Phân lập và xác định độc tố vi khuẩn clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt

Nghiên cứu này sử dụng kinh phí của đề tài “Nghiên cứu sản xuất bộ kit LAMP phát hiện nhanh gen độc tố của Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt", mã số đề tài 02/2021 ĐX.. botuli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ VI KHUẨN

CLOSTRIDIUM BOTULINUM GÂY BỆNH NGỘ ĐỘC THỊT

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của các thầy cô giáo Trường Đại học Mở Hà Nội, các nhà khoa học của Viện vệ sinh dịch tễ trung ương

Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào và các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy cho em những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và hoàn thành luận văn

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thùy Trâm, TS Lê Huy Hoàng, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo Viện vệ sinh dịch tễ trung ương, Lãnh đạo khoa Vi khuẩn và các anh chị phòng thí nghiệm Vi khuẩn kỵ khí, đã luôn tạo điều kiện, chia sẻ và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn

Nghiên cứu này sử dụng kinh phí của đề tài “Nghiên cứu sản xuất bộ kit

LAMP phát hiện nhanh gen độc tố của Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc

thịt", mã số đề tài 02/2021 ĐX Em xin trân trọng cảm ơn chủ nhiệm đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp, cơ quan đã quan tâm, động viên, nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Lê Thị Trang

LỜI CAM ĐOAN Tôi Lê Thị Trang, học viên Cao học khóa 2019-2021 Trường Đại học mở Hà

Nội, chuyên ngành công nghệ sinh học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của các Thầy: TS Nguyễn Thùy Trâm, TS Lê Huy Hoàng

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công

bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực

và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Người viết cam đoan

Lê Thị Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về bệnh ngộ độc thịt 2

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm bệnh ngộ thịt 2

1.1.2 Các dạng bệnh ngộ độc thịt 4

1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt 8

1.2 Tổng quan về vi khuẩn C botulinum 11

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn C botulinum 11

1.2.2 Sự phân bố của vi khuẩn C botulinum 13

1.2.3 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn C botulinum 15

1.2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C botulinum trên thế giới 17

1.2.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C botulinum ở Việt Nam 17

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cúu 19

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 19

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu- dụng cụ hóa chất dùng trong nghiên cứu 19

2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ 19

2.2.2 Vật tư tiêu hao 20

2.2.3 Hóa chất, sinh phẩm 20

Hóa chất sinh phẩm dùng cho nuôi cấy phân lập 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu: 22

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 22

Nghiên cứu mô tả thực nghiệm và mô tả cắt ngang 22

2.3.2 Các kỹ thuật nghiên cứu 22

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 36

3.1 Kết quả thu thập các loại mẫu 36

3.2 Kết quả xác định tính chất sinh vật hóa học C botulinum bằng kit API 20A 38

3.3 Kết quả xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR 40

3.5 Kết quả giải trình gen 45

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 50

KẾT LUẬN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Viết đầy đủ tiếng anh Viết giải nghĩa tiếng

việt

của phân tử DNA

Control and Prevention

Trung tâm kiểm soát

và phòng ngừa bệnh dịch

API Analytical Profile Index Hồ sơ định danh vi

kỵ khí

Electrophoresis

Điện di xung trường

TPGY

Trypticase Peptone Glucose Yeast extract medium

Môi trường TPGY

Orgnization

Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Cơ chế dẫn truyền thần kinh ở khe synap và cơ chế cắt đứt dẫn truyền thần

kinh do botulin 3

Hình 2: Mô hình chuỗi nặng và chuỗi nhẹ độc tố bolulinum 4

Hình 3: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn C botulinum 12

Hình 4: Hình ảnh khuẩn lạc trên thạch C botulinum EYA 13

Hình 5: Phản ứng sinh vật hóa học 28

Hình 6: Sắp xếp index N và S theo thứ tự trên giá 31

Hình 7: Đoạn ngắn DNA sau khi gắn index và adapter 32

Hình 8: Hình ảnh tạo cluster và giải trình tự read 1 34

Hình 9: Quá trình giải trình tự trên máy Miseq 35

Hình 10: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen độc tố B C botulinum 41

Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen độc tố A C botulinum 41

Hình 12: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch máu 43

Hình 13: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch GAM 43

Hình 14: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch Brucella 44

Hình 15: Hình ảnh nhuộm gram chủng Cbt3F01 44

Hình 16: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch EYA 45

Hình 17: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với các chủng C botulinum nhóm I, II, III 47

Hình 18: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với các chủng C tobulinum nhóm I 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Báo cáo ca bệnh ngộ độc thịt từ năm 2008 – 2017 tại Mỹ 6

Bảng 2 1 Thành phần phản ứng PCR……… 29

Bảng 3 1.Tổng số mẫu các loại đã thu thập……… 36

Bảng 3 2 Nguồn gốc mẫu mật ong 36

Bảng 3 3 Nguồn gốc mẫu đất 37

Bảng 3 4 Các loại mẫu đồ hộp 37

Bảng 3 5 Tỉ lệ phân lập C botulinum từ các loại mẫu 42

Bảng 3 6 Kết quả định danh chủng C botulinum bằng bộ kit API 20A 38

Bảng 3 7 Kết quả xác định loại độc tố bằng phương pháp PCR 40

MỞ ĐẦU

Nha bào vi khuẩn Clostridium botulinum (C botulinum) có ở trong mật

ong, đất có thể là nguồn lây nhiễm vi khuẩn vào thực phẩm và gây ra bệnh ngộ độc thịt Nhiều nước trên thế giới (Mỹ, Nhật, Đức, Braxin, Thái Lan) đã có báo cáo hàng năm về số liệu ca bệnh ngộ độc thịt Trung bình mỗi năm ở Mỹ có 70-100 trường hợp ngộ độc thịt được báo cáo, trong số đó khoảng 25% ca bệnh ngộ độc thịt

do thực phẩm và 72% ca bệnh ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh [42,45] Từ năm 1976 đến nay, trên 1500 ca bệnh ngộ độc thịt trẻ em được báo cáo ở hơn 15 quốc gia Tuy nhiên hiện Việt Nam chỉ có 1 chùm ca bệnh được báo cáo gần đây là vào tháng 9/2020 tại Hà Nội và tháng 3/2021 đều do ngộ độc pate chay Điều này có thể do thiếu sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng cũng như các nhà nghiên cứu vi sinh học

Thêm vào đó, vi khuẩn C botulinum là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối, khó nuôi cấy

phân lập Vi khuẩn này sinh độc tố thần kinh được xem là một trong những độc tố mạnh nhất vì thế nó được xếp vào danh sách tác nhân nguy hiểm nhóm A và bị nghi ngờ sử dụng làm vũ khí sinh học nên nó lại càng khó khăn hơn trong việc đặt mua hoặc chia sẻ chủng vi khuẩn từ các hãng hay tổ chức nghiên cứu quốc tế Các cơ sở nghiên cứu, bệnh viện, trường học không có chứng dương để tiến hành các nghiên cứu, xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn này, vì vậy nghiên cứu về bệnh ngộ độc thịt tại Việt Nam hầu như bị quên lãng Bộ Y tế Việt Nam có ban hành các tiêu chuẩn

việt nam (TCVN) liên quan đến chẩn đoán vi khuẩn và độ tố vi khuẩn C botulinum

bằng kỹ thuật PCR và Elisa [4,5,6] nhưng trên thực tế không có chứng dương để xác nhận phương pháp

