TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNGGẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Các phương pháp định lượng thơng thường... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNGGẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP Ưu điểm và nhược điểm
Trang 1Bài 2: Định lượng vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong
chẩn đoán và điều trị
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Chuẩn đầu ra bài học
Sau khi học xong, sinh viên cĩ khả năng :
1 Giải thích nguyên lý, ý nghĩa và vai trị của các kỹ thuật sinh
học phân tử trong định lượng vi sinh vật
2 Diễn giải kỹ thuật Realtime PCR ứng dụng trong định lượng vi sinh vật
3 Phiên giải một số ứng dụng của định lượng trong chẩn đốn và điều trị
Trang 3Phương pháp định lượng là gì ?
Trang 4TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Các phương pháp định lượng thơng thường
Trang 5Phương pháp đếm trực tiếp
men, men, tảo … có thể được xác định trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi.
Trang 7Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10
tế bào
Trang 8Cách đếm tế bào trong buồng đếm
Trang 10TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Ưu điểm và nhược điểm
Ưu điểm: cho biết được số lượng VSV
Nhược điểm: dễ nhầm lẫn, độ chính xác khơng cao,
khơng thích hợp cho huyền phù vsv cĩ mật độ thấp
Khắc phục nhược điểm của pp đếm trực
tiếp ????
Trang 11Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
Các chất nhuộm phát huỳnh quang
- Acridin cam (AODC)
- 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI)
- Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Ưu điểm:
- Loại bỏ sai số do các chất vẩn
Trang 12TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
- Chuẩn bị dịch pha lỗng mẫu
- Chuẩn bị các chuỗi pha lỗng mẫu
- Cấy mẫu vào mơi trường, ủ mẫu
- Đếm số khuẩn lạc hình thành
Trang 13Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu
Trang 14TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Chuẩn bị các chuỗi pha lỗng mẫu
pha lỗng mẫu lỏng theo dãy thập phân
Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng:
10g mẫu + 90ml dung dịch pha lỗng => độ pha lỗng 101
Các bước tiếp theo tương tự như pha lỗng mẫu lỏng Film
Trang 15Cấy mẫu vào môi trường
- Phương pháp cấy bề mặt (cấy trang)
Trang 16TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Phương pháp đổ
đĩa
● Chuẩn bị đĩa petri vơ trùng
mát ở 45oC trong bể điều nhiệt
Trang 17Phương pháp đổ đĩa
Ưu điểm
• Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)
• Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía
• Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng
150-300 khuẩn lạc
Nhược điểm
• Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt
• Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất
định
Trang 18TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
● Mơi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1-2 ngày
để khơ mặt
- Cấy 0.1 – 0,3ml vào đĩa mơi trường
- Trải đều trên mặt bằng que trang tam giác
- Để ở nhiệt độ phịng 15-20 phút cho khơ mặt
- Ủ
Film
Trang 19Phương pháp cấy bề mặt
Ưu điểm
- Định lượng được các VSV nhạy nhiệt
- Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng
- Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu
Nhược điểm
- Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ
- Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp
Trang 20TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc
Máy đếm khuẩn lạc
Máy đếm khuẩn lạc tự động
Trang 21Đếm khuẩn lạc
300
● Tính toán kết quả
(dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính
ra số khuẩn lạc vsv trong dung dịch ban đầu)
Trang 22TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Trang 23Thiết bị lọc nhiều phễu
Trang 24TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Trang 25Khuẩn lạc vsv mọc trên màng
Trang 26TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha lỗng khác nhau của mẫu.
Mỗi độ pha lỗng được nuơi cấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần)
Các độ pha lỗng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại cĩ một số lần dương tính và cĩ một số lần âm tính.
Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đốn số lượng VSV trong mẫu
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
(Most Probable Number)
Trang 27• Hai hệ thống MPN
- Hệ thống 9 ống
- Hệ thống 15 ống
• Đặc điểm
- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc
trưng trên môi trường nuôi cấy như
Sự tạo hơi: Coliforms …
Sự đổi màu: S aureus
- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN
Trang 28TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Hệ thống MPN/g(ml)
Hệ thống 9 ống
10ml mỗi trường
Hệ thống 15 ống
Trang 29Realtime PCR
Kỹ thuật sinh học phân tử
Trang 30TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Kỹ thuật sinh học phân tử ( Thế mạnh )
Trang 31Kỹ thuật sinh học phân tử ( Ý nghĩa )
Rất quan trọng để đưa ra phác đồ điều trị phù hợp
Ngăn chặn sự lây lan của các bệnh truyền nhiễm
Trang 32TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Quy trình định lượng vi sinh vật bằng
kỹ thuật Real-time PCR
Xử lí bệnh phẩm
Tách chiết DNA/RNA
Trang 33Nguyên lý
• Là một phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Sự tích lũy sản phẩm PCR được ghi nhận nhờ fluorescence của sản phẩm
• Giúp xác định sự hiện diện (định tinh) hoặc nồng độ ban đầu (định lượng) của trình tự DNA/mRNA quan tâm.
