đánh giá khả năng cải thiện chất lượng nước của nhóm vi khuẩn chuyển hóa đạm trong hệ thống ương tôm sú (penaeus monodon)

TÓM TẮT Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn hữu ích chọn lọc Bacillus, Nitrosomonas và Nitrobacter trong việc cải thiện chất lượng nước bằng cách áp dụng những dòng vi kh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ TÚ ANH

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CẢI THIỆN CHẤT LƯỢNG

NƯỚC CỦA NHÓM VI KHUẨN CHUYỂN HÓA ĐẠM

TRONG HỆ THỐNG ƯƠNG TÔM SÚ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ TÚ ANH

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CẢI THIỆN CHẤT LƯỢNG

NƯỚC CỦA NHÓM VI KHUẨN CHUYỂN HÓA ĐẠM

TRONG HỆ THỐNG ƯƠNG TÔM SÚ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs.Ts TRƯƠNG QUỐC PHÚ

2010

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thuỷ Sản, Quý Thầy Cô và toàn thể cán bộ Khoa Thuỷ Sản đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Đặc biệt tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy hướng dẫn, PGs Ts Trương Quốc Phú đã tận tình hướng dẫn, góp ý cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin gởi lời cảm ơn đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã có nhiều góp ý, cung cấp thông tin, tài liệu và hướng dẫn bố trí các thí nghiệm Cám ơn các bạn và các

em Trịnh Hoàn Hảo, Nguyễn Trường An, Lê Đông Cung, Trương Minh Trường, Nguyễn Hoàng Trong, Lâm Trung Tín, Nguyễn Thanh Tâm, Nguyễn Minh Nguyệt, Đỗ Văn Lĩnh đã nhiệt tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm

Tập thể lớp Cao học Nuôi trồng thủy sản khóa 15 đã hỗ trợ, giúp đỡ nhiều mặt trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, chia sẻ, giúp tôi vượt qua những khó khăn, trở ngại trong suốt quá trình học tập và công tác

Nguyễn Thị Tú Anh

TÓM TẮT

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn hữu ích chọn lọc

Bacillus, Nitrosomonas và Nitrobacter trong việc cải thiện chất lượng nước bằng

cách áp dụng những dòng vi khuẩn hữu ích ở các mật độ khác nhau và tỷ lệ thể tích bể lọc khác nhau Trong nghiên cứu này, 3 thí nghiệm về hiệu quả chuyển hóa đạm của các dòng vi khuẩn chọn lọc được thực hiện Thí nghiệm 1 ương tôm trong hệ thống tuần hoàn và thí nghiệm 2 trong hệ thống thay nước, thí nghiệm 3 được thực hiện trong hệ thống tuần hoàn với các tỷ lệ thể tích bể lọc lần lượt là 5%, 10%, 15%

Kết quả của 2 thí nghiệm đầu cho thấy chất lượng nước được cải thiện có ý

nghĩa thống kê khi bổ sung vi khuẩn Bacillus, Nitrosomonas và Nitrobacter Nghiệm thức bổ sung Bacillus ở mật độ 105 và 106 CFU/mL cho thấy kết quả mật

độ của vi khuẩn có hại thấp hơn so và tỷ lệ sống của ấu trùng tôm cao hơn so với nghiệm thức đối chứng Tỷ lệ sống của ấu trùng trong hệ thống tuần hoàn cao hơn trong hệ thống thay nước

Trong thí nghiệm 3, mật độ vi khuẩn Vibrio ở các nghiệm thức có bổ sung

vi khuẩn thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng Tỷ lệ thể tích bể lọc 10%, bổ sung vi khuẩn cho thấy hiệu quả chuyển hóa đạm cao nhưng lại ít tốn diện tích và chi phí

Từ khóa: Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, chuyển hóa đạm, ấu trùng

ABSTRACT

This study evaluates the effectiveness of the bacterial probionts Bacillus,

Nitrosomonas, and Nitrobacter on the improvement of water quality by the

application of these probionts at different densities and filtering rates In the present study, three experiments on probiont nitrification efficiency were conducted, the first in a recirculation water system and the second in an exchange water system, the third experimental groups of this system were subjected to the respective water filtration rates of 5%, 10%, and 15%

The results of the first two experiments demonstrate that water quality was

significantly improved by the addition of Bacillus, Nitrosomonas, and

Nitrobacter Treatments of Bacillus at the concentrations 105 CFU mL-1 and 106CFU mL-1 resulted in a lower density of virulence bacteria and higher survival rates than the control The survival rates of shrimp that were reared in the recirculation water system were higher than those in exchange water system

For experiment 3, the density of Vibrio in additional bacteria treatments

was significantly lower than control The results from this experiment suggest that 10% biofilter rate and bacteria addition show the nitrogen removal rate higher , filtering-area and cost -effective are fewer

Keywords: Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter, nitrification, larvae

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Ngày 31 tháng 10 năm 2010

Nguyễn Thị Tú Anh

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1 GIỚI THIỆU 1

PHẦN 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình sản xuất giống tôm sú và các nghiên cứu có liên quan 3

2.1.1 Tình hình sản xuất giống tôm sú ở Việt Nam 3

2.1.2 Các nghiên cứu liên quan đến sản xuất giống tôm sú 3

2.1.3 Các nghiên cứu ứng dụng lọc sinh học trong sản xuất giống tôm sú 3

2.2 Tình hình nghiên cứu và ưng dụng của vi sinh vật hữu ích trong nuôi trồng thủy sản 5

2.2.1 Sơ lược về Probiotic 5

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản 6

2.3 Các dòng vi khuẩn chuyển hóa đạm 8

2.3.1 Vai trò của các dòng vi khuẩn chuyển hóa đạm trong NTTS 8

2.3.2 Các dòng vi khuẩn chuyển hóa đạm thường gặp 10

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Vật liệu nghiên cứu 13

3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

3.2.1 Mô tả thí nghiệm 13

3.2.2 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn 17

3.2.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu vi khuẩn 20

3.2.4 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước 22

3.2.5 Phương pháp thu và phân tích mẫu tôm 22

3.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Xác định khả năng chuyển hóa đạm của 3 dòng vi khuẩn khuẩn Bacillus,

4.1.1 Biến động các yếu tố môi trường nước 23

4.1.2 Biến động mật độ vi khuẩn trong hệ thống ương 37

4.1.3 Tỷ lệ sống của các giai đoạn ấu trùng 44

4.2 Đánh giá hiệu quả xử lý của các tỷ lệ giá thể khác nhau trong hệ thống lọc tuần hoàn 46

4.2.1 Biến động các yếu tố môi trường nước 46

4.2.2 Biến động mật độ vi khuẩn 51

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 62

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Giá trị OD600 17

Bảng 4.1: Biến động các yếu tố môi trường trong thí nghiệm 1 23

Bảng 4.2: Biến động các yếu tố môi trường trong thí nghiệm 2 24

Bảng 4.3: Biến động các yếu tố môi trường trong thí nghiệm 3 46

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1: Chu trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 9

Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm với tỷ lệ thể tích bể lọc khác nhau 16

Hình 3.2: Cách xác định mật độ vi khuẩn theo phương pháp MPN 21

Hình 4.1: Biến động hàm lượng oxy hòa tan trong hệ thống tuần hoàn 24

Hình 4.2: Biến động hàm lượng oxy hòa tan trong hệ thống thay nước 25

Hình 4.3: Biến động hàm lượng COD trong hệ thống tuần hoàn 26

Hình 4.4: Biến động hàm lượng COD trong hệ thống thay nước 27

Hình 4.5: Biến động hàm lượng TSS trong hệ thống tuần hoàn 28

Hình 4.6: Biến động hàm lượng TSS trong hệ thống thay nước 28

Hình 4.7: Biến động hàm lượng TAN trong hệ thống tuần hoàn 29

Hình 4.8: Biến động hàm lượng TAN trong hệ thống thay nước 29

Hình 4.9: Biến động hàm lượng nitrite trong hệ thống tuần hoàn 31

Hình 4.10: Biến động hàm lượng nitrite trong hệ thống thay nước 32

Hình 4.11: Biến động hàm lượng nitrate trong hệ thống tuần hoàn 33

Hình 4.12: Biến động hàm lượng nitrate trong hệ thống thay nước 33

Hình 4.13: Biến động hàm lượng tổng đạm trong hệ thống tuần hoàn 34

Hình 4.14: Biến động hàm lượng tổng đạm trong hệ thống thay nước 35

Hình 4.15: Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong hệ thống tuần hoàn 36

