Giáo trình kỹ thuật lên men công nghiệp

Nhiềusản phẩm có giá trị kinh tế đáng kể được tạo ra từ quá trình lên men công nghiệp được ứngdụng trong công nghệ thực phẩm, trong công nghệ dược phẩm, trong sản xuất hóa chất, trongsản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI -

GIÁO TRÌNH

KỸ THUẬT LÊN MEN CÔNG NGHIỆP

PGS TS Lê Gia Hy

Hà Nội, 7/ 2021

LỜI NÓI ĐẦU

Công nghệ lên men là nền tảng của công nghiệp sinh học, bởi chính công nghệ sinh họcđưa ra các quy trình công nghệ mới, sản phẩm có giá trị thương mại cao, góp phần quan trọngđưa các thành quả của nghiên cứu và triển khai công nghệ vào sản xuất công nghiệp Hiểu cácquá trình công nghệ lên men, các ứng dụng của vi sinh vật trong thực tiễn sản xuất là nhiệm

vụ chính của các cán bộ nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học Trong quá trình công nghệlên men sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học thì được chia làm 2 giai đoạn chính: Giaiđoạn lên men và giai đoạn thu hồi và hoàn thiện sản phẩm, hiểu rõ các kỹ thuật lên men nhằmnâng cao năng suất lên men là rất quan trọng, vừa góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất, vừatạo ra các sản phẩm có ý nghĩa thương mại cao

Lên men công nghiệp là một ngành khoa học liên ngành áp dụng các nguyên tắc liênquan đến sinh học và kỹ thuật, khía cạnh sinh học tập trung vào vi sinh vật học và hóa sinh,còn khía cạnh kỹ thuật áp dụng động lực học chất lỏng và kỹ thuật vật liệu Quá trình lên mencông nghiệp chủ yếu gắn liền với việc khai thác thương mại vi sinh vật trên quy mô lớn, các

vi sinh vật được sử dụng có thể là loài tự nhiên, đột biến hoặc đã được biến đổi gene Nhiềusản phẩm có giá trị kinh tế đáng kể được tạo ra từ quá trình lên men công nghiệp được ứngdụng trong công nghệ thực phẩm, trong công nghệ dược phẩm, trong sản xuất hóa chất, trongsản xuất nông nghệp, trong sản xuất năng lượng sinh học và trong bảo vệ môi trường

Cuốn “Giáo trình kỹ thuật lên men công nghiệp” được xem là cuốn sách chuyên sâu về

kỹ thuật lên men công nghiệp các sản phẩm công nghệ sinh học, một phần rất quan trọngtrong cả quá trình sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học Do vậy, mục đích của của cuốnsách nhằm cung cấp các kiến thức cơ bản về công nghệ lên men nói chung, các nguyên lý, kỹthuật lên men ở mức độ công nghiệp các sản phẩm công nghệ sinh học cho sinh viên, học viêncao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành công nghệ sản xuất các sản phẩm công nghệ sinhhọc

Cuốn Giáo trình gồm 5 chương được soạn theo Đề cương chi tiết học phần Kỹ thuật lênmen công nghiệp, mã số BEKL, của Trường Đại học Mở Hà Nội:

Chương 1: Đại cương về công nghệ lên men, mục đích, phân loại và các công đoạnchính của quá trình lên men và lên men công nghiệp

Chương 2: Chuẩn bị chủng giống sản xuất ở mức độ công nghiệp và các giải pháp kỹthuật để cấp giống chất lượng cho quá trình sản xuất

Chương 3: Chuẩn bị môi trường và hệ thống thiết bị lên men cho quá trình sản xuất ởmức độ công nghiệp

Chương 4: Giới thiệu các kỹ thuật lên men và các công đoạn chính trong quá trình lênmen sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học ở quy mô công nghiệp

Chương 5: Giới thiệu các giải pháp hạn chế nhiễm tạp trong sản xuất công nghiệp, đánhgiá hiệu quả lên men để mở rộng quy mô sản xuất và xây dựng phương án phát triển sản phẩmmới

Tuy nhiên, do thời gian có hạn, cuốn sách mới chỉ tập trung vào những phần cơ bản của

kỹ thuật lên men theo Đề cương chi tiết của học phần, chắc chắn còn nhiều thiếu sót, rất mong

sự đóng góp ý kiến của độc giả để cuốn sách được bổ sung hoàn thiện hơn

Hà Nội, tháng 7 năm 2021

Tác giả

Chương 1.

