Hồng cầu 30

4.2.1 Bạch cầu 31

4.3 Lysozyme 33

4.3.1 Hàm lượng lysozyme trước cảm nhiễm 34

4.3.2 Hàm lượng lysozyme sau cảm nhiễm 35

4.4 Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh 37

4.5 Ảnh hưởng của chiết xuất hoàng kỳ lên sự nhiễm bệnh mủ gan do vi khuẩn E ictaluri… 39

CHƯƠNG 5 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề xuất 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC A 52

PHỤ LỤC B 54

PHỤ LỤC C 55

PHỤ LỤC D 56

vi

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.2: Khả năng ảnh hưởng của thuốc và hóa chất dùng trong NTTS đến sức khỏe con

người (Kimbrell et al., 2005) 10

Bảng 4.2 Số lượng hồng cầu trước và sau cảm nhiễm 30

Bảng 4.2 Số lượng các loại bạch cầu sau cảm nhiễm 33

Bảng 4.5 LD50 của vi khuẩn E ictaluri thí nghiệm 39

vii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Diễn biến diện tích và sản lượng cá tra ở vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-2008 và

quy hoạch đến năm 2020 3

Hình 2.4: Rễ và thân cây Hoàng kỳ 15

Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu của các nghiệm thức thí nghiệm sau 5 tuần 23 Hình 4.2 Bạch cầu đơn nhân (A), tiểu cầu (B), bạch cầu trung tính (C), tế bào lympho (D) và tế bào hồng cầu (E) (100X) 25

Hình 4.3 Biểu đồ số lượng tổng bạch cầu ở cá tra sau 5 tuần 27

Hình 4.4 Số lượng tế bào lympho sau 5 tuần 27

Hình 4.5 Số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ 28

Hình 4.6 Số lượng tế bào bạch cầu trung tính sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ 28

Hình 4.7 Số lượng tế bào Tiểu cầu sau 5 tuần cho ăn Hoàng Kỳ 29

Hình 4.8 Đồ thị nồng độ lysozyme chuẩn 34

Hình 4.9 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau 5 tuần cho ăn Hoàng kỳ 35

Hình 4.10 Hàm lượng lysozyme trung bình của các nghiệm thức sau cảm nhiễm với vi khuẩn E.ictaluri 36

Hình 4.11 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá trước cảm nhiễm 37

Hình 4.12 Phần trăm trung bình vi khuẩn sống sót sau khi tương tác với huyết thanh cá sau cảm nhiễm 38

Hình 4.13 Cá tra thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri (mũi tên chỉ đốm trắng trên gan, thận, tỳ tạng) 40

Hình 4.14 Tỷ lệ chết cá chết tích lũy sau khi gây cảm nhiễm vi khuẩn E.ictaluri 41

1

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Trong những năm gần đây phong trào nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) xuất khẩu ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) gia tăng đáng kể

Thế nhưng, do phát triển quá nhanh không theo quy hoạch nên dịch bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều Theo Phạm Đình Khôi (2009) trong vòng 5 năm qua, môi trường ô nhiễm và dịch bệnh đã làm tỷ lệ sống trung bình của cá nuôi giảm từ 90% xuống còn 80% Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan và ctv (2006) thì tần suất xuất hiện bệnh ở các tỉnh ĐBSCL là đốm trắng trên gan, thận: 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70% và vàng da: 21,60% Trong đó bệnh đốm trắng xuất hiện trên nội tạng đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi

Theo nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2004) thì bệnh đốm trắng trên gan cá tra là do vi khuẩn Edwardsilla ictaluri gây ra, thường xuất hiện vào mùa lũ,

cao điểm là tháng 7 và tháng 8 Ngoài ra qua kết quả khảo sát của (Nguyễn Chính, 2005) cho rằng bệnh đốm trắng trên gan thân gây tỉ lệ hao hụt cao ở cá hương giống (10-90%) tổng số cá nuôi, mức độ thiệt hại có thể lên đến 60-80% Khi dich bệnh xảy ra, để hạn chế thiệt hại người nuôi đã sử dụng thuốc kháng sinh để trị bệnh từ

đó dẫn đến hiện tượng kháng thuốc Vi khuẩn E ictaluri trên cá tra đã kháng với

một số loại thuốc kháng sinh như oxytetracyline, oxolinic acid, sulfonamide (Từ

Thanh Dung và ctv, 2004), hầu hết tất cả các chủng E ictaluri biểu hiện tính đề

kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường sử dụng trong điều trị bệnh

(Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007) Kết quả nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Thiện Nam (2010) cho thấy đa số các chủng vi khuẩn E ictaluri đã kháng với nhiều

loại kháng sinh như: streptomycin, chloramphenicol (95%), florfenicol, enrofloxacin (77,5%), doxycyline (67,5%) Bên cạnh đó nghiên cứu cũng xác định 97,5% chủng

vi khuẩn E ictaluri biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng ít nhất 3 loại kháng sinh) và khả năng chuyển gen kháng tetracyline của vi khuẩn E ictaluri cho vi khuẩn E.coli

RC 85 với tần số tiếp hợp trung bình là 2,54x106

Hiện nay, việc phòng trị bệnh cá tra chủ yếu vẫn phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất Điều này khiến cho việc nuôi và xuất khẩu cá tra của Việt Nam gặp nhiều khó khăn do danh mục các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong

2

nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp phòng trị bệnh có hiệu quả như sử dụng các loại thảo dược, chất tách chiết từ thảo dược và Vắc-xin là rất cần thiết nhằm đảm bảo cho sự phát triển bền vững của nghề (Phạm Văn Thư, 2006)

Sử dụng thảo dược và các chất chiết từ thảo dược để phòng trị bệnh trên cá đã

được nghiên cứu ở nhiều loài cá có vẩy và cá trơn như cá rô phi (Yin et al., 2006, Ardó et al., 2008), cá chép (Yin et al., 2008), cá nheo mỹ (Zheng et al., 2009) tuy

nhiên trên cá tra thì chưa có nhiều nghiên cứu đề cập đến Chính vì sử dụng thảo dược và các chất chiết từ thảo dược trong phòng bệnh cá là một xu hướng mới có

nhiều triển vọng phát triển trong thời gian tới nên đề tài “ Sử dụng chất chiết xuất

từ cây Hoàng Kỳ (Astragalus membranaceus) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được

thực hiện

Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài nhằm tìm hiểu khả năng sử dụng chiết xuất từ cây Hoàng

Kỳ (Astragalus radix) để phòng bệnh mủ gan do vi khuẩn E ictaluri gây ra ở cho cá

tra nuôi thâm canh nhằm từng bước thay thế kháng sinh trong việc phòng bệnh này

Nội dung của đề tài

1 Xác định ảnh hưởng của chiết xuất Hoàng kỳ lên các chỉ tiêu huyết học và miễn dịch của cá tra

2 Xác định ảnh hưởng của chiết xuất Hoàng kỳ lên sự nhiễm mầm bệnh vi khuẩn

E ictaluri ở cá tra

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu

2.1.1Tổng quan về nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL

ĐBSCL có một mạng lưới kênh rạch chằng chịt bao gồm các hệ thống sông rạch tự nhiên và các kênh mương nhân tạo với tổng chiều dài trên 5.000 km với nhiều kích thước khác biệt nhau (Lê Anh Tuấn, 2009) ĐBSCL có hai mặt giáp biển Đông và vịnh Thái Lan dài hơn 600 km, mỗi năm vùng đất này nhận hơn 450 tỷ m3 tổng lượng nước từ sông Mêkông Cùng với hệ thống sông Tiền và sông Hậu là điều kiện thuận lợi để phát triển nuôi trong thủy sản nước ngọt (Lê Anh Tuấn, 2008), trong đó

cá tra là đối tượng nuôi phổ biến mang tính truyền thống từ các hình thức nuôi như tận dụng ao hầm, mương vườn và nguồn thức ăn sẵn có, đến cuối thập niên 90, khi nghề nuôi cá tra đã có những bước tiến vượt bậc sau sự thành công trong việc sản xuất nhân tạo loài cá này (Từ Thanh Dung và ctv, 2004) Kết hợp với điều kiện tự nhiên thuận lợi, áp dụng những kỹ thuật nuôi thích hợp và sự phát triển của thị trường quốc tế đã thúc đẩy cho việc mở rộng diện tích nuôi cá tra ở ĐBSCL Năm

