PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SẢN XUẤT CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ VÀ VI KHUẨN TÍCH LŨY POLYP TRONG CHẤT THẢI TRẠI HEO Ở TỈNH TRÀ VINH

“Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy polyP trong chất thải trại heo (sau biogas) ở tỉnh Trà Vinh”Mặc dù có hệ thống hầm ủ biogas nhưng chất thải trại heo vẫn làm ô nhiễm môi trường. Nhiều nghiên cứu cho thấy xử lí nước thải bằng biện pháp sinh học cho hiệu quả cao. Vì thế đề tài này được thực hiện nhằm hướng đến ứng dụng các dòng vi khuẩn trong thực tế. Từ 14 mẫu chất thải sau biogas ở Tỉnh Trà Vinh phân lập được một trăm tám mươi tám dòng vi khuẩn (28 dòng sản xuất chất kết tụ sinh học, 135 dòng chuyển hóa nitơ và 25 dòng tích lũy polyP). Có 02 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học có tỉ lệ kết tụ cao với dung dịch kaolin: dòng 03.PS.3 (44,09%) và dòng 04.P.1 (50,87%); 08 dòng có khả năng chuyển hóa nitơ tốt khi kiểm tra trên môi trường minimal bổ sung NH4+, NO3 và NO2 với nồng độ tăng dần; 02 dòng có khả năng tích lũy polyP cao: dòng 01.L.1 (7,98 mgl) và dòng 05.L.4 (8,73 mgml). Tất cả chúng được nhận diện trình tự gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi tổng đặc hiệu cho từng loại vi khuẩn. Chúng được chọn để giải trình tự và so sánh trên ngân hàng gen (NCBI) bằng phần mềm BLAST N.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN SẢN XUẤT CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC, VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ

VÀ VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-P TRONG CHẤT THẢI TRẠI

HEO (SAU BIOGAS) Ở TỈNH TRÀ VINH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số 60 - 42 - 80

NĂM 2012

“Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P trong chất thải trại heo (sau biogas) ở tỉnh Trà Vinh”

Mặc dù có hệ thống hầm ủ biogas nhưng chất thải trại heo vẫn làm ô nhiễm môi trường Nhiều nghiên cứu cho thấy xử lí nước thải bằng biện pháp sinh họ c cho hiệu quả cao Vì thế đề tài này được thực hiện nhằm hướng đến ứng dụng các dòng vi khuẩn trong thực tế Từ 14 mẫu chất thải sau biogas ở Tỉnh Trà Vinh phân lập được một trăm tám mươi tám dòng vi khuẩn (28 dòng sản xuất chất kết tụ sinh học, 135 dòng chuyển hóa nitơ và 25 dòng tích lũy poly-P) Có 02 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học có tỉ

lệ kết tụ cao với dung dịch kaolin: dòng 03.PS.3 (44,09%) và dòng 04.P.1 (50,87%); 08 dòng có khả năng chuyển hóa nitơ tốt khi kiểm tra trên môi trường minimal bổ sung

NH 4 + , NO 3 - và NO 2 - với nồng độ tăng dần; 02 dòng có khả năng tích lũy poly-P cao: dòng 01.L.1 (7,98 mg/l) và dòng 05.L.4 (8,73 mg/ml) Tất cả chúng được nhận diện trình

tự gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi tổng đặc hiệu cho từng loại vi khuẩn Chúng được chọn để giải trình tự và so sánh trên ngân hàng gen (NCBI) bằng phần mềm BLAST N Kết quả cho thấy: 02 dòng sản xuất chất kết tụ sinh học (03.PS.3 và 04.P.1) tương đồng 98% với các dòng thuộc chi Bacillus; 08 dòng chuyển hóa nitơ (12.H 4 2, 06.O 3 1, 12.O 2 1, 03.T.1, 06.O 2 1, 14.O 3 1, 14.H 4 4 và 07.T.1) tương đồng 97 đến 99% với các dòng thuộc chi Arthrobacter, Brevibacterium, Rhodococcus và Corynebacterium;

02 dòng tích lũy poly-P (01.L.1 và 05.L.4) tương đồng 98 đến 99% với các dòng thuộc chi Ideonella và Variovorax Cây di truyền dựa trên trình tự 16S rDNA (cho từng loại vi khuẩn) được xây dựng bằng phần mềm MEGA 5.0 cho thấy mối quan hệ di truyền gần gũi: giữa 02 dòng sản xuất chất kết tụ sinh học (03.PS.3, 04.P.1) với các dòng khác thuộc chi Bacillus; giữa 05 dòng chuyển hóa nitơ (12.O 2 1, 03.T.1, 12.H 4 2, 06.O 3 1, 06.O 2 1) với các dòng khác thuộc chi Arthrobacter và chi Brevibacterium, giữa dòng chuyển hóa nitơ (14.O 3 1) với các dòng khác thuộc chi Rhodococcus, giữa 02 dòng chuyển hóa nitơ (07.T.1 và 14.H 4 4) với các dòng khác thuộc chi Corynebacterium; giữa

02 dòng tích lũy poly-P (01.L.1, 05.L.4) với các dòng khác thuộc chi Ideonella và Variovorax

Từ khóa: Chuyển hóa nitơ, nước thải trại heo, PCR 16S rDNA, sản xuất chất kết tụ sinh học,

tích lũy poly-P

“Isolation and selection biofloccullant producing bacteria, removal nitrogen bacteria and polyphosphate accumulating bacteria in sludge of pig-farm (after biogas)

in Tra Vinh province”

Although there are biogas system, but pig farm waste is polluting the environment Many studies show that wastewater treatment by biological methods for high efficiency

So this subject were made towards the application of this strain in practice From 14 samples’s sludge of pig-farm (after biogas) in Tra Vinh province were isolated one hundred and eighty - eight isolates (28 biofloccullant producing isolates, 135 removal nitrogen isolates and 25 polyphosphate accumulating isolates) There are 02 bioloccullant producing isolates had the highest focculant rate with kaolin solution: isolate 03.PS.3 (44,09%) and isolate 04.P.1 (50,87%); 08 removal nitrogen isolates had the ability to remove nitrogen strongly after testing on minimal medium added NH 4 + ,

NO 3 - and NO 2 - with enrichment concentration; 02 polyphosphate accumulating isolates can form highest polyphosphate: isolate 01.L.1 (7,98 mg/l) and isolate 05.L.4 (8,73 mg/ml) All of them were identified 16S rDNA gene with appropriate primers in each kind of bacteria They were chosen to sequence and compare with GenBank database of NCBI by BLAST N software The results showed that: 02 biofloccullant producing isolates (03.PS.3 and 04.P.1) were 98% of the identity with members of Bacillus; 08 removal nitrogen isolates (12.H 4 2, 06.O 3 1, 12.O 2 1, 03.T.1, 06.O 2 1, 14.O 3 1, 14.H 4 4 and 07.T.1) were 97 to 99% of the identity with members of Arthrobacter, Brevibacterium, Rhodococcus and Corynebacterium; 02 polyphosphate accumulating isolates (01.L.1 and 05.L.4) was 98 to 99% of the identity with members of Ideonella and Variovorax Phylogenetic tree were constructed based on partial 16S rDNA sequences (for each kind of bacteria) by MEGA 5.0 software showing phylogenetic relationships: between 02 biofloccullant producing isolates (03.PS.3, 04.P.1), members of Bacillus; between 05 removal nitrogen isolates (12.O 2 1, 03.T.1, 12.H 4 2, 06.O 3 1, 06.O 2 1), members of Arthrobacter and Brevibacterium; between (14.O 3 1), members of Rhodococcus; between 02 removal nitrogen isolates (07.T.1 and 14.H 4 4), members of Corynebacterium; between 02 polyphosphate accumulating isolates (01.L.1, 05.L.4), members of Ideonella and Variovorax

Key words: Biofloccullant producing bacteria, PCR 16S rDNA, polyphosphate accumulating

bacteria, removal nitrogen bacteria, sludge of pig-farm

TÓM LƯỢC i

ABSTRACT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH HÌNH vi

BẢNG TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình chăn nuôi ở nước ta và tỉnh Trà Vinh 3

2.2 Đặc tính chất thải trại chăn nuôi heo 4

2.2.1 Thành phần chất thải từ trại chăn nuôi heo 4

2.2.2 Ảnh hưởng của chất thải chăn nuôi đến môi trường 5

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 6

2.2.1 Kết tụ sinh học (Flocculation) 6

2.2.2 Cơ chế của quá trình kết tụ sinh học (Mechanisms of Bioflocculation) 7

2.2.3 Kiểm tra khả năng kết tụ sinh học của vi khuẩn bằng dung dịch kaolin 7

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kết tụ sinh học .7

2.2.5 Một số vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 9

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn chuyển hóa nitơ 10

2.3.1 Chu trình nitơ 10

2.3.2 Một số nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa nitơ 12

2.4 Giới thiệu về vi khuẩn tích lũy poly-P 15

2.4.1 Sơ lược về phospho 15

khuẩn poly-P 16

2.4.3 Những nghiên cứu về vi khuẩn tích lũy poly-P 17

2.5 Phương pháp nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử 18

2.5.1 Sơ lược về đặc điểm gen 16S rDNA 18

2.5.2 Kỹ thuật PCR (Khuất Hữu Thanh, 2006) 18

2.5.3 Điện di gel agarose (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002) 19