Hình 4.16: Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong hệ thống thay nước 37

Hình 4.17: Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong hệ thống tuần hoàn 38

Hình 4.18: Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong hệ thống thay nước 39

Hình 4.19: Biến động mật độ vi khuẩn Ntrosomonas trong hệ thống tuần hoàn 40

Hình 4.20: Biến động mật độ vi khuẩn Nitrosomonas trong hệ thống thay nước 40

Hình 4.21: Biến động mật độ vi khuẩn Nitrobacter trong hệ thống tuần hoàn 42

Hình 4.22: Biến động mật độ vi khuẩn Nitrobacter trong hệ thống thay nước 42

Hình 4.23: Tỷ lệ sống các giai đoạn ấu trùng trong hệ thống tuần hoàn 43

Hình 4.24: Tỷ lệ sống các giai đoạn ấu trùng trong hệ thống tuần thay nước 44

Hình 4.25: Biến động hàm lượng oxy hòa tan trong thí nghiệm 46

Hình 4.26: Biến động hàm lượng COD trong thí nghiệm .47

Hình 4.27: Biến động hàm lượng TAN trong thí nghiệm 48

Hình 4.28: Biến động hàm lượng nitrite trong thí nghiệm 49

Hình 4.29: Biến động hàm lượng nitrate trong thí nghiệm 49

Hình 4.30: Biến động mật độ vi khuẩn Vibrio trong thí nghiệm 50

Hình 4.31: Biến động mật độ vi khuẩn Bacillus trong thí nghiệm 51

Hình 4.32: Biến động mật độ vi khuẩn Nitrosomonas trong thí nghiệm 51

Hình 4.33: Biến động mật độ vi khuẩn Nitrobacter trong thí nghiệm 52

CFU: Colony forming units

AOB: Ammonia oxidizing bacteria

NOB: Nitrite oxidizing bacteria

MPN: Most probable number

OD: Optical density

PL: Post larvae

ppm: Parts per million

Phần I GIỚI THIỆU

Những năm qua nghề nuôi tôm sú ở nước ta phát triển rất mạnh không những về qui mô mà còn ở sự đa dạng hóa các mô hình nuôi, khi diện tích nuôi ngày càng mở rộng thì người nuôi phải đối đầu với trở ngại mới, đó là ô nhiễm môi trường và dịch bệnh Sự phát triển ồ ạt của nghề nuôi tôm ven biển dẫn đến

sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, gây thiệt hại không nhỏ cho người dân cũng như các ngành kinh tế liên quan Việc nâng cao mức độ an toàn cho các trang trại nuôi thông qua sự phát triển các mô hình nuôi tôm khép kín đã và đang được khuyến khích áp dụng ở nhiều nơi trên thế giới cũng như ở Việt Nam Do đó, việc

xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học và tái sử dụng nguồn nước đóng một vai trò quyết định nhằm giảm lượng hóa chất và thuốc kháng sinh sử dụng trong quá trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm, tạo ra sản phẩm sạch đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm (Bùi Đắc Thuyết, 2004) Theo nghiên cứu của Đặng Đình

Kim và ctv (2006) thì khi bổ sung chế phẩm sinh học vào ao nuôi, các chỉ tiêu lý,

hóa, sinh được cải thiện rất rõ

Trong lĩnh vực sản xuất giống, để có được nguồn nước đáp ứng được yêu cầu trong sản xuất giống, người ta dùng các loại hóa chất như: Chlorine, thuốc tím để xử lý, tuy nhiên việc sử dụng hóa chất xử lý nước sẽ không tránh khỏi tình trạng ô nhiễm môi trường, hơn nữa việc sử dụng hóa chất sẽ làm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong môi trường nước Vì vậy, xu hướng hiện nay nhiều nơi sử dụng các vi sinh vật hữu ích nhằm cải thiện chất lượng nước và hạn chế được các nhóm vi khuẩn gây bệnh trong hệ thống ương nuôi Trong sản xuất giống tôm sú, việc ứng dụng hệ thống lọc sinh học sẽ hạn chế sử dụng kháng sinh trong bể và hạn chế việc thay nước hàng ngày, giảm hiện tượng sốc môi trường và khống chế

được một số vi khuẩn gây bệnh (Thạch Thanh và ctv, 1999)

Trên thị trường đã xuất hiện rất nhiều chế phẩm sinh học với thành phần

chủ yếu là các dòng vi khuẩn như: Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus,

Nitrosomonas, Nitrobacter , các dòng vi khuẩn này có khả năng phân giải

protein thành các polypeptit, axit amin, NH3 (Tăng Thị Chính và Đặng Đình Kim, 2007) Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về sự tồn tại cũng như hiệu quả của các dòng vi khuẩn được đưa vào trong hệ thống lọc sinh học, đặc

biệt là nhóm vi khuẩn Bacillus, Nitrobacter, Nitrosomonas chuyển hóa nitơ từ

dạng có hại cho sinh vật nuôi (NH3, NO2

-) thành dạng ít độc hơn (NO3

-) (Vũ Thế

Trụ, 1994) Do đó, đề tài: “Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng nước của

nhóm vi khuẩn chuyển hóa đạm trong hệ thống ương tôm sú (Penaeus

monodon)” được thực hiện

Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng phân hủy hữu cơ và chuyển hóa đạm của các dòng vi

khuẩn Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter trong hệ thống ương tôm sú nhằm

làm cơ sở cho các nghiên cứu về quản lý và điều khiển vi sinh phát triển theo hướng có lợi cho môi trường và vật nuôi

Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá hiệu quả xử lý nước của vi khuẩn trong hệ thống ương tôm sú tuần hoàn

- Đánh giá hiệu quả xử lý nước của vi khuẩn trong hệ thống ương tôm sú

có thay nước

- Đánh giá hiệu quả xử lý ở các tỷ lệ thể tích giá thể khác nhau trong hệ thống lọc tuần hoàn

Phần II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình sản xuất giống tôm sú và các nghiên cứu có liên quan

2.1.1 Tình hình sản xuất giống tôm sú ở Việt Nam

Công nghệ sản xuất giống tôm nhân tạo ở nước ta đã có những bước tiến

bộ vượt bậc Từ những năm đầu thập niên 70, Việt Nam đã sản xuất giống nhân tạo thành công ở một số loài tôm biển, tuy nhiên việc ương nuôi gặp nhiều khó khăn Đến thập niên 80, kỹ thuật sản xuất nhân tạo giống tôm sú du nhập từ Đài Loan, Thái Lan, Nhật Bản được cải tiến và áp dụng thành công tại Việt Nam (Bộ Thủy Sản, 2000)

Miền Trung là nơi sớm nhất phát triển sản xuất giống tôm sú nhân tạo, trong đó nổi bật nhất là tỉnh Khánh Hòa Từ đây, công nghệ sản xuất giống tôm

sú được chuyển giao cho các tỉnh lân cận và các tỉnh phía Nam

Đến năm 1990, cả nước có 500 trại sản xuất giống, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền trung, năng suất đạt khoảng 1 – 5 triệu PL/năm Năm 1994 cả nước sản xuất được khoảng 1,4 tỷ tôm PL15 (Bộ Thủy Sản, 2000) Đến năm 1998, số trại sản xuất tôm giống tăng lên 2.086 trại và sản xuất được 6,6 tỷ tôm PL15 Tính đến năm 2003, cả nước có 5.094 trại tôm giống với sản lượng đạt 25,9 tỷ con giống cho nghề nuôi tôm (Bộ Thủy Sản, 2005) Trong đó, số lượng trại tôm giống

ở Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng phát triển nhanh chóng, đáp ứng 31,9% nhu cầu tôm giống cho toàn vùng (Lê Xuân Sinh, 2004)

2.1.2 Các nghiên cứu liên quan đến sản xuất giống tôm sú

Thạch Thanh và ctv (2004) nghiên cứu sử dụng nước biển nhân tạo trong

sản xuất giống tôm sú thay một phần hoặc hoàn toàn cho nước biển và nước ót, tuy nhiên nguồn nước này hiện vẫn chưa được ứng dụng nhiều