2003 diện tích nuôi cá tra của ĐBSCL là 2.792 ha đến 2007 lên tới 5.429 ha; tốc độ tăng trưởng bình quân là 18,1%/năm Năm 2008 Cần Thơ là địa phương có diện tích nuôi cá tra cao nhất trong vùng (1.569 ha, chiếm 29%); kế đến là An Giang (1.393

ha, chiếm 25,7%); Đồng Tháp (1.272 ha, chiếm 23,4%) (Hình 2.1) (Dương Công

Chinh và Đồng An Thụy 2009)

Hình 2.1 Diễn biến diện tích và sản lượng cá tra ở vùng ĐBSCL giai đoạn 1997-2008 và

quy hoạch đến năm 2020 (Nguồn: Dương Công Chinh và Đồng An Thụy 2009)

4

Hiện nay, khi nghề nuôi cá tra và ba sa phát triển đã kéo theo sự gia tăng về diện tích và sản lượng, do đó mật độ nuôi cũng được nâng lên với thời gian nuôi là 6 tháng thì năng suất trung bình đạt 300-400 tấn/ha/vụ, có hộ đạt đến 700 tấn/ha/vụ Theo báo cáo của Bộ NN & PTNT (2010) thì diện tích nuôi trồng thủy sản 10 tháng đầu năm 2010 đạt 1,1 triệu ha bằng 103% cùng kỳ năm 2009; sản lượng nuôi ước đạt 2,15 triệu tấn, tăng 8% so cùng kỳ năm 2009

2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL

Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá tra phát triển rất mạnh ở ĐBSCL, phổ biến

ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ từ hình thức nuôi bè nay đã chuyển

sang nuôi thâm canh trong ao đất (Trần Thị Minh Tâm và ctv 2003), đồng thời qui

mô nuôi cũng thay đổi theo hướng tập trung hơn (Nguyễn Phú Son, 2007) Việc thâm canh hóa nghề nuôi cá tra nhằm đáp ứng nhu cầu xuất khẩu đã dẫn đến tình trạng phát triển một cách tự phát không theo qui hoạch làm môi trường nước ngày càng ô nhiễm, là điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh phát triển, không những gây ảnh hưởng đến nghề nuôi mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế - xã hội

2.1.2.1 Bệnh do vi khuẩn và ký sinh trùng

Tình hình dịch bệnh trên cá tra nuôi diễn biến khá phức tạp và có chiều hướng gia tăng, trong đó bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề nuôi Qua khảo sát của Châu Hồng Thúy (2008) các bệnh thường gặp do vi khuẩn trên cá tra nuôi ở Trà Vinh là: mủ gan, xuất huyết, trắng gan trắng mang, phù đầu lồi mắt, khảo sát này phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Chính (2005) và Trần Anh Dũng (2005) trên cá tra nuôi thâm canh ở An Giang

Dịch bệnh trên cá tra nuôi xảy ra quanh năm, thời điểm bệnh bùng phát nhiều nhất là lúc giao mùa do sự thay đổi đột ngột của thời tiết, nhiệt độ, đặc biệt là giai đoạn nước rút, ngoài ra bệnh còn xuất hiện theo loại hình nuôi với tác nhân là ký

sinh trùng (trùng bánh xe, sán lá mang, Myxobolus) và nấm (Bùi Quang Tề, 2001; Trần Thị Minh Tâm và ctv, 2003; Trần Anh Dũng, 2005) Vào mùa khô (từ tháng 11

đến tháng 4 năm sau) thì 68,3% hộ nuôi ghi nhận là do sán lá gan, trong khi mùa mưa (từ tháng 4 đến tháng 11) 73% hộ nuôi ghi nhận là do trùng bánh xe và sán lá mang, nhưng khi lũ rút thì đa số là do trùng bánh xe có 85,4% hộ nuôi ghi nhận Ngoài ra bệnh trên cá tra nuôi còn tùy thuộc vào giai đoạn nuôi Qua khảo sát các tác nhân gây bệnh trên cá tra nuôi thâm canh ở An Giang cho thấy cá tra giống rất mẫn cảm với ký sinh trùng, đặc biệt là trùng bánh xe và chủ yếu gây hại ở giai

5

đoạn này Tuy nhiên đến giai đoạn cá thịt thì tỉ lệ tác nhân gây bệnh do sán lá mang

là 68,3% hộ nuôi ghi nhận được đối với loại hình nuôi ao, loại hình nuôi bè là 73,9% và cao nhất là 88% đối với loại hình nuôi đăng quầng Từ đó cho thấy cá tra nuôi thâm canh rất mẫn cảm với bệnh do sán lá mang và thuộc nhóm khó trị (Trần Anh Dũng, 2005)

2.1.2.2 Tinh hình bệnh mủ gan ở ĐBSCL

Có thể nói nghiên cứu công bố sớm nhất về bệnh mủ gan (đốm trắng) trên cá tra ở

Việt Nam thuộc về Trần Thị Minh Tâm và ctv (2003) nhưng xác định tác nhân là

do 2 loài vi khuẩn Hafnia avlei và Plesiomonas shigelloides gây ra, ngoài ra từ các nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2004) và Nguyễn Quốc Thịnh và ctv (2004) đã xác định bệnh mủ gan trên cá tra là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Tuy nhiên trong giới khoa học về bệnh thủy sản vẫn còn nhiều tranh cải về tác nhân

gây bệnh mủ gan trên cá Theo kết quả nghiên cứu của Lý Thị Thanh Loan và ctv (2006) thì vi khuẩn gây bệnh mủ gan là do vi khuẩn Clostridium sp Đến năm 2008, tại Hội thảo cá da trơn Châu Á tổ chức tại Cần Thơ, các tác giả (Truong Thi Ho et al., 2008; Crumlish et al., 2008; Khoi et al., 2008, Tu Thanh Dung et al 2008) đều khẳng định tác nhân gây bệnh mủ gan ở ĐBSCL, Việt Nam là do E ictaluri Nồng

độ gây chết (LD50) của vi khuẩn E ictaluri gây bệnh mủ gan trên các trang trại nuôi

cá tra thâm canh được xác định là 105,17 CFU/ml (Đang Thi Hoang Oanh and Nguyen Thanh Phuong, 2008) và có thể sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện vi

khuẩn E ictaluri trên cá tra (Đang Thi Hoang Oanh and Nguyen Truc Phuong,

2008)

Theo Từ Thanh Dung (2004) thì bệnh mủ gan trên cá tra xuất hiện từ cuối năm

1998 và trở nên trầm trọng vào năm 1999 ở ĐBSCL, bệnh thường xuất hiện vào mùa mưa lũ và bộc phát cao nhất vào tháng 7 và 8 Bệnh mủ gan xuất hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá con (cá giống và cá thịt), tỉ lệ hao hụt lên đến 90%

(Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003) Ngoài ra qua kết quả điều tra của Trần Anh

Dũng (2005) tại các hộ nuôi cá tra ao ở An Giang thì bệnh mủ gan xuất hiện nhiều vào thời gian lũ về với tỉ lệ 87,8%, còn thời điểm lũ rút thì bệnh xuất huyết lại xuất hiện cao nhất với tỉ lệ 85,4% và bệnh vàng da là 78,1% Đối với loại hình nuôi bè thì bệnh mủ gan xuất hiện cao nhất vào mùa mưa với tỉ lệ hộ nuôi ghi nhận là 86,9%

