ảnh hưởng của sự nhiễm vi khuẩn edwardsiella ictaluri và thuốc trừ sâu cyrus lên sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

ictaluri kết quả phân tich một số chỉ tiêu huyết học cho thấy số luợng hồng cầu cá tra ở các nghiệm thức nhiễm vi khủẩn E.. - Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cyrux 25EC lên một số chỉ tiêu

TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO

ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella

ictaluri VÀ THUỐC TRỪ SÂU CYRUS LÊN SỰ THAY

ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CÁ TRA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRẦN THỊ PHƯƠNG THẢO

ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella

ictaluri VÀ THUỐC TRỪ SÂU CYRUS LÊN SỰ THAY ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CÁ TRA (Pangasianodon

hypophthalmus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs Ts ĐỖ THỊ THANH HƯƠNG

Ts PHẠM MINH ĐỨC

2010

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGs Đỗ Thị Thanh Hương và Ts Phạm Minh Đức đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, quan tâm, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin gởi lời cảm ơn đến các bạn Nguyễn Thị Kim Hà, Nguyễn Văn Toàn

đã giúp đỡ và hỗ trợ về trang thiết bị trong suốt quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm

Xin gởi lời cảm ơn đến các em sinh viên lớp liên thông Nuôi trồng Thủy sản K34 và K35 đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn dự án Physcam đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, những người thân

và bạn bè đã chia sẽ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu sự nhiễm bệnh và hóa chất lên một

số chỉ tiêu huyết học của cá tra Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với

2 thí nghiệm: thí nghiệm 1 cá nhiễm thuốc trừ sâu với nồng độ cypermethrin (LC50-96 giờ, 1/2 LC50-96 giờ) và đối chứng, thí nghiệm 2 cá nhiễm bệnh do vi

khuẩn Edwardsiella icaluri ở mật độ 3,5x104cfu/ml, 3,5x102cfu/ml và đối chứng tiêm nước muối sinh lý

Kết quả cho thấy cypermethrin có độ độc cao đối với cá tra (LC50-96 giờ

là 0,072 mg/L) Số lượng hồng cầu và tỷ lệ huyết cầu giảm khi cá tiếp xúc thuốc, sau 6, 9 giờ có dấu hiệu tăng nhẹ và tiếp tục giảm sau đó Số lương bạch cầu có dấu hiệu giảm khi cá nhiễm cypermethrin đến 96giờ mới có dấu hiệu tăng nhưng vẫn thấp hơn so với đối chứng MCV, MCH, MCHC có biến động nhưng không

đáng kể so với đối chứng Đối với thí nghiệm cá nhiễm vi khuẩn E ictaluri kết

quả phân tich một số chỉ tiêu huyết học cho thấy số luợng hồng cầu cá tra ở các

nghiệm thức nhiễm vi khủẩn E ictaluri dao động từ 1,4-1,51 triệu tế bào/mm3

giảm có ý nghĩa thống kê so với cá khỏe (1,85 triệu tế bào/mm3) Số lượng bạch cầu dao động từ 14,94-16,02 nghìn tế bào/mm3 giảm có ý nghĩa thống kê so với

cá khỏe (18,08 nghìn tế bào/mm3) Trong đó, tế bào lympho và tiểu cầu giảm nhưng số bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính tăng Kết quả nhiên cứu của

đề tài cung cấp thông tin có giá trị làm cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng trong chuẩn đóan và phòng trị bệnh ở cá tra nuôi

ABSTRACT

The aim of this study was to investigate the effects of pesticide and bacteria on hematological parameters of Tra fish There was 2 experiments: the first experiment was randomly designed with 2 different concentrations of cypermethrin (LD50-96 hours and 1/2 LD50-96 hours) and control The second

experiment were infected with bacteria Edwardsiella ictaluri on Tra fish

The result showed cypermethrin was highly toxic to Tra fish (LC50-96h is 3,89 mg/L) The erythrocyte quantity and hematocrit value decreased after administration of cypermethrin MCV, MCH and MCHC were changed lightly and non-significant with control Results from haematological analysis evealed a significant reduction in total number red blood cell in infected striped catfish (ranged from 1,4-1,51 milion cells/mm3) compared to the healthy one (1,85 milion cells/mm3) The number of white blood cell in infectedstriped catfish ranged from 14,94-16,02 thousand cells/mm3 which was signficant lower than the number of white cells in health striped catfish (18,08 thousand cells/mm3) Of these, the number of lymphocyte and thrombocyte decreased but the monocyte and neutrophil increased Results from this study provide valuable basic information for further applied study diagnosis, and effective method for antibacterial in striped catfish farming

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết, luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ dự án Physcam, các kết quả này chưa dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào Dự án có quyền sử dụng kết quả của luận văn này để phục vụ cho dự án

Tác giả luận văn Trần Thị Phương Thảo

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1: 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung của đề tài 2

1.4 Thời gian thực hiện đề tài 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cá tra 3

2.1.1 Phân lọai 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.2 Sinh lý máu và huyết học của cá 4

2.2.1 Chức năng của máu 4

2.2.2 Thành phần và đặc tính lý hóa học của máu 4

2.3 Một số nghiên cứu về huyết học ở cá 6

2.4 Tổng quan tình hình bệnh, sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản 7

2.4.1 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long 7

2.4.2 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản 9

2.5 Tổng quan thuốc trừ sâu Cyrus (chứa hoạt chất cypermethrin) 10

2.5.1 Cypermethrin: 10

2.6 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 8

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Vật liệu nghiên cứu 12

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 12

3.1.3 Hóa chất 12

3.1.4 Vi khuẩn 13

3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm: 13

3.2.1 Thí Nghiệm 1: Xác định LC50 của Cypermerthrin 13

3.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của vi khuẩn E ictaluri lên một số chỉ tiêu huyết học của cá tra giống 14

3.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của Cypermerthrin lên một số chỉ tiêu chỉ tiêu huyết học của cá tra giống 15

3.3 Phương pháp thu mẫu 15

3.3.1 Thời gian thu mẫu 15

3.4 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu huyết học 16

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Giá trị LC50 của thuốc trừ sâu Cyrus 25EC chứa hoạt chất cypermethrin lên cá tra 18

4.2 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cyrus chứa hoạt chất cypermethrin lên chỉ tiêu huyết học 19

4.2.1 Số lượng hồng cầu 19

4.2.2 Số lượng bạch cầu 21

4.2.3 Hàm lượng huyết sắc tố (Hemoglobin, mmol/l) 22

4.2.4 Tỷ lệ huyết cầu (%) 23

4.2.5 Thể tích hồng cầu (MCV) 24

4.2.6 Khối lượng trung bình của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCH) 25

4.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lên chỉ tiêu huyết học cá tra 27 4.3.1 Số lượng hồng cầu 28

4.3.2 Số lượng bạch cầu 29

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề xuất 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

Phụ lục 1 39

Phụ lục 2 40

Phụ lục 3 42

Phụ lục 4 43

Phụ lục 5 45

Phụ lục 6 54

Phụ lục 7 54

Phụ lục 8 55

Phụ lục 9 55

Phụ lục 10 56

Phụ lục 11 56

Phụ lục 12 57

Phụ lục 13 57

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1: Số lượng hồng cầu thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 31

Bảng 4.2: Số lượng bạch cầu thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 32

Bảng 4.3: Hàm lượng huyết sắc tố (mmol/l) thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 33 Bảng 4.4: Tỷ lệ huyết cầu (%) thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 34

Bảng 4.5: Thể tích hồng cầu thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 34

Bảng 4.6: MCH (pg) thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 35

Bảng 4.7: MCHC (%) thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin 36

Bảng 4.8: Các chỉ tiêu huyết học thí nghiệm cá tiêm vi khuẩn E.ictaluri 37

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.7: Cấu tạo Cypermethrin 10 Hình 4.1 Cá bệnh mủ gan 27 Hình 4.2 Các loại bạch cầu 30

trong hồng cầu)