Các nghiên cứu gần đây đã nghiên cứu ứng dụng ozone để xử lý nước và

vi khuẩn có hại trong bể ương ấu trùng tôm sú Nghiên cứu của Trần Thị Kiều

Trang và ctv (2006) đã đưa ra các nồng độ xử lý ozone thích hợp cho từng giai

đoạn ấu trùng và hậu ấu trùng, tiếp theo là nghiên cứu của Tạ Văn Phương (2006)

(Ở nồng độ 0,37 ppm làm kết tủa hoàn toàn sắt, ngăn chặn sự sự tích lũy hữu cơ (30%), làm giảm 67% lượng H2S có trong nước và nitrate hóa hoàn toàn nitrite, nồng độ 0,045 ppm có thể làm giảm mật độ tổng vi khuẩn 91,7% và 81% vi

khuẩn Vibrio) Kết quả cho thấy tỷ lệ sống của ấu trùng là rất tốt khi ương ở hệ

thống có xử lý ozone với nồng độ thay đổi theo từng giai đoạn (Nguyễn Lê Hoàng Yến, 2008), ngoài ra sử dụng ozone để rửa trứng còn ngăn chặn sự lây lan bệnh đốm trắng từ tôm mẹ sang tôm con (Tăng Minh Khoa, 2008) Những nghiên cứu này góp phần hạn chế việc sử dụng các loại hóa chất, kháng sinh trong quá trình ương tôm giống, giúp nâng cao năng suất chất lượng tôm sú giống và góp phần trong việc quản lý dịch bệnh xảy ra trên tôm giống

Ngoài vấn đề nguồn nước thì nguồn tôm bố mẹ cũng đang rất được quan tâm Hiện nay, nguồn tôm bố mẹ ngoài tự nhiên ngày càng cạn kiệt và dễ nhiễm

bệnh Nghiên cứu của Nguyễn Văn Chung và ctv (1997) đã cho tôm bố mẹ từ

nguồn tôm trong ao đìa sinh sản thành công, kết quả này đã góp phần giải quyết vấn đề khan hiếm tôm bố mẹ và góp phần chủ động nguồn tôm nuôi

Bên cạnh đó, việc gia hóa tôm bố mẹ được nghiên cứu và đưa vào sử dụng, tuy sức sinh sản, tỷ lệ thành thục, tỷ lệ nở,…không hiệu quả bằng tôm tự nhiên nhưng có thể được sử dụng để thay thế khi nguồn tôm ngoài tự nhiên khan hiếm và mang nhiều mầm bệnh nguy hiểm (Nguyễn Thanh Phương, 2005)

2.1.3 Các nghiên cứu ứng dụng lọc sinh học trong sản xuất giống

Nghiên cứu ứng dụng lọc sinh học vào sản xuất giống tôm sú của Thạch

Thanh và ctv (1999) đã góp phần nâng cao kỹ thuật sản xuất giống tôm sú, với

phương pháp này giúp hạn chế thay nước và sử dụng nước ót nên có thể ứng dụng cho sản xuất giống tôm sú trong nội địa

Một nghiên cứu khác cho thấy, nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Nitrosomonas,

Nitrobacter) khi cấy vào bể lọc sinh học với giá thể là CaCO3 và hệ thống này nối với các bể nuôi rotifer đã giúp mật độ rotifer tăng lên đến 5.500 cá thể/mL, cao hơn 1,5 – 2,5 lần so với nghiệm thức đối chứng, hơn nữa chất lượng nước trong

các bể nuôi cũng được cải thiện (Belgium et al., 1999)

Nghiên cứu của Grommen et al (2001) cho thấy khi bổ sung 2 nhóm vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter vào hệ thống lọc sinh học đã giúp rút ngắn

thời gian vận hành các bể lọc xuống còn 40 ngày so với các nghiên cứu trước đó cần khoảng 60 ngày ở điều kiện 21 – 260C

Theo Nguyễn Tiến Cư và ctv (2004) nghiên cứu các loại chất mang khác

nhau cho lọc sinh học thì cho hiệu quả xử lí amon trung bình khác nhau: lô nhựa đạt 47,77%; sỏi nhẹ đạt 75,25%, san hô đạt 70,75% Kết quả thử nghiệm cho thấy

sử dụng sỏi nhẹ làm vật liệu cố định vi sinh vật trong hệ lọc có triển vọng nhất

Hệ lọc sinh học với cột lọc tầng sôi và cột lọc nhỏ giọt cải tiến sử dụng sỏi nhẹ đã thực hiện quá trình nitrate hóa NO2

-, NO3 -

cao, hàm lượng NO2

trong môi trường nước ở mức 0,1-0,79 mg/L; NO3

-ở mức 0,61-21,2 mg/L

Bower và Turner (1981 và 1984) trích dẫn bởi Thạch Thanh và ctv, 2004

đã nghiên cứu và nhận thấy nếu sử dụng vật liệu lọc cũ (đã sử dụng trước đó) cho lọc mới thì có ý nghĩa rút ngắn thời gian chuẩn bị lọc (cấy vi khuẩn) Nếu thêm vào 10% vật liệu lọc ngầm của hệ thống lọc ngầm cũ trong môi trường nước mặn thì rút ngắn được 81% thời gian cấy vi khuẩn (4 ngày so với 21 ngày) cho quá

trình sử dụng ammonia của vi khuẩn Nitrosomonas và 89% (4 ngày so với 37 ngày) cho sự phát triển của vi khuẩn Nitrobacter

Theo Nguyễn Tiến Cư và ctv (2004) Nitrosomonas và Nitrobacter đã giúp

xử lý nước thải trong hệ thống nuôi tôm sú tuần hoàn, hàm lượng ammonia bị oxy hóa khoảng 85 – 98%

Khi so sánh tỉ lệ sống của tôm ở giai đoạn postlarvae 15 cho thấy ở nghiệm thức nước tuần hoàn là 55,2% cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với nghiệm thức thay nước chỉ đạt 43,8% (Châu Tài Tảo, 2005)

2.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của vi sinh vật hữu ích trong nuôi trồng thủy sản

2.2.1 Sơ lược về Probiotic

Vào năm 1965, thuật ngữ “Probiotic” đã được biết đến lần đầu tiên do Lilley và Stilluell đề nghị như là “Những chất do một vài sinh vật sản sinh ra, có khả năng kích thích sự tăng trưởng của một loài khác” (Trần Công Bình và Trương Trọng Nghĩa, 2002)

Sau đó Fuller (1989) đã định nghĩa “Probiotic là các sinh vật sống, được cho vào thức ăn, có ảnh hưởng tốt với ký chủ bằng cách cải thiện hệ vi sinh đường ruột

Đến năm 2000, Verchuere et al đưa ra một định nghĩa được coi là hoàn

chỉnh nhất về probiotics trong nuôi trồng thủy sản “Probiotic là thành phần bổ

cách cải thiện quần thể vi sinh vật sống xung quanh hay liên kết với vật chủ; tăng khả năng sử dụng thức ăn hay chất dinh dưỡng của thức ăn; tăng cường khả năng chống lại mầm bệnh hay cải thiện chất lượng môi trường sống xung quanh vật chủ”

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản

Theo Grommen et al (2005) quần thể vi sinh vật trong các thủy vực nuôi

thủy sản nước mặn rất đa dạng, bao gồm một số loài gây bệnh, một số loài không gây bệnh và một số loài có lợi cho vật nuôi, khả năng duy trì sự cân bằng thích hợp của hệ vi sinh này là chìa khoá thành công trong việc quản lý môi trường nuôi thủy sản

Dựa vào vai trò và chức năng của chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản hiện nay có thể chia chúng làm 3 loại: (1) các vi sinh vật thường được trộn vào thức ăn hoặc cho Artemia, rotifer ăn trước khi cho các loại động vật nuôi ăn để giúp hỗ trợ tiêu hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng, gồm có các

nhóm Bacillus, Lactobacillus, Saccharomyces; (2) gồm các vi sinh vật có tính đối kháng hoặc cạnh tranh thức ăn với vi sinh vật gây bệnh như Bacillus

licheniformic, Bacillus sp., Vibrio alginolyticus; (3) nhóm này gồm các vi sinh

vật cải tạo môi trường nước như Nitrosomonas, Nitrobacter, Actinomyces,

Bacillus, Rhodosp.irillum, Rhodopseudomonas viridis, R palutris, Rhodomicrobium vanniell, các loại nấm Asp.ergillus oryzae, A niger, Rhizopus

sp Tuy nhiên, có nhiều chủng vi sinh vật thực hiện được nhiều chức năng khác nhau nên ranh giới giữa các nhóm này đôi khi không rõ ràng (Nguyễn Hữu Phúc, 2003)