Trang 34• Đoạn mồi
(primers)
• Taq polymerase
• dNTP
Trang 35Tín hiệu huỳnh quang (fluorescence) của sản phẩm (1)
• Chất nhuộm khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh
quang:
ethidium bromide, Syber green 1…
• Bộ phận phát quang được thiết kế trên probe (đoạn dò),
gián tiếp báo hiệu sự tạo thành các phân tử DNA mới
Trang 36TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
SYBR GREEN I
Huỳnh quang
7
Trang 37SYBR GREEN I
DNA cần tim
DNA không cần tim
Trang 38TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Tín hiệu huỳnh quang (fluorescence) của sản phẩm (2)
• Chất nhuộm khi chèn vào sợi đơi DNA sẽ phát huỳnh
quang:
ethidium bromide, Syber green 1…
• Bộ phận phát quang được thiết kế trên probe (đoạn dị),
gián tiếp báo hiệu sự tạo thành các phân tử DNA mới
38
Trang 39Cấu tạo của đoạn dò (probe)
• 1 đoạn nucleotide đặc hiệu, có 1 đầu là bộ phận
fluorophore (kích thích) và 1 đầu là bộ phận quencher (ức chế)
39
Trang 40Cơ chế hoạt động của probe
(C) Probe Beacon (D) Probe Scorpion11
(A) Probe
Taqman (B) Probe dual
Trang 42TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Cách xác định sản phẩm PCR trong real-time PCR (1)
4
2
• Sản phẩm PCR được tạo ra theo luật 2 n (n là số chu kỳ nhân đơi)
• Phản ứng PCR tự giới hạn với tỷ lệ tạo sản phẩm chậm dần
Trang 43CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA
Trang 44TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Cách xác định sản phẩm PCR trong real-time
PCR (2)
Trang 45Thời điểm phát tín hiệu:
• Threshold: Điểm bắt đầu quan sát được tín
hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm
này, tín hiệu do sản phẩm PCR > tín hiệu
nền
• Ct (Cycle of threshold): Số chu kỳ mà tại
đó tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm PCR
được phát hiện
Trang 46Cách xác định sản phẩm PCR trong real-time PCR (3)
Trang 47• Ứng dụng: định type VSV, xác định đột biến đặc hiệu (trong nhiều loại đột biến)…
Trang 48TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
• Xác định nồng độ (số copy) sản phẩm của đoạn DNA trình
tự đặc hiệu ban đầu (định lượng tuyệt đối)
• Xác định mức độ biểu hiện 1 gen đặc hiệu trong một tinh
trạng của cơ thể (định lượng tương đối)
48
REAL-TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG
Trang 49Định lượng tuyệt đối (1)
• Phải xây dựng 1 phương trình đường chuẩn (standard curve) từ những
mẫu có số copy DNA đặc hiệu biết trước, cho biết tương quan giữa số copy và Ct đo được
49
Trang 501 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 Cycle 11
C.33 C.31 C.29
C.34
Mẫu chưa biết [C]
Standard curve
21
Trang 51• Ngoài ra, phải xây dựng gen nội kiểm tra (internal control):
• Là đoạn DNA đích được gây đột biến (cùng primer với DNA đích nhưng khác biệt về trình tự khuếch đại dễ phát hiện)
• Nhằm phát hiện yếu tố gây ức chế PCR hiện diện trong dung dịch chạy PCR
• Được pha vào mỗi mẫu thử 1 lượng như nhau
Trang 52E%=PCR efficiency (90%-105%)
R=Corelation coefficiency (>0.990)
E = 10 -1/slope E% = (E-1) x 100%
E =10 -1/slope = 10 -1/-3.425 = 1.959 E% =(1.959 - 1) x 100% =23 95,9
Trang 53• Có sự xuất hiện của gen tham chiếu (reference gene)
• Có 2 cách:
• Sử dụng đường chuẩn
• Sử dụng mẫu chuẩn (calibrator)
53
Trang 54TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
• Cĩ sử dụng đường chuẩn: KQ là 1 tỷ lệ giữa target gene và reference
gene trong mỗi mẫu thử
Dilution curve target gene
‘copy number’ target gene experimental
Dilution curve reference gene
‘ p
e
Copies of target gen Copies of reference gen
Trang 55• Sử dụng mẫu chuẩn:
• Calibrator là một mẫu (dòng tế bào) có tỷ lệ target gene trên reference gene ổn định
• Áp dụng thuật toán
• KQ là tỷ lệ của target gene trong mẫu thử so với trong
calibrator sau khi đã đồng nhất với reference gene.
Định lượng tương đối (3)
Trang 56TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Trang 57Quy trình xét nghiệm hỗ trợ điều trị HBV
Trang 58TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Trang 59Quy trình xét nghiệm hỗ trợ điều trị HBV
Trang 60TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Trang 61Câu hỏi lượng giá
Trang 62TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Câu hỏi lượng giá
2 Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng để:
A Xác định tác nhân gây bệnh cĩ bộ gen bản chất là DNA
B Xác định tác nhân gây bệnh cĩ bộ gen bản chất là RNA
C Xác định đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh
D Định lượng tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích
Trang 63Tài liệu tham khảo
1 Nguyễn Vũ Trung, Vi sinh – ký sinh trùng lâm sàng, tập
1, Nhà xuất bản Y học, 2014 (Trang 35-45)
2 James Versalovic, Karen C Carroll, Guido Funke, James
H Jorgensen, Marie Louise Landry, David W Warnock,
Manual of Clinical Microbiology, Fifth Edition, ASM, 2011
(Trang 1171-1235)
Trang 64TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG
GẮN KẾT – PHÁT TRIỂN – HỘI NHẬP
Tài liệu tham khảo
3.George Manuselis Connie R.Mahon, Text Book of
Diagnostic Microbiology, Second Edition, Elsevier Health