6

Tình hình bệnh trên cá tra khá phức tạp, qua khảo sát ở các hộ nuôi cá tra bè tại Đồng Tháp, có 16 loại bệnh xuất hiện, trong đó bệnh phù đầu có tần suất xuất hiện nhiều nhất chiếm (60%), kế đến là bệnh gan thận có mủ chiếm tỷ lệ (40,7%) vào thời điểm 2004 Đến năm 2006 tình hình bệnh có một số thay đổi so với 2004,

cụ thể bệnh ký sinh trùng và bệnh vàng da xuất hiện ở hầu hết các hộ nuôi nhưng bệnh phù đầu, mủ gan lại xuất hiện với tỉ lệ rất thấp (21,4% và 3,6%) (Nguyễn Quốc Thịnh, 2006)

2.2 Hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi cá tra

2.2.1 Hiện trạng sử dụng

Nuôi trồng thủy sản hiện nay đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh cả về diện tích, mức độ thâm canh, loại hình nuôi đến đầu tư cơ sở hạ tầng và chế biến sau thu hoạch Vì thế việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản có một đóng góp không nhỏ trong sự phát triển của ngành Từ đó việc sản xuất, kinh doanh thuốc kháng sinh ngày càng thu hút nhiều công ty ra đời và thường xuyên tung ra các sản phẩm mới nhằm đáp ứng nhu cầu của người nuôi về giá thành, tính đa dạng của sản phẩm (Nguyễn Hữu Đức, 2007) Qua kết quả điều tra tình hình sử dụng thuốc, hóa chất và chế phẩm sinh học (CPSH) trong NTTS của Mai Văn Tài và ctv (2004) cho thấy có ít nhất 373 loại hóa chất và CPSH được sử dụng trong NTTS, trong đó có 14 loại hóa chất xử lý đất và nước, 6 chất gây màu nước, 86 hóa chất khử trùng và diệt tạp, 138 kháng sinh, 47 loại CPSH, 13 loại vitamin, 57 loại thức ăn bổ sung, 10 loại hoocmon, 5 loại không xác định Đối với nuôi cá ao nước ngọt có 67 loại (trong đó

31 loại là kháng sinh), sản xuất cá giống nước ngọt có 85 loại (trong đó 37 loại là kháng sinh)

Kháng sinh là nhóm có số lượng sản phẩm kinh doanh đứng thứ nhì với mục đích chủ yếu là trị bệnh, ngoài ra còn sử dụng để phòng bệnh bằng cách trộn vào

thức ăn (Trần Thị Minh Tâm và ctv., 2003) đồng thời kích thích tăng trưởng

(Nguyễn Chính 2005) Chi phí cho sử dụng thuốc trong nuôi cá tra công nghiệp tương đối cao và đứng hàng thứ ba sau chi phí thức ăn và con giống Thị trường các loại thuốc trị bệnh cho cá hiện nay rất phong phú và đa dạng về số lượng và chủng loại (Nguyễn Quốc Thịnh, 2006)

Tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra ở An Giang và Cần Thơ cho thấy nhóm quinolone và sulfonamide có nhiều hoạt chất được sử dụng, cao nhất

7

là 6 chất, kế đến là nhóm aminoside 4 chất, tetra 3 chất Về tần suất xuất hiện trong

113 sản phẩm khảo sát thì nhóm quinolone chiếm nhiều nhất là 43 sản phẩm, kế đến

là nhóm colistin 32 sản phẩm (thường dùng kết hợp với các nhóm khác), oxytetracylin 17 sản phẩm, ampiciline 15 sản phẩm, flumequine và trimethoprim 12 sản phẩm (Nguyễn Chính, 2005)

Tại Sóc Trăng và Bạc Liêu cho thấy có 74 loại thuốc và hóa chất trong đó có

19 loại kháng sinh, có 20 loại thuốc và hóa chất dùng diệt tạp và tẩy trùng, 10 loại hóa chất dùng xử lý đất và nước; 10 loại men vi sinh; và một số loại thuốc và hóa chất khác như phân bón, sản phẩm dùng tăng cường hệ miễn dịch bổ sung vào thức

ăn Kháng sinh trên thị trường thường ở dạng kháng sinh đơn lẻ chủ yếu là nhóm fluoroquinolones Trong đó 42,9% số hộ điều tra sử dụng enrofloxacin và 25% số

hộ điều tra sử dụng norfloxacin Ngoài ra, sulfamethoxazol, cortrimoxazol, aminosid, colistin và trimethoprim cũng được sử dụng nhưng chiếm tỉ lệ thấp

(Huỳnh Thị Tú và ctv, 2006)

2.2.2 Hiện trạng kháng thuốc

Mặc dù thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài động vật thuỷ sinh, nhưng do việc sử dụng không đúng cách và sử dụng quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thủy sản Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động của các loại kháng sinh Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi sinh vật tạo ra kháng sinh nhằm bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh này Những gen này có thể được hình thành trong các loài vi khuẩn khác thông qua sự trao đổi gen với một vi khuẩn tạo ra kháng sinh, do vậy chúng có khả năng tạo ra cơ chế làm trung hoà hoặc phá huỷ các loại thuốc kháng sinh (Bùi

Quang Tề và ctv., 2006)

Qua nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Nam Kha và ctv (2005) cho thấy

oxytetracyline, chloramphenicol, trimethorime/sulfamethoxazole, sulfamidea, ampiciline và streptomycine là những kháng sinh thường dùng trong cá nuôi ở trang trại của Việt Nam với tỷ lệ vi khuẩn kháng lên đến 90% và thể hiện tính đa kháng là 34% (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2005) Đặc biệt với kháng sinh cấm chloramphenicol

(Bộ thủy sản, 2002) tỷ lệ kháng rất cao (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2004), bên

8

cạnh đó còn thể hiện tính đa kháng Trong 101 vi khuẩn phân lập đều thể hiện tính

đa kháng với ít nhất 4 loại kháng sinh, đa số (80%) là kháng với 6 loại kháng sinh

Qua phân lập và khảo sát đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn E ictaluri

gây bệnh mủ gan trên cá tra nuôi thâm canh ở một số tỉnh ĐBSCL cho thấy tỷ lệ chủng kháng florfenicol tại Vĩnh Long cao nhất là 45%, kế đến là An Giang 30%, thấp nhất là Cần Thơ 5% trong tổng số 20 chủng kháng florfenicol được khảo sát tại

4 tỉnh Cần Thơ, Vĩnh Long, An Giang, Bến Tre

Theo Crumlish et al (2008) vi khuẩn E ictaluri phân lập từ cá tra bị bệnh từ

các trại nuôi từ 2002 đến 2008, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về loài vi khuẩn gây bệnh Tuy nhiên sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng phát hiện nhiều

Theo Stock and Bernd (2001) cho rằng tất cả các chủng E.ictaluri thì nhạy cảm với

các kháng sinh: tetracyclines, aminoglycosides, ß-lactam, quinolones, antifolates, chloramphenicol, nitrofurantoin and fosfomycin, ngoài ra chúng còn thể hiện tính đề kháng với macrolides, lincosamides, streptogramins, glycopeptides, rifampin and fusidic acid