ĐẠI CƯƠNG VỀ CÔNG NGHỆ LÊN MEN

1.1 Khái niệm về công nghệ lên men

1.1.1 Công nghệ lên men

1.1.1.1 Lên men

Lên men là công nghệ lâu đời nhất trong tất cả các quá trình công nghệ sinh học Theo

tiếng Latin, động từ fevere, có nghĩa là sự sôi xuất hiện trong nước chiết quả hoặc malt nghiền

dưới tác động của nấm men trong quá trình sản xuất rượu

Lên men là quá trình chuyển hóa hóa học nhờ các cơ thể sống hoặc sản phẩm của chúngthường sinh khí (CO2) và nhiệt Các nhà vi sinh vật xem sự lên men như là “bất kỳ quá trìnhsản xuất một sản phẩm bằng cách nuôi cấy một lượng lớn vi sinh vật”, còn các nhà sinh hóahọc xem sự lên men như là một quá trình sinh năng lượng trong một hợp chất hữu cơ của tất

cả chất nhường và nhận điện tử, vì thế lên men là quá trình kỵ khí mà ở đó năng lượng đượcsản sinh không có sự tham gia của oxy hoặc chất nhận điện tử vô cơ Đây là quá trình lên men

kỵ khí nhờ các vi sinh vật lên men hay còn gọi là lên men truyền thống

Lên men là một phương pháp dùng để chuyển hóa nguyên liệu để thu được sản phẩmphục vụ cho đời sống con người Ban đầu lên men chỉ được dùng trong sản xuất các loại thựcphẩm như rượu, giấm, sữa chua,… Cùng với sự phát triển của khoa học và các ưu điểm vượttrội của mình, lên men còn được dùng để sản xuất nhiều loại sản phẩm và dịch vụ khác nhưkháng sinh, hóa chất, xử lý nước thải Kỹ thuật lên men cũng trở nên ngày càng phong phú vềnhiều mặt khác nhau: nguyên liệu, sản phẩm, trang thiết bị Quá trình lên men có oxy phân tửtham gia, để sinh tổng hợp các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp, sinh tổng hợp các loại enzymev.v… là lên men hiếu khí hay còn gọi là lên men sinh tổng hợp

1.1.1.2 Công nghệ lên men

Nói một cách đơn giản hơn, công nghệ sinh học có nghĩa là sử dụng các cơ thể hoặc cácsản phẩm của chúng ở mức độ công nghiệp Công nghệ sinh học hiện nay là lĩnh vực khoahọc hầu như bao gồm các mặt khoa học, công nghệ và thương mại của mọi lĩnh vực hoạt độngcủa con người từ sản xuất nông nghiệp đến bảo vệ môi trường Do vây, công nghệ sinh học làgì? Theo định nghĩa của Liên đoàn châu Âu và Công nghệ sinh học (năm 1981) thì “Côngnghệ sinh học được coi là một tập hợp các ngành sinh hóa học, vi sinh vật học, tế bào học, ditruyền học với mục tiêu đạt tới sự ứng dụng công nghệ các vi sinh vật, các mô, các tế bàonuôi và các cấu phần của tế bào” Để hiểu rõ khái niệm này, người ta thể hiện trên mô hìnhcây công nghệ sinh học (Hình 1.1) Trong ba thành phần trung tâm của công nghệ sinh học thì

vi sinh vật học chính là nền tảng cho sự phát triển của công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học là một lĩnh vực rộng lớn Nếu sắp xếp theo đối tượng sinh học,công nghệ sinh học được chia thành các ngành:

1- Công nghệ sinh học vi sinh vật là công nghệ nhằm khai thác tốt nhất khả năng kỳdiệu của vi sinh vật, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật hoạt động với hiệu suất cao(công nghệ lên men)