Yasuda và Taga (1980) công bố sử dụng vi khuẩn như nguồn thức ăn và là nhân tố sinh học trong phòng trị bệnh cá Nghiên cứu của Austin (1995) cho thấy

sử dụng probiotic (chủ yếu là Vibrio alginolyticus) trên cá Hồi có thể làm giảm bệnh gây ra bởi Aeromonas salmonicids, Vibrio anguillarium, Vibrio ordalii

Baticados et al (1990) đã cảnh báo vi khuẩn phát sáng Vibrio harveyi gây

thiệt hại nghiêm trọng cho tôm sú Để giải quyết vấn đề này các chủ trại nuôi thường sử dụng các chất hoá học và kháng sinh Sự lạm dụng thuốc kháng sinh có thể dẫn đến sự kháng thuốc của những dòng vi khuẩn này (Weston, 1996)

Năm 1995, Griffith (trích dẫn bởi Nguyễn Hữu Phúc, 2003) cho thấy rằng việc đưa probiotic vào ương tôm giống ở Ecuador trong năm 1992 mà sản lượng tôm giống tăng 35% và giảm sử dụng các chất diệt khuẩn đến 94%

Theo Zhermant et al (1997) (trích dẫn bởi Nguyễn Hữu Phúc, 2003) khi nuôi chủng vi khuẩn probiotic trong bể với ấu trùng tôm Litopenaeus vannamei

với mật độ 103 tế bào/mL thì đã ngăn cản được sự xâm nhiễm các vi khuẩn gây bệnh ngay ở nồng độ 107 tế bào/mL Việc sử dụng probiotic thường xuyên giúp

tăng sức đề kháng cho tôm và như một chất thay thế kháng sinh (Rengpipat et al.,

1998)

Nghiên cứu của Vaseeharan et al (2004), probiotic giúp kháng được vi khuẩn Listonella anguillarium xuất hiện trong nước, bùn đáy ao nuôi và trong các

cơ quan của tôm sú Tác giả này cho rằng các sản phẩm bài tiết của Bacillus trong

thức ăn và ruột tôm giúp tăng cường sự sinh trưởng và nâng cao tỷ lệ sống của tôm sú

Các dòng vi khuẩn như Vibrio, Pseudomonas, Bacillus và một số dòng

Lactobacillus đã được kiểm chứng và được xem như những dòng vi sinh hữu ích

trên các đối tượng tôm, cua, nhuyễn thể và cá kết quả thí nghiệm cho thấy tỉ lệ

hao hụt giảm có ý nghĩa trong suốt quá trình ương (Bruno et al., 2000)

Hoạt động của vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng nước chủ yếu là sử dụng oxy, tái tạo lại các dưỡng chất vô cơ và loại trừ các sản phẩm độc trong trao đổi chất như NH3, NO2

-, H2S (Moriaty, 1997) Theo Jory (1998) việc quản lý chất lượng nước và kiểm soát bệnh là vấn đề rất quan trọng, nó có quan hệ trực tiếp và ảnh hưởng nhiều bởi hoạt động của vi sinh vật Vì vậy vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ trong thủy vực giữ vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh chất lượng nước

Shariff et al (2001) đã nghiên cứu việc sử dụng chế phẩm sinh học trên thị trường (có chứa các dòng vi khuẩn Bacillus, các vi khuẩn oxy hóa amonia, nitrite,

vi khuẩn oxy hóa sulphur, và nấm men) đối với môi trường ao nuôi, kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt về chất lượng nước giữa các ao thí nghiệm và các ao đối chứng, trừ yếu tố Ammonia tổng số

Trong những năm gần đây, nhằm mục đích giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học trong quá trình nuôi tôm ở nước ta đang phát triển mạnh Theo Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng trên 200 thương hiệu chế phẩm

sinh học và vitamin đang bán trên thị trường nước ta Đa số các chế phẩm sinh học có nguồn gốc nhập ngoại và một số chế phẩm được sản xuất trong nước nhưng phần lớn các chế phẩm này chưa được công bố về xuất xứ nguồn gốc (Tăng Thị Chính và Đặng Đình Kim, 2007)

Theo Đặng Đình Kim và ctv (2006), các chế phẩm vi sinh nhập ngoại chứa một số nhóm vi khuẩn Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Nitrosomonas,

Nitrobacter,… Nhìn chung các sản phẩm này có thành phần vi sinh vật rất hạn

chế, chủ yếu là các nhóm vi khuẩn phân giải protein và nhóm vi khuẩn nitrate hóa, hầu như không có mặt của các nhóm nấm sợi, xạ khuẩn và nấm men Điều này sẽ làm lớp bùn đáy ao nghèo nitơ và sulfate trong khi nguồn carbohydrat thì lại dư thừa và tích lũy ở đáy ao

Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh bằng cách phân lập và tuyển chọn các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải protein, tinh bột và xenluloza trong môi

trường nước lợ được Đặng Đình Kim và ctv (2006) nghiên cứu và đưa ra ứng

dụng trong nuôi trồng thủy sản Sản phẩm này cho kết quả cải thiện tốt các chỉ số thuỷ lý, thuỷ hoá, thuỷ sinh vật trong môi trường ao nuôi, đặc biệt làm tăng tỷ lệ sống, trọng lượng trung bình/con và sản lượng tôm nuôi cao hơn nhiều so với đối chứng

Sử dụng chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản là một xu hướng tích cực và ngày càng mở rộng Do đó, việc đẩy mạnh công tác nghiên cứu về chế phẩm sinh học đã từng được đưa vào một trong các định hướng về khoa học công nghệ liên quan trực tiếp với môi trường góp phần nuôi trồng thủy sản bền vững (Lê Thanh Lựu, 2005)

2.3 Các dòng vi khuẩn chuyển hóa đạm

2.3.1 Vai trò của các dòng vi khuẩn chuyển hóa đạm trong nuôi trồng thủy sản

Từ nhiều năm qua việc bổ sung vi khuẩn vào các ao nuôi thủy sản đã trở nên rất phổ biến vì vi sinh vật phân hủy chất hữu cơ trong thủy vực giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều chỉnh chất lượng nước đối với các hệ thống nuôi thủy sản thâm canh, chúng giúp chuyển hóa các chất độc như ammoniac và hợp chất nitơ (Boyd và Tucker, 1998) Trong thủy vực, các vật chất hữu cơ không ngừng

bị phân hủy bởi các vi sinh vật vì chúng cần các hợp chất này để làm thức ăn (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2005)

Trong nước nitơ tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như nitơ phân tử, các hợp chất nitơ vô cơ và các hợp chất nitơ phức tạp có trong các cơ thể sống (protein, acid amin) Dưới tác dụng của vi sinh vật, các chất hữu cơ chứa nitơ sẽ bị thối rữa

và amon hóa thành NH3 hay NH4+, dạng NH4+ sẽ bị chuyển hóa thành dạng NO3

-nhờ nhóm vi khuẩn nitrate hóa

Hình 2.1: Chu trình chuyển hóa Nitơ trong tự nhiên (www.microponics.net.au/%3Fp%3D197, trích bởi Nguyễn Thị Kim Xuân, 2008)

Tổng hàm lượng đạm amôn (TAN, bao gồm NH3 và NH4+) là thông số chất lượng nước quan trọng trong sản xuất giống và nuôi thủy sản Sự loại bỏ ammonia (NH3) có vai trò vô cùng quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước trong hệ thống ương nuôi ấu trùng và góp phần làm tăng năng suất trong sản

xuất (Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, 2008)

Trong hệ thống sản xuất giống, để giảm hàm lượng ammonia thì biện pháp thay nước thường được áp dụng Tuy nhiên, biện pháp này cũng có những mặt

thống sản xuất Trong những năm gần đây, hệ thống lọc sinh học tuần hoàn thường được ứng dụng rộng rãi để loại bỏ ammonia dựa trên cơ sở của quá trình nitrate hóa

Các hợp chất gây độc cho các đối tượng thủy sản như NH3 và NO2- sẽ được chuyển sang dạng không độc NO3-

nhờ vào quá trình nitrate hóa được thực hiện bởi các vi khuẩn nitrate hóa (Herbert, 1999)

