Phát hiện đột biến nhờ Khuếch đại ADN bằng kỹ thuật PCR pdf

Những kỹ thuật này có một số hạn chế nhất định: 1 việc dòng hóa thường đòi hỏi nhiều thời gian trung bình là 1 tuần hoặc hơn; 2 việc thực hiện kỹ thuật Southern blot đòi hỏi một lượng lớ

Phát hiện đột biến nhờ Khuếch đại

ADN bằng kỹ thuật PCR

Việc sử dụng các RFLP và VNTR mặc dù có ích nhưng phụ thuộc nhiều vào

kỹ thuật dòng hóa (cloning) và kỹ thuật chuyển và cố định ADN lên màng thấm Những kỹ thuật này có một số hạn chế nhất định:

(1) việc dòng hóa thường đòi hỏi nhiều thời gian (trung bình là 1 tuần hoặc hơn);

(2) việc thực hiện kỹ thuật Southern blot đòi hỏi một lượng lớn ADN tinh khiết, thường là phải nhiều microgram (để có được số lượng này thường cần khoảng 1ml máu tươi)

Kỹ thuật PCR cho phép nhân một đoạn ADN đặc hiệu ngắn (có chiều dài khoảng vài ngàn kb hoặc ngắn hơn) nhân lên một cách nhanh chóng thành hàng triệu bản sao giống hệt nhau (hình 7) tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức ADN hiệu quả hơn rất nhiều so với các phương pháp cổ điển

Khuếch đại ADN bằng kỹ thuật PCR

Quá trình thực hiện PCR đòi hỏi các thành phần sau:

(1) Hai đoạn mồi (primer), mỗi đoạn mồi là một đoạn ADN có từ 15 đến 20 base được gọi là oligonucleotide (oligo có nghĩa là "một vài") Các primer này tương ứng với trình tự của ADN nằm ngay ở các đoạn được quan tâm như đoạn chứa một đột biến gây bệnh hoặc chứa một đa hình của đoạn lặp ADN vi vệ tinh Các primer này được tổng hợp nhân tạo trong phòng thí nghiệm

(2)ADN polymerase, đây là một loại enzyme hằng định với nhiệt độ được trích chiết từ vi khuẩn Thermus

aquaticus Xúc tác cho quá trình nhân đôi của ADN, trong

kỹ thuật PCR quá trình này được gọi là quá trình kéo dài primer (primer extension)

(3) Một lượng lớn các nucleotìde tự do

(4) ADN từ một cơ thể sinh vật cần nghiên cứu, do kỹ thuật PCR rất nhạy nên lượng ADN cần thiết có thể rất nhỏ

Đầu tiên ADN của genome được đun nóng lên ở nhiệt độ tương đối cao

(95oC hoặc hơn) để tách xoắn làm hình thành các chuỗi đơn Sau đó các ADN này được cho tiếp xúc với một lượng lớn các primer, những primer này

sẽ lai với các ADN của genome theo nguyên tắc bổ sung khi được làm lạnh tới nhiệt độ khoảng từ 35oC tới 65oC ADN lại được đun nóng tới nhiệt độ trung gian 70 đến 75oC Trong điều kiện có nhiều nucleotide tự do, một

chuỗi đơn ADN mới sẽ được tổng hợp ở nhiệt độ này dưới sự xúc tác của

ADN polymerase bắt đầu từ đoạn primer Các ADN mới được tổng hợp sẽ có cấu trúc xoắn kép với đầu 5' mang primer được kéo dài bởi các nucleotide theo nguyên tắc bổ sung dưới sự xúc tác của enzyme ADN polymerase

Chuỗi xoắn kép ADN này lại được đun nóng ở nhiệt độ cao trở lại để tách xoắn Chu kỳ nóng lạnh này được lập đi lập lại nhiều lần cho phép các ADN mới được tổng hợp đóng vai trò như các khuôn mới để tổng hợp thêm các ADN mới và số lượng của các bản sao tăng lên theo lũy thừa của 2 Khi chu

kỳ này được lập đi lập lại từ 20 đến 30 lần sẽ tạo ra hàng triệu bản sao của ADN ban đầu

Tóm lại PCR là một quá trình bao gồm ba bước cơ bản:

(1) Tách cấu trúc kép ADN bằng nhiệt độ cao (2) Lai với đoạn primer ở nhiệt độ thấp

(2) Kéo dài đoạn primer ở nhiệt độ trung gian Kết quả là tạo ra các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về trình tự

Mỗi chu kỳ chỉ đòi hỏi vài phút hoặc ít hơn cho nên từ 1 ADN ban đầu có thể khuyếch đại thành hàng triệu bản sao chỉ trong vòng vài giờ

Do tính đơn giản của kỹ thuật nên các máy PCR đã được chế tạo để thực hiện công việc này một cách tự động Khi ADN được khuếch đại, chúng sẽ được phân tích theo những hướng khác nhau

Kỹ thuật PCR có nhiều thuận lợi hơn các kỹ thuật cổ điển do:

(1) Có thể được sử dụng với một lượng ADN ban đầu hết sức nhỏ với đơn vị tính là nanogram (10- 9g) hoặc

picogram (10-12g), số lượng ADN này có thể thu được từ các vết máu khô đã nhiều năm, trên một sợi tóc hoặc thậm chí từ mặt sau của một con tem được dán bằng nước bọt là

đủ cho việc phân tích

(2) Không đòi hỏi quá trình dòng hóa (cloning), do đó PCR cho kết quả nhanh hơn so với các kỹ thuật cũ

(3) PCR cho phép tạo ra một lượng lớn ADN tinh khiết nên không cần phải sử dụng các probe có hoạt tính phóng

xạ để phát hiện các đoạn ADN mang đột biến mà dùng các probe không có hoạt tính phóng xạ đánh dấu bằng phương pháp hóa học an toàn hơn

Tuy nhiên PCR cũng có những bất lợi nhất định:

(1) Việc tổng hợp các primer đòi hỏi phải có sự hiểu biết

về trình tự của đoạn ADN nằm cạnh đoạn ADN cần khảo sát Khi không có những thông tin về trình tự của đoạn đó bắt buộc phải sử dụng các kỹ thuật khác

(2) Do kỹ thuật PCR hết sức nhạy nên rất dễ bị nhiễm ADN từ các nguồn khác trong phòng thí nghiệm

(3) PCR rất khó áp dụng với các đoạn ADN dài hơn 1 đến vài kb nên kỹ thuật này không thể được sử dụng để phát

hiện các đột biến mất đoạn gene lớn hơn đoạn ADN trên Trong trường hợp này phải sử dụng kỹ thuật Southern blotting để thay thế

Do những ưu việt của kỹ thuật PCR, nên hiện nay PCR được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán các bệnh di truyền, trong pháp y và trong di truyền học tiến hóa PCR đã thay thế cho kỹ thuật Southern blotting trong nhiều lãnh vực

và hiện nay thường được dùng để phân tích các RFLP và VNTR