Trong nhóm các đối tượng nuôi nước ngọt, cá tra là lòai cá da trơn có giá trị kinh

tế cao Trong những năm gần đây, cá tra là một trong những đối tượng nuôi

quan trọng của Đồng bằng sông Cửu Long Tại Cần Thơ, diện tích nuôi đến tháng 11 là 14.113 ha, bằng 110% so với cùng kỳ năm 2009, trong đó diện tích nuôi cá tra là 581 ha; sản lượng nuôi đạt 164.579 tấn vượt 8% so với cùng kỳ Vĩnh Long diện tích nuôi cá tra là 405,9 ha và sản lượng đạt 108.746 tấn

Với sự mở rộng nhanh chóng của nghề nuôi, vấn đề suy thoái môi trường và dịch bệnh đã và đang trở thành một trong những trở ngại lớn cho sự phát triển bền vững của nuôi trồng thủy sản nước ngọt Việt Nam Theo Phạm Đình Khôi (2009) trong vòng 5 năm qua, môi trường ô nhiễm và dịch bệnh đã làm tỷ lệ

sống trung bình của cá nuôi giảm từ 90% xuống còn 80% Lý Thị Thanh Loan và

ctv (2006) khi thu và phân lập vi khuẩn gây bệnh trên cá Tra ở ĐBSCL thì bệnh

gan, thận mủ do Clostridium sp chiếm 69,38%, xuất huyết do Aeromonas sp chiếm 44,89% và Pseudomonas sp chiếm 4,08%

Song, xu hướng hiện nay việc phòng trị bệnh trên cá nước ngọt ở nước ta vẫn còn chủ yếu dựa vào việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất kể cả những lọai hóa chất cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, khiến việc xuất khẩu thủy sản của Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn do danh mục các lọai thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng

Các chỉ tiêu huyết học cá đang ngày càng được nghiên cứu nhiều trong quản

lý bệnh thủy sản, và có thể được dùng để chỉ tình trạng sức khỏe của cá cũng như chất lượng nước, như máu trong mang có liên hệ trực tiếp với môi trường nước

và môi trường thay đổi bất lợi có thể được phản ánh trong hệ thống tuần hòan (Mulcahy, 1975) Có một vài nghiên cứu khoa học về ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu lên chỉ tiêu huyết học cá (Srivastava, 1988; Khattak and Hafeez,

1996; Tavares et al., 1999; Svoboda et al., 2001) Nghiên cứu sự thay đổi các chỉ

tiêu huyết học và chức năng đào thải ở từng giai đoạn và nồng độ thuốc trừ sâu

khác nhau của cá rô phi Orieochromis mossambicus (Sampath et al., 1993) Vấn

đề đặt ra là có sự khác biệt như thế nào về một số chỉ tiêu huyết học của cá tra khi có sự tác động của tác nhân sinh học và hóa học Chính vì những lý do trên

mà đề tài: “Ảnh hưởng của sự nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và thuốc trừ sâu Cyrus lên sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus)” được thực hiện

1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định một số yếu tố huyết học của cá tra khỏe và cá nhiễm bệnh do vi khuẩn và hóa chất từ đó đánh giá sự biến đổi một số chỉ tiêu huyết học của cá nhiễm bệnh và hóa chất nhằm cung cấp dẫn liệu khoa học cho việc chẩn đoán và đánh giá sức khỏe ở cá nuôi

1.3 Nội dung của đề tài

- Xác định LC50-96 giờ của thuốc trừ sâu Cyrux 25EC (hoạt chất cypermethrin) trên cá tra giống

- Ảnh hưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri CT 258 lên một số chỉ tiêu

huyết học (hồng cầu, bạch cầu, hematorite và hemoglobin) của cá tra giống

- Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cyrux 25EC lên một số chỉ tiêu chỉ tiêu huyết học

(hồng cầu, bạch cầu, hematorite và hemoglobin) của cá tra giống

1.4 Thời gian thực hiện đề tài

Từ tháng 8/2009 đến tháng 12/2010

CHƯƠNG 2:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học cá tra

2.1.1 Phân loại: cá tra là một trong số 11 lòai thuộc họ cá tra (Pangasiidae) đã

được xác định ở sông Cửu Long Tài liệu phân lọai gần đây nhất của tác giả

Rainboth xếp cá tra nằm trong giống cá tra dầu (Pangasianodon)

và thực vật (Lê Như Xuân, 2000) Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước lợ (nồng độ muối 7-10‰), có thể chịu đựng được nước phèn với pH =4.5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15 oC, nhưng chịu nóng tới 39oC (VINAFIS, 2004) Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác Cá có cơ quan hô hấp phụ và cũng có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước có oxi hòa tan rất thấp (Lê Như Xuân, 2000)

2.1.3 Hiện trạng nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL

ĐBSCL có tiềm năng và lợi thế tự nhiên đặc biệt cho phát triển nghề nuôi cá tra Năng suất nuôi cá tra bình quân đạt tới mức 150-300 tấn/ha, diện tích nuôi cá tra của ĐBSCL 2007 lên đến 7000 ha đạt sản lượng trên 1 triệu tấn với giá trị xuất khẩu hơn 1 tỉ USD (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2008) Toàn vùng có 157 trại giống, năm 2007 và đã sản xuất được 4,1 tỉ cá giống đủ đáp ứng cho nhu cầu nuôi (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2008)

Ở ĐBSCL phong trào nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh ở khu vực ven sông Tiền và sông Hậu, nhất là ở tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long và Thành phố Cần Thơ Tuy nhiên do phát triển tự phát về diện tích và gia tăng cao mật độ nuôi 20-30con/m2 lên 50-70con/m2 thì ngoài việc tăn sản lượng, thu nhập cho

người nuôi nó có dẫn đến môi trường nuôi ở một số nơi có dấu hiệu ô nhiễm và dịch bệnh xảy ra thường xuyên gây thiệt hại lớn về kinh tế Một số bệnh thường gặp ở cá tra nuôi như lở loét, đốm đỏ, đốm trắng, hoại tử và xuất huyết các vây, tuột nhớt, bệnh gan thận mủ

2.2 Sinh lý máu và huyết học của cá

Ở cá, máu chiếm 2-4% trọng lượng cơ thể, ít hơn những động vật có xương sống khác (5-8%) Những thông số huyết học của cá liên quan đến tuổi, giới tính, khẩu phần ăn, lòai, mùa vụ trong năm và nhiệt độ nước (Branson, 1993)

2.2.1 Chức năng của máu

Máu cá tương tự như động vật có xương sống khác bao gồn thể dịch và các thành phần tế bào (Hibiya, 1982) Máu cá cũng có chức năng vận chuyển (khí, dinh dưỡng, các sản phẩm của quá trình trao đổi chất), chức năng điều hòa thể dịch, chức năng bảo vệ, duy trì môi trường bên trong cơ thể (Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000)

2.2.2 Thành phần và đặc tính lý hóa học của máu

Tế bào máu gồm có hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu (Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000)

Hồng cầu: Theo Supranee et al (1991), hồng cầu đuợc chia thành 2 nhóm: hồng

cầu trưởng thành và hồng cầu chưa trưởng thành Ở cá có dạng hình bầu dục, hai

bên lồi, ở giữa có nhân, kích thước biến đổi tùy theo lòai cá, to nhất là cá sụn, cá miệng tròn rồi đến cá xương Ở cá tra khoảng 6,16×6,87 µm Hồng cầu biến động theo tình trạng sinh lý của cá, theo giống loài, theo chế độ dinh dưỡng, theo tuổi cũng như sự biến động của các yếu tố môi trường Hồng cầu là những tế bào

có tính đàn hồi có thể co dãn được và biến đổi hình thể để chui vào các mao mạch Thành phần hóa học của hồng cầu gồm nước (60%), chất khô (40%) trong

