Bài 1 định danh vi sinh vật sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNGGẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Chuẩn đầu ra gen và những yếu tố ảnh hưởng, gây nhiễu đến các phản ứng PCR và kết quả xét nghiệm... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG

Trang 1

Bài 1: Định danh vi sinh vật sử dụng các kỹ thuật sinh học

phân tử

Trang 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP

Chuẩn đầu ra

gen và những yếu tố ảnh hưởng, gây nhiễu đến các phản ứng PCR và kết quả xét nghiệm.

Trang 3

Vật chất di truyền của vi sinh vật

Trang 4

Vật chất di truyền của vi khuẩn

Trang 5

Vật chất di truyền của vi khuẩn

Trang 6

Vật chất di truyền của vi rút

Trang 7

Vật chất di truyền của vi rút

Trang 8

Xác định các tính chất khác (mức độ nhạy cảm kháng sinh, gen độc lực…)

Trả kết quả

8

Trang 9

Nuôi cấy phân lập

9

Trang 10

Trạng thái:

10

Thành phần, chức năng:

cholerae)

PHÂN LOẠI MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY VSV

Trang 11

Định danh thông thường

Trang 12

- Thử nghiệm sinh Pyr

- Thử nghiệm yếu tố CAMP

Trang 13

Nhuộm soi, thử nghiệm các thử nghiệm sinh vật hóa học đơn giản và định danh bằng

các bộ sinh vật hóa học (bộ API, BIS 14 …)

Trang 14

Định danh VSV bằng phương pháp SHPT

14

Trang 15

Phân tích Acid nucleic

VD: viêm họng do Streptococcus nhóm A, trong nhiễm trùng sinh dục gây ra bởi Chlamydia

trachomatis hoặc Neisseria gonorrhoeae)

phản ứng khuếch đại

Trang 16

Tách DNA/RNA

Nguyên lý:

phĩng DNA ra mơi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.

• Loại bỏ protein: sử dụng hỗn hợp Phenol/Chloroform Phenol-Chloroform cĩ khả năng làm biến tính protein, làm protein bị tủa

Trang 17

Phương pháp lai DNA/RNA

Là KT sử dụng các sợi đơn acid nucleic , được gọi là đoạn dò (probe) , bắt cặp bổ sung với một sợi đơn acid nucleic khác, được gọi là phân tử đích (target)

Trang 18

SOUTHERN&NORTHERN BLOT HYBRIDIZATION

Dr.Sarookhani

Trang 19

2 đặc điểm quan trọng của quá trình lai là:

(1)đoạn dò chỉ gắn với trình tự đích;

(2)đoạn dò có thể tìm thấy phân tử đích trong hàng triệu phân

tử liên quan

Trang 20

NGUYÊN LÝ

8/17/20

Trang 21

• Là một đoạn phân tử DNA/RNA (20 bp - < 20 kb) liên kết bổ sung với phân tử đích

Trang 22

SOUTHERN BLOTTING

Trang 23

SOUTHERN BLOTTING

1 Phân cắt DNA/RNA đích bằng enzym cắt hạn chế phù hợp.

2 Điện di sản phẩm trên gel agarose.

3 Phân tách phân tử DNA sợi đôi thành sợi đơn.

4 Chuyển DNA sợi đơn lên màng nylon hoặc nitrocellulose bằng phương pháp thẩm thấu.

5 Cho các đoạn dò bắt cặp với DNA đích trên màng.

6 Hiển thị kết quả bang KT phóng xạ tự ghi.

Quy trình

Trang 24

PCR

Trang 25

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Trang 26

Các bước của phản ứng PCR

• Giai đoạn khởi đầu:

• Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C nếu sử dụng polymerases cực

• Phá vỡ liên kết hydro giữa các bazo  DNA đơn

• Giai đoạn gắn mồi:

• 50-65°C

• 30-40 giây để mồi gắn vào

• Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp với DNA nhưng cũng đủ

cao cho quá trình bắt cặp đặc hiệu

• Liên kết hydro bền vững  mồi bổ sung hoàn toàn với khuôn

• Giai đoạn kéo dài:

• Phụ thuộc vào các DNA polymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75-80°C , và nhiệt độ 72°C thường được sử dụng với enzyme này.

• Chiều 5′ đến 3’

• Giai đoạn kết thúc kéo dài:

• 70-74 °C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme

• polymerase dùng trong phản ứng PCR)

• 5-15 phút sau chu kz PCR cuối cùng

• Giai đoạn bảo quản:

• 4-15°C trong một thời gian để bảo quản ngắn hạn sản phẩm của phản ứng ở cuối chu kz

• 35 vòng  90-120m

Trang 27

Các bước của phản ứng PCR

Trang 28

Nguyên liệu cho phản ứng PCR

Trang 29

Nước Dung môi, tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase (Nucleases free)

DNA mẫu (DNA template) DNA khuôn có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không dài quá, 1-1,5kb.