Dựa vào tình hình thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân

lập và xác định độc tố vi khuẩn C botulinum gây bệnh ngộ độc thịt” với các mục

tiêu nghiên cứu sau:

1 Nuôi cấy phân lập chủng vi khuẩn kỵ khí C botulinum từ mẫu môi trường

và thực phẩm

2 Xác định độc tố C botulinum bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự gen

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về bệnh ngộ độc thịt

1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm bệnh ngộ thịt

Bệnh ngộ độc thịt – tên tiếng Anh là “Botulism” – bắt nguồn từ tiếng La tinh

“botulus” có nghĩa là “xúc xích” do những ca bệnh đầu tiên phát hiện ở châu Âu có liên quan đến xúc xích sản xuất tại nhà Tên “botulism” – bệnh ngộ độc thịt có tầm quan trọng về mặt lịch sử nhưng không phản ánh hết nguồn gốc sinh bệnh vì ngày nay nhiều sản phẩm gây bệnh có nguồn gốc thực vật chứ không phải chỉ ở động vật

Bệnh ngộ độc thịt do độc tố (botulin) của trực khuẩn kỵ khí Clostridum

botulinum (C botulinum) gây ra Độc tố này thuộc loại độc tố thần kinh và là độc tố

độc nhất trong các loại độc tố đã biết Độc tố có thể xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc mắt hoặc niêm mạc đường hô hấp Sau khi vào cơ thể, độc

tố thẩm thấu vào hệ thống tuần hoàn và hệ thống lympho sau đó đến dây thần kinh vận động, gắn không hồi phục vào các đầu mút (receptor) hòa màng của túi Acetycholin và màng cúc tận cùng, ngăn chặn sự giải phóng chất dẫn truyền Acetylcholine từ các đầu dây thần kinh, cắt đứt các dẫn truyền thần kinh, giao tiếp giữa các tế bào thần kinh không được thực hiện, gây liệt các cơ như cơ vận động, cơ

hô hấp [24,36] Độc tố ngộ độc thịt gồm 7 loại (A, B, C, D, E, E, G) gây liệt phản hồi theo cơ chế ức chế sự phóng thích acetylcholine tại các đầu nối thần kinh – cơ, nhưng chúng lại không giống nhau về vị trí gắn kết trên tế bào thần kinh tạo mức độ

ức chế giải phóng acetylcholin khác nhau do vậy mức độ biểu hiện bệnh là khác nhau Chính vì vậy, mức độ nặng nhẹ và thời gian phục hồi của bệnh phụ thuộc vào loại độc tố và lượng độc tố mà bệnh nhân hấp thu vào máu Bệnh tuy hiếm gặp nhưng thuộc loại bệnh tiến triển cấp tính nên cần chẩn đoán và điều trị kịp thời

Hình 1: Cơ chế dẫn truyền thần kinh ở khe synap và cơ chế cắt đứt dẫn truyền thần

kinh do botulin (nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Botulinum_toxin)

Triệu chứng lâm sàng điển hình của tất cả các dạng bệnh ngộ độc thịt bao gồm liệt cơ thần kinh trung ương như hiện tượng song thị và giãn đồng tử, chứng loạn vận ngôn, khô miệng, khó nuốt và liệt mặt Các độc tố này gây liệt mềm nhanh chóng ở người và động vật bằng cách gắn vào đầu mút thần kinh, nếu không điều trị kịp thời sẽ liệt cơ hô hấp và dẫn đến tử vong [36]

Độc tố ngộ độc thịt là một protein lớn có trọng lượng phân tử 150 kDa với hoạt tính của enzym zinc- endopeptidase, gồm 2 tiểu đơn vị là 1 chuỗi nặng và 1 chuỗi nhẹ Chuỗi nặng trọng lượng 100 kDa là chuỗi có thụ thể đặc hiệu cho độc tố gắn vào và vận chuyển qua màng synap Chuỗi nhẹ có trọng lượng 50 kDa có vai trò chính trong việc thay đổi cấu trúc protein liên quan tới việc hợp nhất thành màng tiền synap và giải phóng chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine Phân tử độc tố được tiết ra nguyên bản có chứa cả cấu phần độc tố cũng như cấu phần không độc

tố Cấu phần không độc tố bảo vệ cấu phần độc tố khỏi áp lực môi trường và hỗ trợ cấu phần độc tố thẩm thấu vào cơ thể Độc tố chịu được nhiệt độ thấp nhưng lại mất hoạt tính ở nhiệt độ cao và môi trường kiềm Độc tố bị bất hoạt (mất hoạt tính) nếu

phơi nhiễm với ánh sáng mặt trời trong vài giờ Độc tố có thể bị phá hủy khi xử lí với sodium hypoclorit (NaClO) 0,1% hoặc Sodium Hydroxide (NaOH) 0,1N Độc

tố bị phá hủy ở nhiệt độ 500C/30 phút hoặc 800C/20 phút hoặc >850C ít nhất 5 phút Tuy nhiên độc tố lại không bị phân hủy trong môi trường a xít của dạ dày hay dưới tác dụng của các enzym tiêu hóa (pepsin, tripsin) Sự đề kháng với nhiệt của chúng rất khác nhau phụ thuộc vào thành phần thức ăn hoặc môi trường và nồng độ độc tố [35,36]

Hình 2: Mô hình chuỗi nặng và chuỗi nhẹ độc tố bolulinum (nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Botulinum_toxin)

Liều lượng gây độc của độc tố botulinum phụ thuộc vào loại độc tố và đường lây nhiễm Liều lượng gây chết người của độc tố botulinum chưa được biết nhưng

có thể được ước tính thông qua các nghiên cứu về linh trưởng, người ta ước tính, liều gây chết 50% quần thể thử nghiệm (LD50) của độc tố botulin qua đường hít thở

và đường uống là 1 – 3ng/kg thể trạng, còn nếu qua được tiêm tĩnh mạch thì chỉ từ 0.25 – 0.5ng/kg thể trạng [35]

Là hình thức phổ biến nhất được quan sát thấy trên toàn thế giới, do ăn phải

thức ăn có chứa độc tố thần kinh Thức ăn có nha bào C botulinum sống sót sau khi

chế biến, sau đó gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm, sinh trưởng và tạo ra độc tố

Vì thế các thực phẩm đóng hộp hoặc đóng chai (có hàm lượng oxy thấp) được sản xuất tại nhà không được chế biến kỹ lưỡng, bảo quản ở nhiệt độ thấp là những thực phẩm có tiềm năng gây bệnh ngộ độc thịt cao [45]

Vi khuẩn C botulinum không phát triển trong điều kiện axit (pH nhỏ hơn 4,6),

do đó độc tố sẽ không được hình thành trong thực phẩm có tính axit (tuy nhiên, độ

pH thấp sẽ không phân hủy được độc tố hình thành từ trước) Sự kết hợp giữa nhiệt

độ bảo quản thấp và hàm lượng muối và/hoặc pH cũng được sử dụng để ngăn ngừa

sự phát triển của vi khuẩn hoặc sự hình thành độc tố trong thực phẩm [45]