đó chủ yếu là hemoglobine (90%) Mỗi hồng cầu chứa khỏang 340 triệu phân tử Hemoglobine Ngoài ra cũng có protein, lipip, muối vô cơ và enzyme Lượng Hemoglobine biến đổi theo sự biến đổi số lượng hồng cầu (Đỗ Thị Thanh Hương

và Trần Thị Thanh Hiền, 2000)

Bạch cầu: Theo Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền (2000) bạch cầu

là loại tế bào có nhân lớn, kích thước lớn hơn hồng cầu, số lượng bạch cầu biến đổi tùy loài, sinh lý, tuổi, dinh dưỡng, nhiệt độ, thành thục sinh dục Chức năng của bạch cầu là bảo vê cơ thể chống lại sự xâm nhập vào cơ thể bằng phương thức thực bào (do monocyte và neutrophil leucocyte) và tạo kháng thể (do

lymphocyte), góp phần vào quá trình rụng trứng và quá trình tiêu hóa Dựa vào các đặc tính bắt màu và thuốc nhuộm mà người ta chia ra làm 2 nhóm: bạch cầu

có hạt và bạch cầu không hạt

Bạch cầu có hạt: Nguyên sinh chất của bạch cầu có hạt bắt màu và nhân có

nhiều thùy Tùy loại màu nhuộm mà người ta chia thành bạch cầu ưa acid (acidophil leucocyte), bạch cầu ưa kiềm (basodophil leucocyte) và bạch cầu trung tính (neutrophil leucocyte) Bạch cầu trung tính (neutrophil leucocyte) có

số lượng nhiều nhất trong tổng số bạch cầu, chiếm từ 60-70% Có nhiều trong

máu ngoại vi, giữ vai trò chủ chốt trong phản ứng viêm, có khả năng ăn những tế bào nhỏ nên được gọi là tiểu thực bào Do vậy khi cơ thể bị thương, bạch cầu trung tính kéo đến để thực bào vi khuẩn và các vật lạ Nhân của bạch cầu này luôn biến đổi Lúc còn non nhân có hình que, khi già nhân phân ra các thùy, có thể từ 2-5 thùy

Bạch cầu ưa acid (acidophil leucocyte): chiếm từ 2-4% tổng số bạch cầu, đường kính từ 10-12 micron, các hạt trong nguyên sinh chất bắt màu acid Hạt trong nguyên sinh chất của bạch cầu này có kích thước lớn hơn hạt trong nguyên sinh chất của các loại bạch cầu có hạt khác Bạch cầu ưa acid tăng số lượng khi

cơ thể bị cảm nhiễm vi khuẩn, cảm nhiễm kí sinh trùng đường ruột và cá trạng thái dị ứng cũng như tiêm protein lạ vào cơ thể

Bạch cầu ưa kiềm (basodophil leucocyte): chiếm từ 0,5-1% tổng số bạch cầu Đường kính từ 8-10 micron Các hạt trong nguyên sinh chất bắt màu thuốc nhuộm kiềm Ở một số lòai cá không có lọai bạch cầu này Chức năng của nó chưa rõ nhưng khi thiếu vitamin A, lọai bạch cầu này tăng lên rõ rệt

Bạch cầu không hạt: là lọai không hạt bắt màu và nhân không chia thùy, có 2

loại: monocyte (có 1 nhân) và lymphocyte (có nhiều nhân)

Monocyte: có một nhân, liên kết với cá mô của cơ quan đích (thận, tỳ tạng, ống

tiêu hóa, ) để thực hiện chức năng thực bào ngay trong huyết quản, chỉ tồn tại vài ngày trong tuần hòan máu, tham gia vào quá trình trình diện kháng nguyên

Lymphocyte: chiếm khỏang 20-25% tổng số bạch cầu, ở các động vật còn non

có thể chiếm đến 50% Có khả năng thực bào khi ra ngoài mạch máu vào tổ chức liên kết Có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch sau khi liên kết với các mô của

cơ quan đích

Tiểu cầu: có kích thước nhỏ cỡ nhân hồng cấu, hình thoi không ổn định, tồn tại

trong máu từ 5-9 ngày, có nhân to, có một lớp nguyên sinh chất mỏng có vai trò

trong quá trình đông máu vì nó dễ tan để giải phóng men Thronbokinaza có tác dụng biến fibrinogen thành fibrin (Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000)

Đặc tính lý hóa học của máu: máu cá có tỉ trọng bình quân 1,032- 1,051 (Đỗ

Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000) Độ dẫn điện cá nước ngọt thấp hơn so với động vật bậc cao và áp suất thẩm thấu biến động tùy lòai (Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000)

2.3 Một số nghiên cứu về huyết học ở cá

Benli và Yildiz (2004) đã có nghiên cứu là có sự thay đổi các chỉ tiêu huyết

học của cá rô phi nhiễm Edwardsiella tarda Theo Ueda et al (2001) nghiên cứu thành phần các loại huyết cầu cá rô phi (Oreochromis niloticus) cho biết ở cá rô

phi có các loại huyết cầu tương tự ở người gồm hồng cầu, tiểu cầu và các loại bạch cầu Tác giả mô tả chi tiết hình dạng, cấu tạo và chức năng của các loại

huyết cầu cá rô phi Nghiên cứu về huyết học ở cá trê trắng (Clarias batrachus)

tác giả cho biết có 5 lọai tế bào máu tham gia vào vòng tuần hoàn máu gồm hồng cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu và tế bào lympho

(Chinabut et al., 1991) Trong khi đó, Hrubec et al (2000) đã đưa ra những số

liệu cụ thể về kích thước và số lượng từng lọai huyết cầu cá rô phi lai

(Oreochromis hybrid) Cá Trắm cỏ bị nhiễm bệnh do Aeromonas hydrophila thì

số lượng hồng cầu giảm, số lượng bạch cầu tăng lên Kích thước tế bào hồng cầu

cá bệnh nhỏ hơn cá bình thường So với cá khỏe bình thường, tỷ lệ các bạch cầu dạng basophil, neutrophil, bạch cầu monocyt, bạch cầu lymphocyt trong máu đều thay đổi Hiện tượng tăng bạch cầu lymphocyt cho thấy vai trò của tế bào lympho trong hoạt động bảo vệ cơ thể (Lưu Thị Dung, 2000) Khi sử dụng Basudin ở nồng độ 3,7mg/l đối với cá chép và cá mè vinh và 3,5mg/l đối với cá

rô phi thì tỉ lệ huyết cầu đều tăng so với đối chứng được thí nghiệm trong bể kính

và bể ximăng tại thời điểm 12 giờ, ngòai ra thể tích hồng cầu trung bình của đối tượng thí nghiệm đều giảm và tỉ lệ với nồng độ thuốc (Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) Theo Murty (1988) lượng hồng cầu và bạch cầu trong máu lươn ở các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ gia tăng cao hơn nghiệm thức đối chứng, và mức gia tăng vẫn giữ cao thậm chí khi lươn được thả trở lại môi trường nước không có thuốc (trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương,

1998) Theo Pimpão et al (2006) thì khi nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc Deltamthrin lên huyết học và enzime của cá Ancisstrus multipinis ở cả 2 nồng độ