2- Công nghệ tế bào (tế bào động vật

và thực vật): Công nghệ nhằm tạo điều

kiện cho các tế bào động thực vật phát

triển tốt trong các môi trường xác định và

an toàn Công nghệ chủ yếu của công nghệ

tế bào là kỹ thuật nuôi cấy mô

3- Công nghệ gen là công nghệ nền,

cải biến chủng giống nhằm nâng cao hiệu

suất của chủng giống sản xuất và đa dạng

hóa sản phẩm sinh học

Công nghệ sinh học vi sinh vật học

trở thành nền tảng cho sự phát triển của

công nghệ sinh học theo 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1 Công nghệ sinh học

truyền thống là các quá trình dân dã nhằm

chế biến, bảo quản các loại thực phẩm, xử

lý đất đai, phân bón để phục vụ nông

nghiệp

Giai đoạn 2 Công nghệ sinh học cận

đại là quá trình sử dụng các nồi lên men công nghiệp để sản xuất ở quy mô lớn các sản phẩmsinh học như mỳ chính, axit amin, axit hữu cơ, dung môi hữu cơ, chất kháng sinh, một sốvitamin (như vitamin B2, B12, C ), nhiều loại enzyme

Giai đoạn 3 Công nghệ sinh học hiện đại chia ra các lĩnh vực như: Công nghệ di truyền(genetic engineering), công nghệ tế bào (cell engineering), công nghệ enzyme và protein(enzymprotein engineering), công nghệ vi sinh vật/ công nghệ lên men (microbialengineering/ fermentation), công nghệ môi trường (environmental engineering) Công nghệsinh học hiện đại thường gắn liền với các cơ thể mang gene tái tổ hợp (recombination gene).Như vậy, công nghệ sinh học vi sinh vật hay còn gọi là công nghệ vi sinh vật là ngànhcông nghệ nhằm khai thác tốt nhất khả năng kỳ diệu của vi sinh vật Vi sinh vật được coi lànhà máy cực kỳ nhỏ và tinh vi, mà nhiệm vụ của công nghệ vi sinh vật là tạo ra các điều kiệnthuận lợi cho các vi sinh vật hoạt động với hiệu suất cao nhất Chính vì vậy, trước đây ngoàingành vi sinh vật học đại cương người ta còn phát triển thành ngành vi sinh vật công nghiệp.Chỉ từ khi công nghệ sinh học hình thành thì người ta cũng coi đây là ngành công nghệ vi sinhvật, mà điều kiện thuận lợi để cho các vi sinh vật hoạt động với hiệu suất cao nhất chính làđiều kiện nuôi cấy vi sinh vật Về bản chất của công nghệ sinh học vi sinh vật chính là côngnghệ lên men

Trong công nghệ sinh học, khái niệm công nghệ lên men được sử dụng theo nghĩa rộng,nghĩa là không chỉ sử dụng các vi sinh vật lên men (fermentative microorganisms) lên mentrong điều kiện kỵ khí tạo ra các sản phẩm lên men truyền thống, mà sử dụng cả các vi sinhvật hiếu khí, các tế bào động vật và thực vật lên men trong các nồi lên men và nồi phản ứngsinh học có sục khí để sinh tổng hợp các sản phẩm mong muốn, còn được gọi là lên men sinhtổng hợp

Hình 1.1: Mô hình cây công nghệ sinh học.

1.1.2 Sơ lược lịch sử phát triển của công nghệ lên men

1.1.2.1 Các giai đoạn phát triển của công nghệ lên men ứng dụng

Giai đoạn 1: Thời kỳ trước Pasteur (đến 1865)

Con người ứng dụng tiềm năng của vi sinh vật sản xuất các sản phẩm khi còn chưa nhậnthức được sự tồn tại của chúng trong tự nhiên như sản xuất đồ uống chứa rượu, như rượu vang,bia, sản xuất thực phẩm lên men như muối chua rau quả, ủ chua thức ăn cho gia súc…