2.2.3 Tồn lưu trong môi trường và sản phầm

Xu hướng hiện nay trong việc phát triển nghề nuôi cá tra là thâm canh hóa để gia tăng năng suất và sản lượng Tuy nhiên, thâm canh đã gây ảnh hưởng xấu đến môi trường nước và làm giảm chất lượng sản phẩm mà tác nhân chính là do hậu quả của việc sử dụng hóa chất, kháng sinh không đúng cách, đồng thời tạo hệ vi sinh vật gây bệnh cho người và vật nuôi Ngoài ra dư lượng hóa chất kháng sinh không đáp ứng được yêu cầu bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng trong nước cũng như qui định của các nước nhập khẩu Do đó nhiều lô thủy sản xuất khẩu đã bị từ chối hoặc tiêu hủy do phát hiện nhiễm dư lượng hóa chất kháng sinh cấm như: chloramphenicol, nitrofuran, malachite green, thiệt hại ước tính hàng triệu USD (Lê Thị Huệ, 2006) Vấn đề tồn lưu kháng sinh, hóa chất trong cá thương phẩm trong các trại nuôi cá tra thâm canh ở An Giang và Cần Thơ năm 2005 cho thấy các chỉ tiêu như: chloramphenicol, nitrofuran và nhóm tetracycline đều không phát hiện, nhưng nhóm sulfonamid thì có 8 mẫu (12,5%), nhóm quinolone có 3 mẫu (4,67%) dưới mức giới hạn cho phép theo quyết định 07/2005 của Bộ Thủy sản Tuy nhiên, malachite green

là chất bị cấm sử dụng nhưng lại hiện diện với tỉ lệ 10/64 mẫu (chiếm 15,6%) Qua đánh giá ảnh hưởng của malachite green (MG) lên sinh lý, sinh hóa và tồn lưu trên cá tra cho thấy sau 6 giờ cá bị gây nhiễm MG ở các nồng độ (0,1 ppm; 0,15

9

ppm và 0,2 ppm) thì hàm lượng MG và Leucomalachite green (LMG) tồn tại trong

cơ và da cá rất cao (trung bình từ 39,8 đến 73,5 ppb) chiếm 40% so với nồng độ gây nhiễm ban đầu, nhưng sau 72 giờ gây nhiễm thì hàm lượng MG và (LMG) trong cơ

và da cá giảm nhanh đạt giá trị khoảng 10-25% hàm lượng tồn lưu ở lần thu mẫu 6 giờ Tuy nhiên, khả năng chuyển hóa và đào thải của MG thì khác nhau tùy theo từng loài cá và môi trường sống Ở cá, hơn 80% MG bị hấp thu và chuyển hóa thành LMG, ngoài ra MG có thể tồn tại trong môi trường nước khoảng 80 ngày, nó còn ảnh hưởng đến các sinh vật trong nước như: tảo, nguyên sinh động vật (Lương Thị Diễm Trang, 2009)

2.2.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Việc sử dụng thuốc và hóa chất trong NTTS công nghiệp như là thuốc kháng sinh, thuốc diệt nấm, chất gây màu nước và hormone với tỉ lệ ngày càng tăng trong các trại đã ảnh hưởng đến sức khỏe con người, tính an toàn của thực phẩm (Lương Đức Phẩm, 2001) và lưu tồn với số lượng lớn Kết quả điều tra nghiên cứu của Kimbrell and Letterman (2005) cho thấy khả năng ảnh hưởng của thuốc và hóa chất dùng trong NTTS đến sức khỏe con người được trình bày ở bảng (2.2)

Theo Bùi Quang Tề và ctv (2006a) cho thấy một vài hậu quả cụ thể gây ra từ

kháng sinh như: Chloramphenicol gây chứng máu chậm đông, thiếu máu do làm giảm sự hấp thu và vận chuyển sắt (Lương Đức Phẩm, 2001) Neomyxin kìm hãm

sự hoạt hóa disaccharidaza của ruột, tao nên tác động phụ làm rối loạn hô hấp, Streptomyxin và các aminoglycosid đã làm liệt hô hấp và làm liệt các cơ khác do nó làm giảm sự dẫn truyền kích thích thần kinh, các aminoglycosid lại làm kéo dài thời gian tái hóa vôi, do đó gây độc cho gan, ngoài ra một số kháng sinh còn gây dị ứng cho cơ thể Chính vì những hạn chế trên mà các nhà khoa học đã đưa ra một bản dự thảo về một số kháng sinh, hóa dược, chế phẩm sinh học dự định được thay thế kháng sinh cấm sử dụng trong NTTS nhằm làm giảm những tác hại không mong muốn gây ra cho con người

Đối với các kháng sinh như erythromycin, rifampin được dùng để thay thế cho kháng sinh chloramphenicol, nitrofuran, furazon Kháng sinh bactrim và doxycycline thì thay cho chloramphenicol, nitrofuran, furazon và metrodidazole Kháng sinh chlortetracyclin dùng thay cho kháng sinh cấm hiện nay là chloramphenicol và nitrofuran Bên cạnh đó còn có một số hóa dược như MS-222 thay thế cho kháng sinh chloroform và chlorpromazine trong điều trị Ngoài ra còn

10

có nhóm thuốc sát khuẩn như tricloisocyanuric acid (TCCA), BKC, chlorine, dung dịch anolyte, iodine, formalin và KMnO4 thì dùng để thay thế các chất khử trùng có độc lực cao Quan trọng hơn là việc dùng chế phẩm sinh học như các vi sinh vật hữu

ích, men vi sinh, chiết xuất của thực vật (trừ Aristolochia spp), β Glucan, Vắc-xin

vô hoạt, Bacterin giải độc tố, kháng thể và vitamin các loại để thay thế các loại kháng sinh cấm

Bảng 2.2: Khả năng ảnh hưởng của thuốc và hóa chất dùng trong NTTS đến sức khỏe con người (Kimbrell and Letterman, 2005)

STT Thuốc và

hóa chất Ví dụ Loài bị nhiễm Khả năng nguy hiểm

1 Kháng sinh Oxytetracycline,

Chloramphenicol, Sulfadimethoxine- ormethoprim, Amoxicillin trihydrate, Nitrofurans

Tôm, Cá da trơn, Cá Hồi

Phát triển vi khuẩn kháng thuốc và tồn lưu trong máu

2 Thuốc gây

màu

Astaxanthin, Canthaxanthin Cá Hồi

Có vấn đề đến tính hiếu động của trẻ em và mắt

5 Biến đổi gen

ở cá

Growth hormones, antifreeze protein

Cá Hồi, Hàu, 2 mảnh vỏ

Gây dị ứng, gây độc, gây ảnh hưởng ngoài dự kiến

6 Hormone Bovine growth

hormone (rBGH)

Hai mảnh vỏ (sò, nghêu) Có liên quan đến ung thư

2.3 Sơ lược các nghiên cứu về thảo dược

Trong lịch sử y học cổ truyền Việt Nam vấn đề nghiên cứu về cây thuốc để trị bệnh cho người và động vật đã có từ thế kỷ 17 do Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh với hai tác phẩm “ Nam dược thần hiệu” mô tả 580 vị thuốc trong 3.873 bài thuốc dân gian và

11

“Hồng nghĩa gia thủ thư” tóm tắt về 680 vị thuốc Sau đó lương y Lê Hữu Trác tức Hải Thượng Lãn Ông (1720-1791) là tác giả của 30 tập sách về y học cổ truyền Việt Nam Sau cách mạng Tháng Tám năm 1945 Đỗ Tất Lợi, đã nghiên cứu và biên soạn cuốn sách “Medicinal Plants and Drugs from Vietnam” dày hơn 1.200 trang về cây thuốc, động vật và khoáng vật làm thuốc ở Việt Nam (Đỗ Tất Lợi Và Nguyễn Xuân Dũng, 1991) Từ đó cho thấy tầm quan trọng của thảo dược trong phòng trị bệnh ở người và động vật và đã được nghiên cứu từ rất lâu

Đối với NTTS việc sử dụng các hoạt chất có nguồn gốc thực vật trong việc phòng bệnh đã được người dân áp dụng từ rất lâu theo kinh nghiệm Một số thảo

mộc có hoạt chất sinh học có thể sử dụng trong NTTS như: Hành (Allium fistulosum), tỏi (Allium sativum L.) có chất alixin có tác dụng kháng khuẩn mạnh (Đỗ Tất Lợi, 2004; Bùi Quang Tề và ctv 2006a), hẹ (Allium odorum L.) có chất odorin có tác dụng ức chế vi trùng Staphyllo coccus aureus và Bacillus coli và một

số cây dùng trong diệt tạp như dây thuốc cá (Derris elliptica) có chất rotenone, có nhiều trong rễ cây, cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia Burm) trong toàn bộ cây có

chứa cosmosilin, taraxerol, tirucallol và myrixylacohol có tác dụng ức chế sinh sản

của nhiều loài vi trùng (Đỗ Tất Lợi, 2004; Phan Xuân Thanh và ctv, 2003)