0,1 và 0,3mg/kg đều tăng hồng cầu và bạch cầu Theo Đỗ Thị Thanh Hương

(1998) khi nghiên cứu ảnh hưởng của Basudin lên huyết học của cá chép, cá rô phi và mè vinh thì thấy số lượng hồng cầu tăng 1,3 lần ở cá chép, 1,5 lần ở cá rôphi, 1,6 lần ở cá mè vinh sau khi tiếp xúc với thuốc 12 giờ ở nồng độ LC50 96

giờ Theo Svobodova et al (1992) cho rằng số lượng hồng cầu và Hemoglobin

của cá chép tăng có ý nghĩa thống kê so với đối chứng khi tiếp xúc với thuốc trừ sâu có gốc lân hữu cơ, trong khi đó tỉ lệ huyết cầu thì ngược lại (trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) Tổng số lượng hồng cầu, hemoglobin và tỉ lệ huyết sắc

tố của cá Heteropneustes fossilis bị giảm xuống, trong khi đó số lượng bạch cầu tăng lên và làm chậm quá trình đông máu sau khi cá nhiễm MG (Srivastava et

al., 1996) Nguyễn Thanh Phương và Đỗ Thị Thanh Hương (1997) nghiên cứu

sự thay đổi sinh lý bên ngoài của cá rô phi (Oreochromis niloticus) giống thì

thấy khi đưa thuốc Methyl parathion (MP) vào các bể thí nghiệm thì lô có nồng

độ cao nhất (17 và 24 ppm) cá dần dần bất động và chìm xuống đáy bể sau 2 giờ

tiếp xúc với thuốc Nghiên cứu của Vosyliense et al (2003) về ảnh hưởng của

NH3 lên máu cá hồi (Oncorhynchus mykiss) trương thành trong thời gian 14 ngày

ở các nồng độ 0,09; 0,04; 0,024; 0,012 ppm Kết quả cho thấy hàm lượng hemoglobin và số lượng hồng cầu trong máu giảm có ý nghĩa (P<0,05) đồng thời gia tăng đáng kể các tế bào hồng cầu bị tổn thương Hồ Thị Thanh Tuyến (2008) khảo sát sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cá tra nuôi ở 2 mật độ khác nhau khi sử dụng kháng sinh Enrofloxacine Kết quả cho thấy số lượng bạch cầu và hồng cầu tăng sau khi cho an kháng sinh 7 ngày

2.4 Tổng quan tình hình bệnh, sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản

2.4.1 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long

Trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở ĐBSCL tăng rất nhanh, đem về cho đất nước một nguồn ngoại tệ rất lớn Thế nhưng, do phát triển quá nhanh không theo quy hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều nhưng việc điều trị lại kém hiệu quả đang là vấn đề quan tâm hàng đầu của người nuôi cá và cả các nhà chuyên môn Hàng năm các nguồn chất thải do nuôi trồng thủy sản ở khu vực ĐBSCL thải ra chưa được xử lý triệt

để vào sông rạch trong khu vực là rất lớn làm mất cân bằng sinh thái trong nuôi trồng thủy sản mà thể hiện rõ nét ở tình trạng dịch bệnh phát sinh trên diện rộng

do ô nhiễm môi trường đối với đối tượng nuôi này tăng nhanh gây tổn thất kinh

tế trong nghề nuôi cao Theo Bùi Quang Tề (2001) và Nguyễn Thị Phương Nga (2004) dịch bệnh trong nghề nuôi cá tra hiện nay xảy ra quanh năm nhưng cao

nặng nhất là trong giai đọan giao mùa, thời tiết, nhiệt độ thay đổi đột ngột và vào mùa mưa, mùa nước đổ Trên cá Tra bè bệnh do vi khuẩn chủ yếu do

Flavobacterium columnaris (Nguyễn Quốc Thịnh, 2006) Trên cá Tra nuôi ao,

khảo sát của Truong Thi Ho et al (2008) cho thấy E ictaluri hiện diện 87,9% trong số 58mẫu phân lập từ 65 mẫu cá bệnh, A hydrophila là 3,03% trong 2 mẫu

phân lập và 9,07% trong 6 mẫu phân lập là thuộc các vi khuẩn khác Nguyễn Chính (2005) khảo sát các hộ nuôi cá tra ao ở An Giang và Cần Thơ bệnh xuất huyết dưới da xuất hiện ở 100% hộ điều tra, bệnh xuất huyết ở gốc vây, hốc mắt chiếm 29%, bệnh xuất huyết đường ruột chiếm 12% Bệnh xuất huyết dưới da xảy ra nhiều nhất là thời điểm giao mùa và người dân cho rằng nếu không điều trị kịp thời cá thương phẩm có thể chết 30% Tại Trà Vinh, Châu Hồng Thúy (2008) báo cáo tỷ lệ cá Tra nhiễm bệnh xuất rất cao chiếm 85,4%, thấp hơn bệnh

mủ gan (96%) nhưng lớn hơn rất nhiều so với bệnh trắng gan trắng mang (28,2%), bệnh phù đầu (18,8%) và bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ (4,2%) Theo nghiên cứu

của Lê Thanh Hùng và ctv (2000), Từ Thanh Dung (2003) hiện tượng chết hàng

loạt trong quá trình ương cá Tra bột có liên quan tới việc cá bị sốc, cá cắn và ăn

lẫn nhau tạo điều kiện cho vi khuẩn A hydrophila tấn công và làm chết cá

Một số nghiên cứu về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

E ictaluri là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, hình que, Gram âm, kích thước

biến đổi, không di động, lên men, không bị oxi hóa, phân bố rộng (Từ Thanh

Dung và ctv, 2004) Các chỉ tiêu sinh hóa của E ictaluri đều âm tính, riêng lysine và glocose cho phản ứng dương tính (Từ Thanh Dung và ctv, 2004) Theo thí nghiệm của Newton et al (1989), cá nheo (channel catfish) được ngâm trong

dung dịch có lượng ki khuẩn 5×108 cfu/ml có 93% cá nheo bị nhiễm bệnh Plumb and Hilge(2007)xác định LD50 của E ictaluri trong thí nghiệm với cá da

trơn Châu Âu là 5,6×106 và LD50 của E ictaluri trong thí nghiệm cảm nhiễm với

cá nheo (Ictalurus punctatus) là 104 Lương Trần Thục Đoan (2006) khi gây cảm

nhiễm bằng phương pháp tiêm vi khuẩn E ictaluri trên cá tra ở nhiệt độ 260C –

280C đưa ra kết luận mật độ vi khuẩn 1×106 cfu/ml và 1×105 cfu/ml có độc lực

đủ mạnh để gây chết cá Hùynh Chí Thanh (2007) cho biết LD50 là 3,16×106 cfu/ml khi tiến hành phân lập vi khuẩn ở ngòai tự nhiên (cá tra bệnh mủ gan ở

An Giang) Vi khuẩn E ictaluri đã được phân lập trên cá trê sông nâu (Ictalurus

nebulosus) và vi khuẩn này cũng được phát hiện trên cá nheo Mỹ (channel catfish) (Hawke, 1979) Ngòai ra Crumlish (2001) và Bùi Quang Tề (2003) vi

khuẩn này cũng được phân lập trên cá tra nuôi (Pangasius hypophthalmus) (trích

dẫn của Bùi Quang Tề, 2005) Rahman and Kawai (2000) thí nghiệm gây cảm

nhiễm Aeromonas hydrophila cá vàng bằng 4 cách gây cảm nhiễm là tiêm ở

bụng (3×108 - 3×104 cfu/ml), ở cơ (8×108 – 8×104 cfu/ml), ở da (8,5×108 – 8,5×104 cfu/ml) và ngâm cá trong vi khuẩn (4,6×108 – 4,6×104 cfu/ml) So sánh kết quả cho thấy tiêm dưới da có biểu hiện độc lực cao nhất với LD50 là 106,4cfu/ml

2.4.2 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản

Việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản rất khó kiểm sóat Theo Nguyễn Xuân Lý và Nguyễn Chu Hồi (2003) trong ao nuôi thủy sản đều có

sử dụng thuốc và hóa chất Theo Nguyễn Thị Phương Nga (2004) trong 40 lọai hóa chất được sử dụng trong mô hình nuôi thâm canh và bán thâm canh chủ yếu với mục đích diệt tạp và xử lý nước và kháng sinh được người nuôi sử dụng trong quá trình nuôi thường ở dạng kháng sinh đơn lẻ chủ yếu Cách sử dụng thuốc thì chủ yếu người nuôi dựa vào kinh nghiệm và tự pha trộn Theo trích dẫn của Hồ Thị Thanh Tuyền (2008) người nuôi dùng thuốc theo chỉ dẫn của người bán hoặc theo nhãn thuốc (64%), theo kinh nghiệm bản thân (59%), rất ít người theo chỉ dẫn của cán bộ khuyến ngư (3%) Mặt khác người nuôi biết rõ về danh mục các lọai thuốc cấm nhưng một số người vẫn còn sử dụng mà chưa hiểu rõ về các nguy cơ của việc sử dụng thuốc, hóa chất trong phòng trị bệnh cá (Nguyễn Chính, 2005)