Khoảng 7000 năm trước Công nguyên, nho bắt đầu được trồng, và sau đó, rượu vangbắt đầu được sản xuất Các nhà khảo cổ cũng tìm được một số dụng cụ mà họ cho là dùng đểsản xuất rượu, bia có niên đại 6000 đến 5000 năm trước Công nguyên ở Georgia, Iran và AiCập Lên men sữa để sản xuất sữa chua (lên men lactic) xuất hiện ở Babylon vào khoảng 3500năm trước Công nguyên

Trong khoảng từ năm 200 trước Công nguyên đến năm 200, thêm nhiều sản phẩm lênmen ra đời: Rau muối chua, phô mai, tương và một số sản phẩm từ đậu nành như tương nén(tempeh) ở Indinesia, tương miso ở Nhật Bản,

Đầu thế kỷ 17, Jan Baptist van Helmont quan sát thấy rằng cặn của rượu vang cũng có

thể dùng để lên men rượu được và ông gọi chất cặn này là "fermentum" Thuật ngữ này có xuất xứ La tinh, có thể là “fervere” nghĩa là sôi, cũng có thể là “ferveo” nghĩa là sủi bọt (vì

khi lên men rượu, bề mặt của dịch lên men xuất hiện rất nhiều bọt như sôi) Ông cũng nhậnxét rằng chất khí thoát ra trên bề mặt dịch lên men cũng chính là chất khí tạo ra khi đốt than.Vào đầu thế kỷ 17, một dụng cụ mới ra đời và tạo điều kiện cho sự phát triển mạnh mẽcủa sinh học, đó là kính hiển vi quang học Nhờ dụng cụ này ta có thể tìm hiểu cấu trúc củasinh vật một cách cặn kẽ hơn Một trong những nhân vật có những đóng góp đáng kể tronglĩnh vực này là Anton Philips van Leeuwenhoek Ông là một người chuyên mài tinh chế cácthấu kính dùng để chế tạo kính hiển vi và cũng là một người chế tạo kính hiển vi Ông cũng

có thói quen ghi chép những gì quan sát được và tìm cách giải thích chúng Bằng cách nàyông ta trở thành một nhà nghiên cứu khoa học nghiệp dư Tuy vậy, các công trình này cũngrất có giá trị và được các nhà nghiên cứu khác coi trọng và khối lượng nghiên cứu cũng rấtđáng kể (560 báo cáo được ghi nhận) Năm 1675 van Leeuwenhoek, đã quan sát được vi sinhvật và các hoạt động của chúng Ông được xem như là người phát minh ra vi sinh vật học.Năm 1836, Dore Schwann đã khám phá ra nguyên nhân của lên men rượu là do sinh vật

đơn bào sử dụng đường, mà ông gọi tên là “nấm đường” (Saccharomyces) Sau đó, Charles

Caignard de Latour xác định loại sinh vật đơn bào này là nấm men, sử dụng đường để sinh rarượu và CO2, sinh sản bằng cách nẩy chồi

Đặc trưng của giai đoạn một là lên men truyền thống (Traditional fermentation), các quá trình lên men tạo ra các sản phẩm lên men nhờ vi sinh vật, được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc.

Giai đoạn 2: Thời kỳ sau Pasteur (1865-1940)

Giai đoạn này được xem là giai đoạn phát triển của công nghiệp lên men, bao gồm cáccông trình của Pasteur (1865) về lên men và học thuyết về mầm bệnh, Pasteur cũng đã đề raphương pháp thanh trùng Pasteur để khử trùng rượu nho, bia mà không làm hỏng phẩm chất,

mà ngày nay vẫn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm Bởi vậy, Pasteur được coi làngười sáng lập ra vi sinh vật công nghiệp Cũng trong giai đoạn này, sự phát triển của hoá

Hình 1.3: Thí nghiệm của Louis Pasteur bác bỏ thuyết tự

sinh.