Ngày nay trong NTTS đã có những nghiên cứu bàn về tiềm năng sử dụng kháng sinh thảo mộc trong việc phòng và chữa trị bệnh nhiễm khuẩn mà tác giả

Nguyễn Thị Vân Thái và ctv (2006) đã đề cập Trong đó các chất như: alixin trong

tỏi (Bùi Quang Tề, 2006a), odorin trong hẹ, brazilin và sappanin trong tô mộc đã được sử dụng để trị các bệnh về viêm nhiễm Bên cạnh đó các chất chiết từ nấm linh chi, hoàng kỳ, sài đất, nhọ nồi, tỏi, kim ngân, lá ổi, gừng và cỏ mực đã được nghiên cứu sử dụng trong phòng trị bệnh trên động vật thủy sản (Bùi Quang Tề và

ctv 2006a; Ardó et al., 2008; Yin et al., 2006) Ngoài ra còn nêu những nguyên tắc

và phương pháp sưu tầm chất kháng khuẩn dùng trong NTTS như: Chọn những thực vật có tính đối kháng với vi khuẩn dựa vào kinh nghiệm dân gian Thử hoạt tính kháng khuẩn một cách hệ thống theo từng họ thực vật, thông qua đó mà chọn ra

những cây có tác dụng tốt nhất Dügenci et al (2003) cho rằng một vài cây thuốc như: gừng (Zingiber officinale), cây tầm ma (Viscum album), cây tầm gửi (Urtica dioica) khi bổ sung vào trong thức ăn tạo chất kích thích miễn dịch cho cá giúp ngăn

ngừa một số bệnh như virus, vi khuẩn và nấm

12

Theo Yin et al 2008 khi nuôi cá chép kết hợp tiêm vắc-xin và cho ăn 2 loại thảo dược là Hoàng kỳ (Astragalus radix) và Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

làm kích thích hoạt động hô hấp, sự thực bào của bạch cầu trong máu Cá chép được

gây cảm nhiễm với vi khuẩn A hydrophila có tỷ lệ sống cao Tỷ lệ sống cao nhất

(60%) là nhóm cá có tiêm vắc-xin và được nuôi bằng cả 2 loại thảo dược, trong khi

đó hầu như 90% cá đối chứng (kiểm soát âm tính) và 60% cá chỉ được tiêm vắc-xin (kiểm soát dương tính) đã chết

Trên tôm sú (8 g) bị nhiễm đốm trắng, Citarasu et al (2006) cho rằng chiết chất Methanolic từ Cỏ gà (Cyanodon dactylon), Aegle marmelos, Dây ký ninh (Tinospora cordifolia), Picrorhiza kurooa và Cỏ mực (Eclipta alba) có tác dụng

nâng cao tỷ lệ sống Methanolic được trộn vào thức ăn với hàm lượng 100, 200, 400

và 800 mg/kg thức ăn và được theo dõi trong 25 ngày Kết quả đến ngày thứ 7 nghiệm thức không cho ăn Methanolic có tỷ lệ sống thấp hơn so với các nghiệm thức có cho ăn Methanolic Nghiệm thức cho ăn 800 mg Methanolic/kg thức ăn có

tỷ lệ sống 74% khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức cho ăn Methanolic còn

lại (p<0,0001) Với tôm sú bị bệnh mềm vỏ do Vibrio spp, theo Bùi Quang Tề và ctv (2006a) phối hợp chất chiết từ tỏi (Alltium sativum) và sài đất (Weledia calendualacea) có thể phòng trị được bệnh này Immanuel et al (2004) báo cáo rằng giàu hóa Artemia bằng butanolic chiết từ thực vật (cây Thầu dầu (Ricinus communis), Diệp hạ châu (Phyllanthus niruri), Húng cay đất (Leucus aspera), Khoai mì (Manihot esculenta)) và rong biển (Rong mơ (Ulva lactuca và Rong nâu (Sargassum wightii)) làm tăng tỷ lệ sống của tôm he Ấn Độ (Penaeus indicus) giai

đoạn giống từ 24,4 lên 43,3-58,9%, tốc độ tăng trưởng từ 1,1%/ngày lên 1,46-2,15

%/ngày và giảm nồng độ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong cơ và gan tụy từ

3,71 x105 và 3,86 x105 CFU/g xuống 1,36-2,03 x105 và 1,47-2,16x105 CFU/g Tại Trung Quốc, Zheng et al (2009) chứng minh tinh dầu cây lá thơm orengano (Origanum heracleoticum) thêm vào khẩu phần thức ăn cá Nheo bị nhiễm Aeromonas hydrophila thì cá vẫn tăng trưởng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng

(P<0,005) và chức năng gan và các cơ quan nội tạng được cải thiện (P<0,005) Hoạt

động chống oxy hóa của cá cũng tăng lên Kết quả của Jeney et al (2008) cho thấy trộn thảo dược Hoàng kỳ (Astragalus radix) và Kim ngân (Lonicera japonica) vào

thức ăn có thể tăng cường hệ miễn dịch cá chép và rô phi chống lại vi khuẩn

A.hydrophila Theo Yin et al (2006) bổ sung Hoàng kỳ (Astragalus radix) 0,1-0,5%

13

vào thức ăn cho cá Rô phi làm tăng lysozyme sau 1 tuần và sau 3 tuần hoạt động thực bào của tế bào thực bào tăng nhưng không tăng hoạt động hô hấp của tế bào

thực bào Còn Hoàng cầm (Scutellaria radix) thì không có tác dụng Kết quả tương

tự trên cá Đỏ dạ (Pseudosciaena crocea), hệ miễn dịch cá được tăng cường và tỷ lệ sống được cải thiện khi cho cá ăn 1-1,5% hỗn hợp Hoàng kỳ (Radix astragali seu Hedysari) và Đương quy (Radix angelicae sinensis) với tỷ lệ 5:1 (Jian and Wu,

2003) Kết quả tương tự khi Jian và Wu (2004) sử dụng 1% hỗn hợp Hoàng kỳ và Đương quy tỷ lệ 5:1 trên cá chép

Tại Bangladesh, Muniruzzaman và Chowdhury (2004) nghiên cứu tác dụng

của chất chiết từ 26 loài thảo dược với 3 vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda và Pseudomonas fluoescens gây bệnh trên cá Kết quả có 21 loài thảo dược (80,76%) có tác dụng với A.hydrophila, 24 loài thảo dược (92,3%) có tác dụng với P.fluoescens và 12 loài thảo dược (46,15%) có tác dụng với E.tarda Trong các loài thảo dược thì tỏi (Allium satium) có tác dụng chống A.hydrophila và P.fluoescens tốt nhất và lá cây Bồng bồng (Calotropis gigantea) diệt vi khuẩn E.tarda tốt nhất.