Theo kết quả kiểm sóat dư lượng các chất độc hại trong sản phẩm thủy sản nuôi tháng 12/2007 của Bộ Thủy sản cập nhật ngày 29/1/2008 tại Cao Lãnh - Đồng Tháp phát hiện một mẫu cá tra nhiễm Chloramphenicol (0,43 ppb), phát hiện dư lượng kháng sinh hạn chế sử dụng thuộc nhóm Fluoroquinolones trong

05 mẫu cá tra, trong đó có 04 mẫu nhiễm Enrofloxacin/Ciprofloxacin (03 mẫu tại Châu Đốc, Long Xuyên, Chợ Mới – An Giang; 01 mẫu tại Thốt Nốt, Cần Thơ, giá trị phát hiện từ 2,33 – 70,7 ppb) và 01 mẫu nhiễm Sarafloxacin (tại Thốt Nốt-Cần Thơ với mức phát hiện là 10,1 ppb) nhưng đều ở dưới mức giới hạn tối đa cho phép Theo báo cáo 05 mẫu cá tra có dư lượng flofeniclo (tại Châu Đốc- An Giang; Thốt Nốt, Ô Môn-Cần Thơ, Phụng Hiệp-Hậu Giang, Tx Vĩnh Long-Vĩnh Long, mỗi địa phương 01 mẫu) nhưng đều thấp hơn nhiều so với mức giới hạn tối đa cho phép (giá trị phát hiện từ 0,2 đến 210,69 ppb) Tại Đồng Tháp, Nguyễn Quốc Thịnh (2006) nhận thấy rằng, có 48 loại thuốc kháng sinh trị bệnh thì Encrofloxacine chiếm 83,3% và Encrofloxacine chiếm 69,6% Châu Hồng

Thúy (2008) trên cá Tra nuôi thì kháng sinh cấm sử dụng có thành phần Norfloxacine, Enrofloxacine vẫn có người nuôi cá sử dụng với quan niệm kháng sinh trên vẫn được sử dụng khi cá còn nhỏ

2.5 Tổng quan thuốc trừ sâu Cyrus (chứa hoạt chất cypermethrin)

2.5.1 Cypermethrin:

Đại cương về Cypermethrin:

Hình 2.7: Cấu tạo Cypermethrin

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/) Công thức Cypermethrin: C22H19Cl2NO3

Khối lượng phân tử: 416.30 g/mol

Tên hóa học: Cyclopropanecarboxylic acid, dimethyl-, cyano(3-phenoxyphenyl)methyl ester

3-(2,2-dichloroethenyl)-2,2-Tên thương mại: bao gồm Ammo, Arrivo, Barricade, Basathrin, CCN52, Cymbush, Cymperator, Cynoff, Cypercopal, Cyperguard 25EC, Cyperhard Tech, Cyperkill, Cypermar, Demon, Flectron, Fligene CI, Folcord, Kafil Super, NRDC

149, Polytrin, PP 383, Ripcord, Siperin, Stockade, Super, Cyrux 25EC

Một vài tính chất của Cyrux 25EC:

Cyrux 25EC (Cypermethrin 25%, Phụ gia 75%) là thuốc trừ sâu thế hệ mới, thuộc nhóm Cúc tổng hợp, có tính tiếp xúc và vị độc, diệt trừ nhiều loại sâu gây hại như: cắn phá, chích hút, đục hoa, đục quả Cypermethrin có dạng nhũ dầu (ở

600C chuyển thành dạng dung dịch lỏng), hầu như không tan trong nước, tan nhiều trong dung môi hữu cơ, tương đối bền trong môi trường trung tính và acid nhẹ, thủy phân trong môi trường kiềm, quang giải yếu Cypermethrin là một hợp chất tổng hợp, chủ yếu được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu để kiểm soát nhiều loại sâu bệnh (Casida, 1980) Cypermethrin là loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm độc II và chỉ có tính độc trung bình đối với động vật máu nóng nhưng lại

có độc tính cao đối với cá, ong và các lòai côn trùng

Một số nghiên cứu về Cypermethrin:

Cypermethrin thực tế không gây độc cho loài chim (Yilmaz, 2005) Cypermethrin hòa tan trong nước rất thấp từ 5-10 µg/L (Stephenson, 1982) trích dẫn bởi Suchismita Saha (2008) Bradbury and Coats (1989) đã báo cáo độc tính của pyrethroid đối với những động vật hữu nhũ, các loài chim, cá và đưa ra giá trị LC50-96h của cypermethrin là 2,2µg/L trên cá Tilapia nilotica, 0,9 – 1,1 µg/L trên cá chép (Cyprinus carpio), 1,2 µg/L trên cá brown trout (Salmo trutta), 0,5 µg/L trên cá rainbow trout (Salmo gairdneri) và 0,4 µg/L trên cá Scardinius

cypermethrin trên nhóm guppies 21,4 µg/L Theo Stephenson (1983) đã cho kết quả nghiên cứu LC50 của cypermethrin trên cá loài cá như: 2,8 µg/L trên cá

rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), 1,2 µg/L trên cá fathead minnow và 0,93 µg/L trên Pimephales promelas Trên nghiên cứu khác của Stephenson (1982) cũng nghiên cứu ảnh hưởng của cypermethrin trên một số lòai cá như Cyprinus

carpio, Scardinius erythrophthalmus, Salmo gairdneri, Salmo trutta và Tilapia

Theo Suchismita Saha (2008) đã tìm được giá trị LC50 96h của cypermethrin

từ 0,03 µg/L trên giáp xác đến 9,0 µg/L trên nòng nọc Là loại thuốc trừ sâu có

tác dụng độc lên một số chỉ tiêu sinh hóa của cá đã được báo cáo (Oluah et

al,2001; Omoregie et al, 1990) Ở Việt Nam, cypermethrin là loại thuốc trừ sâu

phổ biến do đó có khả năng rằng nó có thể làm ô nhiễm nguồn nước trong lĩnh vực ứng dụng Ngoài ra, đôi khi thuốc trừ sâu được sử dụng để kiểm sóat bệnh

cá, hiện nay, (pyrethroid tổng hợp) cypermethrin với liều rất thấp đang được sử dụng rộng rãi để kiểm soát bệnh argulus và tiêu diệt ấu trùng các loài cá tạp trong quá trình cải tạo ao

CHƯƠNG 3:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá tra giống có kích cỡ từ 25-30g được mua từ trại sản xuất giống hay ương

cá tại Cần thơ Cá mua về sẽ được thuần dưỡng trong bể có thể tích 2-3 m3 ít nhất 7 ngày cho cá ổn định và quen với điều kiện sống trong bể trước khi bố trí thí nghiệm Cá được cho ăn 2 lần/ngày bằng thức ăn Cargill Cá chọn thí nghiệm

có kích cỡ đồng điều, khỏe và hoạt động mạnh

3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

Xô nhựa, cân tiểu li, thước đo chiều dài,dụng cụ tiểu phẩu, kính hiển vi quang học, buồng đếm hồng cầu Naubauer, hay nhuộm mẫu, pipet, ống đong, máy li tâm, máy so màu quang phổ, dụng cụ, thiết bị thí nghiệm được dùng tại phòng thí nghiệm Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.3 Hóa chất

Thuốc trừ sâu trong thí nghiệm: Cyrus 25EC (hoạt chất cypermethrin) là thuốc

trừ sâu thuộc gốc cúc tổng hợp và có nồng độ hoạt chất là 250 g/L Cyrus 25EC

do Công ty CP BVTV An Giang sản xuất

Phương pháp pha nồng độ thuốc: thuốc được pha thành 2 bước, bước 1 pha

dung dịch thuốc mẹ từ thuốc ban đầu và bước 2 là pha nồng độ thuốc cho các bể thí nghiệm Cả 2 dung dịch pha (dung dịch mẹ và dung dịch thí nghiệm) đều dựa vào công thức tính nồng độ sau: C1xV1 = C2xV2