Enzyme DNA polymerase

Xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp Kết quả của phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzyme polymerase Taq

Nguyên liệu cho phản ứng PCR

Trang 30

ĐOẠN MỒI – PRIMER

30

Trang 31

Các yếu tố ảnh hưởng đến 1 phản ứng PCR

• Primer và nhiệt độ lai: Chìa khóa quan trọng

• Việc lựa chọn/thiết kế primer cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:

• Độ dài: minimum ~ 15 nu, maximum ~ 30 nu

• Trình tự: Tỷ lệ G C khoảng 50% Nên thiết kế để hạn chế misprime (bắt cặp lỗi)

i. Không được có trình tự nu bổ sung lẫn nhau giữa 2 mồi

ii. Hạn chế lặp lại kéo dài của một hoặc hai cặp nu

iii. G C ở 5 nu cuối (đầu 3’)

• Nhiệt độ của đoạn mồi: Tm của 2 mồi không nên cách nhau quá xa (maximum 5oC)

• Đoạn gene cần khuếch đại: > 1 kb và < 3 kb

Trang 32

Bắt cặp lỗi (misprime)

1

2

3

Trang 33

Các yếu tố ảnh hưởng đến 1 phản ứng P C R

• Nhiệt độ nóng chảy (T m ): Primer Melting Temperature (Tm) by definition is the temperature at which one half of the DNA duplex will

dissociate to become single stranded and indicates the duplex stability.

• Primer 18 – 25 nu

• Tm = 4x(G+C) + 2x(A+T)

• Nhiệt độ bắt cặp (T a ): Annealing temperature – hybridization

temperature generally about 5°C below the Tm of your primers.

Trang 34

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng P C R

• Số lượng chu kỳ:

• Trong thực tế số chu kỳ cho một phản ứng P C R khơng nên vượt quá 40

• Số chu kỳ cho một phản ứng P C R tùy thuộc số lượng mẫu DNA ban đầu

• Mẫu 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ

• Mẫu 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40 chu kỳ

Trang 35

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng P C R

• Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphosphate)

• 20 – 200 μM

• Nồng độ cao hơn  khuếch đại “ký sinh“

• Mất cân bằng trong thành phần các dNTP tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

Trang 36

• Kết quả PCR = DNA quan tâm

• Điện di trên một khuơn đỡ (gel)

• Các loại thuốc nhuộm

• Ethidium Bromide (EtBr): rẻ, phổ biến, độc hại

• SYBR®Gold và SYBR®Safe

• GelRed™ và GelGreen™

• V.v…

Làm thế nào để đọc kết quả P C R?

Trang 37

Nguyên tắc điện di

• Điện di: hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động của

điện trường

• Phân chia các phân tử DNA, RNA, hay protein

• Khối lượng, điện tích

• Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch

chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng

• Khuôn đỡ (support matrix): giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel

• Kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc polyacrylamide):

• Dung dịch đệm để dẫn điện

• Gel để phân tách các phân tử

• Chất nhuộm phát hiện vị trí các phân tử trên gel

• Agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử DNA hoặc RNA có kích thước từ 20 bp-20 kb.

•

Trang 38

Điện di gel Agarose (Khơng biến tính)

• Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ

• Agarose và đệm điện di được đun nĩng tới >100độ C đơng

• Gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ

• Các chuỗi polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hố

• Dung dịch đệm: TAE hay TBE để tạo mơi trường thích hợp cho các ion di chuyển

Trang 39

EthBr

Trang 40

• Mặt phẳng ngang

• DNA mang điện tích (-) nên đi chuyển từ cực (-) sang (+) trong điện trường

• Tách các đoạn DNA với kích thước khác nhau

• Tốc độ dịch chuyển phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường, v.v

• Thường: DNA kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh và xa hơn trên gel, DNA kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn và gần hơn trên gel

• Các phân tử nucleic acid cĩ khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra

• Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp

• Nhuộm ethidium bromide (EtBr) nồng độ thấp và cĩ thể phát hiện dưới tia UV

Điện di gel Agarose (Khơng biến tính)

Trang 41

Điện di polyacrylamide (Không biến tính và Biến tính)

• Không biến tính: Không phá vỡ cấu trúc phân tử

• Biến tính: Phá vỡ cấu trúc phân tử (Protein 3D mạch thẳng)