Độc tố botulinum được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm, bao gồm các loại rau củ muối bảo quản bằng nồng độ axit thấp, chẳng hạn như đậu xanh, rau bina, nấm và củ cải đường; cá, bao gồm cá ngừ đóng hộp, cá lên men, ướp muối và hun khói; và các sản phẩm thịt, chẳng hạn như giăm bông và xúc xích [8,15] Bệnh ngộ độc thịt lây truyền qua thực phẩm đặc trưng bởi tình trạng người bệnh tê liệt từ trên cao xuống thấp (liệt từ mặt lan dần xuống các chi), toàn thân tê liệt, sức co cơ bằng

0, cơ thể như bị tiêm thuốc giãn cơ quá liều nhưng đầu óc vẫn hoàn toàn tỉnh táo Liệt mềm ở cơ hô hấp có thể khiến bệnh nhân khó/không nuốt được, không thở được, mức oxy bão hòa trong máu thấp gây suy hô hấp khiến bệnh nhân tử vong Các triệu chứng ban đầu bao gồm mệt mỏi, suy nhược và chóng mặt, sau đó thường

là mờ mắt, khô miệng, khó nuốt và khó nói Nôn mửa, tiêu chảy, táo bón, chướng bụng cũng có thể xảy ra Bệnh có thể tiến triển thành yếu ở cổ và cánh tay, sau đó các cơ hô hấp và cơ vùng hạ vị bị ảnh hưởng Không sốt và không mất ý thức Các triệu chứng thường xuất hiện trong vòng 12 đến 36 giờ sau khi tiếp xúc [45] Tỷ lệ bệnh ngộ độc thịt thấp, nhưng tỷ lệ tử vong cao nếu không được chẩn đoán kịp thời

và điều trị thích hợp Bệnh có thể gây tử vong trong 5 đến 10% trường hợp

1.1.2.2 Bệnh ngộ độc thịt tr s sinh

Thường do C botulinum nhóm I, độc tố loại A, B, Bf và F Bệnh thường xảy

ra ở trẻ sơ sinh dưới 6 tháng tuổi khi trẻ nuốt phải nha bào C botulinum, sau đó nha

bào đã nảy mầm và phát triển sản sinh độc tố trong ruột già Ở hầu hết người lớn và trẻ em trên 6 tháng tuổi, điều này không xảy ra vì hệ thống phòng thủ tự nhiên của

cơ thể giúp ngăn chặn sự nảy mầm và phát triển của nha bào C botulinum Bệnh

ngộ độc thịt trẻ em gây nôn mửa, táo bón, chán ăn, suy nhược cơ thể, cơ không phát triển, khóc yếu Nếu không được chữa trị kịp thời, những triệu chứng này có thể phát triển gây tê liệt cánh tay, chân và cơ hô hấp [45]

Ở Mỹ, bệnh ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh là thể phổ biến và thường gặp nhất trong các dạng ngộ độc thịt Trung bình mỗi năm có 160 ca ngộ độ thịt sơ sinh và tỷ lệ tử vong chung từ 5 – 10%

Điểm đáng chú ý là trong số bệnh nhân ngộ độc botulinum có tới 72% là trẻ nhũ nhi dưới 1 tuổi Một nghiên cứu định lượng các mẫu mật ong có khả năng gây bệnh ở Mỹ cho thấy, mỗi gam mật có từ 5-70 nha bào vi khuẩn Khi trẻ nhũ nhi ăn phải nha bào có trong mật ong, dạ dày của trẻ ít axit, nên các nha bào có điều kiện nảy mầm, phát triển tạo ra độc tố botulinum Biểu hiện bệnh ở trẻ nhũ nhi cũng khác người lớn Chưa biết chính xác thời gian khởi bệnh, nhưng khoảng từ 3 – 30 ngày, tính từ thời điểm trẻ ăn phải nha bào Các dấu hiệu chính gồm yếu cơ (mềm người) và mí mắt có thể rũ xuống lúc nào cũng nhắm như ngủ, đôi khi trẻ táo bón không đi ngoài trong vài ngày, bú kém hoặc bỏ bú, trẻ hay cáu gắt hoặc tiếng khóc bất thường Giai đoạn muộn trẻ khó thở, suy hô hấp, ngừng thở và tử vong nếu không được điều trị kịp thời [37]

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phải đưa ra khuyến cáo trẻ dưới 1 tuổi không nên cho ăn mật ong và các sản phẩm chứa mật ong, bao gồm cả việc bôi mật ong vào núm vú Châu Âu và các quốc gia phát triển khác ở châu Á cũng đều khuyến cáo như vậy

1.1.2.3 Bệnh ngộ độc thịt v t th ng

Do nha bào C botulinum dính vào vết thương hở, nảy mầm và phát triển trong

vết thương hoặc ổ áp xe ở điều kiện kỵ khí Triệu chứng của bệnh ngộ độc vết thương giống với triệu chứng của bệnh ngộ độc thịt và thường xuất hiện sau 2 tuần lây nhiễm Bệnh này thường gặp ở người phải tiêm thuốc nhiều lần trong ngày hoặc những người tiêm bạch phiến hắc lào trong da (injecting black tar heroin) [45]

1.1.2.4 Các dạng bệnh ngộ độc thịt khác

Ngoài 3 dạng bệnh ngộ độc thịt phổ biến kể trên, còn có thể gặp các sau: Bệnh ngộ độc thịt do hít phải độc tố botulinum, trường hợp này rất hiếm và không phải xảy ra một cách tự nhiên, thường là sự kiện cố ý (chẳng hạn như khủng

bố sinh học) dẫn đến giải phóng chất độc trong bình xịt Chứng ngộ độc lây qua đường hô hấp có dấu hiệu lâm sàng tương tự như chứng ngộ độc thực phẩm Liều gây chết trung bình cho con người ước tính là 2 nanogram độc tố botulinum trên

mỗi kg trọng lượng cơ thể, cao hơn khoảng 3 lần so với các trường hợp lây qua thực phẩm Sau khi hít phải chất độc, các triệu chứng sẽ xuất hiện trong vòng 1-3 ngày, thời gian khởi phát lâu hơn, mức độ nhiễm độc thấp hơn và đỉnh điểm là tê liệt cơ

và suy hô hấp Nếu nghi ngờ có tiếp xúc với chất độc qua đường hô hấp, niêm mạc mắt bằng khí dung thì phải ngăn ngừa tiếp xúc thêm cho bệnh nhân và những người khác Quần áo của bệnh nhân phải được cởi ra và cất trong túi nhựa cho đến khi có thể giặt kỹ bằng xà phòng và nước Bệnh nhân nên tắm và được khử độc ngay lập tức