Trong đó:

C1 là nồng độ thuốc dung dịch mẹ

V1 là thể tích dung dịch mẹ cần cho vào bể thí nghiệm

C2 là nồng độ thuốc cần cho thí nghiệm

V2 là thể tích dung dịch thuốc trong thí nghiệm

Hóa chất phân tích mẫu:

Dung dịch nhuộm hồng cầu: Dung dịch Natt-Herrick

Dung dịch nhuộm bạch cầu: Dung dịch Methanol 100%, Wright, Giemsa, dung dịch pH 6,2; pH 6,8; nước cất, nước muối sinh lí

3.1.4 Vi khuẩn

Nguồn vi khuẩn thuần chủng CT258 trữ trong tủ -800C của Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản, Khoa thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn:

Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA ở 280C Sau 24-48h quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm Gram kiểm tra tính thuần của vi khuẩn

Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm:

Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que cấy tiệt trùng lấy khỏang 2-3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml NB đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24h Sau 24h chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem li tâm 4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút Sau khi li tâm lọai bỏ dung dịch phía trên và dùng nước muối sinh lí tiệt trùng để rửa

vi khuẩn (2-3 lần) Lần li tâm cuối cùng, lọai bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khỏang 25ml dung dịch nước muối sinh lí tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy vortex

Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy so màu quang phổ với bước sóng 610nm (OD= 1 ± 0,1≈109 cfu/ml) sau đó dung dịch vi khuẩn được pha loãng 10 lần (1ml dung dịch vi khuẩn 109 cfu/ml + 9ml nước muối sinh lý)

để lần lược được các mật độ 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102 cfu/ml Mật độ vi khuẩn cũng được xác định bằng cách nhỏ 20µl (lặp lại 6 lần) dung dịch vi khuẩn

đã điều chỉnh mật độ lên đĩa TSA và ủ ở 28-30o

C rồi đếm số khuẩn lạc trung bình sau 24-48 giờ

Bước 1: Thí nghiệm xác định khoảng gây độc (thí nghiệm thăm dò)

Thí nghiệm sẽ được tiến hành trong bể kính 60 L có thể tích nước là 50 lít Mỗi bể thả 10 cá với kích cỡ là 20- 25 g/con Thí nghiệm được tiến hành với 8 mức nồng độ gồm 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 và 0,3 mg/L Cá cho vào bể và

không cho ăn 2 ngày trước khi thí nghiệm để tránh phân cá làm ảnh hưởng đến thí nghiệm Nước được cho vào bể nhựa lót nilon 60L chứa 50L nước và sục khí liên tục trong 1-2 ngày để khử chlor trước khi thí nghiệm

Trong thời gian thí nghiệm, bể được sục khí nhẹ nhằm đảm bảo đủ oxy cho

cá Cá chết được ghi nhận vào các khoảng thời gian sau thí nghiệm như 6, 9, 12,

24, 48 và 96 giờ Khi xuất hiện cá chết sẽ được loại ra khỏi bể thí nghiệm để hạn chế ảnh hưởng đến chất lượng nước

Thí nghiệm nhằm xác định nồng độ cao nhất gây chết không quá 10% cá sau

96 giờ và nồng độ thấp nhất gây chết khoảng 90% cá sau 1-2 giờ Khoảng nồng

độ này cơ sở cho bố trí thí nghiệm xác định LC50

Bước 2: Thí nghiệm xác định giá trị LC 50

Thí nghiệm này được dựa vào kết quả của thí nghiệm xác định khỏang gây chết Trong giới hạn nồng độ thuốc gây chết sẽ được chia thành 6 mức nồng độ

và 1 đối chứng Các nghiệm thức được bố trì hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại cho mỗi nghiệm thức Thí nghiệm được bố trí trong bể kính hình chữ nhật chứa 50 L dung dịch Mỗi bể thả 10 cá, cá được thả vào bể 2-3 ngày trước khi cho thuốc vào Trước khi cho thuốc cần vệ sinh sạch bể, trong thời gian thí nghiệm các bể được sục khí nhẹ và liên tục và không thay nước

Theo dõi và ghi nhận số cá chết sau 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ sau thí nghiệm Khi phát hiện cá chết sẽ được loại ra khỏi bể thí nghiệm để hạn chế ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

Giá trị LC50 được xác định dựa vào phương pháp Probit (Finey, 1971)

3.2.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của vi khuẩn E ictaluri lên một số chỉ tiêu

huyết học của cá tra giống

Thí nghiệm xác định LD 50 : thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6

nghiệm thức và nghiệm thức đối chứng không tiêm, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con/bể Cá thí nghiệm được tiêm (0,1ml vi khuẩn/cá) tại gốc vi

ngực mật độ vi khuẩn E ictaluri tiêm cho cá thí nghiệm được trình bày như

sau :

Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 14 ngày Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẩu quan sát dấu hiệu bệnh mủ gan và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận tỳ tạng Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) được xác định theo công thức của Reed and Muench (1938) :

LogLD50= LogA +(50%-d%)/(%t-%d)xLog10

Trong đó : LogA : nồng độ nhỏ và cận 50%

Log 10 : độ pha loãng

%d : % số cá chết nhỏ và cận 50%

%t : % số cá chết lớn và cận 50%

Chuẩn bị thí nghiệm : cá thí nghiệm (trọng lượng từ 20-25g) được nuôi dưỡng

trong bể có thể tích 1m3, có sụ khí và cho ăn hằng ngày theo nhu cầu Trước khi thí nghiệm cá được lựa chọn là những cá khỏe, nước và dụng cụ thí nghiệm được khử trùng, bằng chlorine

Bố trí thí nghiệm: gồm 3 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Bố trí

25con/bể và các nghiệm thức gồm:

NT1: Nghiệm thức đối chứng (cá được tiêm với nước muối sinh lý)

NT2: Nghiệm thức cá được tiêm với vi khuẩn E ictaluri với nồng độ LD50

NT3: Nghiệm thức cá được tiêm với vi khuẩn E ictaluri với nồng độ 10% LD50 3.2.4 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của Cypermerthrin lên một số chỉ tiêu chỉ tiêu huyết học của cá tra giống

Bố trí thí nghiệm: gồm 3 nghiệm thức và mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Bể đối

chứng chứa cá không gây cảm nhiễm thuốc Chọn cá đồng cỡ và không cho ăn một ngày trước khi bố trí thí nghiệm Cá được cân trọng lượng và đo chiều dài trước khi thả vào bể thí nghiệm Trong thời gian 14 ngày thí nghiệm cá không cho ăn Bố trí 40 con/bể (100lít) và các nghiệm thức thí nghiệm gồm:

NT1: Nghiệm thức đối chứng

NT2: cá được nuôi trong bể có hóa chất Cypermerthrin với nồng độ 50% LC50 NT3: cá được nuôi trong bể có hóa chất Cypermerthrin với nồng độ 10% LC50

3.3 Phương pháp thu mẫu

3.3.1 Thời gian thu mẫu

Thu mẫu cá nhiễm vi khuẩn

Theo dõi bệnh lý của cá

Thu mẫu cá lờ đờ và cá chết sau đó cân trọng lượng, đo chiều dài từng con Thu máu để phân tích huyết học và các chỉ tiêu khác

- Lấy mẫu cá sau 0, 3,6, 12, 24, 48, 96 giờ

- Vớt những cá có dấu hiệu lờ đờ hoặc gần chết

Thu mẫu cá nhiễm hóa chất

Quan sát và ghi nhận những dấu hiệu cũng như biểu hiện của cá, theo dõi tỉ lệ chết của cá trong suốt quá trình thí nghiệm

- Lấy mẫu cá sau 0, 3, 6, 12, 24, 48, 96 giờ

- Thu mẫu kiểm tra các chỉ tiêu huyết học trên những mẫu cá có dấu hiệu lờ đờ, gần chết

3.4 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu huyết học

đó cho vào dung dịch Giemsa trong 20-30 phút Tiếp tục cho mẫu vào dung dịch

pH 6.2 từ 15-30 phút Rửa sạch mẫu bằng nước cất, để khô tự nhiên Đọc kết quả dưới kính hiển vi

Phương pháp đo Hematorite

Theo Larsen và Snieszko (1961) (Trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) (Phụ lục 4)

Phương pháp so màu quang phổ

Theo Oser (1965) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) (Phụ lục 4)

Số lượng huyết sắc tố mmol/l

Thể tích hồng cầu (MCV: mean cell volume):

Tỷ lệ huyết cầu (%) MCV ((µm3)= x 10

CHƯƠNG 4:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Giá trị LC 50 của thuốc trừ sâu Cyrus 25EC chứa hoạt chất cypermethrin lên cá tra

Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nước tĩnh, các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm được trình bày trong Bảng 1 Cho thấy nhiệt độ buổi chiều cao hơn buổi sáng từ 0,2-0,4oC pH khá ổn định trong thời gian thí nghiệm 7,12 đến 7,34 Hàm lượng oxi hòa tan nằm trong khoảng 4,69 mg/L ở các nghiệm thức Hàm lượng oxi hòa tan từ lúc bắt đầu thí nghiệm đến thời điểm cuối thí nghiệm có sự chênh lệch lớn là do suốt quá trình thí nghiệm các bể tiến hành trong điều kiện hoàn toàn không sục khí, cá sử dụng oxi trong quá trình hô hấp làm giảm dần lượng oxi hòa tan trong nước Tuy nhiên lượng oxi gần như đồng đều giữa các nghiệm thức ở từng thời điểm

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường trong bể trước khi tiến hành thí nghiệm

Giá trị: trung bình ± độ lệch chuẩn

Các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm khá đồng đều và ổn định giữa các nghiệm thức thích hợp cho sự phát triển bình thường của cá Khi cho thuốc trừ sâu cyrus 25EC vào bể cá thí nghiệm, cá bắt đầu chết nhiều trong 3-9 giờ và số cá chết tỉ lệ thuận với nồng độ thuốc thí nghiệm từ 0 (đối chứng) đến nồng độ cao nhất là 0,3 mg/L, cá tăng hoạt động hô hấp và giảm hoạt động bơi lội, thời gian hoạt động bơi lội giảm khi nồng độ thuốc gia tăng Ở nồng độ thuốc cao khi tiếp xúc thuốc sau 1 giờ mang cử động mạnh để tăng cường hô hấp, cá biểu hiện mất thăng bằng, bơi lội không định hướng, giảm bơi lội, sau đó cá chết

Tỷ lệ chết gia tăng theo sự gia tăng nồng độ

Kết quả thí nghiệm cho thấy giá trị LC50-96h của cypermethrin đối với cá tra khá cao Giá trị LC50-96 giờ của cypermethrin đối với cá tra của thí nghiệm này

là 0,072 mg/L Một số nghiên cứu khác với hoạt chất cypermethrin cho thấy giá trị LC50-96 giờtrên cá giống Labeo rohita được tìm thấy ở nồng độ 0,139 mg/L

(Basanta, 2002), giá trị LC50-24h của họat chất cypermethrin trên cá Cyprinus

carpio là 1,86 ppm (Suvetha, 2010) Tuỳ loại hoạt chất, loài cá khác nhau mà

giá trị LC50 khác nhau Độc tính của thuốc trừ sâu còn tuỳ thuộc vào kích cỡ cá,

cá nhỏ chịu đựng kém hơn cá lớn là do hàm lượng lipid trong cơ thể cá lớn cao nên dự trữ được nhiều độc chất hơn (Murty, 1988) Cá hoạt động mạnh sau khi tiếp xúc với cypermethrin làm tăng quá trình trao đổi chất dẫn đến tăng hấp thu

chất độc trong cơ thể Sự tổn thương trê thận cá theo Farombi et al (2008) thí nghiệm Butachlor trên cá Clarias gariepinus thì sự giảm hoạt tính men GST ở

thận liên quan đến sự dư thừa chất bất hoạt enzyme, chất này tạo liên kết cystine (cysteina β-lyase hoặc chất nền chứa O-) từ chất chuyển hóa glutathion (GSH) và gây độc trên thận Tuy nhiên, Koesoemadinata và Djajadirecdja (1976) cho rằng độc tính của thuốc BVTV có giá trị LC50<1 mg/L nằm trong nhóm thuốc BVTV

có độc tính cao Giá trị LC50-96 giờ là 0,072mg/L thì cyrus 25EC chứa hoạt chất cypermethrin có độc tính rất cao đối với cá tra giống Theo Đỗ Thị Thanh Hương

và Nguyễn Văn Tư (2010) thì các chất độc xuất hiện trong môi trường nước có thể làm tổn thương các tế bào biểu bì mang, làm đông đặc chất nhầy tạo thành một màng bao bọc bề mặt hô hấp, ngăn cản quá trình trao đổi khí giữa cá và nước và cá sẽ chết ngạt Ngoài ra, các chất độc cũng có thể làm tổn thương cơ quan hô hấp phụ như da, cơ quan trên mang và ruột

4.2 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cyrus chứa hoạt chất cypermethrin lên chỉ tiêu huyết học

4.2.1 Số lượng hồng cầu

Bảng 4.1 Số lượng hồng cầu (106 tế bào/mm3) của cá trong quá trình thí nghiệm với cypermethrin

Nghiệm thức Thời Gian Thu Mẫu

Đối chứng

0,036 mg/L (cypermethrin)

0,072 mg/L (cypermethrin)

Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Kết quả thí nghiệm cho thấy số lượng hồng cầu của cá tra có xu hướng giảm

so với đối chứng sau khi tiếp xúc với cypermethrin Sau 3h cá tiếp xúc thuốc tổng lượng hồng cầu của cả 2 nghiệm thức đều giảm so với đối chứng, ở nồng độ 0,072 mg/L giảm từ 2,15 triệu tế bào/mm3 xuống 1,54 triệu tế bào/mm3 (giảm 28,37%) và 0,036 mg/L giảm từ 2,073 triệu tế bào/mm3 xuống 1,453 triệu tế bào/mm3 (giảm 29,90%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Số lượng hồng cầu ở nghiệm thức 0,072 mg/L và 0,036 mg/L cho thấy sau khi cá tiếp xúc thuốc cyrus có xu hướng tăng nhẹ ở 6h và 9h nhưng khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng Ở thời điểm 12h sau khi cá tiếp xúc thuốc số lượng Hồng cầu cả 2 nghiệm thức giảm so với đối chứng, ở nồng độ thuốc 0,072 mg/L giảm từ 2,09 triệu tế bào/mm3 xuống 1,473 triệu tế bào/mm3 (giảm 29,52%) và 0,036 mg/L giảm từ 2,09 triệu tế bào/mm3 xuống 1,783 triệu tế bào/mm3 (giảm 14,68%), khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) Nghiệm thức 0,072 mg/L cho ta thấy số lượng hồng cầu giảm khác biệt có ý nghĩa ở các thời điểm so với đối chứng (p<0,05) Hiện tượng giảm tế bào hồng cầu có khả năng do cypermethrin làm ức chế cơ quan tạo và tổng hợp hồng cầu, gia tăng phá hủy hồng cầu trong cơ quan tạo máu Đến 96 giờ cả hai nghiệm thức ở nồng độ 0,072 mg/L và 0,036 mg/L tổng lượng hồng cầu tăng nhẹ nhưng vẫn thấp hơn và không khác biệt so với đối chứng

Kết quả này cũng tương tự như một số nghiên cứu khác cùng hoạt chất cypermethrin trên cá rohita số lượng hồng cầu giảm có ý nghĩa so với đối chứng