Nitrate hóa là quá trình mà ammonia được oxy hóa thành nitrate (NO3-) qua 2 giai đoạn được thực hiện bởi 2 nhóm vi khuẩn khác nhau Ở giai đoạn thứ

nhất, vi khuẩn Nitrosomonas oxy hóa ammonium thành nitrite (NO2

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, di động, có kích thước

2-3x0,7-0,8 µm, có tính ổn định cao với nhiệt độ, tác động của hóa chất, tia bức xạ

do vi khuẩn này có khả năng hình thành bào tử Vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong thiên nhiên (không khí, đất, bụi và nước), chịu được nhiệt và dễ sấy khô, được coi là vi khuẩn hiệu quả nhất và có lợi ích nhất trong việc bảo vệ sức khỏe

và kích thích hệ thống miễn nhiễm được ưa thích hơn thuốc kháng sinh

Vi khuẩn Bacillus sp.p đã được sử dụng như một chế phẩm sinh học từ rất

lâu giúp cải tiến chất lượng nước nhờ vào tác dụng phân hủy các hợp chất hữu cơ

và làm giảm số lượng mầm bệnh tiếp cận với các loài thuỷ sản nuôi (Wang et al.,

2003)

Theo Hasting và Nealson (1981) Bacillus S11 có thể tạo ra một số chất kháng khuẩn và có thể tiêu diệt V harveyi Cũng với hướng nghiên cứu này Moriaty (1998) kết luận rằng sau khi sử dụng probiotic (chứa chủng Bacillus

sp.p.) tỷ lệ sống của tôm sú tăng lên, hạn chế được mầm bệnh vi khuẩn phát sáng

Vibrio sp.p trong nước và trong bùn đáy ao

Kết quả nghiên cứu của Vaseeharan et al (2002) cho kết quả tương tự khi

sử dụng dòng vi khuẩn B subtilis BT23 để chống lại sự tăng trưởng của V

harveyi, tỷ lệ tôm chết giảm 90%

Trên đối tượng thẻ chân trắng (Penaeus vannamei), Kuan-Fu Liu et al (2010) đã làm thí nghiệm trộn Bacillus subtilis E20 vào thức ăn cho tôm ăn, kết quả cho thấy tỷ lệ sống ở nghiệm thức có Bacillus subtilis E20 cao hơn so với đối

chứng, hơn nữa còn cho thấy vai trò kích thích hệ thống miễn dịch ở tôm

Theo kết quả nghiên cứu của Đặng Đình Kim và ctv (2006) cho thấy

Bacillus có khả năng phân giải protein và tinh bột, khả năng này đóng vai trò

quan trọng trong các chu trình sinh học Nitơ và Carbon

Một số loài của nhóm vi khuẩn Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis, Bacillus sp , Bacillus megaterium ) dùng để làm sạch môi trường

nhờ khả năng sinh các enzyme (proteaza, amylaza, xenlulaza, kitinaza) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh

do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính và Đặng Đình Kim, 2007)

Nghiên cứu của Sirirat et al (2007) sử dụng 2 dòng Bacillus KKU02 và

Bacillus KKU03 (107 CFU/mL) trộn vào thức ăn cho tôm càng xanh (M

rosenbergii) Kết quả cho thấy tăng trưởng và trọng lượng của tôm ăn thức ăn có Bacillus khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng

là nhóm vi khuẩn tự dưỡng hóa năng và hiếu khí bắt buộc

Theo Engel (1958) thì loài Nitrosomonas europaea có khả năng di động và

có 2 roi khi các tế bào vi khuẩn phát triển ở giai đoạn tăng trưởng Vi khuẩn

Nitrosomonas là nhóm vi khuẩn khó phân lập và nuôi do chúng không có khả

năng sống trên môi trường thạch và không thể hình thành khuẩn lạc trong điều kiện thời gian cho phép (Herbert, 1999) Phương pháp MPN được áp dụng để xác định mật độ của nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Valerie và Rene, 1995)

Tất cả các loài thuộc giống Nitrosomonas sử dụng NH3 như là nguồn năng lượng cho sự chuyển hóa thành NO2- Ammonia đầu tiên bị khử hydro thành

amine (NH2) sau đó bị oxy hóa thành NO2

- Quá trình chuyển hóa này cho phép

Nitrosomonas sử dụng một số hợp chất của amine (Engel và Alexander, 1958)

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của Nitrosomonas khoảng 25 – 300C,

pH thích hợp khoảng 7,8 – 8 Nitrosomonas là vi khuẩn mẫn cảm với ánh sáng

đặc biệt là ánh sáng màu xanh dương và tím

2.3.2.3 Nitrobacter

Nitrobacter được chứng minh có nhiều trong đất và bùn (Degrange và

Bardin, 1995), chúng giữ vai trò quan trọng nhất trong bước thứ hai của quá trình

nitrate hóa Những loài thuộc giống Nitrobacter là những vi khuẩn Gram (-), có

hình que ngắn hay hình quả lê (0,5 – 0,8 x 1,0 – 2,0 µm) Đây là nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, sống tự dưỡng trong môi trường hữu cơ, vô cơ và cả khoáng hóa (theo Straat và Nason (1964), trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết, 2008)

Nitrobacter không có khả năng di động và cần phải bám vào bề mặt giá

thể như đá, cát hay một giá thể sinh học nào đó để chúng có thể phát triển thuận lợi nhờ tiết ra chất nhầy từ màng bao bên ngoài

Aleem và Alexander (1960) đã nghiên cứu về dinh dưỡng và sinh lý của

Nitrobacter agilis, các tác giả này đã đưa ra chứng minh cụ thể về mức dưỡng

chất thích hợp với Nitrobacter khoảng 5ppm cho cả phosp.hate và magnesium, trong khi đó sắt cần khoảng 0,005 ppm Nitrobacter bị ảnh hưởng mạnh hơn

Nitrosomonas nếu DO thấp, quá trình nitrate hóa xảy ra tốt nhất nếu DO ở mức >

80% trạng thái bão hòa, quá trình này sẽ không xảy ra khi hàm lượng oxy hòa tan

≤ 2 mg/L

Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

- Hệ thống bể composite loại 50 L, 100 L và 2000 L

- Ấu trùng tôm sú

- Hạt xốp tròn đường kính 4 mm, đá mài được sử dụng làm giá thể trong

bể lọc

- Các dòng vi khuẩn chuyển hóa đạm sử dụng để bố trí thí nghiệm gồm

Bacillus, Nitrobacter, Nitrosomonas được phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh

- Các trang thiết bị thu mẫu và phân tích mẫu nước, Phòng thí nghiệm Phân tích chất lượng nước (Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng – Khoa Thủy sản)

- Các trang thiết bị thu và phân tích mẫu vi sinh, Phòng thí nghiệm Vi sinh (Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng – Khoa Thủy sản)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiệm thức 1 (NT1): cho vào mỗi bể 104 CFU/mL Nitrosomonas, 104CFU/mL Nitrobacter và 104 CFU/mL Bacillus

- Nghiệm thức 2 (NT2): cho vào mỗi bể 104 CFU/mL Nitrosomonas, 104CFU/mL Nitrobacter và 105 CFU/mL Bacillus

- Nghiệm thức 3 (NT3): cho vào mỗi bể 104 CFU/mL Nitrosomonas, 104CFU/mL Nitrobacter và 106 CFU/mL Bacillus

- Nghiệm thức đối chứng (ĐC): không sử dụng vi khuẩn

Chuẩn bị 4 bể loại 50 L để làm bể lọc cho mỗi nghiệm thức riêng biệt và

12 bể 100 L để làm bể ương Nước được pha có nồng độ muối là 30 ‰, tiệt trùng bằng chlorine nồng độ 80 ppm, sục khí mạnh và liên tục trong 48 giờ, sau đó để lắng 2 ngày cuối cùng lọc lại trước khi đưa vào bể ương Nước chuẩn bị đưa vào

bể ương cần phải kiểm tra nồng độ chlorine, pH Nếu còn chlorine thì trung hòa bằng thiosulfate natri (Na2SiO3)

Giá thể được sử dụng cho lọc sinh học là hạt xốp tròn đường kính 4 mm, các hạt xốp được đựng trong túi bằng lưới cước đặt trong bể lọc, thể tích lọc chiếm 15% thể tích bể ương Dụng cụ được xử lý với chlorine 80 ppm trước khi