Tại Thổ Nhĩ Kỳ, Dügenci et al (2003) sử dụng chất chiết từ cây Tầm gửi (Viscum album), cây Tầm ma (Urtica dioica), và cây Gừng (Zingiber officinale) cho

cá Hồi (Oncorhynchus mykiss) ăn với khẩu phần 0,1%, 1% và 5% trọng lượng

thân/ngày liên tục trong 3 tuần Kết quả cá ăn thảo dược thì hoạt động hô hấp tăng đáng kể (P<0,0001) so với đối chứng Đặc biệt khẩu phần cá ăn 1% chất chiết từ cây gừng cho kết quả tăng cường miễn dịch về hoạt động thực bào, tăng cường hô hấp của tế bào bạch cầu và tăng mức protein trong huyết tương Trong tất cả các nồng

độ thảo dược, nồng độ 0,1% của cây gừng là không có tác dụng tăng mức protein trong huyết tương

Tại miền Nam Ấn Độ, Crasta et al (1997) đã chiết Acetone và Ethanol từ 5 loài rong biển Rong nho (Caulerpa taxifolia), Rong sợi (Chaetomorpha antennina), Cladophora fascicularis, Rong mơ (Ulva lactuca) và Rong câu (Gracilaria corticata) Kết quả C.taxifolia, C.antennina và G corticata có khả năng chống lại vi khuẩn Bacillus subtilis Gracilaria corticata còn có tác dụng chống lại nấm Candida albicans Nhưng không có chất chiết nào có thể ức chế vi khuẩn Pseudomonas aeurginosa, nấm Aspergillus flavus và Fusarium oxysporum

14

Thí nghiệm cho cá Rô phi (Oreochromis niloticus) ăn 2 loại thảo dược Hoàng

kỳ (Astragalus membranaceus) và Kim ngân (Lonicera japonica) 0,1% trong 4

tuần Kết quả cho thấy hệ miễn dịch của cá được tăng cường Hoạt động đại thực

bào, hô hấp của tế bào máu được tăng cường, tỷ lệ sống tăng lên (Ardó et al., 2008) Cũng trên cá Rô phi, Pachanawan et al (2008) chứng minh có thể sử dụng lá ổi (Psidium guajava) để kiểm soát bệnh do Aeromonas hydrophila gây ra Vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá Trê trắng (Clarias batrachus) cũng sẽ được kiểm soát chất chiết từ Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) (Balasundaram and Harikrishnan, 2009) Theo Bùi Quang Tề và ctv (2006a) phối hợp chất chiết từ

tỏi và sài đất cũng có tác dụng tốt để tăng cường hệ miễn dịch cá Tra với mầm bệnh

xuất huyết (do A.hydrophila) và mủ gan (do Edwardsiella tarda và Hafnia alvei) gây ra Theo Harikrishnan et al (2003) ngâm cá chép đã gây cảm nhiễm A hydrophila nồng độ 108 cfu/ml bằng lá Sầu đâu (Azadirachta indica) 1g/l trong 10

phút suốt 30 ngày để kiểm tra sự thay đổi thành phần sinh hóa Kết quả tế bào bạch cầu, tế bào hồng cầu, mức protein huyết thanh tăng có ý nghĩa thống kê so với cá đối chứng Tuy nhiên mức glucose, cholesterol và calcium trong huyết thanh giảm

dần theo các lần thu mẫu Trên cá vàng (Carassius auratus) và cá chép gây cảm nhiễm nhân tạo bằng A.hydrophila được ăn kết hợp Probiotics (Lactobacillus sp và Sporolac sp.) và 3 loại thảo Kết quả cho thấy cả probiotics và thảo dược điều có tác

dụng giúp cá hồi phục tốt sau 24 ngày (Harikrishnan R and C Balasundaram, 2009)

Tại Việt Nam, Phan Xuân Thanh và ctv (2003) đã đánh giá 25 loài cây (tỏi,

sài đất, nghệ, bạc hà…) có hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm có thể

sử dụng trong phòng trị bệnh thủy sản Kết quả nghiên cứu còn chiết được chất kháng khuẩn 2-hydroxy 6-pentadeca-trienylbenzoat từ các loài thảo dược trên và thí nghiệm trên tôm sú nuôi, ở nồng độ chất chiết 1-3 ppm có hiệu lực trị bệnh phát sáng, đen mang, vàng mang, đóng rong, hoại tử phụ bộ… và nồng độ 0,5-1 ppm thì

có tác dụng phòng bệnh do vi khuẩn, nấm và nguyên sinh động vật gây ra Bùi Quang Tề (2003) đã nghiên cứu thực nghiệm khả năng chống khuẩn của các thảo dược như tỏi, sài đất, nhọ nồi Chất tách chiết trên với hoạt chất 10% trộn vào thức

ăn phòng được bệnh xuất huyết, đốm trắng cho cá Tra (Bùi Quang Tề, 2006a) Tỏi

có tác dụng phòng trị bệnh đường ruột cho tôm sú (Bùi Quang Tề, 2006b) Theo

15

Nguyễn Mạnh Hùng (2008) dịch chiết từ cây Nemm (Azdirachta indica) có thể thay thế 50% kháng sinh trong sản xuất giống cua biển (Scylla paramamosain)

Gần đây nhất là nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu (2010) Đã sử dụng 30 loại

thảo dược thường dùng trong dân gian như: Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens), Bàng (Terminalia catappa), Ổi (Psidium guajava), Từ bi (Pluchea indica)…để thử hoạt tính kháng khuẩn trên 3 loại vi khuẩn E.ictaluri, E.tarda và Aeromonas hydrophila cho thấy các cây thuốc này đều có khả năng kháng khuẩn (MIC=16-

2048 µg/ml) Hoạt phổ mạnh trên cả 3 loại vi khuẩn là Bàng, Ổi, Trầu không, Tràm

(MIC=64-512 µg/ml) Tác động mạnh nhất trên E.ictaluri là Sâm đại hành (MIC=16 µg/ml), E.tarda là Rau mương (MIC=32 µg/ml), Aeromonas hydrophila là Bàng

(MIC=128 µg/ml)

2.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý cây Hoàng kỳ

Hình 2.4: Rễ và thân cây Hoàng kỳ (Nguồn http://www.yhoccotruyen.htmedsoft.com/)

Thành phần hóa học của cây hoàng kỳ

Theo Y học cổ truyền Việt Nam trong Hoàng kỳ có Cholin, Betain, nhiều loại Acid Amin và Sacarosa, Glucosa, tinh bột, chất nhầy, gôm, hơi có phản ứng Alcaloid Ngoài ra còn có nhiều loại Acid Amin, Protid (6,16- 9,9%), Cholin, Betain, Acid Folic, Vitamin P, Amylase, Palmatic acid, Linoleic acid, Linolenic acid, Coriolic acid

16

Theo Đỗ Tất Lợi (2004) cho rằng Hoàng kỳ (Astragalus membranaceus (Fish)

Bunge) là một cây sống lâu năm, cao 50-80 cm, rễ cái dài và mọc sâu, rất khó bẻ, đường kính 1-3 cm, vỏ ngoài màu vàng đỏ hay nâu và là bộ phận chính dùng làm thuốc Trong hoàng kỳ có cholin betain, nhiều axit amin và sacaroza Cho đến nay chúng ta vẫn phải nhập hoàng kỳ của Trung Quốc, mặc dù đã được trồng thử nghiệm trong nước cho kết quả tốt nhưng chưa đưa vào trồng phổ biến

Tác dụng dược lý của cây Hoàng kỳ

Theo Y học cổ truyền Việt Nam cho rằng Hoàng kỳ có tác dụng làm tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể bằng cách làm tăng chức năng thực bào của hệ thống tế bào lưới, ngoài ra còn có khả năng làm cho tế bào tương của lách súc vật tăng sinh, thức đẩy sự hình thành kháng thể và nâng cao tính miễn dịch thể dịch Bên cạnh đó còn thúc đẩy quá trình chuyển hóa trong cơ thể như chuyển hóa sinh lý tế bào bằng cách điều chỉnh cAMP và cGMP trong tế bào, thúc đẩy sự chuyển hóa protid của huyết thanh và gan

Theo Đỗ Tất Lợi (2004) Một số tác dụng dược lý của hoàng kỳ đã được ghi nhận: kéo dài chu kỳ động kinh của chuột bạch, tăng sự co bóp của tim, lợi tiểu, có

tác dụng như kháng sinh (đối với vi trùng lị Shiga) trong ống nghiệm

17

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

− Thời gian: 10/2009 – 12/2010

− Địa điểm: Khoa Thủy Sản – Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu

− Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm: Kính hiển vi, cân điện tử, lame, lamelle, ống đong, ống nhỏ giọt nhựa, pipet, ống chích, khẩu trang, găng tay, bình tam giác, chai chịu nhiệt, que cấy, đèn cồn, viết lông dầu, bình xịt cồn, bộ tiểu phẩu, đĩa petri, ống nghiệm, khay nhôm

− Bếp khuấy gia nhiệt, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh, tủ cấy, tủ ấm, nồi thanh trùng, máy chuẩn độ pH Các chỉ tiêu pH, Nhiệt độ, Oxy được đo bằng nhiệt kế và test kit

− Bể thí nghiệm: nhựa 250 lít, bể composit 2 m3

− Hóa chất: NaCl, Na2SO4, Na2HPO4.2H2O, NaH2PO4.2H2O, KH2PO4, Formaline (37%), Methyl violet, nước cất, Methanol, Glycerol, dung dịch Wright&Giemsa, Acid nitric, môi trường TSA, NB, cồn đốt, cồn 700C

− Nguồn cá tra thí nghiệm được mua từ trại cá giống ở Thành phố Cần Thơ

− Chiết xuất hoàng kỳ (40% polysaccharide) do hãng Xuancheng Baicao, Trung Quốc sản xuất

− Nguồn vi khuẩn E ictaluri CAF 258 từ bộ sưu tập vi khuẩn của Bộ môn Sinh

học và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn

Chủng vi khuẩn thí nghiệm được phục hồi trên môi trường TSA Sau 48 giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc và nhuộm gram kiểm tra tính thuần của chủng vi khuẩn được phân lập Sau đó nuôi tăng sinh trong môi trường BHI để chuẩn bị cho thí nghiệm xác định LD50 và thí nghiệm cảm nhiễm

18

3.3.2 Thí nghiệm xác định LD 50

Chuẩn bị thí nghiệm

Cá tra thí nghiệm có trọng lượng 20-25g sau khi mua về được nuôi dưỡng trong bể

có thể tích 1m3, có sục khí và cho ăn hằng ngày đến khi nào thấy cá ăn đều thì tiến hành thí nghiệm Trước khi bố trí thí nghiệm cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi khuẩn nhằm lựa chọn được cá khỏe

Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm

Vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong 200ml môi trường BHI và ủ qua đêm ở 28-300C trên máy lắc 180 vòng/phút Sau đó vi khuẩn được cho vào ống falcon tiệt trùng (50ml) và ly tâm 5.000 r.p.m trong 10 phút ở 4 0C để thu vi khuẩn Vi khuẩn được rửa qua nước muối sinh lý (0,9% NaCl) 3 lần và đếm mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610nm (OD=1±0,1≈109 CFU/ml) sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng 10 lần để được các mật độ cần thí nghiệm là 103, 104, 105,

106 Mật độ vi khuẩn cũng được xác định bằng cách nhỏ 20 µl (lặp lại 6 lần) dung dịch vi khuẩn đã điều chỉnh mật độ lên đĩa TSA và ủ 28-30 0C rồi đếm số khuẩn lạc trung bình sau 24-48 giờ

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức ở nồng độ 103, 104,

105, 106 và nghiệm thức đối chứng không tiêm vi khuẩn, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con cá/bể Cá được tiêm (0,1ml vi khuẩn/cá) tại gốc vi ngực Mật

độ vi khuẩn E ictaluri tiêm cho thí nghiệm là: 2,8x103

, 5,4x104, 5x105, 0,8x106 Sau khi tiêm, các biểu hiện của cá được theo dõi và ghi nhận số cá chết liên tục trong 14 ngày LD50 được xác định theo phương pháp của Reed và Muench (1938)

LD50= mức gây tỷ lệ nhiễm bệnh trên cá 50% thấp nhất- số nội suy (p.d)

p.d = (L%-50)(L%-H%) Trong đó:

L%: tỷ lệ cá nhiễm bệnh thấp nhất trên 50%

H%: tỷ lệ cá nhiễm bệnh cao nhất dưới 50%

3.3.3 Thí nghiệm cho ăn thảo dược

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại được thực hiện trong 5 tuần Trong đó nghiệm thức 1 (NT1) cho ăn thức ăn (TĂ) không bổ sung hoàng kỳ (HK), nghiệm thức 2 (NT2) cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ, nghiệm thức 3 (NT3) cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ nhưng

19

được tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3, nghiệm thức 4 (NT4) cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3, nghiệm thức 5 (NT5) cho ăn thức ăn không

bổ sung, nghiệm thức 6 (NT6) cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ

3.3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm sau khi cho ăn thảo dược 5 tuần

Sau 5 tuần cho ăn thảo dược tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri cho cá ở

các nghiệm thức 2, 3, 4 và 5, riêng nghiệm thức 6 thì tiêm NaCl

Vắc-xin được điều chế từ chủng E ictaluri độc lực cao bằng cách làm vở tế

bào vi khuẩn bằng formaline 4% trong 24 giờ Vắc-xin được tiêm với liều lượng 0,1ml/con, nồng độ 105.17 cfu/ml Thời gian hiệu ứng của Vắc-xin là 3 tuần Sau

đó gây cảm nhiễm cho cá bằng các chủng vi khuẩn E ictaluri có khả năng gây bệnh

thông qua kết quả thí nghiệm LD50 Sau khi tiêm các chủng vi khuẩn trên vào các

bể thí nghiệm trừ bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý thì theo dõi liên tục trong 1 tuần Để đánh giá chính xác khả năng bảo hộ của vắc-xin, trước khi thí nghiệm kết thúc thì tiến hành tái phân lập các cá còn sống nhằm xác định sự tấn công của các

chủng vi khuẩn đã công cường độc (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2002) Các chỉ

tiêu ghi nhận bao gồm: (1) dấu hiệu bệnh mủ gan của cá; (2) số cá chết và thời gian chết

3.3.3 Xác định hiệu quả của chiết xuất thảo dược lên sự đề kháng bệnh mủ gan trên cá tra qua các chỉ tiêu

Cá từ các nghiệm thức thí nghiệm được thu và lấy máu để nghiên cứu các chỉ tiêu đánh giá khả năng miễn dịch của cá

Phương pháp nhuộm mẫu máu

Dùng ống tiêm 1ml lấy máu ở mạch máu phần đuôi cá Cho 1 giọt máu lên lame và trãi điều mẫu, để khô tự nhiên trong không khí Cố định mẫu bằng methanol Tiến

20

hành nhuộm mẫu theo phương pháp của Humason (1979) trích dẫn bởi Rowley (1993) Cho lame mẫu vào dung dịch Wright trong 3-5 phút Chuyển mẫu sang dung dịch pH 6.2-6.8 từ 5-6 phút Sau đó cho vào dung dịch Giemsa trong 20-30 phút Tiếp tục cho mẫu vào dung dịch pH 6.2 trong 15-30 phút Rửa sạch lại bằng nước cất, để khô tự nhiên và đọc kết quả dưới kính hiển vi

Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu (Hrubec et al, 2000)

Quan sát lame mẫu dưới kính hiển vi ở vật kính 100x có giọt dầu.Sau khi nhuộm bạch cầu ta tiến hành đếm trên mỗi lam đếm 1500 tế bào theo hình zichzac

Tổng tế bào bạch cầu (TBC) được xác định bằng cách đếm tổng số 1500 tế bào hồng cầu và bạch cầu trên lame mẫu

(Số bạch cầu x mật độ tế bào hồng cầu)

TBC (tb/mm3) =

Số hồng cầu trên lame mẫu

Đếm 200 tế bào bạch cầu nhằm xác định mật độ từng loại bạch cầu

Số lượng mỗi loại bạch cầu x TBC

Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm3) =

200

3.3.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng lysozyme trong huyết thanh