ở nồng độ thuốc 0,16µg/L, 0,4µg/L và 0,8 µg/L sau khi tiếp xúc thuốc trong suốt quá trình thí nghiệm (Adhikari et al , 2004) Sự thay đổi tổng lượng hồng cầu của cả 2 nghiệm thức cá rohita nhiễm cypermethrin trong 45 ngày cho thấy giảm

so với đối chứng nhưng khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05) (Das, 2003)

Tuy nhiên theo Hii và ctv (2007) nghiên cứu trên lươn đồng khi tiếp xúc với endosulfan hồng cầu tăng sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, nhưng thời điểm 96 giờ hồng cầu lại giảm so với đối chứng Sau khi tiếp xúc với diazinon (2 mg/L, 4 mg/L, 8 mg/L, 16 mg/L, 32 mg/L) số lượng hồng cầu giảm thấp và khác biệt có

ý nghĩa so với đối chứng ở thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ trên cá da trơn giống (Koprucu et al, 2006) Khi cá tiếp xúc với thuốc diazinon thì mang của cá sẽ bị hoại tử hay lớp màng nhầy của mang bị cô đặc lại làm ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của cá, cá sẽ phản ứng lại thông qua gia tăng số lượng hồng

cầu bằng cách huy động lượng máu từ kho dự trữ hoặc tăng nhanh quá trình tạo máu (Đỗ Thị Thanh Hương, 2010)

Cá tiếp xúc với nồng độ thuốc cao, thuốc thâm nhập vào máu hồng cầu bị phá vỡ làm cho số lượng hồng cầu trong cơ thể giảm thấp và có hiện tượng nhân hồng cầu phân thùy hay phân hủy cũng xuất hiện trên lame Những biểu hiện bất thường ở hồng cầu như trên cũng được Vosyliene & Svecevìeius (1997) mô tả như là biểu hiện bệnh lý của cá nhiễm độc kim loại Tế bào hồng cầu được tạo ra

từ mô của tụy hoặc tì tạng, khi cá tiếp xúc thuốc ở nồng độ cao cơ quan tạo hồng

cầu bị phá vỡ ảnh hưởng đến quá trình tạo hồng cầu trong máu (Morgan et al.,

Đối chứng

0,036 mg/L (cypermethrin)

0,072 mg/L (cypermethrin)

Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

Sau 3 giờ, bạch cầu của cá ở nghiệm thức đều bị giảm, nghiệm thức ở nồng

độ 0,072 mg/L giảm từ 18,23 nghìn tế bào/mm3 xuống 12,40 nghìn tế bào/mm3(giảm 31,98%) và nghiệm thức ở nồng độ 0,036 mg/L giảm từ 17,64 nghìn tế bào/mm3 xuống 12,30 nghìn tế bào/mm3 (giảm 30,27%) đồng thời cũng giảm khác biệt có ý nghĩa so với số lượng bạch cầu của cá ở lô đối chứng Cá tiếp xúc thuốc Cyrus sau 6h tổng lượng bạch cầu vẫn giảm so với ban đầu và so với đối chứng, nghiệm thức cá tiếp xúc thuốc ở nồng độ 0,072 mg/L giảm 20,65% và nghiệm thức ở nồng độ 0,036 giảm 24,09% so với đối chứng tại cùng thời điểm

6 giờ Sau 12 và 24 giờ số lượng bạch cầu của cá ở nghiệm thức 0,072 mg/L vẫn còn giảm và sai khác có ý nghĩa Sau 96 giờ lượng bạch cầu ở 2 nồng độ 0,072

mg/L và 0,036 mg/L có tăng nhưng vẫn thấp hơn so với đối chứng Khi thuốc thâm nhập vào cơ thể ở nồng độ cao, bạch cầu bị phá hủy bởi thuốc và các cơ quan sản sinh bạch cầu bị ảnh hưởng cao bởi thuốc làm số lượng bạch cầu của cá

giảm (Morgan et al , 1980 trích dẫn Koprucu et al , 2006) Sau 3 ngày các cơ

quan trong cơ thể cá dần dần phục hồi nhằm giúp cơ thể thoát khỏi tình trạng

“stress” sinh lý ở các nghiệm thức và không còn khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng

Sự thay đổi số lượng bạch cầu là phản ứng của cơ thể nhằm thích nghi với điều kiện bất lợi của môi trường sống Nhiều nghiên cứu trước cũng cho thấy sự

thay đổi số lượng bạch cầu khi cá tiếp xúc thuốc trừ sâu (Hii et al., 2007; Koprucu et al., 2006; Khoshbavar-Rostami et al, 2006)

4.2.3 Hàm lượng huyết sắc tố (Hemoglobin, mmol/l)

Bảng 4.3: Hàm lượng huyết sắc tố (mmol/l) của cá trong quá trình thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin

Nghiệm Thức

Thời Gian Thu Mẫu Đối chứng

0,036 mg/L (cypermethrin)

0,0372 mg/L (cypermethrin)

Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Hàm lượng hemoglobin của cá có xu hướng giảm dần sau khi cá tiếp xúc cypermethrin Sau khi tiếp xúc thuốc 6 giờ, hàm lượng hemoglobin của cá ở cả 2 nghiệm thức giảm đáng kể, nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,072 giảm từ 9,97 mmol/L xuống 7,54 mmol/L (giảm 24,93%) và nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,036 mg/L giảm từ 9,97 mmol/L xuống 7,48 mmol/L (giảm 24,33%) so với nghiệm thức đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê so (p<0,05) Sau 48 giờ, hàm lượng hemoglobin của cá ở cả 2 nghiệm thức giảm đáng kể, nghiệm thức

có nồng độ thuốc 0,072 giảm từ 7,95 mmol/L xuống 5,31 mmol/L (giảm 34,80%) và nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,036 mg/L giảm từ 7,95 mmol/L

xuống 5,18 mmol/L (giảm 33,21%) so với nghiệm thức đối chứng và khác biệt

có ý nghĩa thống kê so (p<0,05) Nhìn chung hàm lượng huyết sắc tố cá cá nhiễm cypermethrin có xu hướng giảm trong suốt thời gian thí nghiệm

Nghiên cứu sự nhiễm độc cypermethrin trên cá tra đã đem lại kết quả là làm giảm tế bào hồng cầu, hemoglobin và gây ra hiện tượng thiếu máu Hàm lượng hemoglobin giảm ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển oxy trong máu Kết quả

này tương tự như kết quả của (Koprucu et al, 2006) khi cho cá tiếp xúc với diazinon hemoglobin giảm khi nồng độ thuốc gia tăng Adhikari et al (2004)

nghiên cứu trên loài cá xương, khi cá tiếp xúc với cypermethrin và carbofuran hàm lượng huyết sắc tố trong máu giảm mạnh khi nồng độ thuốc gia tăng Cá tra tiếp xúc với malachite green hàm lượng huyết sắc tố cũng giảm (Lương Thị Diễm Trang, 2009)

0,072 mg/L (cypermethrin)

Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

Sự biến động tỷ lệ huyết cầu của cá sau khi tiếp xúc cypermethrin được trình bày ở bảng dưới đây Kết quả cho thấy sau khi tiếp xúc thuốc 3 giờ tỷ lệ huyết cầu có xu hướng tăng nhẹ ở nghiệm thức 0,072 mg/L tăng 11,15% từ 37,9% tỉ lệ huyết cầu lên 43,57% tỉ lệ huyết cầu và ở nghiệm thức có nồng độ 0,036 mg/L tăng 14,96% từ 36,23% tỉ lệ huyết cầu lên 40,27% tỉ lệ huyết cầu nhưng không khác biệt với cá chưa tiếp xúc thuốc, tuy nhiên sau 6 giờ đến suốt thời gian thí nghiệm tỷ lệ huyết cầu có xu hướng giảm nhưng chỉ ở thời điểm 6 giờ ở nghiệm thức 0,072 mg/L giảm 40,62% từ 50,19% tỉ lệ huyết cầu xuống 33,38% tỉ lệ