2.5.4 Phương pháp giải trình tự DNA (Khuất Hữu Thanh, 2006) 20

2.5.5 Phần mềm phân tích DNA được giải mã 21

2.5.6 Xây dựng cây phát sinh loài từ trình tự DNA bằng phần mềm MEGA 22

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời điểm và địa điểm thực hiện đề tài 23

3.2 Phương tiện nghiên cứu 23

3.2.1 Dụng cụ, thiết bị 23

3.2.2 Nguyên vật liệu 24

3.2.3 Hóa chất 24

3.2.4 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 25

3.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.3.1 Thu mẫu 28

3.3.2 Phân tích mẫu chất thải sau biogas 28

3.3.3 Phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P 29

3.3.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P 31

3.3.5 Nhận diện (identification) và phân tích đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P 36

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4.2 Kết quả phân lập 44

4.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 44

4.2.2 Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ 46

4.2.3 Kết quả phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P 49

4.3 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P 51

4.3.1 Kết quả tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 51

4.3.2 Kết quả tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitơ 51

4.3.3 Kết quả tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P 55

4.4 Kết quả nhận diện và phân tích đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P 57

4.4.1 Kết quả nhận diện vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 58

4.4.2 Kết quả nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ 61

4.4.3 Kết quả nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P 69

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73

5.1 Kết luận 73

5.2 Đề nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ CHƯƠNG

Phụ lục 1 Kết quả thu mẫu và phân tích mẫu chất thải

Phụ lục 2 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập Phụ lục 3 Kết quả khảo sát hoạt tính các dòng vi khuẩn phân lập

Trang

Hình 1 Mô hình chăn nuôi heo và hệ thống hầm ủ biogas ở một số hộ gia đình ở

tỉnh Trà Vinh 4

Hình 2 Chu trình nitơ 10

Hình 3 Chuỗi cấu trúc của polyphosphate 15

Hình 4 Mẫu chất thải trại heo sau biogas 24

Hình 5 Thu mẫu chất thải trại chăn nuôi heo (sau biogas) 28

Hình 6 Pha loãng (A) và nhỏ giọt (B) trong phương pháp đếm sống 30

Hình 7 (A) Khuẩn lạc cấy chuyển từ mẫu trải, (B) Khuẩn lạc ròng được trữ trong ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng 30

Hình 8 Vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học được nuôi trong ống Falcon 31

Hình 9 Xác định khả năng phát triển của vi khuẩn 33

Hình 10 Đường chuẩn đo poly-P 35

Hình 11 Sơ đồ tóm tắt phương pháp nghiên cứu thí nghiệm 41

Hình 12 Kết quả đo pH các mẫu chất thải 42

Hình 13 Mật số vi khuẩn trung bình các mẫu chất thải 43

Hình 14 Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 45

Hình 15 Hình dạng dòng vi khuẩn 03.PS.3 chụp dưới kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại 12000 lần 45

Hình 16 Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn chuyển hóa nitơ 48

Hình 17 Hình dạng dòng vi khuẩn 03.T1 chụp dưới kính hiển vi điện tủ ở độ phóng đại 5500 lần 49

Hình 18 Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tích lũy poly-P 50

Hình 19 Hình dạng dòng vi khuẩn 05.L.4 chụp dưới kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại 12000 lần 50

Hình 20 Số dòng vi khuẩn oxy hóa ammonium phát triển trên môi trường minimal bổ sung NH4+ 51

NO3- 52 Hình 22 Số dòng vi khuẩn khử nitrite phát triển trên môi trường minimal bổ sung

NO2- 53 Hình 23 Số dòng vi khuẩn T (oxy hóa ammonium, khử nitrate, khử nitrite) phát

triển trên môi trường minimal bổ sung NH4+

, NO3-, NO2- 54 Hình 24 Kết quả kiểm tra khả năng phát triển của một số dòng vi khuẩn chuyển hóa

nitơ trên môi trường minimal bổ sung sung NH4+

, NO3-, NO2- 55 Hình 25 Sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn tích lũy poly-

P sau 5 ngày 56 Hình 26 Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường phosphate khó tan

sau 5 ngày 56 Hình 27 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 02 dòng vi khuẩn

sản xuất chất kết tụ sinh học trên gel agarose 1,2% 58 Hình 28 Cây phả hệ di truyền (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ di truyền

giữa các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học 60 Hình 29 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn

chuyển hóa nitơ trên gel agarose 1,2% 61 Hình 30 Cây phả hệ di truyền (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ di truyền

giữa các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ 68 Hình 31 Phổ điện di sản phẩm PCR được nhân lên từ DNA của 02 dòng vi khuẩn

tích lũy poly-P trên gel agarose 1,2% 70 Hình 32 Cây phả hệ di truyền (phylogenetic tree) trình bày mối quan hệ di truyền

giữa các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P 72 Hình 33 Bản đồ hành chánh tỉnh Trà Vinh

Hình 34 Phương trình đường chuẩn P2O5

Bovine Serum Albumin Acetyllated Carbonaceous Biochemical Oxygen Demand Colony forming Unit

Enhanced biological phosphorus removal Ethylene Diamin Tetra Aceticacid

Luria Bertani National Center for Biotechnology Information Optical Density

Polymerase Chain Reaction Polyphosphate

Sodium Dodecyl Sulfate Tổng ( ammonium, nitrate, nitrite)Tris acetate EDTA

Thermus aquaticus

Tris boric EDTA Tris EDTA Melting temperature Weight/Volume

Trà Vinh nằm trong vùng đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), nên có điều kiện thuận lợi về khí hậu, nhiệt độ ổn định rất thích hợp cho ngành chăn nuôi heo Theo sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Trà Vinh năm 2012, đầu năm 2011 toàn tỉnh Trà Vinh có tổng đàn heo là 449,7 triệu con tăng so với năm 2010 (421,8 triệu con) Chăn nuôi ở Trà Vinh chủ yếu là hộ gia đình chất nên thải đưa ra sông, gây ô nhiễm môi trường Mặc dù thời gian qua, một số hộ chăn nuôi đã đầu tư xây dựng hầm khí sinh học biogas nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tận dụng nguồn phân thải Nhưng con số đó cũng còn rất ít so với số hộ chăn nuôi hiện có và làm cho tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng tăng

Vì vậy muốn phát triển bền vững thì song song với việc phát triển kinh tế, con người cần quan tâm bảo vệ môi trường Hiện nay, biện pháp hữu hiệu để xử lí nước thải là biện pháp sinh học vì hiệu quả cao triệt để, không gây tái ô nhiễm và chi phí

đầu tư thấp (Chu Thị Thơm et al., 2006) Việc sử dụng các chất sinh học như: chất kết

tụ sinh học, chất chuyển hóa nitơ, chất tích lũy phosphate trong các hệ thống xử lí nước thải chăn nuôi đã mang lại hiệu quả cao

Do đó vấn đề sử dụng vi sinh vật có ích trong tự nhiên, đặc biệt là vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P là điều cần quan tâm và nghiên cứu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường nước

Với các lý do nêu trên, đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P trong chất thải trại heo (sau biogas) ở tỉnh Trà Vinh” được thực hiện nhằm tiến đến ứng dụng các

dòng vi khuẩn này trong xử lý chất thải ở trại chăn nuôi trong thực tế

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài này thực hiện nhằm các mục tiêu như sau:

- Phân lập các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa

nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P từ chất thải trại heo (sau biogas) ở tỉnh Trà Vinh

- Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P có hoạt tính cao

CHƯƠNG II

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình chăn nuôi ở nước ta và tỉnh Trà Vinh

Việt Nam là một trong những nước ở vùng Đông Nam Á có điều kiện khí hậu thuận lợi cho ngành chăn nuôi heo và ngành này đã mang lại lợi nhuận đáng kể cho người chăn nuôi Theo số liệu thống kê của cục tống kê năm 2011, thì tổng đàn heo cả nước vào tháng 4 năm 2011 là 26,3 triệu con giảm 3,71% so cùng kỳ, nhưng đến tháng

9 năm 2011 tổng đàn lợn ước đạt 27,2 triệu con tăng 3,3% so với thời điểm tháng 4/2011 Mặc dù số lượng này giảm so với năm 2010 (27,3 triệu con) do dịch bệnh, thời tiết, giá thức ăn cao vào cuối năm 2010 Tuy nhiên số lượng đàn heo nước ta vẫn khá cao trên thế giới, Việt Nam có tổng đàn heo đứng thứ tư thế giới (sau Trung Quốc, Hoa Kỳ và Brazil) Theo dự đoán của Tổng cục nông nghiệp thì số lượng đàn heo ở nước ta trong những năm tới với xu hướng vẫn tiếp tục tăng do nhu cầu tiêu thụ của dân số ngày một tăng nhanh Trong đó ĐBSCL chiếm 3798,8 nghìn con trong năm

2010 (Bảng 1)

Bảng 1 Số lượng đàn heo (nghìn con) ở Việt Nam qua các năm

Cả nước 27435,0 26855,3 26560,7 26701,6 27627,7 27373,1 Đồng bằng sông

Cửu Long 3828,6 3982,0 3784,8 3630,1 3730,8 3798,8

Nguồn: Tổng cục thống kê (tháng 4/2011)

Tại Trà Vinh tình hình chăn nuôi heo tăng nhưng không ổn định từ năm 2005

-2010 là do giá thức ăn, thuốc thú y tăng cao và giá heo hơi không ổn định thường xuyên biến động làm cho hộ chăn nuôi bị thua lỗ đã làm sản lượng ngành chăn nuôi tiêu thụ trên thị trường chậm, ảnh hưởng đấn qui mô phát triển đàn trên địa bàn của tỉnh Tuy nhiên, đầu năm 2011 chăn nuôi ở tỉnh Trà Vinh có hướng phát triển khá cả

về số lượng lẫn chất lượng, chủ yếu là do giá một số sản phẩm chăn nuôi liên tục tăng

ở mức cao, làm cho người chăn nuôi có lãi nên đã kích thích người dân mạnh dạn đầu

tư sản xuất Tuy ngành chăn nuôi heo gặp nhiều khó khăn nhưng vẫn đạt một số sản

lượng nhất định Đến tháng 4 năm 2011 số lượng đàn heo của tỉnh là 449,7 nghìn con, tăng so với năm 2010 (421,8 nghìn con) (Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Trà Vinh, 2012)

Mô hình trại chăn nuôi heo ở tỉnh Trà Vinh chủ yếu là hộ gia đình, một số nơi

có đầu tư hệ thống hầm ủ biogas (hình 1)

Hình 1 Mô hình chăn nuôi heo và hệ thống hầm ủ biogas ở một số hộ gia đình ở tỉnh

Trà Vinh (ngày 24/05/2011) 2.2 Đặc tính chất thải trại chăn nuôi heo

2.2.1 Thành phần chất thải từ trại chăn nuôi heo

Thành phần một số chất thải trại chăn nuôi heo được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Một số thành phần trong chất thải rắn, lỏng chăn nuôi heo

MPN: Most Probale Nuber

(Nguồn: Nguyễn Thị Hoa Lý, 2005)

Trong chất thải rắn, lỏng tỉ lệ các chất hữu cơ, vô cơ, vi sinh vật trong chất thải tùy thuộc vào khẩu phần, giống loài gia súc, qui mô đàn gia súc và cách thức dọn vệ sinh, tùy thuộc vào phương pháp xử lý chất thải khác nhau của các trại chăn nuôi như

ủ phân, biogas Trong chất thải lỏng nước chiếm 75 – 95%, phần còn lại là các chất hữu cơ, vô cơ và mầm bệnh (Nguyễn Thị Hoa Lý, 2005)

2.2.2 Ảnh hưởng của chất thải chăn nuôi đến môi trường

Chất thải chăn nuôi gia súc tác động môi trường thường được biết đến là mùi hôi, ruồi muỗi và bụi Tuy nhiên đây chỉ là tác động cục bộ ảnh hưởng đến người chăn nuôi

và láng giềng Chất thải trong chăn nuôi còn có thể tác động trên phạm vi rộng lớn hơn, thông qua việc ô nhiễm không khí, đất, nước và ảnh hưởng đến sức khỏe con người (Phan Thị Giác Tâm, 2001)

Dưới tác động của yếu tố tự nhiên như: ánh sáng, nhiệt độ, nước, vi sinh vật… chất thải bị chuyển hóa và tạo ra các tác nhân ô nhiễm thứ cấp, thường có độc tính thấp hơn chất ô nhiễm ban đầu Khi tác nhân ô nhiễm tiếp xúc với cây cỏ, động vật và con người, chúng có thể gây tác động sinh học thể hiện qua việc hấp thụ, chuyển hóa, tương tác và lưu tồn trong cơ thể sinh vật Chất ô nhiễm có thể xâm nhập vào cơ thể qua da, hô hấp, tiêu hóa hay qua dây chuyền thực phẩm (Lê Trình, 1997)

a Ô nhiễm nước mặt

Chất thải gia súc là chất thải hữu cơ, việc thải các chất thải chưa được xử lý sẽ gây mất cân bằng sinh học Khi lượng chất thải lên cao thì vi khuẩn cần nhiều oxy hơn cho quá trình oxy hóa và tổng hợp của chúng, dẫn đến việc suy giảm oxy hòa tan trong nước gây nguy hại cho thủy sinh vật, mất mỹ quan và chất lượng môi trường sống ở khu vực xung quanh sẽ bị suy giảm (Lê Hoàng Việt, 2003)

Ô nhiễm nguồn nước do chất thải gia súc bao gồm hiện tượng phú dưỡng đối với nước mặt Hiện tượng phú dưỡng là hiện tượng tảo phát triển quá mức do dư chất nitơ

và photphate trên bề mặt các ao hồ Do đó, các vi khuẩn phân hủy rong tảo cũng phát triển, sử dụng oxy trong nước và khi chết đi tạo mùi khó chịu trong nước Sự phú dưỡng gắn liền với sự phát triển của một số loài sinh vật có hại có thể giết chết cá hàng loạt và gây bệnh cho người (Phan Thị Giác Tâm, 2001)

b Ô nhiễm nước ngầm

Nguồn phân gia súc và rác thải chăn nuôi không được xử lý mà đưa thẳng ra môi trường, ngấm qua đất vào nước ngầm cũng làm cho chất lượng nước ngầm bị thay đổi Khi nước ngầm bị nhiễm bẩn, nó không có khả năng tự làm sạch như nguồn nước mặt Hơn nữa, dòng chảy trong nước ngầm rất chậm và không phải là dòng chảy liên tục nên các chất ô nhiễm không thể bị pha loãng và phân tán (Nguyễn Thị Kim Thái, 1999)

Ammonium là sản phẩm từ chất thải gia súc, sau một quá trình chuyển hóa tạo nitrate trong đất Nitrate tồn đọng trong đất ở một lượng cao có thể ngấm qua đất vào nước ngầm gây ô nhiễm nguồn nước Nước có nồng độ nitrate cao có khả năng gây hội chứng “trẻ xanh” (Methaemoglobinaemia) tử vong cao cho trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi (Phan Thị Giác Tâm, 2001)

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học

2.2.1 Kết tụ sinh học (Flocculation)

Kết tụ sinh học là sản phẩm của hợp chất cao phân tử được hình thành trong quá

trình phát triển của vi sinh vật (Shih et al., 2001)

Vi khuẩn tạo ra chất kết tụ sinh học là loài vi khuẩn có thể sử dụng các chất dinh dưỡng trong môi trường tổng hợp chất đa phân tử trong tế bào dưới sự hoạt động của các enzym đặc biệt, sau đó chúng có thể bài tiết ra ngoài và tồn tại trong môi trường hoặc trên bề mặt vỏ tế bào vi khuẩn, các hợp chất này có khả năng tạo sự kết tụ với các

chất khác nhau và tạo thành một khối nhầy lắng xuống đáy (Jie et al., 2006)

Trong những năm gần đây, nhiều vi sinh vật sản xuất chất kết tụ sinh học gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn đã được báo cáo có khả năng sản xuất chất kết tụ sinh học

khác nhau như polysaccharide, protein và glycoprotien (Jie et al., 2006)

Chất kết tụ sinh học phân loại thành ba nhóm chính: chất kết tụ vô cơ như aluminum sulfate và polyaluminum chloride, chất kết tụ tổng hợp hữu cơ như là dẫn xuất của polyacrylamide và polyethylene imine, chất kết tụ xảy ra trong tự nhiên như:

chitosan, sodium alginate và chất kết tụ bởi vi khuẩn (Zhi-quang et al., 2007) Các chất

kết tụ vô cơ và chất kết tụ tổng hợp hữu cơ có khả năng gây ung thư, tác động mạnh đến thần kinh, có thể gây ra ô nhiễm thứ và chúng khó bị phân hủy trong tự nhiên

(Yokoi et al., 1994) Gần đây, kết tụ sinh học bởi vi sinh vật được ngành công nghệ

sinh học môi trường chú ý bởi vì chúng có khả năng phân giải sinh học và không độc

hại (Lu et al., 2005) Theo Sheng et al (2006) chất kết tụ sinh học có tác dụng nhanh

chóng và an toàn, không độc hại cho con người và môi trường

2.2.2 Cơ chế của quá trình kết tụ sinh học (Mechanisms of Bioflocculation)

Việc nghiên cứu cơ chế của quá trình kết tụ có thể giúp chúng ta hiểu rõ vai trò của chất kết tụ sinh học trong xử lý nước và nước thải Khối lượng phân tử và các nhóm chức trong phân tử chất kết tụ là nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả kết tụ Chất kết tụ sinh học là protein: nhóm amino và carboxyl là nhóm chức năng trong sự kết tụ, nhưng khối lượng phân tử của chúng thường thấp Trong khi chất kết tụ là

polysaccharide thường có trọng lượng phân tử cao và nhiều nhóm chức hơn (Kurane et

al., 1994)

Nhiều cầu nối hóa học xảy ra khi vật thể được hấp thụ vào bên trong chuỗi kết tụ sinh học Nhiều vật thể có thể hấp thụ vào một chuỗi dài, và nhiều vật thể hấp thụ chuỗi này có thể hấp thụ cùng lúc nhiều chuỗi khác, tiếp tục kết thành khối và lắng

xuống đáy (Deng et al., 2003) Nói chung các chất kết tụ sinh học gây ra sự tập hợp

các hạt rắn và các tế bào thông qua cầu nối và quá trình trung hòa điện tích

2.2.3 Kiểm tra khả năng kết tụ sinh học của vi khuẩn bằng dung dịch kaolin

Kaolin là một khoáng sét có công thức là Al2Si2O5(OH)4 cho vào nước tạo thành một dung dịch các chất lơ lửng Dung dịch này dùng để đánh giá khả năng kết tụ của chất kết tụ sinh học tổng hợp từ vi khuẩn, thông qua đa phân tử kết tụ sinh học sẽ hấp thụ các phân tử kaolin trong dung dịch và lắng xuống đáy làm trong dung dịch Độ trong của dung dịch được kiểm tra bằng cách đo OD ở bước sóng 550nm sẽ đánh giá

được khả năng kết tụ của chất kết tụ sinh học (Deng et al., 2003) Đây là bước đầu

trong việc đánh giá khả năng kết tụ nhằm chọn ra dòng vi khuẩn có khả năng sản sinh kết tụ sinh học hiệu quả nhất

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kết tụ sinh học

a Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và muối

Theo Sheng et al (2006) sự thay đổi nguồn carbon, nitrogen và muối khoáng ảnh

hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn và tạo kết tụ sinh học Đối với dòng vi khuẩn

Klebsiella sp nguồn carbon là maltose cho sự phát triển của vi khuẩn tạo kết tụ sinh

học hiệu quả cao nhất so với các nguồn carbon khác như glucose, fructose, ethanol và

nguồn nitrogen là ure cho kết quả tốt hơn so với NH4Cl, (NH4)2SO4, peptone và Yeast extract

Bảng 3 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen đến hiệu quả kết tụ sinh học

Nguồn carbon Tỉ lệ kết tụ (%) Nguồn nitrogen Tỉ lệ kết tụ (%)

(Nguồn: Sheng et al., 2006)

b Ảnh hưởng của pH

Theo Sheng et al (2006) giá trị pH ảnh hưởng đến hiệu quả kết tụ sinh học vì pH

là bề mặt của các chất phân tán thay đổi, và mỗi dòng vi khuẩn cho hiệu quả kết tụ

sinh học cao nhất ở các giá trị pH khác nhau Theo Deng et al (2003) dòng vi khuẩn

Bacillus mucilaginosus cho hiệu quả kết tụ cao nhất ở pH = 9, theo Jie et al (2006)

dòng vi khuẩn Vagococcus sp Cho hiệu quả cao nhất ở pH = 7, theo Sheng et al (2006) dòng vi khuẩn Klebsiella sp Cho hiệu quả kết tụ cao nhất ở pH = 6

c Ảnh hưởng của các ion kim loại

Sự kết tụ sinh học sẽ được kích thích và tăng hiệu quả khi cho thêm một số ion như Al3+

và Fe3+ (Zang và Lin, 1999) Những cation này khi được thêm vào dung dịch kaolin sẽ làm tăng điện tích âm của vật thể từ đó làm tăng khả năng hấp thu các chất lơ

lững dễ dàng hơn (Sheng et al., 2006)

Tuy nhiên, sản phẩm kết tụ sinh học của từng dòng vi khuẩn khác nhau thích hợp với từng ion kim loại khác nhau Phần lớn các dòng vi khuẩn thích hợp với ion Ca2+

Trong đó, một số dòng không bổ sung ion kim loại vẫn cho hiệu quả kết tụ tốt như

Citrobacter sp., Bacillus mucilaginosus…

d Ảnh hưởng của liều lượng vi khuẩn

Tùy theo dòng vi khuẩn mà cho hiệu quả kết tụ sinh học ở liều lượng khác nhau

Có dòng cho kết tụ ở liều lượng rất cao, như: dong Bacillus licheniformis ở liều lượng

150ml/l cho tỉ lệ kết tụ 98,5%, dòng Citrobacter sp ở liều lượng 100ml/l cho tỉ lệ kết

tụ 98,4%, điều này không cho hiệu quả kinh tế Trong khi đó, một số dòng cho hiệu

quả cao ở liều lượng rất thấp, như: dòng Bacillus mucilaginosus ở liều lượng 0,1ml/l cho tỉ lệ kết tụ 99,6%, dòng Alcaligenes latus ở liều lượng 1ml/l cho tỉ lệ kết tụ 98,8% (Deng et al., 2003)

2.2.5 Một số vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học

Một trong số các chủng vi khuẩn được báo cáo có thể sản xuất chất kết tụ sinh

học là Bacillus

Seo (1993) phân lập từ mẫu đất chủng Bacillus sp A56 Tinh sạch chất kết tụ

sinh học sản xuất từ chủng vi khuẩn A56 bằng ethanol và cetylpyridinium chloride và qua sắc ký, ước tính được trọng lượng phân tử của chất kết tụ sinh học từ chủng A56 khoảng 2.106

Daltons

Chủng vi khuẩn Bacillus sp (AS-101) (Salehizadeh et al., 2000) tạo chất kết tụ

được phân lập từ bùn hoạt tính, có dạng hình que, gram dương, sinh bào tử, hiếu khí,

có thể di chuyển Chất kết tụ chủng AS-101 được tinh sạch bằng ethanol lạnh và cetylpyridinium chloride Chất kết tụ được tinh sạch từng phần là một polysaccharide

có tính acid gồm acid uronic, acid pyruvate và acid acetic có tỉ lệ 11,4% : 6,1% : 0,4% Chất kết tụ sinh học của chủng AS-101 hoạt động dưới điều kiện acid và hoạt tính kết

tụ tối đa ở pH tối hảo khoảng 3,7 và nồng độ dung dịch huyền phù kaolin tối hảo khảng 30ppm Hoạt tính kết tụ được điều chỉnh bằng cách thêm Al3+

, Fe3+, Ca2+ với nồng độ tối hảo lần lượt là 0,2M, 0,25M, 8M

Chủng vi khuẩn Bacilus mucilaginousus phân lập từ các mẫu đất có tỉ lệ kết tụ đạt đến 90% (Deng et al., 2003) Vi khuẩn này có hình que, kích thước 4,16 – 4,83 x

0,5 – 0,83 m, là vi khuẩn gram dương, hiếu khí, là chủng sản xuất lớp màng nhầy mỏng, nhiệt độ tối hảo cho quá trình phát triển từ 25 – 30oC Vi khuẩn này có thể tăng trưởng trên môi trường potassium silicate và có thể thủy phân tinh bột Khuẩn lạc của

vi khuẩn này không màu, riêng biệt, nhớt, láng và đàn hồi khi nuôi trên cơ chất rắn có mặt của potassium silicate

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn chuyển hóa nitơ

2.3.1 Chu trình nitơ

Chu trình nitơ gồm 4 quá trình cơ bản được tóm tắt ở hình 2 Cụ thể như sau:

Hình 2 Chu trình nitơ

(Nguồn: Tortora et al., 2004)

- Quá trình cố định nitơ (dinitrogen fixation): Nitơ phân tử (N2) được chuyển hóa thành nitơ hợp chất Hầu hết được thực hiện bởi vi khuẩn sống tự do hoặc vi khuẩn

cộng sinh nốt rễ cây họ đậu (Rhizobium) và cả ở bèo hoa dâu (Trần Đức Viên et al.,

2004)

- Quá trình ammonium hóa (ammonification): là quá trình phân giải các hợp chất

hữu cơ chứa nitơ có trong chất thải hữu cơ thành NH3 (ammonia) và các muối amon, xảy ra trong chất thải hữu cơ và xác động thực vật Quá trình amon hóa protein có 2 giai đoạn: phân giải protein và khử amin Tham gia vào quá trình này là những vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease và những enzyme khử amin (Nguyễn Đức Lượng

và Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003)

- Quá trình nitrate hóa (nitrification): Sự nitrate hóa là sự chuyển đổi ammonium

(NH4+) thành nitrate (NO3-) bằng hoạt động của các vi sinh vật Quá trình này được thực hiện bằng hai loại vi sinh vật, trong hai giai đoạn: chuyển ammonium thành nitrite và chuyển nitrite thành nitrate

Chuyển ammonium thành nitrite: Việc chuyển ammonium thành nitrite được thực

hiện bởi nhờ các vi khuẩn nitrite hóa (Nitrosomonas và Nitrosococcus) và vi khuẩn nitrate hóa (Nitrobacter) là các vi khuẩn tự dưỡng hiếu khí Ngoài ra còn có nhóm vi sinh vật dị dưỡng gồm nhiều loại vi khuẩn và xạ khuẩn thuộc các chi Alcaligenes,

Anthrobacter, Corynebacterium, Achromobacter, Pseudomonas (Purkhold et al.,

Chuyển nitrite thành nitrate: thực hiện bởi vi khuẩn oxy hóa nitrite Các loài

được xếp vào nhóm phụ alpha proteobacteria và các loài tự dưỡng bắt buộc (ngoại trừ

Nitrobacter có thể sinh trưởng dị dưỡng với sự hiện diện của acetate, formate, hoặc

pyruvate) như Nitrobacter (N agilis, N winogradski), Nitrospina, Nitrospira, và

Nitrococcus chuyển đổi nitrite thành nitrate (Bitton, 2005)

nitơ (Lee et al., 2002) Quá trình này được xem là sự tập hợp của sự hô hấp nitrate,

nitrite kết hợp với sự khử nitrite oxide và sự hô hấp nitrous oxide (Zumft, 1997) Nitrate → Nitrite → Nitric oxide → Nitrous oxide → Dinitrogen gas

(NO3- ) (NO2- ) (NO) (N2O) (N2)

Hydroxylamine oxidoreductase

ammonia monooxygenase

Nitrite oxidoreductase

Dạng phản ứng oxy hóa - khử:

2NO3- + 10e- + 12H → N2 ↑ + 6H2O

Quá trình này được thực hiện bởi các vi khuẩn dị dưỡng như Paracoccus

denitrificans, Thiobacillus denitrificans và những loài Pseudomonas, Clostridium Đặc

biệt là quá trình ANAMMOX (Anaerobic Ammonium Oxidation- Oxy hóa ammonium trong điều kiện kỵ khí), nitrite và ammonium sẽ được chuyển đổi trực tiếp thành nitơ phân tử dưới điều kiện thiếu oxy Có thể ứng dụng tiến trình này vào trong xử lý nguồn nước thải giàu nitơ Toàn bộ phản ứng dị hóa này là:

NH4+ + NO2- → N2 + 2H2O

3NH4+ + 2NO3- → 2/5 N2 + 6H2O

2.3.2 Một số nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự chuyển nitrate thành nitrite và nitơ phân tử Đây là cách biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp kỵ khí Hầu hết các vi sinh vật chuyển hóa nitrate là những vi sinh vật kỵ khí, thực hiện quá trình chuyển nitrate khi môi trường không có oxy Sản phẩm cuối cùng của sự chuyển hoá này có thể là nitrite (NO2-

), ammonia (NH3-), nitơ phân tử (N2), hydroxylamine (NH2OH) hay nitric oxide (NO) tùy thuộc vào từng loài

vi sinh vật và điều kiện môi trường (Trần Linh Thước, 2003)

Gần 130 vi khuẩn chuyển hóa nitơ đã được tìm thấy trong khoảng hơn 50 giống (Zumft, 1992) Con đường chuyển hóa nitơ giúp cho chúng có lợi thế cạnh tranh trong môi trường có nồng độ oxy thấp Tuy nhiên, cũng có một vài loài hiếu khí có thể chuyển hóa nitơ trong hầu như tất cả các môi trường sống Sự chuyển hóa nitơ là nguyên nhân của sự mất nitơ trong đất nông nghiệp và còn thải ra N2O phá hủy tầng ozone làm ấm toàn cầu Mặc dù vậy, sự chuyển hóa nitơ giữ một chức năng quan trọng trong xử lý nước thải bằng việc loại thải nitơ thừa trong môi trường và phân hủy kỵ khí các chất ô nhiễm có nguồn gốc hữu cơ (Hallin và Lindgren, 1999)

Zumft (1997) đã có những nghiên cứu về cơ sở di truyền và sinh học tế bào của

sự chuyển hóa nitơ như mô tả kích thước gen và bản đồ gen của vi khuẩn chuyển hóa nitơ, những đặc tính và cấu trúc enzyme khử nitrite, nitric oxide, nitrous oxide, độ đa dạng của vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Braker et al (1998) đã nghiên cứu phát triển hệ thống các cặp mồi PCR khuếch đại đoạn gen khử nitrite (nirK và nirS) để nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong mẫu bùn hoạt động của hệ thống xử lý nước thải ở Đức Gen nirK đã được khuếch đại

từ Blastobacter denitrificans, Alcaligenes xylosoxidans và Alcaligenes sp (DSM 30128); gen nirS được khuếch đại từ Alcaligenes eutrophus DSM 530 và từ chủng

chuyển hóa nitơ IFAM 3698 Với mỗi gen, ít nhất một mồi phối hợp đã khuếch đại

thành công đối với tất cả các chủng trong thí nghiệm Cặp mồi nirK1F-nirK5R và

nirS1F-nirS6R được dùng trong PCR cho kết quả tốt với các chủng vi khuẩn chuyển

hóa nitơ có mang gen tương ứng nirK và nirS

Bennasar et al (1998) đã phát triển kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt để nhận diện Pseudomonas stutzeri Gần đây, có nhiều quan tâm về việc sử dụng rRNA

để thiết kế mẫu dò đặc trưng nhận diện vi khuẩn Trong bài, ông cũng đã nêu ra một

kỹ thuật PCR và mẫu dò oligonucleotide dựa trên trình tự 16S rRNA mà có thể sử

dụng để nhận diện P stutzeri một cách nhanh chóng và chuyên biệt

Chèneby et al (2000) tiến hành phân tích 16S rDNA về đặc tính của vi khuẩn

chuyển hóa nitơ phân lập từ mẫu đất Tổng cộng đã phân lập được 138 chủng từ 1445 chủng vi khuẩn kỵ khí là có khả năng chuyển hóa nitơ Phân tích hệ thống phát sinh loài của 16S rDNA của những dòng chuyển hóa nitơ đã phân lập được từ 3 loại đất trên đã phát hiện sự đa dạng ở một mức độ cao Các vi khuẩn khử đạm mà các tác giả

đã phân lập được thuộc về vi khuẩn Gram âm như Burkholderia, Pseudomonas,

Xanthomonas và thuộc về vi khuẩn Gram dương như Bacillus, Streptomyces, trong đó Streptomyces là một giống mới lạ trong quần xã chuyển hóa nitơ

Lee et al (2002) nghiên cứu về đặc điểm phân tử của quần xã vi khuẩn trong mẫu

bùn hoạt động loại thải nitrate bằng việc sử dụng phương pháp dựa trên trình tự 16S rDNA như áp dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi tổng 27f và 1492r, phương pháp giải trình tự và đã nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ chất thải trại chăn nuôi Qua phân

tích cho thấy, đa số chúng thuộc lớp Gammaproteobacteria và là vi khuẩn Gram âm,

có hình que như Pseudomonas, Arthrobacter,

Henry et al (2006) đã ứng dụng kỹ thuật PCR để nhận diện, định lượng gen nosZ

(mã hóa enzyme nitrous oxide reductase khử nitrous oxide thành nitơ phân tử) trong vi

khuẩn Pseudomonas fluorescens từ mẫu đất và đối chiếu với sự phong phú của các gen 16S rRNA, gen narG (mã hóa cho enzyme khử nitrate ở màng) và gen nirK (mã hóa

cho enzyme khử nitrite ở nhân) Hiện nay, nồng độ nitrous oxid trong khí quyển đang gia tăng với một tỉ lệ khoảng 0,3% mỗi năm, là một sản phẩm trung gian của con đường chuyển hóa nitơ

Kim et al (2006) đã tìm ra những điều kiện phân lập, nuôi cấy tối ưu và nghiên

cứu về sự đa dạng của vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ mẫu bùn hoạt động của hệ thống

xử lý nước thải đô thị Theo đó, môi trường sinh trưởng tối ưu với pH = 7, hàm lượng nitơ 3mM, có bổ sung 1ml vitamin hòa tan, nguồn carbon từ ethanol hoặc succinate

Có 199 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ được phân lập, đa số thuộc lớp

Betaproteobacteria (100 dòng phân lập chiếm 50,4%) và Alphaproteobacteria (75

dòng phân lập chiếm 36,8%); ngoài ra cũng tìm thấy những đại diện của lớp

Gammaproteobacteria (11 dòng phân lập chiếm 5,6%), Epsilonproteobacteria (4 dòng

phân lập chiếm 2%), Firmicutes (8 dòng phân lập chiếm 4%) và Bacteroidetes (1 dòng

phân lập) Nghiên cứu này đã khám phá ra một quần xã vi khuẩn chuyển hóa nitơ đa dạng hơn so với những mô tả trước đây

Theo Verstraete (1972), Arthobacter là vi khuẩn sống trong đất được tìm thấy có

khả năng thực hiện một số chức năng quan trọng như đầu độc trái đất với các hóa chất

khó chịu Gần đây, người ta đã phát hiện được một số loài Arthobacter có thể làm

giảm crom hóa trị sáu, có thể gây nghiêm trọng đối với con người và nền nông nghiệp

Arthobacter là vi khuẩn Gram âm, hầu hết các loài Arthobacter sống hiếu khí bắt

buộc Arthrobacter sp phân lập từ nước thải oxy hóa ammonium thành hydroxylamine

(NH2OH), nitric oxide, nitrite và nitrate Nồng độ nitơ hydroxylamine tự do đạt 15 pg/ml Acid hydroxamic là sản phẩm chủ yếu của quá trình nitrate hóa Nhiều vi sinh vật được báo cáo tạo nitrite từ ammonium hoặc nhóm amin, nhưng lượng nitrite-nitơ

thường là 0,5 đến 2,0 ug/ml Arthrobacter sp hình thành nitrite nhiều hơn của mức này Nghiên cứu cho thấy có ít nhất hai loài Arthobacter globiformis và Arthobacter

nicotianae, có quá trình trao đổi chất kỵ khí Những loài này sử dụng nitrate như một

chất nhận điện tử cuối cùng của chuỗi hô hấp, làm giảm ammonium qua nitrite

2.4 Giới thiệu về vi khuẩn tích lũy poly-P

2.4.1 Sơ lược về phospho

Phospho là chất dinh dưỡng chủ yếu cần cho tất cả các tế bào sống, phospho cấu tạo nên adenosine triphosphate (ATP), acid nucleic (DNA và RNA), phospholipids, acid teichoic, acid teichuroic ATP là phân tử giàu năng lượng, được dùng để vận chuyển năng lượng trong tế bào Phospholipids là thành phần quan trọng trong cấu trúc của màng tế bào Acid teichoic, acid teichuroic là thành phần quan trọng trong cấu trúc vách tế bào vi khuẩn gram dương Phospho còn được lưu trữ trong tế bào như là hạt nhỏ volutin hay polyphosphates Phospho có thể chiếm từ 1 – 3% trọng lượng khô của

vi khuẩn

Phospho có thể tồn tại dạng hữu cơ hoặc vô cơ

- Dạng vô cơ của phospho gồm orthophosphates và polyphosphates

+ Orthophosphates có giá trị đối với sự chuyển hóa sinh học mà không cần có thêm sự bẻ gãy, được coi như là chất dinh dưỡng phospho có giá trị cho vi khuẩn sử dụng trong các hệ thống xử lí nước thải và cho thực vật thủy sinh trong nước tự nhiên Orthophosphates bao gồm PO43-

, HPO42-, H2PO4- và H3PO4, phổ biến nhất trong các hệ thống xử lí nước thải là HPO42-

, H2PO4- + Polyphosphates là phân tử phức hợp với hai hay nhiều nguyên tử phospho, nguyên tử oxy và có thể có nguyên tử hydro, polyphosphates được thể hiện bằng công thức hóa học của ion pyrophosphate (P2O73-) là thành phần đầu tiên trong chuỗi polyphosphates không phân nhánh (P2O73-, P3O105-…)

Hình 3 Chuỗi cấu trúc của polyphosphate

(Nguồn: http:// www.dairyscience.info/industrial sms.html)

Polyphosphates qua sự thủy phân rất chậm và phóng thích orthophosphates,

sự thủy phân có thể được thực hiện bằng phương pháp hóa học hoặc bằng sinh học nhờ

vi khuẩn và tảo Sự thủy phân của polyphosphates chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm thời gian và pH trong phản ứng hiếu khí, dạng chính của orthophosphates đạt

được từ sự thủy phân là tùy thuộc vào pH Nhờ vào tính ổn định của nước, polyphosphates còn dễ dàng tách khoáng như là aluminum, calcium, và iron

- Phosphate (Pi) có thể gắn với các hợp chất hữu cơ gọi là phospho hữu cơ, phổ biến gồm inositol phosphates, acids nucleic, phospholipids, và phytin Phytin là acid hữu cơ tìm thấy ở bắp và đậu nành rất khó phân hủy (Gerardi và Michael, 2006)

2.4.2 Vi khuẩn tích lũy poly-P và quá trình tích lũy polyphosphate của vi khuẩn poly-P

Vi khuẩn tích lũy polyphosphate (poly-P) tích lũy phospho dưới dạng poly-P nội bào Chúng được sử dụng trong quá trình “Làm tăng thêm sự loại bỏ phospho sinh học” (EBPR – Enhanced biological phosphorus removal) Quá trình này xảy ra trong các hệ thống xử lý nước thải, phức hợp poly-P, kim loại, protein và acid nucleic bó thành cụm và ở dạng hạt dày điện tử

Polyphosphates là những phân tử mang điện âm mạnh và tạo phức tốt với nhiều ion kim loại Phức hợp của polyphosphate với những kim loại như Ba2+

, Pb2+, Mg2+ là những hợp chất kém hòa tan Điều này có thể gây kết tủa phức hợp poly-P- kim loại

trong tế bào như là những hạt nhỏ poly-P (Bonting et al., 1993)

Polyphosphates được tổng hợp bởi vi khuẩn là chất trùng hợp của nhiều gốc phosphate, thường có kích thước phân tử lớn và không phân nhánh Poly-P của

Acinetobacter johnsonii 210A có chiều dài chuỗi khoảng 700 gốc phosphate (Bonting,

vi sinh vật (Kulaev, 1979)

Quá trình đồng hóa của EBPR trong xử lý nước thải sử dụng hai nhóm vi khuẩn,

vi khuẩn lên men và vi khuẩn tích lũy poly-P, do đó có ít nhất hai bình phản ứng được

sử dụng trong EBPR, bình kỵ khí (bình lên men) và bình hiếu khí Vi khuẩn lên men

kỵ khí bắt buộc hoặc không bắt buộc, trong khi vi khuẩn tích lũy poly-P là hiếu khí nghiêm ngặt Chìa khóa của EBPR là vi khuẩn tích lũy poly-P xen kẽ điều kiện hiếu khí và kỵ khí Trong điều kiện kỵ khí, cBOD được lên men trong điều kiện thiếu oxy

tự do và nitrate, quá trình lên men tạo ra nhiều acid béo bay hơi, vi khuẩn tích lũy poly-P nhanh chóng hấp thụ và trùng hợp acid béo như là hạt tinh bột không tan poly-β-hydroxybutyrate (PHB) Poly-β-hydroxybutyrate trong vi khuẩn poly-P có hai nhiệm

vụ chính: giúp vi khuẩn sinh trưởng và tạo nên polyphosphates bằng cách lấy đi

phosphate hòa tan và poly-β-hydroxybutyrate cùng với polyphosphate giúp cho vi khuẩn poly-P hiếu khí sống sót trong điều kiện kỵ khí

Sự trùng hợp của acid béo đòi hỏi tiêu dùng năng lượng của tế bào vi khuẩn tích lũy poly-P, vì thế chúng phóng thích orthophosphates Kết quả trong điều kiện kỵ khí

có chứa hai nhóm phospho là phospho trong nước thải và phospho được phóng thích bởi vi khuẩn poly-P

Trong điều kiện hiếu khí, vi khuẩn tích lũy poly-P sử dụng oxy tự do để làm thoái giảm poly-β-hydroxybutyrate được tích trữ như là nguồn năng lượng và cacbon Vi khuẩn poly-P hấp thụ orthophosphates để tích trữ năng lượng được phóng thích từ sự thoái giảm poly-β-hydroxybutyrate Vi khuẩn poly-P có được rất nhiều năng lượng từ

sự thoái giảm poly-β-hydroxybutyrate mà chúng hấp thụ không chỉ phospho được phóng thích mà còn lượng lớn phospho cung cấp Phospho hấp thụ được đồng hóa thành đại phân tử và tích trữ như hạt nhỏ polyphosphate hay volutin Sự loại bỏ phospho đạt được khi vi khuẩn trong bùn được thải ra từ bình thứ cấp, bùn này không được đưa trở lại bình kỵ khí khi qui trình EBPR được lập lại Bằng các hoạt động của

vi khuẩn tích lũy poly-P trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí, chúng lấy đi phospho dư thừa của nhu cầu bình thường của tế bào (Gerardi và Michael, 2006)

2.4.3 Những nghiên cứu về vi khuẩn tích lũy poly-P

Lý thuyết của sự loại bỏ phospho sinh học được thiết lập căn cứ vào số lượng lớn những nghiên cứu, lý thuyết này cho rằng sự loại bỏ phospho sinh học được thực hiện

với pha hiếu khí và kỵ khí Nhóm vi khuẩn này gồm: Acinetobacter, Pseudomonas (Kim và Pagilla, 2000) Candidatus accumulibacter (Cai et al., 2007) là những sinh

vật tích kũy phosphate

Friedrich et al (2002), so sánh trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn tích lũy poly-P

phân lập từ chất thải trại chăn nuôi sau biogas với các dòng vi khuẩn trong ngân hàng

gen Trong số những dòng ông xác định có một số dòng tương đồng với loài Ideonella

dechloratans (99,4%), một loài thuộc bộ Burkholderiales, lớp Betaproteobacterial

Lotter và Murphy (1985) thấy rằng Pseudomonas spp., Moraxella spp., Aeromonas

spp… cũng có khả năng tích lũy poly-P ở điều kiện hiếu khí

2.5 Phương pháp nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử

2.5.1 Sơ lược về đặc điểm gen 16S rDNA

Ribosome có vai trò như là các vị trí tổng hợp protein trong các tế bào chân hạch

và sơ hạch RNA ribosome có thể chia thành nhiều loại theo kích thước của các đơn vị RNA Hầu hết các sinh vật sơ hạch có ba rDNAs, mã hóa rRNA 5S, 16S và 23S

(Lodish et al., 2004)

Gen rDNA là gen được bảo tồn nhất trong tất cả các tế bào Các phần của chuỗi rDNA từ sinh vật có quan hệ xa thì tương đối rõ rệt Điều này có nghĩa là trình tự từ sinh vật có quan hệ xa có thể được xếp hàng chính xác, tạo sự khác biệt chính xác thật

sự dễ dàng đo lường Vì thế, các gen mã hóa rRNA (rDNA) đã được sử dụng rộng rãi

để định hướng sự phân loại, sự phát sinh giống loài, và để ước lượng tỉ lệ của sự khác nhau giữa các loài vi khuẩn Như vậy, so sánh các chuỗi 16S rDNA cho thấy mối quan

hệ tiến hóa giữa các vi sinh vật Công trình này đã được thực hiện đầu tiên bởi Carl Woese, người đã đề xuất hệ thống ba lãnh giới (three Domain system) Archaea, Bacteria và Eucarya dựa trên thông tin trình tự như vậy

Ở vi khuẩn các gen 16S, 23S và 5S rDNA được tổ chức đặc trưng như một operon đồng sao chép Các gen 5S đã được nghiên cứu, nhưng nó quá nhỏ (120 nucleotide) để suy luận sự phát sinh loài chính xác Các gen 16S rDNA (1500 nucleotide) và 23S (2900 nucleotide) đủ lớn để sử dụng cho mục đích phân loại

(http:/www.biquest.org/bedrock/washingtondc_03_07/projectfiles/16s%20rDNAhandout.pdf)

2.5.2 Kỹ thuật PCR (Khuất Hữu Thanh, 2006)

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase) là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào, chỉ với sự hiện diện của một cặp mồi (primers pair) chuyên biệt, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, dung dịch đệm (buffer)

theo các chu kỳ nhiệt

Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước sau

- Giai đoạn biến tính (Denaturation): Các liên kết hydro trong phân tử DNA đứt

ra, hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác dụng của nhiệt độ cao, thường là

90 - 950 C trong 60 đến 120 giây

- Giai đoạn gắn đoạn mồi (Annealing): ở nhiệt độ 55 - 650 C, các đoạn mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên lý Chargaff Giai đoạn này kéo dài từ 30 - 60 giây

- Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (Elongation): Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, tạo nên mạch đơn mới DNA, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymerase hóa (polymerization), được thực hiện ở nhiệt độ 70 - 720

C và kéo dài từ 30 giây đến vài phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA

Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ số lượng bản sao là 2n

2.5.3 Điện di gel agarose (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002)

Sản phẩm phản ứng PCR được phát hiện bằng điện di trên gel agarose và quan sát kết quả dưới tia UV (bước sóng 260 nm)

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic, đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường

Agarose là loại gel thông dụng nhất, một polysaccharide được sản xuất từ tảo biển thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 - 20kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002) Nồng độ agarose trong dung dịch đệm thường

là 0,6 - 2,5% Ngoài ra còn có gel polyacrylamide dùng để phân tách các đoạn có kích thước dưới 1000 cặp base Dung dịch đệm thường dùng là TAE (Tris acetate EDTA),

TE (Tris EDTA), TBE (Tris boric EDTA)

Trong điện trường, DNA di chuyển từ cực âm sang điện cực dương Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực cản ngăn sự chuyển dịch của DNA DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh,

do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh Nhờ vậy người ta phân loại được các đoạn phân tử DNA trên gel agarose (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Các acid nucleic trong gel agarose sẽ quan sát dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hoá chất ethidium bromide (C21H20BrN3) là thuốc nhuộm acid nucleic do chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại

sẽ phát huỳnh quang Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ gel hay sau điện di, gel được chiếu sáng bằng tia tử ngoại, acid nucleic sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam

Thang DNA (DNA ladder): “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker-MWM), dùng để ước lượng kích thước các trình tự acid nucleic trong gel agarose, đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết

2.5.4 Phương pháp giải trình tự DNA (Khuất Hữu Thanh, 2006)

a Giải trình tự gen theo phương pháp hóa học

Phương pháp này dựa trên cơ sở biến tính phân tử DNA thành các mạch đơn không tự xoắn lại với nhau, đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’ của mạch đơn tạo các đoạn đánh dấu có thể được phát hiện bằng phóng xạ Xử lý hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotid được phát hiện bằng điện di Kết quả các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacrylamid, có thể xác định trình tự các mạch đơn

Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo bốn nhóm phản ứng:

- Nhóm I: xử lý mạch đơn DNA bằng dimethyl sunfat làm đứt mạch đơn tại G

- Nhóm II: xử lý mạch đơn DNA bằng acid pH=2 gây đứt mạch đơn tại A hay G

- Nhóm III: xử lý mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt mạch đơn tại C và T

- Nhóm IV: xử lý mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ muối cao làm mạch đơn bị đứt C

Kết quả các phản ứng tạo thành các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên, có kích thước khác nhau Điện di kết quả được trên gel polyacrylamid, đọc kết quả điện di bằng phóng xạ tự ghi, thu được trình tự của các nucleotid của mạch đơn DNA

b Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ OH, khi gặp nucleotid không

có nhóm 3’ OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại một cách ngẫu nhiên

Phương pháp dideoxy gồm bốn loại phản ứng, mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP có một loại được đánh dấu phóng xạ S35

hoặc P32, enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện thích

hợp đồng thời có thêm khoảng 1% một loại dideoxy-nucleotid ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) Các dideoxy-nucleotid mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 Khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn một ddNTP phản ứng tổng hợp ngừng lại, không có nhóm 3’ OH ở nucleotid cuối cùng do đó mạch đang tổng hợp không được tiếp tục kéo dài Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotid dài ngắn khác nhau một nucleotid, có thể nhận biết nhờ phương pháp điện di trên gel polyacrylamid

Các đoạn oligonucleotid kích thước khác nhau tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel Tổng hợp kết quả phản ứng ở bốn ống thu được trình tự các nucleotid của mạch đơn, có thể biết trình tự sắp xếp các nucleotid trong gen

c Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động

Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động dựa trên cơ sở phương pháp dideoxy Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giải các nhầm lẫn do kỹ thuật Có hai loại mồi xuôi (primer forward) và mồi ngược (primer reverse) được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA Tiến hành biến tính DNA trong môi trường có urea và nhiệt độ cao (khoảng 550C), hai mạch đơn DNA tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotid, từ

đó tổng hợp được trình tự sắp xếp của gen

2.5.5 Phần mềm phân tích DNA được giải mã

BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool) là một chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học BLAST dựa trên nền tảng thống kê vững chắc cho phép so sánh, tìm kiếm, giải mã 1 trình tự (DNA và protein) với tất cả các trình tự

có trong ngân hàng gen (Genbank) Nói cách khác BLAST sẽ cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein, xác định đoạn mà ta quan tâm có tương đồng với đoạn nào trong ngân hàng gen hay không khi được cung cấp một thư viện hay cơ sở dữ liệu các chuỗi đó Để chạy BLAST cần đầu vào là 2 chuỗi: 1 chuỗi đích và 1 chuỗi cơ sở

dữ liệu Chuỗi đích nhỏ hơn rất nhiều so với cơ sở dữ liệu

Có 5 chương trình BLAST: BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLAST N, TBLAST X Trong đó BLAST N (Nucleotide – Nucleotide BLAST) cho phép so sánh chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Kent, 2002; Ye và Madden, 2006)

2.5.6 Xây dựng cây phát sinh loài từ trình tự DNA bằng phần mềm MEGA

Phần mềm MEGA (Molecular Evolutionary Gentics Analysis) là phần mềm ứng dụng được thiết kế để phân tích so sánh các chuỗi gen tương đồng từ các họ đa gen hoặc từ các loài khác nhau với một tầm quan trọng đặc biệt về các mối quan hệ tiến hóa của các mẫu DNA và protein MEGA làm nổi bật sự phân tích của các trình tự thu

đươc với sự phân tích tiến hóa (Kumar et al., 2006, Tamura et al., 2011)

CHƯƠNG III

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời điểm và địa điểm thực hiện đề tài

- Thời điểm: bắt đầu từ tháng 10/2011 đến tháng 05/2012

- Địa điểm: Thu mẫu tại tỉnh Trà Vinh Sau đó tiến hành thí nghiệm tại phòng thí nghiệm vi sinh vật môi trường và phòng sinh học phân tử của Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học - Trường Đại học Cần Thơ

3.2 Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Dụng cụ, thiết bị

- Vá thu mẫu, keo nhựa đựng mẫu, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, bình tam giác, lam, lamen, tube 1,5ml, ống falcon, giấy lọc (Sartorius Stedim 17598, 0,45m, CE), chai ampicillin…

- Máy chụp ảnh kỹ thuật số Sony Cyber-shot 8.0 (Nhật Bản)

- Kính hiển vi Olympus CH-2 (Nhật Bản)

- pH kế Orion 420A (Mỹ)

- Kính hiển vi điện tử quét JSM 5500 (Nhật Bản)

- Cân điện tử Sartorius TE 612 (Đức)

- Tủ sấy EHRET (Đức), tủ hút, máy trộn mẫu Vortex

- Tủ cấy vi sinh vật Flow Cabinet 125B-81804 (Pháp)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức), Tuttnauer 3870 MLV (Đức)

- Lò vi sóng Panasonic NN-GX 36WF (Thái Lan)

- Máy li tâm Biofuge pico Heraus D-37520 Osterode (Đức)

- Nồi ủ cách thủy GFL 1083 (Đức)

- Máy sấy chân không Eppendorf Concentrator 5301 (Đức)