Hàm lượng lysozyme trong huyết thanh được xác định theo phương pháp của Ellis (1990) trích dẫn bởi Doan Nhat Phuong (2007) như sau:

- Dung dịch Micrococcus lysodeikticus được chuẩn bị bằng cách cho 75 mg vi khuẩn Micrococcus lysodeikticus (R3770, sigma) vào 100ml phosphate buffer saline

5 µg/ml Kế đến lấy 0,5 ml dung dịch lysozyme nồng độ 5 µg/ml vào 0,5 ml PBS được dung dịch lysozyme nồng độ 2,5µg/ml Tiếp tục lấy 100µl dung dịch lysozyme nồng độ 10µg/ml vào 0.9ml PBS được dung dịch lysozyme nồng độ 1µg/ml Tiếp tục lấy 0,5ml dung dịch lysozyme nồng độ 1µg/ml vào 0,5ml PBS

Micrococcus lysodeikticus vào 3 giếng còn lại Sau khi cho mẫu vào đĩa 96 giếng

thì lắc đều, đọc nhanh ở bước sóng 530 nm bằng máy microplate reader Sau khi đo xong để 5 phút, lắc đều lại và đo lập lại 1 lần nữa Hoạt tính của của lysozyme trong mẫu huyết thanh được xác định từ đường cong chuẩn trên

3.3.3.3 Xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh

Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh được xác định theo phương pháp của Secombes (1990)

Phương pháp: Sau khi đĩa vi khuẩn đã được thuần, chọn 1 khuẩn lạc nuôi tăng sinh

trong môi trường NB trong 48h ở 280C Tiến hành pha loãng vi khuẩn đến mật độ

104 cfu/ml Sau đó pha loãng huyết thanh 10 lần trong nước muối sinh lý Lần lược cho 100 µl dung dịch NB vào tất cả các giếng, tiếp theo cho 100 µl dung dịch huyết thanh vào các giếng trừ giếng control và blank thì cho NB (TSB), tiếp tục cho 30 µl

vi khuẩn vào các giếng trừ giếng blank thì cho NB (TSB) và ủ qua đêm ở 280C Sau

đó cho 10 µl MTT (5 mg/ml nước cất) vào các giếng, lắc trong 15 giây thì đo ở bước sóng 600 nm

Đọc kết quả: Phần trăm vi khuẩn sống sót được tính bằng công thức sau

PSA = ((ODSample - ODblank)/(ODcontrol - ODblank))x100

OD là kết quả đọc ở bước sóng 600 nm

3.4 Quản lý hệ thống thí nghiệm

- Thí nghiệm được bố trí trong xô nhựa 250 lít, mỗi xô nhựa thả 30 con Hàng ngày kiểm tra hệ thống, ghi nhận dấu hiệu bệnh lý, số cá chết

- Thức ăn sử dụng cho cá là thức ăn công nghiệp chứa 28% đạm chuyên dùng cho

cá Tra giống của công ty Proconco Cần Thơ

- Cá được cho ăn theo nhu cầu (khoảng 3 lần/ngày) bằng thức ăn dạng viên với chế độ dinh dưỡng có chứa Hoàng kỳ (0,5%) trong 5 tuần Đối với cá đối chứng

- Mỗi con cá được lấy máu 1 lần để tránh ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm do chảy nhiều máu và ảnh hưởng bởi stress

3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả được trình bày như sau: trung bình của 5 con cá (± sai số tiêu chuẩn), và được so sánh ở mỗi thời điểm bằng cách sử dụng bảng ANOVA một chiều và kiểm định Duncan của nhiều chiều (SPSS 13) Có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các thí nghiệm ở mức ý nghĩa 95% Tỷ lệ chết (thu được ở phần cuối của thí nghiệm) trong mỗi nhóm điều trị đã được thống kê so với nhóm kiểm soát bằng cách sử dụng kiểm định Chi-square (SPSS 13) Sự khác biệt giữa nhóm kiểm soát và nhóm điều trị ở một mức độ đáng kể P <0,001 và P <0,05

23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của chiết xuất từ cây Hoàng Kỳ lên các chỉ tiêu huyết học của

cá tra

4.1.1 Hồng cầu

Kết quả (Hình 4.1) cho thấy sau 5 tuần thí nghiệm số lượng hồng cầu trung bình giữa các nghiệm thức dao động từ 1,40 x 106 tế bào/ml đến 2,02 x 106 tế bào/ml và khác biệt có ý nghĩa thống kê (P< 0,05) giữa các nghiệm thức thí nghiệm

Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu của các nghiệm thức thí nghiệm sau 5 tuần NT1: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ NT2: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ NT3: Cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3 NT4: Cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng kỳ và tiêm vắc-xin ở tuần thứ 3 (*) Thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Kết quả phân tích cho thấy sau hai tuần đầu của thí nghiệm số lượng hồng cầu của

cá ở NT2 và NT4 cao hơn ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với NT1 và NT3 Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Trần Thị Yến Nhi và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) khi so sánh số lượng hồng cầu giữa cá tra cho ăn thức ăn có bổ sung hoàng

24

kỳ và cá cho ăn thức ăn không bổ sung hoàng kỳ cho thấy số lượng hồng cầu ở cá

có bổ sung hoàng kỳ cao hơn cá không bổ sung hoàng kỳ và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Sau khi tiêm vắc-xin cho NT3 và NT4 ở tuần thứ 3 thì số lượng hồng cầu của

cá ở các nghiệm thức này đều tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với tuần 1 và 2 Sau 5 tuần cho ăn thì số lựơng hồng cầu ở NT4 là cao nhất, kế đến là NT2, NT3 và thấp nhất là NT1 Sự khác biệt giữa NT2 và NT1 là có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên giữa NT2 và NT3 là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Còn sự khác biệt giữa NT4 đối với NT2 và NT3 là có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Điều này cho thấy khi bổ sung hoàng kỳ vào khẩu phần thức ăn đã làm tăng số lượng hồng cầu, giúp vận chuyển và phân phối oxy đến các mô tốt hơn Tóm lại số lượng hồng cầu tăng đều qua các tuần và khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nghiệm thức có bổ sung hoàng kỳ và không bổ sung hoàng kỳ

Theo Jeney et al (2002) khi bổ sung vitamin U với hàm lượng 100 ppm vào

thức ăn cho cá tầm lai trong 4 tuần làm gia tăng hoạt động thực bào và gia tăng tuần hoàn của bạch cầu so với nhóm cá không bổ sung vitamin U, tuy nhiên khi bổ sung vitamin C vào thức ăn cho cá tầm lai thì số lượng hồng cầu và bạch cầu lại thấp hơn nhóm đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê

Theo nghiên cứu của Yin et al (2008) khi nuôi cá chép kết hợp tiêm vắc-xin

và cho ăn hoàng kỳ và nấm linh chi (Astragalus và Ganoderma) làm kích thích hoạt

động hô hấp, sự thực bào của bạch cầu trong máu Ngoài ra trên cá Rô phi

(Oreochromis niloticus) khi cho ăn hai loại thảo dược là Hoàng kỳ (Astragalus membranaceus) và Kim ngân (Lonicera japonica) với hàm lượng 0,1% trong 4 tuần

Kết quả cho thấy hệ miễn dịch của cá được tăng cường Hoạt động của đại thực bào,

hô hấp của tế bào máu được tăng cường và tỷ lệ sống tăng lên (Ardó et al., 2008)

Qua đó cho thấy mặc dù loài cá có khác nhau nhưng khi bổ sung hoàng kỳ vào khẩu phần thức ăn đều làm tăng cường hoạt động của các tế bào máu dẫn đến số lượng hồng cầu tăng và khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức (p<0,05)

4.1.2 Bạch cầu

Kết quả định lượng và định loại bạch cầu cho thấy có 4 loại bạch cầu gồm: Tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Hình 4.2) Số lượng tổng bạch cầu, tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu