Đánh giá hàm lượng các chất β-agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối

Đánh giá hàm lượng các chất β-agonist (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ THU THỦY

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG CÁC CHẤT β-AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỨC ĂN GIA SÚC VÀ DƯ LƯỢNG TRONG THỊT GIA SÚC BẰNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 GS.TS Chu Phạm Ngọc Sơn

2 TS Trần Kim Tính

Tp Hồ Chí Minh - 2011

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là salbutamol và clenbuterol [14] Salbutamol được dùng cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol…Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax, protovent (Theo tài liệu trên trang web http://en.wikipedia.org/wiki/Salbutamol)

Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hóa chất thuộc nhóm β-agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan[14]

Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp vào

danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (Quyết định số

54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN & PTNT)[11] Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm 2005-2008 phần lớn chỉ dừng lại ở mức độ định tính và định lượng bằng ELISA với độ chính xác chưa cao Việc định lượng chính xác

dư lượng của các β-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm Đồng thời, việc xác định tồn dư β-agonist trong thịt một

số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về salbutamol (sal) và clenbuterol (clen) được công bố trong và ngoài nước, đồng thời nhờ sự

hỗ trợ về thiết bị của Trung tâm Đào tạo và Phát triển Sắc ký TP Hồ Chí Minh, Phòng Thí

nghiệm Chuyên sâu của trường Đại Học Cần Thơ, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Đánh giá

hàm lượng các chất β-agonists (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”

Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

Mục đích nghiên cứu

Đề tài này được thực hiện với mong muốn:

• Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước

• Theo dõi mức độ tồn lưu của clen và sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa clen và sal

• Điều tra sơ bộ tình hình sử dụng hợp chất β-agonist, cụ thể là sal và clen, trong thức ăn gia súc và khả năng tồn lưu của chúng trong thịt gia súc ở một số tỉnh đồng bằng sông

Cửu Long (Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang)

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

a Các mẫu thức ăn gia súc: lấy mẫu từ các cơ sở bán thức ăn gia súc, gia cầm gồm một số loại được ký hiệu như sau: NH, MT, HG, CTC, CC, CG, TAS80, ST, ADBC, ODBAS, TA11C30, TATNB, TĐĐ 6711, CT (mẫu được lấy từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 9 năm

2009)

b Mẫu thịt heo, thịt gà nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ nhất định clen và sal

để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy

c Mẫu thịt dùng cho điều tra được lấy từ các tỉnh Vĩnh Long, Hậu Giang, Thành phố Cần

Thơ

d Thiết bị phân tích

• Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS TSQ Quantum Access của Thermo

Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh)

• Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực LC/MS 2010A của Shimadzu (Công ty dịch vụ

KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh)

Phạm vi nghiên cứu

• Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết và làm giàu chất phân tích

(clenbuterol và salbutamol) trước khi đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ

• Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả năng tồn dư

clenbuterol và salbutamol trong thịt heo, thịt gà

• Phân tích 1700 mẫu thức ăn chăn nuôi và thịt heo, thịt gà, sơ bộ đánh giá tình hình sử dụng clenbuterol và salbutamol ở thành phố Cần thơ và hai tỉnh Vĩnh Long, Hậu Giang

Điểm mới của luận án

• Xây dựng thành công phương pháp định lượng clenbuterol và salbutamol bằng

LC/MS/MS, có sử dụng nội chuẩn đồng vị clenbuterol-d 9 và salbutamol-d 3 , làm tăng độ

tin cậy của phương pháp

• Quy trình phân tích tương đối không quá phức tạp nhưng đạt các yêu cầu trong quy định

của Châu Âu về hiệu suất thu hồi, giới hạn phát hiện (theo quyết định 2002/657/EC)

• Phân tích hơn 1700 mẫu gồm: Thức ăn chăn nuôi (TACN), thịt heo và thịt gà ở thành phố Cần Thơ và hai tỉnh Vĩnh Long, Hậu Giang trong ba năm 2007-2009

• Xác định khả năng lưu tồn của clenbuterol và salbutamol trong thịt gà và thịt heo qua thử

nghiệm nuôi gà, nuôi heo trực tiếp bằng chất kích thích clenbuterol, salbutamol với các nồng độ đưa vào thức ăn cho các nghiệm thức thí nghiệm là 400, 600, 1000μg/kg; thực tế,

cho đến nay, chưa có tác giả nào ở Việt Nam thực hiện nghiên cứu tương tự

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở nước ngoài và trong nước.

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Năm 2001, tác giả Woodward K.N[77] thuộc viện nghiên cứu về thuốc thú y ở Anh đã

nghiên cứu quá trình chuyển hóa và độc tính của clenbuterol trên một số loài động vật (chuột, khỉ, trâu, bò, ngựa)

Các tác giả Warriss P D và cộng sự (1990 và 1991) [73],[74], Fawcett J P và cộng sự

(2004)[40] đã nghiên cứu ảnh hưởng của salbutamol lên thịt heo, các chuyển hóa về mặt sinh học của gia súc khi sử dụng hợp chất này

Theo các tài liệu đã công bố, từ năm 1990 đến 2011, nhiều tác giả đã nghiên cứu phương pháp phân tích clenbuterol, bằng LC-MS, LC-MS/MS với các giá trị LOD cho clenbuterol trong nhiều nền mẫu khác nhau (thịt, gan, thận, thức ăn chăn nuôi, mẫu máu ) thường đạt từ 0,02 dến 9 ppb [33]; [34],[41],[50],[54],[72],[75] ; với phương pháp phân tích β-agonist trên các nền mẫu sinh học bằng sắc ký khí (GC-MS), các nghiên cứu được công bố cho giá trị LOD của clenbuterol < 0,5 ppb hoặc không công bố giá trị LOD [55] Riêng trong năm

1999, Guy và cộng sự[43] thuộc trung tâm nghiên cứu Nestlé - Switzerland đã thông báo phương pháp phân tích clenbuterol trong thịt gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực (với qui trình chiết mẫu bằng acid HClO4) với LOD đạt 0,01 ppb, hiệu suất thu hồi đạt 63-70%

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

- Việc phân tích clenbuterol, salbutamol tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam vào năm 2006 chủ yếu được thực hiện với phương pháp ELISA (dựa vào phản ứng kháng nguyên - kháng thể) [6] Tuy nhiên, phương pháp này chủ yếu có tính sàng lọc và có thể cho kết quả dương tính giả Theo quyết định 2002/657/ EC của châu Âu, một phương pháp sàng lọc, dù đã được chứng minh có thể áp dụng được cho đối tượng kiểm nghiệm, vẫn phải được xác minh lại bằng một phương pháp có tính khẳng định hơn nếu nghi ngờ về kết quả

- Năm 2007, Phạm Xuân Viết và cộng sự[16], Trường Đại Học Dược Hà Nội đã nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, một tứ cực,để định lượng salbutamol trong huyết tương, hiệu suất chiết salbutamol ở các nồng độ 10, 75, 200ppb khoảng 80%

- Năm 2008, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí nghiệm TPHCM đã nghiên cứu và xây dựng qui trình phân tích clenbuterol bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) đạt hiệu suất thu hồi từ 65- 88%; giá trị LOD đối với TACN là 0,16 ppb (clen), 0,11 ppb (sal); giá trị LOD đối với thịt là 0,05 ppb (clen), 0,07 ppb (sal) báo cáo đề tài cấp thành phố năm 2008

- Năm 2009, Bùi Quốc Anh (công ty Inotech – Thành phố Hồ chí Minh) nghiên cứu đề tài bộ kit phát hiện nhanh chất clenbuterol trong thịt gia súc gia cầm trong thời gian 2 giờ Tuy nhiên, đây chỉ là phương pháp định tính dựa trên sự biến đổi màu của thuốc thử

Năm 2010, Nguyễn Thị Chân và cộng sự [2] thuộc trung tâm phân tích và thí nghiệm

TPHCM, đã nghiên cứu đề tài “ Xác định clenbuterol trong thịt heo bằng phương pháp sắc

ký lỏng ghép khối phổ triplequad (LC-MS/MS) ” giới hạn phát hiện LOD = 0,03ppb Nhóm

nghiên cứu không sử dụng nội chuẩn đồng vị và do đó không tận dụng được ưu thế của loại nội chuẩn nầy

1.2 Lý thuyết về chất kích thích tăng trưởng họ β-agonists

1.2.1 Clenbuterol

- Công thức phân tử : C12H18Cl2ON2

- Khối lượng phân tử: 276,0796 đvC

- Công thức cấu tạo

Cl

Cl

H 2 N

NH OH

- Tên gọi: 2–(tert–butylamino)–1–(4–amino–3,5–dichlorophenyl)ethanol

Trong y học, clenbuterol có tác dụng làm dãn phế quản, dãn cơ trơn ở cuống phổi, clenbuterol còn là dược phẩm được chỉ gây tổn định để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến phổi như: hen, suyễn, tuy nhiên có thể hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người

Trong thú y, clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng đường hô hấp

ở ngựa (tên thương mại là ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu, bò, Thuốc có thể thải dần qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài

1.2.2 Salbutamol

- Công thức phân tử: C13H21O3N

- Khối lượng phân tử: 239,152 đvC

- Công thức cấu tạo:

HO

OH

- Tên gọi: 2–(tert–Butylamino)–1-(3–hydroxyethyl–2–hydroxyphenyl)ethanol

Salbutamol được ứng dụng trong y học để điều trị bệnh hen suyễn rất hiệu nghiệm Thuốc điều trị bệnh hen suyễn có chứa salbutamol có nhiều trên thị trường trong nước cũng như trên thế giới

Tác dụng của clenbuterol và salbutamol lên động vật nuôi và người

Clenbuterol và salbutamol tích lũy trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,…

1.3 Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Thiết bị gồm các bộ phận chính: bơm chịu áp suất (pump), van tiêm mẫu (injector), cột sắc ký lỏng (column), đầu dò (detector) và phần điều khiển và xử lý số liệu (data

processor)

Bộ phân tích khối ba tứ cực Với hệ thống ba tứ cực, chế độ vận hành rất phong phú, cho

phép có nhiều thông tin hữu ích trong phân tích, thí dụ có thể chạy Full Scan, SIM, Full

Scan MS/MS hay Product ion, SRM (Selected Reaction Monitoring)

1.4 Quy trình định tính và định lượng β- agonists (salbutamol và clenbuterol)

Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol và clenbuterol đều trãi qua ba giai đoạn như sau

• Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu)

• Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích

• Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Thiết bị và hóa chất

2.1.1 Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm:

• Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động

• Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI và APCI

• Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck)

• Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký

2.1.2 Hóa chất và dung dịch thử

• Nước cất 2 lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC và K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M

• Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) và H2O (0,1% HCOOH) (v/v)

2.1.3 Chất chuẩn và nội chuẩn

• Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2,HCl)

• Clenbuterol–d 9 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C12H 9D9 Cl2ON2)

• Salbutamol sulfate, Dr Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ½ H2SO4

• Salbutamol–d 3 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C13H19D3O3N)

2.2 Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC-MS/MS

2.2.1 Khảo sát quá trình quét phổ các ion chất chuẩn và nội chuẩn (Sử dụng chế độ Full scan)

Để đảm bảo độ phân giải và độ nhạy của thiết bị LC-MS/MS trong phân tích vết

clenbuterol (clen) và salbutamol (sal), cần phải tối ưu hóa các thông số vận hành của máy

Quá trình khảo sát gồm các bước sau:

- Chuẩn bị dung dịch của riêng từng chất sal sulfate, clen hydrochloride, sal-d3, clen-d9 Các dung dịch đều có nồng độ 10ppb

Trên phần mềm Xcalibur, chọn các thông số thích hợp: Điều chỉnh khoảng khối lượng nguyên tử cần quét để thu được đủ số ion cần thiết cụ thể từ 50 đến 400 Da

2.2.2 Khảo sát năng lượng phân mảnh của các tiền ion (chọn chế độ SRM: Selected Reaction Monitoring)

─ Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn gồm clen, sal với nồng độ mỗi chất khoảng 10ppb

─ Điều chỉnh năng lượng phân mảnh tiềnion (tính theo volt, thực chất là eV), mỗi lần tăng

lên hoặc giảm xuống một hoặc hai đơn vị cho đến khi nào độ nhạy tức cường độ mũi sắc

ký, không tăng nữa thì dừng lại

2.2.3 Khảo sát nhiệt độ ống mao quản

─ Chọn nhiệt độ cần khảo sát cho ống mao quản, bắt đầu khảo sát ở nhiệt độ 300oC

─ Điều chỉnh nhiệt độ tăng dần, mỗi lần tăng lên 25oC đến khi nào độ nhạy không tăng nữa thì dừng lại Sau khi cài đặt nhiệt độ, tiêm trực tiếp hỗn hợp dung dịch chuẩn 10ppb vào

hệ thống MS/MS

2.2.4 Khảo sát chương trình dung môi

2.2.4.1 Khảo sát theo chương trình đẳng dòng

Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn của 2 chất clen, sal với nồng độ khoảng 5ppb được pha trong pha động là MeOH:H2O (10:90)

─ Tiến hành phân tích hỗn hợp dung dịch chuẩn vừa chuẩn bị với các thông số đã tối ưu hóa, dùng cột sắc ký C18 và pha động chạy HPLC theo chương trình đẳng dòng (tốc độ dòng 0,5ml/phút)

2.2.4.2 Khảo sát thành phần pha động theo chương trình gradient

Với tốc độ dòng đã chọn, tiến hành khảo sát chương trình gradient dung môi bằng cách phân tích hỗn hợp dung dịch chuẩn 5ppb clen và sal đã chuẩn bị Tính độ phân giải RS và

hệ số đối xứng AS theo công thức sau

W : chiều rộng đáy của mũi sắc ký của chất phân tích 2

Yêu cầu: RS ≥ 1,3 ( khi R S < 1 cần thay đổi các thông số thực

nghiệm)

S

b A a

= với

b: độ dài của phân nửa đoạn bên

phải của đường ngang vẽ ở 10% chiều cao mũi sắc ký

a: độ dài của phân nửa đoạn bên

phải của đường ngang vẽ ở 10% chiều cao mũi sắc ký

Yêu cầu: Mũi sắc ký được chấp

nhận khi 0,9 < A S < 1,2

2.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính của clen và sal trong xây dựng đường chuẩn

Do clen và sal bị cấm không được có theo tiêu chuẩn Việt Nam nên phần đánh giá khoảng tuyến tính cần khảo sát với khoảng nồng độ sal, clen ≤ 200μg/L (ppb) Với các mẫu

có nồng độ Co (nồng độ cuối khi tiêm vào máy) vượt quá 200μg/L, cần giảm lượng mẫu cân

Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, bình phương hệ số tương quan lớn hơn 0,99 Dung dịch chuẩn được pha chế từ chuẩn gốc có nồng độ clen:118 ppm, sal: 189ppm

2.3 Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu

2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của đệm pH trên khả năng giữ lại clen, sal và nội chuẩn

đồng vị trên cột SCX

─ Bước 1: Chuẩn bị 6 ống ly tâm nhựa 50ml Mỗi ống ly tâm chứa:

0,1ml hỗn hợp nội chuẩn (sal-d3: 4ppb; clen-d9: 2ppb) + 0,1ml hỗn hợp chuẩn gồm (sal: 7,763 ppb; clen: 1,981ppb) + 10ml K2HPO4 0,1M có giá trị pH tương ứng trong 6 ống ly tâm lần lượt là 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 Lắc (vortex) các ống ly tâm

─ Bước 2: Chuẩn bị cột SPE (Strata-SCX), hoạt hóa mỗi cột SPE bằng 6ml MeOH, 6ml

H2O khử ion, 6ml đệm K2HPO4 0,1M có pH ứng với pH ở bước 1

─ Bước 3: Cho tất cả dung dịch ở bước 1 lên cột SPE, (dung dịch chảy chậm qua cột với

tốc độ 1ml/1 phút)

─ Bước 4: Rửa cột SPE lần lượt bằng 3ml nước, 3ml hỗn hợp MeOH:H2O (10 : 90), rút chân không đến khô

─ Bước 5: Rửa giải chất cần phân tích bằng 5ml hỗn hợp MeOH : NH4OHđđ (95:5) Sau đó thổi khô dịch rửa giải dưới dòng khí nitơ

─ Bước 6: Hút chính xác 1mL pha động là: MeOH:H2O (15:85), cho vào ống nghiệm đã thổi khô

─ Bước 7: Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm và tiêm mẫu vào thiết bị LC-MS/MS với

các thông số đã được tối ưu hóa

2.3.2 Khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal.

Sử dụng các thông số kỹ thuật đã được tối ưu hóa của hệ thống LC/MS/MS để khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo trên 6 lần lặp lại, khi thêm 1ml chuẩn clen nồng độ 0,495ppb,

chuẩn sal nồng độ 0,776 ppb, (chứa nội chuẩn xác định clen-d 9 và sal-d 3) vào mẫu trắng, tách chiết, làm sạch và định mức cuối cùng là 1ml với pha động.

Các đại lượng thời gian lưu trung bình t R, độ lệch chuẩn trung bình (RSD%) được xác định dựa trên kết quả phân tích và được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích

Trong phân tích LC-MS/MS, nền mẫu có thể ảnh hưởng lớn trên kết quả phân tích ở hai giai đoạn: chuẩn bị mẫu (hiệu suất tách chiết giảm) và định lượng trên đầu dò khối phổ (hiệu suất tạo ion), nên có hiện tượng khử ion Một cách khắc phục hiệu ứng không tốt của nền mẫu là dùng nội chuẩn đồng vị Do chuẩn và nội chuẩn có thời gian lưu xem như bằng nhau, ảnh hưởng của nền mẫu trên chuẩn và nội chuẩn trong hai giai đoạn chuẩn bị mẫu và định lượng trên đầu dò khối phổ về nguyên tắc là giống nhau Với clen và sal, nội chuẩn

đồng vị lần lượt là clen-d 9 và sal-d 3

Để định lượng clen và sal, đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu như sau:

- Nội chuẩn có cùng nồng độ, chất phân tích có nồng độ khác nhau, được thêm vào những lượng mẫu trắng bằng nhau trước khi xử lý

- Mẫu được xử lý trong những điều kiện giống nhau, thể tích định mức và thể tích dung dịch bơm vào máy cũng giống nhau

2.3.4 Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu

Trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích, cần thiết phải xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu (thịt và TACN) biểu thị mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích

pic ion định lượng clen (m/z 203,01) và clenbuterol-d 9 (m/z 204,01), tỉ lệ diện tích ion định lượng sal (m/z 148,10) và sal-d 3 ( m/z 151,15) thu được theo nồng độ chuẩn clen, sal tương

ứng Việc xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu giúp xác định hiệu suất thu hồi một cách chính xác hơn

1

0

V m

C

=

2.3.5 Xác định hiệu suất thu hồi

Xác định hiệu suất thu hồi của clen và sal trên mẫu trắng, trên nền thịt, TACN, gan Chuẩn bị dung dịch chuẩn: 1ml dung dịch chuẩn sal và clen trong MeOH ở các nồng độ khác nhau:

Clen: 0,1; 0,25; 0,5; 1; 10; 20 ; 50; 100 μg/L (ppb)

Sal: 1,6 ; 4; 10; 50; 100 ; 155 μg/L (ppb)

Sử dụng mẫu trắng Chuẩn bị các mẫu thịt (gan) và thức ăn chăn nuôi, mỗi mẫu 2g, cho

vào các ống ly tâm nhựa dung tích 50mL Bổ sung các dung dịch chuẩn sao cho nồng độ mỗi chất trong mẫu từ 0,05 - 75 μg/L (ppb) theo dãy nồng độ đã nêu, (thực hiện 03 lần), để yên 1 giờ Sau đó, tách chiết làm sạch (chọn pH = 6,0 ở bước 2)

Yêu cầu: Độ lệch chuẩn (RSD%) tính theo diện tích pic sắc kí của 03 lần thực hiện riêng

biệt trên cùng một nồng độ phải nhỏ hơn 10 %

• Hiệu suất thu hồi trên các nền mẫu khác nhau phải đáp ứng quy định của châu Âu (theo 2002/657/EC):

• Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm được tính theo công thức sau:

Trong đó: - X: nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu kiểm, μg/kg hoặc μg/L

- Co: nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, μg/L

- 1: Thể tích định mức 1 mL

- m: khối lượng mẫu (g) hoặc (V) thể tích mẫu phân tích, (mL)

2.4 Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp (LOD, LOQ)

Thêm dung dịch chuẩn sal, clen vào mẫu thức ăn chăn nuôi và mẫu thịt (mẫu trắng) sao cho hàm lượng các chất có trong mẫu khá nhỏ Xử lý mẫu và thực hiện phân tích trên thiết bị LC-MS/MS theo các điều kiện đã chọn

Tìm nồng độ chuẩn trong nền mẫu tối thiểu của clen và sal (Cmin Clen và Cmin Sal) sao cho sau khi tách chiết và làm sạch (clean up) và tiêm vào máy với thể tích 25 μL dung dịch, mũi sắc đồ khối có cường độ T đáp ứng được điều kiện:

3 T S 15

N

< = < Với: S là cường độ tín hiệu, N là nhiễu nền

Giới hạn phát hiện của phương pháp Cmin được tính theo công thức: L O D 3 Cm i n

T

=

Giới hạn định lượng được tính theo công thức: LOQ ≈ 3 x LOD

2.5 Thực nghiệm nuôi gà lấy mẫu - Kiểm tra dư lượng của clen và sal trong mẫu thử nghiệm

2.5.1 Phương tiện thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên 24 gà nòi lai (12 gà nòi mái và 12 gà nòi trống) có trọng lượng 0,6 ± 0,1kg trong thời gian 21 ngày

Thức ăn và khẩu phần thí nghiệm: Thức ăn được mua một lần tại địa điểm bán thức ăn

vào đầu thí nghiệm, phối hợp thành một khẩu phần cơ sở, các nghiệm thức được bổ sung

chất kích thích tăng trưởng clen và sal (với hàm lượng lần lượt là 0; 200; 300; 500 ppb cho

mỗi chất )

Công thức thức ăn thí nghiệm được bố trí như sau:

Nghiệm thức 1 (NT1): KPCS + 200 ppb clen + 200 ppb sal (B)

Nghiệm thức 2 (NT2): KPCS + 300 ppb clen + 300 ppb sal (C)

Nghiệm thức 3 (NT3): KPCS + 500 ppb clen + 500 ppb sal (D)

Các khẩu phần thí nghiệm sau khi phối trộn dạng bột được đem đóng viên tại nhà máy thức ăn khoa Thủy Sản, Đại Học Cần thơ để đảm bảo viên có đường kính 4mm

Công thức phối hợp khẩu phần cơ sở :

- Nguyên liệu thực phẩm: Bắp (42%); Tấm (18%); Cám (20%); Bánh đậu nành (13%);

Bột cá (5%); Dicalcium phosphate (1%); Thyromin(0,5%)

- Thành phần hóa học và đinh dưỡng: Ẩm độ (12,73%); Hàm lượng tro (7,93%); protein thô (crude protein):18,11%; Chiết chất ether hay béo thô (Ether Extract):

(4,9%), Xơ thô (Crude Fibre): 6,13%, Chiết chất không đạm (Nitrogen free extractives): 62,93%, Năng lượng trao đổi (Metabolizable Energy):3224kcal/Kg)*

* Metabolizable Energy: được tính theo Jansen, 1989

2.5.2 Phương pháp thí nghiệm

a Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẩu nhiên với

4 nghiệm thức, có tổng cộng 24 đơn vị thí nghiệm, mỗi đơn vị thí nghiệm nhận 1 con gà

b Chăm sóc nuôi dưỡng: Thức ăn được cân một lần trong ngày, cho vào xô đựng

riêng biệt cho từng đơn vị thí nghiệm, gà được cho ăn nhiều lần trong ngày, cuối ngày cân

lượng thức ăn còn thừa

c Mỗ khảo sát: Đến cuối thí nghiệm (sau 21 ngày), tất cả 24 con gà được tiến hành

mỗ khảo sát để lấy mẫu phân tích Mẫu được ký hiệu theo từng nghiệm thức và trữ đông