Mẫu được thu 3 ngày/lần với các chỉ tiêu bao gồm: pH, nhiệt độ, DO, COD, NO2_, NO3_, TAN, TN, TP, TSS, H2S và mật độ vi khuẩn (thu nước và thu giá thể) Thí nghiệm kết thúc khi ấu trùng chuyển sang giai đoạn PL7

Thí nghiệm 2: Xác định khả năng chuyển hóa đạm của 3 dòng vi khuẩn Bacillus, Nitrobacter, Nitrosomonas trong hệ thống ương tôm sú thay nước

Thí nghiệm này gồm 3 nghiệm thức với các mật độ vi khuẩn khác nhau và nghiệm thức đối chứng, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

- Nghiệm thức 1 (NT1): cho vào mỗi bể 104 CFU/mL Nitrosomonas, 104CFU/mL Nitrobacter và 104 CFU/mL Bacillus

- Nghiệm thức 2 (NT2): cho vào mỗi bể 104 CFU/mL Nitrosomonas, 104CFU/mL Nitrobacter và 105 CFU/mL Bacillus

- Nghiệm thức 3 (NT3): cho vào mỗi bể 104 CFU/mL Nitrosomonas, 104

- Nghiệm thức đối chứng (ĐC): không sử dụng vi khuẩn

Mức nước ban đầu 50% thể tích bể ương Trong quá trình ương nuôi không thay nước trong giai đoạn nauplius Giai đoạn zoea cấp thêm 10% mỗi ngày Từ giai đoạn mysis trở đi thay nước hàng ngày 20% Đáy bể được hút cặn hằng ngày trước khi thay nước Sau khi cấp nước mới vào vi khuẩn sẽ được bổ sung với lượng tương ứng

Bể loại 100 L được chuẩn bị để ương tôm (12 cái), nước được pha có nồng

độ muối là 30‰, tiệt trùng bằng chlorine nồng độ 80 ppm Trước khi đưa vào bể ương cần phải kiểm tra nồng độ chlorine, pH

Sử dụng hạt xốp tròn đường kính 4 mm, các hạt xốp này được cho vào túi làm bằng lưới cước đặt vào bể ương để làm giá thể cho vi khuẩn bám, lượng giá thể cho vào chiếm 5% thể tích bể ương

Vi khuẩn được cấy vào bể ương sau khi bố trí ấu trùng Vi khuẩn

Nitrobacter, Nitrosomonas được cấy vào với mật độ 104 CFU/mL, Bacillus được

cho vào bể ương với các mật độ khác nhau ở các nghiệm thức khác nhau

Ấu trùng tôm ở giai đoạn Nauplii được xử lý bằng formol 25 ppm trong 5 phút, bố trí vào bể ương với mật độ 150 ấu trùng/L Chế độ cho ấu trùng ăn áp dụng ở phụ lục B1

Mẫu chất lượng nước và mẫu vi khuẩn được thu tương tự thí nghiệm 1 Thí nghiệm kết thúc khi ấu trùng chuyển sang giai đoạn PL7

Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả xử lý ở các tỷ lệ thể tích bể lọc khác nhau trong hệ thống lọc tuần hoàn

Ở thí nghiệm này, giá thể là đá mài được bố trí vào bể lọc với các tỷ lệ thể tích khác nhau so với thể tích bể ương, bể lọc được bố trí dạng lọc ướt Vi khuẩn

được cho vào với mật độ như nhau ở các nghiệm thức 1, 2 và 3 gồm: Nitrobacter,

Nitrosomonas cấy vào với mật độ 104 CFU/mL, Bacillus 105 CFU/mL, đây là mật độ vi khuẩn cho hiệu quả xử lý nước cao nhất trong thí nghiệm 1 Bể lọc ở nghiệm thức đối chứng được bổ sung NH4Cl với lượng 0,1 mg/L và vận hành một tuần trước khi cho thông với bể ương Thức ăn tôm được cho vào theo phụ lục B2 đều nhau ở tất cả các nghiệm thức để tạo nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn sử dụng (không bố trí tôm vào các bể ương) Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

- Nghiệm thức 1 (NT1): thể tích bể lọc bằng 5% thể tích bể ương, bổ sung

vi khuẩn

- Nghiệm thức 2 (NT2): thể tích bể lọc bằng 10% thể tích bể ương, bổ sung vi khuẩn

- Nghiệm thức 3 (NT3): thể tích bể lọc bằng 15% thể tích bể ương, bổ sung vi khuẩn

- Nghiệm thức đối chứng (ĐC): thể tích bể lọc bằng 15% thể tích bể ương, không bổ sung vi khuẩn

Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm với tỷ lệ thể tích bể lọc khác nhau

Các chỉ tiêu chất lượng nước như: pH, nhiệt độ đo mỗi ngày; DO, COD,

NO3_, NO2-, TAN, TN, thu 2 ngày/lần và mật độ vi khuẩn (thu nước và thu giá thể) thu 3 ngày/ lần Thí nghiệm kết thúc sau 21 ngày

3.2.2 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn

Các dòng vi khuẩn Bacillus, Nitrosomonas và Nitrobacter có nguồn gốc

phân lập từ bùn đáy ao nuôi tôm sú thâm canh tại Huyện Vĩnh Châu – Tỉnh Sóc Trăng đã được chọn lọc

* Nuôi tăng sinh vi khuẩn Bacillus

Môi trường nuôi tăng sinh là môi trường Luria Bertani (LB) (phụ lục A6)

Vi khuẩn Bacillus được cho vào bình tam giác chứa môi trường LB, các bình tam

giác được gắn sục khí, để ở nhiệt độ 300C trong vòng 24 - 48 giờ

Sau khi nuôi tăng sinh mật độ vi khuẩn được xác định bằng 2 phương pháp

- Phương pháp đếm trên đĩa thạch với môi trường chuyên biệt cho giống

Bacillus (phụ lục A5)

- Phương pháp đo OD: sau khi nuôi tăng sinh sử dụng máy đo quang phổ tại bước sóng 600 nm để xác định giá trị OD Mẫu đối chứng không có vi khuẩn được đo đầu tiên và có giá trị bằng 0 Dung dịch huyền phù vi khuẩn cần đo sẽ có giá trị OD trong khoảng 0,125-1,25 Theo tiêu chuẩn Mac Farland giá trị OD bằng 1 tương ứng mật độ vi khuẩn 1,2x109 CFU/mL

Mật độ vi khuẩn được tính theo công thức:

Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) = 1200*10 6 *OD*Độ pha loãng

Bảng 3.1: Giá trị OD 600nm

Giá Trị OD 600 0,125 0,250 0,500 0,750 1,000 1,250

Mật Độ Vi Khuẩn

* Nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter

Hai dòng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường chuyên biệt ở phụ lục

A3 và A4 Các bình tam giác nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas và

Nitrobacter được bọc kín bằng giấy bạc để tránh ánh sáng và được đặt trên máy

lắc khoảng một tuần trước khi bố trí thí nghiệm Sau đó dùng phương pháp OD để xác định mật độ vi khuẩn cấy vào bể thí nghiệm

3.2.3 Phương pháp thu và phân tích mẫu vi khuẩn (Huys, 2002)

3.2.3.1 Chuẩn bị trước khi thu mẫu

- Các ống falcon, ống nghiệm được tiệt trùng để thu mẫu

- Các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,85% tiệt trùng ở 1210C trong 15 - 20 phút

- Môi trường NA + 1,5% muối NaCl, TCBS ((Thiosulphate Citrate Bile

Sucrose Agar)) và môi trường chuyên biệt cho Bacillus, Nitrobacter và

Nitrosomonas

3.2.3.2 Phương pháp thu mẫu

- Mẫu nước được thu bằng ống falcon tiệt trùng, thu mẫu cách mặt nước

20 – 30 cm Sau đó trữ lạnh ngay ở 40C và tiến hành phân tích trong vòng 2 giờ

- Mẫu giá thể được thu ở trong bể lọc và trong bể ương, mỗi bể thu 10 g hạt xốp (dùng làm giá thể) cho vào ống falcon tiệt trùng và trữ lạnh ngay ở 40C và tiến hành phân tích trong vòng 2 giờ

3.2.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn Vibrio

* Cách pha loãng mẫu:

Các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý (0,85%) đã tiệt trùng ở 121ºC trong 20 phút được chuẩn bị sẵn để pha loãng mẫu

Tại phòng thí nghiệm, mẫu nước được lấy ra khỏi tủ mát, để nhiệt độ phòng Dụng cụ chứa mẫu được mở nắp trong tủ cấy tiệt trùng, chuyển 1ml mẫu nước từ mỗi bể sang các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng, trộn đều bằng máy 1 phút Được mẫu có độ pha loãng 10-1 Từ mẫu này chuyển 1

ml dung dịch sang ống nghiệm khác chứa 9 ml nước muối sinh lý được độ pha loãng 10-2 Tiếp tục pha loãng theo cách này đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp, bắt đầu từ độ pha loãng 10-2

* Xác định mật độ vi khuẩn Bacillus:

Tất cả các ống nghiệm vừa pha loãng được sấy ở 800C trong 30 phút rồi lấy ống nghiệm ra để nguội

Sau đó dùng micropipete hút 100µL dung dịch vi khuẩn cho vào các đĩa

chứa môi trường chuyên biệt cho giống Bacillus, rồi dùng que thuỷ tinh tán đều

đến khi mẫu khô Ủ ở 280

C trong 24 – 48 giờ Mỗi mẫu nước cần chọn 2 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần

Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động

từ 20 đến 200 Số khuẩn lạc tổng cộng được đếm trên những đĩa petri có số khuẩn lạc > 20 và < 200 và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/mL nước

* Xác định mật độ vi khuẩn Vibrio:

Dùng micropipete hút 100µL dung dịch vi khuẩn cho vào các đĩa chứa môi

trường TCBS chuyên biệt cho giống Vibrio, dùng que thuỷ tinh tán đều đến khi

mẫu khô Ủ ở 280C trong 24 – 48 giờ Mỗi mẫu nước cần chọn 2 độ pha loãng khác nhau, mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần

Sau khi ủ kiểm tra môi trường nuôi cấy để xác định số khuẩn lạc dao động

từ 20 đến 200 Số khuẩn lạc tổng cộng được đếm trên những đĩa petri có số khuẩn lạc > 20 và < 200 và được tính bằng đơn vị hình thành khuẩn lạc/mL nước

* Công thức tính mật độ vi khuẩn:

Số tế bào/mL (CFU/ mL) = số khuẩn lạc × độ pha loãng × 10

3.2.3.4 Phương pháp xác định mật số vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter theo phương pháp đếm số lượng có khả năng nhất (MPN) (Pickering, 1975)

* Môi trường ammonium-calcium-carbonate được chuẩn bị cho

* Pha loãng mẫu giá thể:

Tại phòng thí nghiệm mẫu hạt xốp được lấy ra khỏi tủ mát, để ở nhiệt độ phòng Mở nắp dụng cụ chứa mẫu trong tủ cấy tiệt trùng, chuyển 1 g mẫu ống nhựa từ ống falcon các ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng, trộn đều bằng máy 1 phút Ta được mẫu có độ pha loãng 10-1

Từ mẫu này để yên cho lắng 30 giây chuyển 1ml dung dịch ở phần giữa ống nghiệm sang ống nghiệm khác chứa 9ml nước muối sinh lý được độ pha loãng 10-2 Tiếp tục pha loãng theo cách này đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp, bắt đầu từ độ pha loãng 10-2chỉ lắc 30 giây và để lắng 15 giây

Mỗi bể chuẩn bị 9 ống nghiệm chứa môi trường ammonium – carbonate - calcium và 9 ống nghiệm chứa môi trường nitrite – calcium – carbonate, chuyển 1

mL dung dịch huyền phù vi khuẩn ở 3 độ pha loãng thích hợp cho vào các ống nghiệm chứa môi trường trên, mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần

Mỗi môi trường lấy 3 ống nghiệm, các ống nghiệm này chỉ chứa môi trường nuôi không cho dung dịch vi khuẩn vào để làm đối chứng âm

Các ống nghiệm chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn và các ống đối chứng

âm này được ủ ở 280C khoảng 21 ngày

Sau khi ủ, sự có mặt của NO2

ở các ống nghiệm chứa dung dịch chứa huyền phù vi khuẩn và các ống đối chứng âm được kiểm tra bằng thuốc thử Griess – Ilosway (Phụ lục A7) Trộn lẫn các phần đều nhau của thuốc thử dung dịch A, B, C, sau đó thêm vài giọt huyền phù vi khuẩn từ mỗi ống Quan sát sự phát triển màu đỏ hồng trong 5 phút

* Xác định dương tính đối với nhóm AOB (vi khuẩn oxy hóa ammonium):

Các ống chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn của môi trường ammonium – calcium – carbonate sẽ xuất hiện màu đỏ hồng trong 5 phút khi có mặt NO2- Phản ứng màu chứng tỏ có sự hiện diện của nhóm AOB

Trong trường hợp các ống nghiệm này không xuất hiện màu đỏ hồng trong

5 phút thì cho một lượng nhỏ hỗn hợp Zn – Cu – MnO2, nếu có màu đỏ xuất hiện cho thấy sự có mặt của nhóm AOB bởi vì kết quả âm tính đối với NO2

ở phản ứng đầu cho thấy NO2

được hình thành bởi nhóm AOB đã bị oxy hóa thành NO3

-bởi nhóm NOB

* Xác định dương tính đối với nhóm NOB (vi khuẩn oxy hóa nitrite):

Các dung dịch chứa huyền phù vi khuẩn của môi trường nitrite – calcium – carbonat không xuất hiện màu đỏ hồng sau khi phản ứng với thuốc thử Griess – Ilosway chứng tỏ không còn NO2

nữa do đã được chuyển toàn bộ thành NO3

bởi nhóm NOB

Nếu các ống đối chứng âm cho kết quả dương tính sau khi nhỏ thuốc thử chứng tỏ môi trường đã bị nhiễm

Số lượng ống nghiệm chứa dung dịch huyền phù vi khuẩn cho phản ứng dương tính được xác định bằng cách kiểm tra 3 độ pha loãng, kết quả từ 3 lần lặp lại của mỗi độ pha loãng được sử dụng để tính MPN Cách chọn 3 độ pha loãng để xác định chỉ số MPN như sau: độ pha loãng đầu tiên là độ pha loãng cao nhất mà cả 3 lần lặp lại đều cho kết quả dương tính sau khi nhỏ thuốc thử, 2 độ pha loãng sau

đó cao hơn

Hình 3.2: Cách xác định mật độ vi khuẩn theo phương pháp MPN

Sau khi kiểm tra ghi nhận các kết quả dương tính và âm tính từ các ống nghiệm Tra cứu bảng MPN tiêu chuẩn (Phụ lục A8) để xác định số lượng có thể

có của nhóm AOB và NOB trong 1 g mẫu giá thể

ủ 28ºC

21 ngày

3.2.4 Phương pháp thu và phân tích mẫu nước

Mẫu nước được thu bằng chai nút mài và chai nhựa, thu cách mặt nước 20 – 30 cm Các chỉ tiêu chất lượng nước được phân tích trong phòng thí nghiệm với các phương pháp sau:

+ Nhiệt độ: đo bằng máy đo đa chỉ tiêu YSI 556

+ pH đo bằng máy đo đa chỉ tiêu YSI 556

+ TAN: phương pháp Phenate (4500-NH3F.APHA et al., 1995)

+ NO3-: phương pháp khử Cadmium (4500-NO3- E.APHA et al., 1995) + NO2-: phương pháp Diazonium (4500-NO2-B APHA et al., 1995)

+ COD: phương pháp hoàn lưu kín-chuẩn độ (5220 C APHA et al., 1995) + DO: phương pháp Wincler (4500-O C APHA et al., 1995)

+ TSS: phương pháp sấy 1050C (2540D APHA et al., 1995)

+ TN: phương pháp Persulfate (4500-Norg D APHA et al., 1995)

3.2.5 Phương pháp thu và phân tích mẫu tôm

Xác định tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng trước khi bố trí thí nghiệm

và khi kết thúc thí nghiệm (Postlarvae 7) theo công thức:

Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định khả năng chuyển hóa đạm của 3 dòng vi khuẩn Bacillus,

Nitrobacter, Nitrosomonas trong hệ thống ương tôm sú

4.1.1 Biến động các yếu tố môi trường nước

Kết quả biến động các yếu tố môi trường nước của thí nghiệm 1 (hệ thống tuần hoàn) và thí nghiệm 2 (hệ thống thay nước) được trình bày ở Bảng 4.1 và Bảng 4.2 Kết quả phân tích thống kê cho thấy, ở thí nghiệm 1 các chỉ tiêu: COD, TSS, TAN và NO2- khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (p<0,05) Chỉ tiêu NO3- ở NT2 và NT3 khá cao hơn so với NT1 và ĐC, tuy nhiên, khi phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm

Bảng 4.2: Biến động các yếu tố môi trường nước trong thí nghiệm 2

* Các giá trị trên cùng một cột có chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

Kết quả phân tích thống kê các chỉ tiêu môi trường nước ở thí nghiệm 2 cho thấy, các yếu tố COD, TSS, NO2- và NO3- thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (p<0,05)

Chỉ tiêu pH ở các nghiệm thức trong cả hai thí nghiệm dao động không đáng kể và đều nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của ấu trùng tôm

trọng ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh trưởng và phát triển của tôm pH thích hợp cho sự phát triển của tôm là 7,5-8,5 và khoảng dao động trong ngày không quá

0,5 đơn vị pH pH dưới 4 hay trên 10 có thể gây chết tôm (theo Kungvankij et al.,

1986 trích dẫn bởi Vũ Thế Trụ, 1994) Theo nghiên cứu của Briggs và Funge Smith (1994) nguồn nước có pH dao động trong khoảng 7,5 – 8,5 cũng là điều kiện tối ưu cho nhóm vi khuẩn nitrate hóa tăng trưởng

Giá trị pH và nhiệt độ của các nghiệm thức ở cả hai thí nghiệm đều nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của ấu trùng tôm, tuy nhiên ở thí nghiệm ương tôm trong hệ thống thay nước (có thay nước) thì cho thấy mức độ dao động giữa các lần thu mẫu cao hơn ở thí nghiệm ương tôm trong hệ thống tuần hoàn do thay nguồn nước mới vào dẫn đến biến động nhiệt độ và pH trong bể ương Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

4.1.1.2 Oxy hòa tan (DO)

Theo Whetstone et al (2002) hàm lượng oxy hòa tan trong nước lý tưởng

cho tôm là trên 5 mg/L và không vượt quá 15 mg/L Chất lượng nước thích hợp cho sản xuất giống tôm sú đòi hỏi hàm lượng oxy hòa tan phải lớn hơn 4 (Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương, 2009) Hàm lượng oxy hòa tan trong thí nghiệm ương tôm trong hệ thống tuần hoàn dao động từ 4,21 – 10,39 mg/L, đối với hệ thống thay nước sự dao động oxy hòa tan trong khoảng 5,36 – 10,37 mg/L Như vậy, hàm lượng oxy hòa tan trong cả hai thí nghiệm đều nằm trong khoảng

thích hợp cho sự phát triển của tôm Hơn nữa, theo nghiên cứu của Kristian et al

(2001) quá trình nitrate hóa xảy ra tốt nhất nếu hàm lượng oxy ở mức lớn hơn 80% trạng thái bão hòa

0 2 4 6 8 10

ĐC

Qua Hình 4.1 và 4.2 cho thấy, hàm lượng oxy hòa tan có xu hướng tăng dần lên vào cuối thí nghiệm Theo Boyd (1998) hàm lượng oxy hòa tan ở mức bão hòa là 8 mg/L, trong tự nhiên hàm lượng oxy hòa tan trong nước chỉ vượt mức bão hòa khi nguồn nước giàu dinh dưỡng, tảo phát triển mạnh Trong cả hai thí nghiệm mặc dù có sử dụng tảo tươi để làm nguồn thức ăn cho ấu trùng tôm nhưng số lượng tảo trong nước ương là không đáng kể, vì vậy hàm lượng oxy hòa tan trong thí nghiệm tăng đột ngột ở vài lần thu mẫu có thể do sai sót trong thao tác thu hoặc phân tích mẫu

ĐC

Hình 4.2: Biến động hàm lượng oxy hòa tan trong hệ thống thay nước

Trong cả 2 thí nghiệm, hàm lượng oxy hòa tan ở nghiệm thức đối chứng luôn cao hơn ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn (Thí nghiệm 1: ĐC là 8,8±2,2 mg/L so với các NT bổ sung vi khuẩn là 8,1±2,4 mg/L; Thí nghiệm 2:

ĐC là 8,2±2,0 mg/L so với các NT bổ sung vi khuẩn là 8,1±2,0 mg/L) Điều này

có thể do hoạt động phân hủy vật chất hữu cơ của vi khuẩn được bổ sung đã sử dụng nhiều lượng oxy hòa tan hơn, làm cho hàm lượng oxy thấp hơn đối chứng Tuy nhiên, kết quả phân tích thống kê cho thấy giữa các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05)

4.1.1.3 Tiêu hao oxy hóa học (COD)

Ở thí nghiệm ương tôm trong hệ thống tuần hoàn (Hình 4.3), hàm lượng COD ở NT1 và ĐC dao động từ 11,02 – 16,47 mgO2/L cao hơn khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với NT2 và NT3, điều này cho thấy mức độ tích lũy

vật chất hữu cơ ở nghiệm thức bổ sung vi khuẩn Bacillus với mật độ 104 CFU/mL

và nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn cao hơn so với hai nghiệm thức còn lại (NT2: 105 CFU/mL Bacillus, NT3: 106 CFU/mL Bacillus) Hàm lượng COD

trong nghiệm thức 1, có giảm so với đối chứng nhưng không đáng kể do vi khuẩn

Bacillus được bổ sung với mật độ 104 CFU/mL nên đã không phát huy được vai trò của mình trong việc phân hủy vật chất hữu cơ trong bể ương

0 2 4 6 8 10

ĐC

Hình 4.3: Biến động hàm lượng COD trong hệ thống tuần hoàn

Kết quả của thí nghiệm ương tôm trong hệ thống thay nước (Hình 4.4) Qua đó cho thấy COD trong các nghiệm thức dao động từ 6,71- 16,86 mgO2/L và

có khuynh hướng tăng dần vào cuối thí nghiệm Kết quả phân tích thống kê cũng cho thấy hàm lượng COD ở NT1 và ĐC cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với NT2 và NT3 Sự dao động lớn giữa các lần thu mẫu trong thí nghiệm thay nước là do có sự xáo trộn môi trường nước ương khi thay nước mới vào

0 2 4 6 8 10

ĐC

Hình 4.4: Biến động hàm lượng COD trong hệ thống thay nước

Qua kết quả phân tích ở cả 2 thí nghiệm cho thấy, COD có khuynh hướng tăng dần vào cuối thí nghiệm, nguyên nhân là do thức ăn dư thừa và chất thải của tôm tích lũy theo thời gian do đó phải cần nhiều oxy cho quá trình phân hủy các chất thải đó Hàm lượng COD thấp ở các nghiệm thức có mật độ vi khuẩn

Bacillus cao hơn cho thấy vai trò của vi khuẩn trong việc chuyển hóa vật chất hữu

cơ thể hiện rất rõ

4.1.1.4 Tổng vật chất lơ lửng (TSS)

Kết quả thí nghiệm ương tôm trong hệ thống tuần hoàn cho thấy, hàm

lượng TSS của nghiệm thức bổ sung vi khuẩn Bacillus với mật độ 105 CFU/mL

và 106 CFU/mL thấp hơn so với nghiệm thức bổ sung 104 CFU/mL Bacillus và

nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn Phân tích thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (p<0,05), điều này cho thấy hàm lượng TSS trong bể ương giảm đi do ảnh hưởng rất lớn bởi khả năng phân hủy vật chất hữu cơ của vi

khuẩn Bacillus

Qua Hình 4.5 cho thấy, hàm lượng TSS đột nhiên tăng cao vào đợt thu

mẫu thứ 2 Do giai đoạn này sử dụng tảo Chaetoceros và các loại thức ăn tổng

hợp để chuẩn bị sẵn sàng thức ăn khi ấu trùng tôm từ Nauplius chuyển sang Zoae1, vì thế TSS tăng đột ngột ở tất cả các nghiệm thức Sau đó, ấu trùng tôm bắt đầu sử dụng thức ăn và vi khuẩn phân hủy vật chất hữu cơ làm TSS giảm Ở các lần thu mẫu sau tăng dần cho đến kết thúc thí nghiệm do quá trình tích lũy thức ăn dư thừa, cặn bã và chất thải của tôm