Chứng ngộ độc thịt thể ẩn (Hidden botulism) – còn gọi là chứng ngộ độc ruột hay ngộ độc thịt sơ sinh tuổi trưởng thành, do chứng bệnh này gặp ở người lớn bị ngộ độc thịt nhưng không có nguồn gốc độc tố botulinum rõ ràng, Người ta tìm thấy

vi khuẩn Clostridium botulinum trong đường tiêu hóa của những bệnh nhân này,

chúng sinh sôi nảy nở và tạo ra chất độc thần kinh Những bệnh nhân này thường

có bất thường về đường tiêu hóa như phẫu thuật trước đó, nhiễm khuẩn achlorhydria, bệnh viêm ruột hoặc sử dụng kháng sinh gần đây …

Chứng ngộ độc thịt vô tình (Inadvertent Botulism): là loại bệnh gần đây nhất được cộng đồng y tế công nhận, là dạng bệnh do sử dụng độc tố botulinum để điều trị y tế hoặc xảy ra do nhân viên phòng thí nghiệm tiếp xúc với độc tố Một báo cáo gần đây về bệnh ngộ độc thịt toàn phát do sử dụng độc tố botulinum trị liệu ở ít nhất

2 bệnh nhân Ba trường hợp ngộ độc thịt đã được báo cáo ở nhân viên phòng thí nghiệm dường như đã mắc bệnh bệnh do hít phải chất độc này

1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt

Chẩn đoán lâm sàng bệnh ngộ độc thịt có thể được xác định bằng cách phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, gen sinh độc tố của vi khuẩn hoặc độc tố botulinum trong máu, phân hoặc chất nôn của bệnh nhân hoặc thực phẩm nghi ngờ Các bệnh phẩm thu thập cho mục đích xác định độc tố phải được thu thập trước khi sử dụng thuốc kháng độc tố botulinum cho bệnh nhân [46] Xác định thực phẩm gây bệnh là quan trọng nhất trong việc ngăn ngừa thêm các trường hợp ngộ độc thịt Chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt thường mất nhiều thời gian và phương pháp chẩn đoán phụ thuộc

vào dạng bệnh Có thể chỉ sử dụng một kỹ thuật nhưng cũng có thẻ phải phối hợp

nhiều kỹ thuật cùng lúc

1.1.1.3.1 Ph ng pháp PCR phát hiện gen sinh độc tố

Phát hiện trực tiếp gen sinh độc tố của vi khuẩn C botulinum bằng cách tách

chiết trực tiếp DNA từ mẫu vật hoặc thêm bước tăng sinh nồng độ vi khuẩn trong

mẫu bằng cách nuôi cấy trong môi trường TPGY trong điều kiện kỵ khí, canh thang

tăng sinh sau đó được tách DNA tổng số DNA thu được sau đó được dùng làm

DNA khuôn mẫu trong phản ứng PCR phát hiện gen sinh độc tố Sơ đồ quy trình

phát hiện gen sinh độc tố của vi khuẩn C botulinum bằng phương pháp PCR như

sau [6,27]:

1.1.3.2 Ph ng pháp nuôi cấy phát hiện vi khuẩn

Để đáp ứng nhanh cho quá trình chẩn đoán, mẫu bệnh phẩm dùng cho nuôi

cấy phát hiện vi khuẩn C botulinum thường được cấy trực tiếp lên môi trường chọn

lọc CBI, đồng thời cấy tăng sinh nồng độ vi khuẩn trong môi trường TPGY Các mẫu nuôi cấy được ủ kỵ khí và đọc kết quả sau 40 -18 giờ sau nuôi cấy Nếu mẫu cho kết quả âm tính, mẫu vẫn phải được theo dõi thời gian nuôi cấy kỵ khí đủ 7 ngày Sau 7 ngày nuôi cấy, mầu vẫn cho kết quả âm tính, lúc đó mới khẳng định là

mẫu âm tính [5] Các khuẩn lạc nghi ngờ C botulinum trên thạch CBI được định

danh bằng các phương pháp khác nhau như PCR phát hiện gen sinh độc tố, phương pháp xác định tính chất sinh vật hóa học bằng kit Api20A

1.1.3.3 Ph ng pháp Elisa phát hiện độc tố botulin

Phương pháp này được dùng để phát hiện các độc tố thần kinh botulinum typ

A, B, E và F trong các môi trường nuôi cấy tăng sinh TPGY và CMM Các độc tố trong môi trường bị bắt giữ bởi các kháng thể immunoglobin G (IgG) đã được phủ trên các đĩa vi và được phát hiện bằng cách sử dụng các IgG đã biotinyl hóa và các chất cộng hợp phosphatase kiềm Enzym gắn kết với kháng thể sau đó được quan sát bằng cách sử dụng cơ chất được khuếch đại Phép thử dương tính là khi có giá trị độ hấp thụ > 0,2 trên giá trị độ hấp thụ quan sát được trong các giếng chứng âm [4,5]

1.1.3.4 Ph ng pháp thử nghiệm trên động vật

Huyết thanh, dịch tiết dạ dày, phân hoặc thức ăn của bệnh nhân được pha loãng trong dung dịch đệm phosphate và tiêm vào màng bụng của chuột thí nghiệm Sau đó chuột được theo thời điểm xuất hiện các triệu chứng giống ngộ độc botulism như: lông xơ, yếu cơ và suy hô hấp… Các triệu chứng được ghi chép và so sánh triệu chứng của nhóm chuột đối chứng (chứng âm - chuột khỏe mạnh, và chuột chứng dương (chuột được tiêm độc tố) Trong quá trình theo dõi sức khỏe của chuột thử nghiệm, người ta có thể tiêm thêm cho chuột nhiễm bệnh kháng độc tố botulism Các triệu chứng ngộ độc botulism sẽ hết khi chuột nhiễm bệnh nhận được

chất kháng độc tố phù hợp [15] Kỹ thuật xét nghiệm này tốn nhiều công sức và nguồn lực Do vậy, chỉ có một số ít phòng thí nghiệm y tế hiện đại mới có thể thực hiện thử nghiệm này [19]

1.2 Tổng quan về vi khuẩn C botulinum

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn C botulinum

C botulinum là trực khuẩn kỵ khí, có khả năng di động và sinh nha bào Nha

bào hình oval, ở gần đầu nên làm cho tế bào phồng lên Trên tiêu bản nhuộm gram,

vi khuẩn bắt màu gram dương, kích thước dao động tùy từng nhóm

Dựa vào đặc điểm huyết thanh của độc tố sinh ra, độc tố thần kinh của C

botulinum được chia thành 8 loại độc tố kí hiệu bằng các chữ từ A đến G và một số

subtype Có chủng sinh cả hai loại độc tố và có chủng sinh một loại độc tố nhưng

mang gen lặn của độc tố khác Loài Clostridia khác là C butyricum cũng sinh độc

tố E và C baratii sinh độc tố F Bệnh ngộ độc thịt ở người thường do các chủng

sinh độc tố A, B, E hoặc F gây ra Độc tố A có xu hướng độc hơn độc tố B, E và thời gian gây bệnh dài hơn [13

Còn dựa vào kiểu hình và kiểu gen, C botulinum chia thành 4 nhóm đánh số

từ I-IV Nhóm I, II là nhóm gây bệnh trên người, nhóm III thường gây bệnh trên động vật – nhưng cũng có trường hợp ngoại lệ Nhóm IV thường không gây bệnh vì

vậy nhóm IV đã được đề nghị đổi tên thành vi khuẩn Clostridium argentinense

C botulinum nhóm I sinh độc tố loại A, B, E và nhóm II sinh độc tố B, E, F

Thông thường, C botulinum ở nhóm I là nhóm có khả năng li giải protein và sinh

enzym endogenous có khả năng phân tách phân tử độc tố Còn nhóm II là nhóm không li giải protein, phân tử độc tố thần kinh cần những protease khác (như trypsin) để hoạt hóa hệ thống enzym Nhóm I hoặc nhóm II đều liên quan đến nguy

cơ mất an toàn thực phẩm nhưng nha bào của C botulinum nhóm I có khả năng

chịu nhiệt cao hơn nha bào của nhóm II, nhóm I sinh trưởng tốt ở nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể (370C) trong khi đó C.botulinum nhóm II sinh trưởng tốt ở nhiệt độ

dưới 300C và bị hạn chế ở nhiệt độ 370C C botulinum nhóm I thường liên quan đến

kích thước 3,0-22 µm x 0,5-2,4 µm C botulinum thường đứng đơn và ít khi xuất

hiện cặp đôi hoặc chuỗi ngắn [12]

Hình 3: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn C botulinum

Khuẩn lạc C botulinum tròn, bờ không đều và đường kính khoảng 3mm,

nhưng đường kính có thể tăng đến 8mm sau thời gian ủ dài hơn Khuẩn lạc có thể vồng lên hoặc dẹt, thô ráp hoặc trơn bóng và thường có xu hướng lan Tuy nhiên,

hình thái khuẩn lạc của các chủng thuần khiết thuộc giống Clostridum có thể rất

khác nhau nên nuôi cấy thường bị nhầm lẫn Khi cấy chuyển các khuẩn lạc thuần thì

khuẩn lạc thường giống nhau giữa các nhóm khác nhau Chủng vi khuẩn C

botulinum sản sinh enzym lipolytic (enzym tiêu mỡ), tạo ra a xít béo tự do từ lòng

đỏ trứng (trong thạch EYA) kết tủa phía dưới khuẩn lạc và tạo màng óng ánh (lớp ngọc trai) bao phủ khuẩn lạc Một số chủng của nhóm III còn có khả năng sinh

lecithinase (vùng kết tủa) Nhìn chung, khuẩn lạc của tất cả các nhóm C botulinum

thường được bao quanh bởi vòng tan máu hoàn toàn Nuôi cấy kỵ khí đặc trưng bởi mùi hôi thối do sinh a xít béo bay hơi và H2S

Hình 4: Hình ảnh khuẩn lạc trên thạch C botulinum EYA 1.2.2 Sự phân bố của vi khuẩn C botulinum

Trực khuẩn kỵ khí C botulinum có mặt rộng rãi trong đất (nghĩa trang, nơi

có nhiều xác động vật, gia súc, gia cầm), bùn, nước, mật ong [13,18,29,30] Cây

cối, tảo và động vật thối rữa tạo môi trường kỵ khí thuận lợi cho C botulinum sinh

trưởng, chúng có thể xâm nhập vào chuỗi thức ăn làm cho động vật bị nhiễm độc Với việc tận dụng dinh dưỡng hoại sinh, vi khuẩn nhanh chóng tạo nha bào và thành

ổ chứa nha bào Nha bào C botulinum tồn tại trong bùn, đất hàng thập kỉ và lây lan sang động vật hoặc côn trùng C botulinum xâm nhập vào mạng lưới thức ăn của

động vật, độc tố có thể gây nhiễm độc và giết chết động vật Vi khuẩn hoại sinh con mồi bằng cơ chế enzym, bao gồm protease và chitinase tạo ra nguồn dinh dưỡng có sẵn cho lượng lớn nha bào nảy mầm và sản sinh độc tố Đất và bùn là môi trường nguyên thủy chứa nha bào, là vùng ủ bệnh và từ đó các căn nguyên có thể di chuyển khắp nơi [13,18,29,30]

Nha bào C botulinum có sức đề kháng cao, khi gặp điều kiện thích hợp thì nha bào lại nảy mầm tạo thành tế bào sinh dưỡng Nha bào C botulinum cũng có

thể thấy ở cặn đáy hồ, suối hoặc đại dương, ở đường ruột động vật có vú khỏe mạnh, gia cầm, chim hoang dã và cá Khi xảy ra dịch ngộ độc thịt, tự nha bào vi khuẩn có thể tồn tại mãi mãi Ví dụ trong một vụ dịch ngộ độc thịt ở chim, bệnh lan

truyền qua ruồi ăn xác chim chết do ngộ độc thịt rồi đẻ trứng trên những xác động

vật này Khi giòi sinh sôi trong xác chết sẽ tạo môi trường khị khí, giúp C

botulinum phát triển và tăng lượng độc tố ngộ độc thịt Khi động vật khác ăn giòi

này, nó sẽ ăn cả độc tố và vi khuẩn C botulinum rồi trở thành nạn nhân tiếp theo

(tạo nên vòng tròn xác chết-giòi) [14 Vi khuẩn gây bệnh ngộ độc thịt không lây truyền giữa người và người hoặc giữa động vật với nhau bằng tiếp xúc thông thường Tuy nhiên, có thể mắc nếu người hoặc động vật ăn phải những mô nhiễm nha bào vi khuẩn

C botulinum có thể sinh trưởng ở nhiều loại vật chất hữu cơ khác nhau

nhưng yêu cầu về điều kiện kỵ khí tuyệt đối, độ ẩm tương đối cao, pH >4,6 và không có nồng độ muối hoặc chất bảo quản ức chế Nhiệt độ tối đa, tối thiểu và tối

ưu cho sự sinh trưởng khác nhau tùy từng nhóm vi khuẩn sinh độc tố khác nhau

Đặc biệt, C botulinum sinh độc tố E có thể sống sót và sinh trưởng ở nhiệt độ thấp

hơn các chủng loại A hoặc B [13]

Tế bào sinh dưỡng của C botulinum mẫn cảm với nhiều loại nước tẩy rửa như sodium hypoclorit 1% và cồn 70% nhưng nha bào C botulinum lại có sức đề

kháng cao Nha bào chỉ có thể bị phá hủy trong nồi hấp ướt 1210C/ít nhất 30 phút hoặc sấy khô 1600C/2 giờ hoặc tia phóng xạ Nha bào của chủng nhóm I bị bất hoạt

ở nhiệt độ 1210C/3 phút trong quá trình đóng hộp thương mại Nha bào của chủng nhóm II kém đề kháng với nhiệt hơn và chúng thường bị phá hủy ở 900C/10 phút,

850C/52 phút hoặc 800C/270 phút, tuy nhiên cách xử lí này có thể không đủ đối với một số loại thực phẩm [12]

Sự phân bố các chủng vi khuẩn C botulinum sinh các loại độc tố khác nhau

rất đa dạng theo vùng địa lý Tại Mỹ đã có một vài dự án giám sát mẫu đất bùn để

phát hiện C botulinum loại A, B, C, D và E Chủng C botulinum loại A tìm thấy

nổi trội ở phía Tây sông Mississippi còn type B thì nổi trội ở phía Đông, chủng F phân lập từ cặn biển Pacific và từ cua ở vịnh Cheasepeake [13 Chủng loại E ưa lạnh có liên quan đặc biệt đến môi trường trong khu vực miền Tây Bắc Mỹ, Nhật Bản và bờ biển Baltic Chủng loại E thường phân lập được từ bùn vùng thủy sản

hơn là từ các loại đất vì bùn cung cấp điều kiện kỵ khí, độ ẩm và nhiều chất dinh dưỡng Chủng loại E cũng thường là nguyên nhân về sự bùng phát bệnh ngộ độc

thịt mà cá là phương tiện lây nhiễm chủ yếu Ở lục địa châu Phi, C botulinum loại A-D được tìm thấy trong mẫu đất ở Zambia và Kenya Tại Úc, C botulinum loại A,

B và D được tìm thấy ở các ca bệnh ngộ độc thịt hoặc trong mẫu đất Ở khu vực

nhiệt đới (Indonesia), đã phát hiện C botulinum độc tố loại A, B, C, D, F và không

có loại E Tại Ấn độ, loại C và D phổ biến ở cá và môi trường nước và chủng loại E cũng không phân lập được ở đây Nhìn chung tại châu Âu, độc tố loại B có xu hướng phổ biến hơn loại A Một nghiên cứu mẫu đất ở Đan Mạch đã báo cáo tỉ lệ

C botulinum khoảng 41,0% ở đất canh tác trồng trọt, trong khi đất nguyên thủy ở

rừng thì không phân lập được C botulinum [11,13,18]

1.2.3 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn C botulinum

Do đặc điểm sinh lí học khác nhau giữa chủng nhóm I và II nên việc nuôi

cấy phân lập vi khuẩn C botulinum rất khó khăn Tuy nhiên những ca bệnh ngộ độc thịt sơ sinh hay ngộ độc thịt vết thương, phân lập thành công vi khuẩn C botulinum

sinh độc tố là tiêu chuẩn vàng và là công cụ chẩn đoán quan trọng, hơn nữa trong nghiên cứu chủng vi khuẩn là nguyên liệu cần thiết cho những nghiên cứu tiếp theo như sản xuất kháng độc tố, xây dựng quy trình chẩn đoán … vì vậy nuôi cấy phân lập vi khuẩn là một kỹ thuật quan trọng không thể thiếu Để nuôi cấy phân lập thành

công C botulinum, các mẫu phải được nuôi cấy song song ở nhiều điện kiện khác

nhau như: tăng sinh hoặc không tăng sinh, sốc cồn (nhiệt) hay không sốc cồn (nhiệt), nhiệt độ nuôi cấy ở 300C hay 370C

C botulinum sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí bắt buộc Môi trường vận

chuyển hoặc nuôi cấy cần khử oxi bằng cách đun nóng cách thủy hoặc để trong điều kiện kỵ khí trước Những hóa chất có thể khử oxi như thioglycolate, cystein

…thường được thêm vào môi trường để duy trì điều kiện kỵ khí trong quá trình nuôi cấy và ủ Luôn sử dụng chỉ thị kỵ khí để kiểm soát chất lượng khí trường nuôi

cấy C botulinum

Nuôi cấy phân lập C botulinum truyền thống bao gồm những bước sau: Nuôi

cấy trong môi trường lỏng và phát hiện độc tố ngộ độc thịt từ dịch nổi bằng thử nghiệm trên chuột Những mẫu dương tính tiếp tục ria cấy trên môi trường rắn Chọn khuẩn lạc thuần để tiếp tục định loại độc tố bằng thử nghiệm trên chuột hoặc tiến hành phản ứng PCR phát hiện gen độc tố Những mẫu lâm sàng như huyết thanh và phân có thể cấy trực tiếp hoặc xử lí cồn để loại bỏ vi khuẩn không sinh nha bào Có thể dùng phương pháp sốc nhiệt 800C/10 phút cho nha bào nhóm I nhưng nhiệt độ này có thể ảnh hưởng đến nha bào nhóm II Nha bào nhóm II nên xử lí ở nhiệt độ 600C/10-20 phút Việc bổ sung enzyme li giải chịu được nhiệt độ như lyzozyme (5µg/ml) vào môi trường nuôi cấy có thể kích thích sự nảy mầm của những nha bào bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ

Môi trường lỏng thường dùng: Môi trường thịt băm glucose tinh bột; môi trường thịt chín (CMM); canh thang chứa hỗn hợp tryptone, peptone, glucose, nấm men, và trypsin; môi trường tăng sinh cho dòng clostridia; canh thang kỵ khí khó tính Tất cả các loại môi trường này là môi trường không chọn lọc nên nhiều loại vi khuẩn có thể mọc được

Thạch máu và thạch lòng đỏ trứng nhuyễn (Egg Yolk Agar - EYA) là môi

trường rắn không chọn lọc thường dùng để nuôi cấy C.botulinum Trên môi trường này C.botulinum có phản ứng lipase dương tính đặc trưng Tuy nhiên nhiều giống

clostridia cũng sinh lipase nên có thể nhầm lẫn Môi trường EYA không chứa bất cứ thành phần ức chế nào nhưng khi bổ sung 3 loại kháng sinh D-cycloserin,

sulfamethoxazole và trimethoprim được gọi là môi trường chọn lọc C botulinum

(Clostridim botulinm Isolation - CBI) Môi trường này được dùng phân lập vi khuẩn

từ mẫu phân của bệnh ngộ độc thịt trẻ em Tuy nhiên vì loại môi trường này có thể

ức chế sinh trưởng của C botulinum nhóm II nên hạn chế dùng môi trường này

chẩn đoán ngộ độc thịt lây truyền qua thực phẩm

1.2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C botulinum trên thế giới

Tại Mỹ mỗi năm trung bình có hơn 100 trường hợp bệnh ngộ độc thịt được báo cáo Tại châu Á, số liệu của Nhật Bản từ năm 1976-2006 đã báo cáo 20 trường hợp bệnh ngộ độc thịt [29, 42 Trung quốc cũng đã có những báo cáo ca bệnh ngộ độc thịt lẻ tẻ [38 Ở miền bắc Thái Lan vụ dịch ngộ độc thịt xảy ra ngày 14/3/2006

là vụ lớn nhất cho đến nay với 209 người mắc bệnh Trong đó 42 người suy hô hấp

và 25 người được chuyển về 9 bệnh viện hiện đại để điều trị [19

Một nghiên cứu tại Đức cho thấy, vi khuẩn hoặc độc tố của C botulinum

phát hiện ở 20% trẻ tử vong do hội chứng đột tử ở trẻ sơ sinh (SIDS- Sudden Infant Death Syndrome) [15 Vì vậy, đã có giả thuyết về mối liên hệ giữa bệnh ngộ độc thịt trẻ sơ sinh và SIDS Nghiên cứu về các yếu tố nguy cơ đối với bệnh ngộ độc thịt trẻ sơ sinh thông qua bằng chứng dịch tễ học và xét nghiệm cho thấy việc cho trẻ dưới 1 tuổi ăn mật ong là nguy cơ quan trọng nhất liên quan tới bệnh ngộ độc thịt trẻ sơ sinh Năm 2006, nghiên cứu của Vũ Thị Lâm An báo cáo có khoảng 11,2% (12/179) mẫu thức ăn cho trẻ và 8,1% (8/99) mẫu mật ong thu thập tại Việt Nam có

kết quả PCR dương tính với C botulinum độc tố B, C, D, E Trong nghiên cứu này cũng báo cáo có 8/46 (17,4%) mẫu thu thập tại Đức có nha bào C botulinum, đặc biệt có 2 mẫu mật ong chứa cả C botulinum độc tố B và E [7

1.2.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C botulinum ở Việt Nam

Tại Việt Nam, năm 2012 đã có tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9049:2012 - Xác

định C botulinum và độc tố của chúng bằng phương pháp vi sinh Năm 2015, tiêu

chuẩn quốc gia TCVN11135:2015- Vi sinh vật trong thực phẩm- Phát hiện độc tố

C botulinum typ A, B, E và F ra đời, sử dụng thử nghiệm hấp phụ gắn enzym (kĩ

thuật ELISA) Gần đây nhất bộ tiêu chuẩn TCVN 11395.2016 - Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm, phát hiện clostridia sinh độc tố thần kinh botulinum loại A, B, E

và F Theo quyết định số 3320/QĐ-BCT ngày 7 tháng 4 năm 2015 của Bộ Công Thương về việc chỉ định cơ sở kiểm nghiệm thực phẩm, viện Kiểm nghiệm An toàn

Thực phẩm Quốc gia có chức năng phát hiện C botulinum trong thực phẩm Tuy

nhiên tất cả các bộ tiêu chuẩn trên chỉ áp dụng cho các sản phẩm thực phẩm, thức

ăn chăn nuôi và các mẫu môi trường Hơn nữa, Viện Kiểm nghiệm An toàn Thực

phẩm Quốc gia và một số cơ sở nghiên cứu C botulinum cũng chỉ báo cáo kết quả

dương âm chứ không lưu giữ chủng [4, 5, 6

Các nghiên cứu về bệnh ngộ độc thịt ở người chưa được thực hiện ở Việt

Nam Gần đây chỉ có một số ít nghiên cứu về vi khuẩn C botulinum ở khu trú ở

ruột vịt, gây bệnh liệt mềm cổ (dân gian gọi là bệnh cúm cần) của một số tác giả Nghiên cứu tại một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long cho thấy chủ yếu phát hiện

được C botulinum độc tố C, D nhưng cũng đã có sự hiện diện của C botulinum độc

tố E trên vịt bị liệt mềm cổ Sự đào thải các chủng này ra môi trường có thể là nguồn lây nhiễm vi khuẩn vào chuỗi thức ăn và con người [1, 2

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cúu

Các loại mẫu môi trường (đất, bùn) và thực phẩm (mật ong, đồ hộp)

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm thu thập mẫu môi trường: một số tỉnh phía Bắc (Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hải Dương, Hải Phòng, Hà Giang, Thái Bình, Thanh Hóa, Nam Định, Hà Nam)

Địa điểm thu thập mẫu thực phẩm: Mật ong được thu thập tại các trang trại nuôi ong, ngoài ra mật ong thương mại và mẫu thực phẩm được mua đa dạng nguồn gốc xuất xứ các sản phẩm tại siêu thị, cửa hàng Mẫu đồ hộp thu thập từ nguồn thực phẩm nghi ngờ gây bệnh cho bệnh nhân ngộ độc thịt hoặc đồ hộp có dấu hiện phồng, màu sắc, mùi vị bất thường

Địa điểm thực hiện xét nghiệm: Theo thông tư số 41/2016/TT-BYT về danh mục vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm theo nhóm nguy cơ và cấp độ an toàn sinh

học phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm thì vi khuẩn C botulinum thuộc nhóm nguy cơ

2, cấp độ an toàn sinh học phù hợp cho các kỹ thuật xét nghiệm chung là phòng xét nghiệm (PXN) an toàn sinh học cấp 2 Vì vậy các xét nghiệm trong nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi khuẩn kỵ khí – Khoa Vi khuẩn – Viện vệ sinh dịch tễ trung ương là PXN đạt tiêu chuẩn phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 2

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

2.2 Vật liệu- dụng cụ hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ

- Tủ kỵ khí model UM107 (Hãng sản xuất Bug Box Plus – Anh)

- Máy PCR model ABI9700 (Hãng sản xuất ABI – Mỹ)

- Bể ủ nhiệt nước Memmert (Đức)

- Kính hiển vi quang học Olympus (Đức)

- Máy đo pH (Oakton – Eutech)

- Máy chụp ảnh gel

- Tủ an toàn sinh học cấp 2 Esco

- Máy giải trình tự gen Miseq System, Model SY-410-108 (Hãng Illumina – Mỹ)

Hóa chất sinh phẩm dùng cho nuôi cấy phân lập

Kit định danh sinh hóa API 20A (Hãng BioMerieux)

Kháng sinh: D-cyloserin (Hãng Wako – Nhật), Trimethoprim và Sulfamethoxazol (Hãng Merck)

Môi trường không chọn lọc: Thạch GAM (Hãng Gifu - Nhật)

Môi trường CMM (Hãng Oxoid – Mỹ)

Cồn 100% (Hãng Merck), 70%

Túi tạo kỵ khí Gas Pack (Hãng Mishumishi – Nhật)

Chỉ thị kỵ khí (Hãng Oxoid – Mỹ)

Bộ hóa chất nhuộm Gram

Hóa chất sinh phẩm dùng cho PCR

2X Go-taq Master-Mix (GoTaq® DNA Polymerase, Promega)

Thang chuẩn DNA: 100bp, 1kb

Bot Er GCT ATT GAT CCA AAA CGG TGA

Hóa chất sinh phẩm dùng cho giải trình tự

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả thực nghiệm và mô tả cắt ngang

2.3.2 Các kỹ thuật nghiên cứu

2.3.2.1 Kỹ thuật thu thập mẫu:

Nextera XTDNA samples preparation kit 24

sample

Illumina/USA FC-131-1024

Nextera XT index kit (24 indicate) Illumina/USA FC-131-1001 MiSeq reagent kit 300V2 Illumina/USA MS-102-2002 Qubit Assay kit dsDNA HS Invitrogen- Q32851

Optical Clear 8 cap strips Applied Biosystems- 4323032

Đất: dùng xẻng nhỏ gạt lớp đất bề mặt sâu 10cm Thu thập khoảng 100-200g đất vào túi zip/lọ vô trùng Mật ong: thu khoảng 50-100g mẫu vào các lọ nhựa vô trùng Bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng

Mật ong: Thu mua nguyên lọ tại các cửa hàng, siêu thị hoặc thu thập mật ong tại trang trại nuôi ong Mật ong được chia vào các lọ nhựa vô trùng, vận chuyển về PTN

Mẫu thực phẩm: Thu thập mẫu thực phẩm nghi ngờ gây ngộ độc trong các vụ

ngộ độc thực phẩm ngi ngờ do C botulinum hoặc mẫu thực phẩm đóng hộp có dấu

hiệu bất thường như phồng rộp, có mùi vị khó chịu …

2.3.3.2 Kỹ thuật pha môi tr ờng nuôi cấy

Pha chế môi trường thạch GAM

Cân bột thạch GAM theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hòa tan vào nước khử ion (nước cất 2 lần) và đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch Hấp ướt 1150C/15 phút

Để nguội xuống 500C Trộn đều rồi đổ 15-20ml /1 đĩa 90 mm Để mặt thạch khô hoàn toàn Ghi nhãn (tên môi trường, ngày sản xuất), đóng gói và bảo quản ở 4 –

80C Sử dụng trong vòng 4 tuần

Pha chế môi trường thạch EYA

Thành phần môi trường EYA gồm:

Cân các thành phần theo công thức từ 1 đến 9, hòa tan bằng nước khử ion và đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch Hấp ướt 1210C/15 phút Để bình thạch nguội 500C, bổ sung 5% lòng đỏ trứng nhuyễn (Egg Yolk Emulsion - EYE) Trộn đều rồi

đổ 15-20ml/1 đĩa 90 mm Để mặt thạch khô hoàn toàn Lấy bất kỳ một đĩa trong lô

để kiểm tra vô trùng và dinh dưỡng Số còn lại bảo quản ở 4 – 80C và dùng trong vòng 4 tuần

Cách làm lòng đỏ trứng nhuyễn EYE

Rửa sạch vỏ ngoài trứng, ngâm trong cồn 70%/1 giờ, dùng panh kẹp vô trùng tạo lỗ khí ở 2 đầu quả trứng Mở rộng lỗ khí ở 1 đầu để dốc bỏ lòng trắng ra bên ngoài Dùng xilanh để hút lấy lòng đỏ, quan sát thể tích lòng đỏ trứng hút được, cho

vào bình bi thủy tinh vô trùng Cộng thêm 1 thể tích nước muối sinh lý tương đương Lắc đều tay để nước muối phân tán đều, tạo nhũ tương lòng đỏ trứng (lòng

đỏ trứng nhuyễn) Dùng pipet vô trùng hút lòng đỏ trứng nhuyễn vào lọ thủy tinh hoặc lọ nhựa vô trùng mới Bảo quản ở 40

C trong 4 tuần tuy nhiên nên sử dụng sản

phẩm lòng đỏ trứng nhuyễn tươi (trong ngày) khi pha chế môi trường

Môi trường CBI là môi trường EYA bổ sung 3 loại kháng sinh: 250.0mg D-

Cycloserine, 76.0mg Sulfamethoxazole và 4.0mg Trimethoprim trong 1 lít thạch

2.3.3.3 Kỹ thuật nuôi cấy phân lập vi khuẩn C botulinum

Kỹ thuật nuôi cấy phân lập C botulinum từ mẫu mật ong

Cân 20 gam mật ong (tương đương 15 ml) pha loãng 3 lần với dung dịch pepton 1% (45ml) trong ống falcon 50ml Vortex hoặc lắc mạnh đến đồng nhất mẫu Li tâm lạnh (5 - 80C) ở tốc độ 12.000 vòng/30 phút Hút bỏ nước nổi (chú ý không chạm cặn), để lại 1-2 ml cặn Dùng que cấy hoặc que tre vô trùng để làm tan cặn ly tâm, cấy trải 100µl cặn trên môi trường thạch đĩa CBI Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phòng (khoảng 250C)/48 giờ Phần cặn còn lại chuyển vào ống môi trường thịt chín CMM để nuôi cấy tăng sinh Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phòng (khoảng 250C)/5 ngày Sau

đó dùng que tre vô trùng phá vỡ hạt thịt, hút 100 µl phần canh thang cấy trải trên môi trường EYA Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phòng (khoảng 250C) trong 48 giờ

Kỹ thuật nuôi cấy phân lập C botulinum từ mẫu đất

Cân 25 gam đất vào trong ống falcon 50ml, thêm 25g bi thủy tinh kích thước 0.5cm và 25ml đệm Gelatin Phosphat Buffer (GPB) Vortex hoặc lắc mạnh đến đồng nhất mẫu Ly tâm 2.000 vòng/ 5 phút Hút toàn bộ nước nổi (khoảng 18-20 ml) sang ống falcon 50 ml mới, đặt vào bể ủ nhiệt nước 650

C/30 phút, sau đó chia lượng nước nổi làm 2 phần bằng nhau:

Phần 1 cho vào ống falcon 15 ml vô trùng, li tâm 12.000 vòng/30 phút, bỏ nước nổi, hòa đều cặn và cấy trải 100 µl cặn trên môi trường CBI Ủ kỵ khí ở nhiệt

độ phòng và 370C trong 48 giờ

Phần 2 cho vào ống falcon đã có sẵn 10ml môi trường CMM, đóng nắp, ủ kỵ khí ở nhiệt độ phòng và 370

C trong 3 ngày để nuôi cấy tăng sinh Sau đó dùng que tre dầm nhỏ hạt thịt Thực hiện sốc cồn phần canh thang tăng sinh trước khi nuôi cấy trên môi trường thạch bằng cách: lấy 500 canh thang + 500µl cồn tuyệt đối, trộn đều và để nhiệt độ phòng 60 phút, cấy trải 100 µl dung dịch sau sốc cồn trên môi trường CBI Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phòng (khoảng 250C) và 370C trong 48 giờ

Đọc kết quả nuôi cấy: Lựa chọn ít nhất 10 khuẩn lạc nghi ngờ có đặc điểm:

hơi dẹt, bề mặt thô ráp, bờ không đều, có kết tủa mờ (lethicinase dương tính) xung quanh khuẩn lạc, có hình ảnh lấp lánh như ngọc trai (phản ứng lipase dương tính) để cấy thuần trên môi trường CBI Có thể phải cấy chuyển nhiều lần mới có được khuẩn lạc thuần Khi có khuẩn lạc thuần trên CBI, chọn 1 khuẩn lạc cấy trên môi trường không chọn lọc GAM để thực hiện kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng xác định tính chất sinh vật hóa học và lưu giữ chủng Chủng thuần được lưu giữ trong môi trường Skim milk 20% ở -800C

2.3.3.4 Kỹ thuật định danh bằng xác định tính chất sinh vật hóa học

Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn

Dùng tăm bông gặt toàn bộ khuẩn lạc trên đĩa thạch GAM Cho vào lọ môi trường API 20A, xoay tròn tăm bông hoặc mài vào thành ống để giũ vi khuẩn ra canh thang Độ đục vi khuẩn tương đương hoặc hơn 3 McFaland (đục như nước vo gạo)

Chuẩn bị thanh sinh hóa

Ghi mã số chủng lên thanh sinh hóa, đặt vào trong khay ủ Dùng pipet nhỏ huyền dịch vi khuẩn vừa chuẩn bị trong ống môi trường API 20A vào các giếng (hơi nghiêng thanh sinh hóa để dung dịch chảy xuống và tránh tạo bọt khí)

Đối với thử nghiệm GEL: Nhỏ canh khuẩn đầy giếng

Đối với thử nghiệm IND: nhỏ dầu khoáng lên trên để IND không bị bay hơi trong quá trình nuôi cấy