ở -18oC

Tổng số mẫu khảo sát: 24 mẫu thịt gà, 12 mẫu gan gà và 8 mẫu thận

d Các chỉ tiêu theo dõi

- Tiêu tốn thức ăn: lượng thức ăn cho ăn trừ đi lượng thức ăn thừa

- Hệ số chuyển hóa thức ăn: tiêu tốn thức ăn / tăng trọngsalbut

- Dư lượng clenbuterol và salbutamol trong thịt, gan và thận gà sau thời gian thử nghiệmamol và clenbutar

2.6 Thực nghiệm nuôi heo lấy mẫu- Kiểm tra dư ượng của clen và sal trong mẫu thử nghiệm

2.6.1 Phương tiện thí nghiệm

Từ ngày 02/04/2008 đến ngày 02/09/2008, heo được nuôi tại Xã Thuộc nhiêu, Huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang Mẫu thịt, gan, thận heo được giữ động lạnh và bảo quản ở phòng thí nghiệm chuyên sâu của trường Đại Học Cần Thơ

Thí nghiệm được thực hiện trên 5 heo giống, trung bình từ 16kg/con đến 18 kg/con Chia thành 2 nghiệm thức:

Đối chứng : 1 heo ăn khẩu phần cơ sở (không cho ăn chất kích thích tăng trưởng)

Thí nghiệm: 2 heo với khẩu phần cơ sở + 500ppb clen và 2 heo với khẩu phần cơ sở +

500ppb sal

c Thức ăn thí nghiệm

Thức ăn tự chế với thành phần gồm cám, gạo, các vitamin dạng premix (khẩu phần cơ sở)

có trộn thêm chất kích thích tăng trưởng clen và sal với hàm lượng 500ppb cho mỗi loại Các khẩu phần thí nghiệm sau khi phối trộn và được xay nhuyễn ở dạng bột

2.6.2 Phương pháp thí nghiệm

a Chăm sóc nuôi dưỡng: heo được nuôi riêng mỗi con ở một chuồng khác nhau và

ăn riêng Thức ăn được cân một lần trong ngày, cho vào xô đựng riêng biệt cho từng đơn vị thí nghiệm, heo được cho ăn ba lần trong ngày, cuối ngày cân lượng thức ăn còn thừa

b Mổ khảo sát: Đến cuối thí nghiệm, tất cả 5 con heo được tiến hành mổ khảo sát để

lấy mẫu phân tích Mẫu được ký hiệu theo từng nghiệm thức và trữ đông ở -18oC Tổng số

mẫu khảo sát: 5 loại mẫu thịt heo, 5 loại mẫu gan heo và 5 loại mẫu thận heo

c Các chỉ tiêu theo dõi

- Tiêu tốn thức ăn (g/ngày)

- Hệ số chuyển hóa thức ăn: xác định bằng cách chia tổng số thức ăn trong kỳ thí nghiệm cho tăng trọng

- Dư lượng của clenbuterol và salbutamol trong thịt, gan và thận heo sau thời gian thử nghiệm

2.7 Điều tra tình hình sử dụng clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi, thịt heo, thịt gà ở thành phố Cần thơ, tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Hậu Giang trong thời gian 3 năm từ tháng 7/2007 đến 12/2009

2.7.1 Thu mẫu TACN, thịt heo, thịt gà: từ tháng 7/ 2007 đến 12/2009 mẫu được điều tra

ở các địa phương: Thành phố Cần Thơ, Tỉnh Hậu Giang, Tỉnh Vĩnh Long

Loại TACN gồm 14 loại của các công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi trong nước cũng như các công ty hợp tác với nước ngoài được ký hiệu như sau: NH, MT, HG, CTC, CC, CG, TAS80, ST, ADBC, ODBAS, TA11C30, TATNB, TĐĐ 6711, CT

2.7.3 Phân tích mẫu

Áp dụng quy trình tách chiết và làm giàu mẫu trên cột chiết pha rắn SPE Strata - SCX

và phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ, số mẫu TACN điều tra và phân tích là 393 Số mẫu thịt heo, thịt gà điều tra và phân tích là 1377 mẫu (gồm thịt heo, thịt gà, gan heo, thận heo)