• Dùng để phân tách các phân tử protein, các đoạn DNA, RNA Gel được rót vào

giữa hai tấm kính được ngăn cách bởi các miếng đệm để ngăn không cho polyacrylamide tiếp xúc với không

khí

• Chiều dài của gel: 10 – 100 cm

• Nồng độ gel: 3.5% – 20% ( tuỳ thuộc vào kích thước của phân tử protein hoặc DNA)

Trang 42

Điện di khơng biến tính

• Ít ảnh hưởng đến hoạt tính, cấu trúc của các chất cần phân tách

• Điện di trong mơi trường đệm ở pH kiềm (8-9) nhằm để các protein tích điện âm

• Đối tượng: protein, DNA

Điện di biến tính

• Đối tượng: protein

Điện di polyacrylamide (Khơng biến tính và Biến tính)

Trang 43

Ví dụ:

Dùng P C R để phát hiện Mycobacterium tuberculosis trong máu bệnh nhân

• Điện di trên gel agarose

Trang 44

(+) (-)

Mẫu 1 Mẫu 2

Trang 47

Điện di

(-) (+)

• Chứng dương: thang DNA/RNA (marker/ladder)

Trang 48

Trang 49

Đọc kết quả P C R: Nhận diện sự hiện diện của gene quan tâm là trình tự 419bp IS6110, có sự đối chiếu với thang đo và chứng dương, để xác định là bệnh nhân

có nhiễm vi khuẩn lao, ở ngưỡng có thể phát hiện được

(+) 1 2 3 (-)

Trang 50

Dr.Sarookhani

Trang 51

Mycoplasma

Trang 52

PCR với BRUCELLA

Dr.Sarookhani

Trang 53

PCR-based detection of H.pylori (cag A

gene)

Trang 54

PCR-based detection of Treponema pallidum

Trang 55

PCR-based xác định Mycobacterium lepre sinh thiết da

Trang 56

PCR-based xác định Yersinia entrocolitica (chromosomal ail gene)

Trang 57

Các kỹ thuật PCR thường gặp trong xét nghiệm

Trang 58

Real – time PCR

Trang 59

Nguyên lý

Giống P C R, nhưng:

• Máy luân nhiệt đặc biệt

• Thiết bị đo cường độ phát huỳnh quang từ giếng mẫu

• Chương trình vi tính cho phép xử lý kết quả xác định

sự biến đổi

• Có thể theo dõi quá trình khuếch đại khi nó đang diễn ra (in real time)

Trang 62

Huỳnh quang nhuộm non-specific detection

• SYBR green

• Khơng bám vào mạch đơn DNA

• Mạch kép DNA hình thành bám vào và phát tín hiệu

Trang 63

Huỳnh quang probe Specific detection

• Taq man probe: đầu kép, có thể bị thuỷ phân

• Probe: đoạn dò bắt cặp bổ sung với DNA đích

• Đoạn nucleotide ngắn có 2 đầu đặc biệt: 5’ gắn huỳnh quang (reporter), 3’ gắn chất hấp thụ tương ứng (quencher)

(1) Probe gắn vào DNA đích

(2) Bình thường: Quencher hấp thụ huỳnh quang không tín hiệu

(3) Khuếch đại bắt đầu, Taq polymerase cắt bỏ đoạn probe tách đôi 2 đầu phát sáng

(4) 1 phát sáng 1 cặp DNA mới hình thành

(•) Tại sao đặc hiệu?

Trang 64

Đọc kết quả realtime P C R

Trang 65

GIAI ĐOẠN TRONG XÉT NGHIỆM: QUI TRÌNH CHẨN ĐOÁN SARS-COV-2

⮚ Quy trình của Thái Lan: Realtime RT-PCR – gen đích N

⮚ Quy trình của Nhật Bản: PCR và sequencing – gen đích ORF1a , Realtime RT-PCR – gen đích N

⮚ Quy trình của Hồng Kong: Realtime RT-PCR – gen đích ORF1b và N

⮚ Quy trình của US-CDC: Realtime RT-PCR – gen đích N

⮚ Quy trình của China-CDC: Realtime RT-PCR – gen đích ORF1ab

⮚ Quy trình của Pháp: Realtime RT-PCR – gen đích RdRp

⮚ Quy trình của Đức: Realtime RT-PCR – gen đích E, N, RdRp

Trang 66

SƠ ĐỒ CHẨN ĐỐN XÉT NGHIỆM BỆNH PHẨM NGHI NGỜ NHIỄM SARS-COV-2

Trang 67

HỆ THỐNG MÁY XÉT NGHIỆM REAL-TIME PCR

Trang 68

NHẬN ĐỊNH VÀ TRẢ KẾT QUẢ

• Kết quả xét nghiệm được chấp nhận khi:

+ Chứng âm (NTC): khơng cĩ tín hiệu huỳnh quang

+ Chứng âm tách chiết (NEC): khơng cĩ tín hiệu huỳnh quang

+ Chứng dương (POS): cĩ tín hiệu huỳnh quang ≥28 ≤ 35 chu kỳ

• Mẫu dương tính: khi tín hiệu huỳnh quang ≤ 37 chu kỳ

• Mẫu âm tính: khi tín hiệu huỳnh quang: khi tín hiệu huỳnh quang > 40 chu kỳ

• Mẫu nghi ngờ: khi tín hiệu huỳnh quang > 37 - ≤ 40 chu kỳ

• Trong trương hợp kết quả real-time RT PCR cho kết quả E gene dương tính nhưng RdRp và N gene âm tính thì cần lấy mẫu lại và làm xét nghiệm lại

Trang 69

Giải trình tự gene

Trang 70

Phân tích protein

Dấu ấn DNA

Dấu ấn khối phổ Dấu ấn khối phổ

Biểu hiện kiểu hình

Tính chất sinh vật hóa học, hình

thái, kiểu hình Tính chất sinh vật hóa học, hình

thái, kiểu hình

Trang 71

MALDI-ToF MS Trong phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng

Trang 73

Sự kết tinh

⮚Ria khuẩn lạc trên đĩa kim loại

⮚Nhỏ 1µl Matrix (CHCA)

⮚Để khô tạo tinh thể

⮚Cấu trúc tế bào vi sinh vật bị phá vỡ và protein kết hợp với matrix

Ionisation

Of- Flight

Time-Mass

Trang 75

Dựa vào sự tương đồng khối phổ

Khối phổ

Cơ sở dữ liệu

Định danh Tên vi sinh vật

⮚ Tương đồng phổ của các loài (chi, loài, dưới loài)

⮚ Sự khác nhau khối phổ các loài các nhau

Trang 76

A b A b

b A b

Rapid Identification by MALDI-ToF MS

⮚ Significant reduction in mortality (12.7% compared to 20.3% (p=0.021))

⮚ Highly noticeable with GN Bacteremia cases (8.3% vs 25.3% (p=0.003))

⮚ Significant reduction in mortality (12.7% compared to 20.3% (p=0.021))

⮚ Highly noticeable with GN Bacteremia cases (8.3% vs 25.3% (p=0.003))

⮚ Time to intervene antibiotic therapy

▪ Significantly improved on effective therapy (20.4 Hrs vs 30.1 Hrs (p=0.021)

▪ Significantly improved on optimal therapy (47.3 Hrs 90.3 Hrs (p<0.001)

⮚ Time to intervene antibiotic therapy

▪ Significantly improved on effective therapy (20.4 Hrs vs 30.1 Hrs (p=0.021)

▪ Significantly improved on optimal therapy (47.3 Hrs 90.3 Hrs (p<0.001)

⮚ Significant reduction in LOS in ICU (8.3 days vs 14.9 days (p=0.014))

⮚ Significantly less frequent recurrent bacterimia in 30 days (2.0% vs 5.9%)

A b A b

Tác động của định danh nhanh trong quản lý bệnh nhân nhiễm trùng

Trang 77

TÁC ĐỘNG LÂM SÀNG CỦA ĐỊNH DANH NHANH

MALDI-ToF MS trong thực hành lâm sàng

Trang 78

và/hoặc lồi

Trả kết quả

81

Trang 79

Tóm tắt các ý chính

Real-time PCR, giải trình tự gen, phân tích protein

Trang 80

Câu hỏi lượng giá

Trang 81

Tài liệu tham khảo

1 Nguyễn Vũ Trung, Vi sinh – ký sinh trùng lâm sàng, tập 1, Nhà xuất bản Y học, 2014 (Trang 35-45)

2 James Versalovic, Karen C Carroll, Guido Funke, James H Jorgensen, Marie Louise Landry, David

W Warnock, Manual of Clinical Microbiology, Fifth Edition, ASM, 2011 (Trang 1171-1235)

Trang 82

Tài liệu tham khảo

3.George Manuselis Connie R.Mahon, Text Book of Diagnostic Microbiology, Second Edition,

Elsevier Health Sciences, 2000 (Chương 13)

4 Jawetz, Melnick, Adelberg, Medical microbiology, 2013 (Chương 11)

5 McGraw-Hill, Molecular Microbiology, 2012 (Trang 1085-1099)

Tiêu đề	Định Danh Vi Sinh Vật Sử Dụng Các Kỹ Thuật Sinh Học Phân Tử
Trường học	Đại học Y tế công cộng

Định dạng
Số trang	82
Dung lượng	9,07 MB