- Máy đo OD Beckman Coulter DU 640B (Đức)

- Bộ điện di một chiều BioRad (Mỹ)

- Máy đọc và chụp hình gel Bio-Rad Universal HoodII (Mỹ)

- Máy PCR Perkin Elmer 9700 (Hoa Kỳ)

- Máy PCR Bio-Rad DNA Engine (Mỹ)

- Máy giải trình tự DNA tự động ABI PRISM 3130 XL (Mỹ)

- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

3.2.2 Nguyên vật liệu

Mẫu chất thải thu từ trại chăn nuôi heo (sau giai đoạn biogas) ở tỉnh Trà Vinh (hình 4)

Hình 4 Mẫu chất thải trại heo sau biogas (ngày 25/05/2011)

A Mẫu chất thải H.06 thu tại ấp Ngãi Hiệp, xã Hưng Mỹ, Châu Thành

B.Mẫu chất thải H.09 thu tại ấp Giồng Bèn, xã Huyền Hội, Càng Long

3.2.3 Hóa chất

a Hóa chất dùng cho phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

Glucose, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, carbamide, L-acid glutamic, yeast extract, (NH4)2SO4, CaCl2, NH4Cl, NaNO2, NaNO3, pepton, agar…

b Hóa chất dùng để tuyển chọn vi khuẩn

* Tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học dùng: kaolin, CaCl2

* Tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitơ dùng: NH4Cl, NaNO2, NaNO3

*Tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P dùng:

- (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, MgCl2, KCl2, Ca3(PO4)2, Bromothymol Blue…

- Hóa chất đo polyphosphate: NaOH 0,2N, HCl 1M, dung dịch A, dung dịch B

Dung dịch A gồm:

+ 140 ml acid sunfuric đậm đặc (H2SO4 ) vào 1000 ml nước cất để nguội (1)

+ 12 g amonium molypdate (NH4)6Mo2O24 4H2O vào 25 ml nước cất đun nóng cho tan (2)

+ 0,2908 g Potasssium antymonyl tartrate (KSbC4H2O6 ) vào 100 ml nước cất (3) + Trộn (1), (2), (3) và thêm nước cất cho đủ 2 lít

Dung dịch B gồm: 1,050 acid ascorbic + 200 ml dung dịch A

c Hóa chất dùng để trích DNA vi khuẩn

Môi trường Luria Bertani (LB), TE pH8, sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%, isopropanol, ethanol 70%, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10%, NaCl 0,75 M, proteinase K (10mg/ml), chloroform: isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1), bi-H2O

d Hóa chất dùng trong phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn

Bi nước, buffer NH4+

, MgCl2 25mM, deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs),

mồi xuôi và mồi ngược, BSA (Bovine Serum Albumin Acetylated 10mg/ml), Taq

DNA polymerase, DNA mẫu

e Hóa chất điện di để phát hiện sản phẩm PCR

Agarose, TAE buffer, loading buffer, ethidium bromide (EtBr), thang chuẩn DNA 100bp plus

3.2.4 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

- Theo Deng et al (2003) thành phần môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide như sau:

- Theo Hazana et al (2008) thành phần môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

sản xuất chất kết tụ sinh học protein như sau:

- Theo Zhao et al (2010), môi trường minimal được dùng phân lập vi khuẩn

chuyển hóa nitơ gồm các thành phần như bảng 4

Bảng 4 Thành phần môi trường minimal phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ

( a) Môi trường tổng hợp 3 loại nitơ (ammonium, nitrate, nitrite)

( b) 1 lít khoáng vi lượng: 3g MgSO 4 7H 2 O, 1g MnSO 4 , 1,12g H 3 BO 3 , 0,3g FeSO 4 7H 2 O, 0,6g CaCl 2

ammonium

Môi trường nitrate

Môi trường nitrite

- Theo Wang et al (2008), môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P gồm các

- Theo Nautiyal (1999), môi trường phosphate khó tan dùng để kiểm tra khả năng hòa tan phosphate của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P như sau:

3.3 Phương pháp nghiên cứu

C (Hình 5C)

Hình 5 Thu mẫu chất thải trại chăn nuôi heo (sau biogas) (ngày 24/05/2011)

(A) Thu mẫu tại hầm ủ biogas; (B) Thu mẫu tại túi ủ biogas; (C) Thu mẫu

3.3.2 Phân tích mẫu chất thải sau biogas

* Mục đích: Nhằm đánh giá sơ bộ chất lượng của mẫu chất thải sau giai đoạn biogas và kiểm tra mức độ hiện diện của các loại vi khuẩn trong mẫu chất thải tiến hành đo pH và đếm mật số vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P

* Đo pH: Chuẩn bị dung dịch đo pH bằng cách lắc đều mẫu chất thải, đo pH dung dịch mẫu bằng máy đo pH ở nhiệt độ phòng

* Đếm mật số: Mật số vi khuẩn sản xuất chất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P được xác định bằng phương pháp đếm sống

nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982) Phương pháp tiến hành như sau:

- Pha loãng mẫu

+ Cho 1ml mẫu chất thải lỏng vào 99 ml nước cất vô trùng trong bình Erlenmeyer

250 ml đã khử trùng, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu, lắc đều Lúc này mẫu được pha loãng 100 lần, độ pha loãng là 10-2

+ Hút 1ml mẫu đã pha loãng từ bình tam giác cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất đã khử trùng, mẫu gốc đã được pha loãng 1000 lần, độ pha loãng 10-3 Tương

tự, pha loãng tiếp đến 10-4

(hình 6A)

- Nhỏ giọt

+ Dùng micropipet nhỏ giọt dung dịch ở mỗi độ pha loãng tương ứng 10-2, 10-3,

10-4 vào ô đã đánh dấu trên đĩa petri có các môi trường phân lập (20μl dung dịch/1 giọt, nhỏ 3 giọt/1 ô) Nhỏ gọn, nhẹ sao cho từng giọt tỏa tròn, đều, các giọt đều nằm trong ô và không dính nhau

+ Để khô đĩa trong tủ cấy vô trùng khoảng 5 phút Sau đó, ủ trong tủ ủ ở 30oC, ủ khoảng 24 giờ (đối với vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học), 48 giờ (vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P) tiến hành đếm mật số bằng phương pháp đếm sống (hình 6B)

- Đếm mật số: Chọn đếm vi khuẩn ở 1 độ pha loãng có các khuẩn lạc rời và số lượng đủ lớn trong mỗi giọt, tính số khuẩn lạc trung bình Tính mật số vi khuẩn như sau:

Số tế bào/ml =

n: số khuẩn lạc trung bình của 3 giọt đếm

V: Thể tích một giọt nhỏ (20µl)

D: Độ pha loãng

1000: hệ số quy đổi từ µl sang ml

3.3.3 Phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy poly-P

Từ mẫu chất thải trại heo (sau biogas), lắc đều, pha loãng ở nồng độ thích hợp, hút 50µl trải lên đĩa petri có chứa các môi trường phân lập, dùng que thủy tinh trải đều khắp mặt thạch, để khô trong tủ cấy khoảng 5 phút, ủ ở 300

C trong tủ ủkhoảng 24 giờ (vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học), 48 giờ (vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P)

* Tách ròng vi khuẩn

- Chọn những khuẩn lạc rời khác nhau từ đĩa môi trường trên cấy chuyển nhiều lần sang đĩa môi trường cùng loại đến khi các khuẩn lạc rời rạc, đồng nhất (hình 7A)

n D 1000 (cfu/ml)

V

- Sau đó chuyển một khuẩn lạc rời vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng cùng loại để kiểm tra độ ròng bằng phương pháp giọt ép (hình 7B)

Hình 6 Pha loãng (A) và nhỏ giọt (B) trong phương pháp đếm sống

(ngày 02/06/2011)

Hình 7 (A) Khuẩn lạc cấy chuyển từ mẫu trải, (B) Khuẩn lạc ròng được trữ trong ống

nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng (ngày 15/06/2011)

* Kiểm tra độ ròng bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi ở độ phóng đại

400 lần

- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Khử trùng lam và lamen bằng cồn, để khô Nhỏ 25 μl nước cất vô trùng lên lam Dùng que cấy để nguội sau khi đã khử trùng trên ngọn lửa

đèn cồn lấy một ít khuẩn lạc rời rồi trải đều lên giọt nước trên lam Lấy lamen đậy lên

giọt nước bằng cách để lamen tiếp xúc với kính mang vật và giọt nước một góc 45o, hạ kính đậy vật xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí Quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu

- Nếu mẫu ròng (xem như 1 dòng) đồng thời tiến hành quan sát hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn Sau đó trữ mẫu đã ròng vào 2 ống nghiệm chứa môi trường trên để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

* Mô tả đặc điểm hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn

Sau khi các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành cấy trên môi trường cùng loại để quan sát các dạng hình thái khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi

và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt và đo kích thước khuẩn lạc bằng thước milimet (mm) 3.3.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P

a Tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học

Mục đích: Kiểm tra hiệu quả kết tụ của các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học phân lập được nhằm xác định tỉ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, từ đó chọn ra 01 dòng vi khuẩn có tỉ lệ kết tụ cao nhất ở mỗi loại môi trường để giải trình tự và nhận diện vi khuẩn