Hình 1.4: Christian Hansen (1842-1909) Buchner Hình 1.5: Eduard (1860-1917)

sinh học với các kiến thức về trao đổi chất trung gian đã phát hiện và làm chủ việc phát hiện

và sử dụng các loại enzyme trong sản xuất công nghiệp

Năm 1854, Louis Pasteur, bác bỏ Thuyết tự sinh (Hình 1.2 và 1.3) tìm ra mối liên hệgiữa lên men và nấm men Ông kết luận rằng loại vi sinh vật này đã sử dụng cơ chất là đường

có sẵn trong nho để chuyển hóa thành rượu và trong điều kiện kỵ khí Từ đó, thuật ngữ lênmen (fermentation) còn có một nghĩa khác là sự hô hấp trong điều kiện kỵ khí Pasteur cũngnhận thấy rằng, nếu sau khi đã lên men đạt yêu cầu, ta đun nóng thì rượu vang sẽ bảo quảnđược lâu hơn nhiều Kỹ thuật xử lý nhiệt này sau đó được mang tên ông: Khử trùng Pasteur(pasteurization)

Tuy một số quá trình được thực hiện ở quy mô rộng rãi, nhưng những sự thành công đócòn phụ thuộc vào sự ngẫu nhiên hay kinh nghiệm của những người thợ giỏi truyền cho cácthế hệ sau Vai trò của vi sinh vật trong sự chuyển hóa các chất hữu cơ được con người biếtđến khoảng hơn 100 năm trước đây

Năm 1883, Emil Christian

Hansen, nhà thực vật học người Dan

Mạch, đã đi sâu nghiên cứu về nấm

học và sinh lý lên men, đã làm cuộc

cách mạng về công nghiệp lên men

bia bằng phát minh của mình về

phương pháp nuôi cấy chủng nấm

men thuần khiết Như vậy, việc

nghiên cứu và sử dụng các chủng

nấm men thuần khiết Saccharomyces

carlsbergensis trong sản xuất bia có

thể xem là bước mở đầu cho công nghiệp lên men dựa trên cơ sở khoa học

Công nghệ sinh học đã bắt đầu với ngành sản xuất bia Vào thời đó, Đức là một quốcgia tiêu thụ rất nhiều bia Sản xuất loại thức uống có cồn này là một ngành có lợi nhuận lớn,mặt khác thuế đánh trên mặt hàng này cũng đóng góp phần không nhỏ vào ngân sách nhànước Điều này đã thúc đẩy các nghiên cứu có chiều sâu về quá trình lên men bia và tìm cáchứng dụng vào công nghiêp Trung tâm nghiên cứu nổi tiếng nhất về lĩnh vực này là ViệnCarlsberg đã tìm ra nhiều quy trình rất đặc biệt để nấu bia

Hình 1.2: Luis Pasteur

(1822-1895)

Hình 1.6: Ngài Alexander Fleming (1881-1955).

Năm 1897, Eduard Buchner - nhà hóa học và men học đã khám phá ra nguyên nhân sâu

xa hơn của sự lên men Ông đã dùng các chất chiết từ nấm men sau khi đã nghiền và lọc quaphễu lọc sứ (sau này gọi là phễu Buchner) để lên dịch quả vô trùng thành rượu mà không cần

tế bào nấm men sống và đã đi đến kết luận là sự chuyển hóa các loại đường có trong dịch quảthành rượu có bản chất hóa học mà không phải là sinh học

Buchner cũng khám phá ra rằng chất do nấm men tiết ra để chuyển đường thành rượu cóbản chất là protein và ông gọi đó là “zymase” và từ đó tiếp vĩ ngữ “ase” được dùng để chỉenzyme Ông cũng đã nhận được Giải thưởng Nobel về Hóa học năm 1907

Trong Thế chiến thứ nhất, do chiến tranh và sự cấm vận mà sự cung cấp các nhu yếuphẩm cho con người cũng như nguyên liệu cho công nghiệp bị giảm sút Các nhà khoa học đãtham gia để giải quyết vấn đề này và công nghệ sinh học bắt đầu phát triển mạnh Đức đã sửdụng sinh khối từ quá trình lên men để thay thế 60% thức ăn gia súc mà trước đó họ phải nhậpkhẩu, sản xuất axit lactic, aceton, butanol, Năm 1917, James Currie, khám phá ra rằng một

số chủng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng tạo axit citric rất tốt và ngay lập tức Công ty

Pfizer đã sản xuất axit này ở quy mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt

Đặc trưng của giai đoạn thứ hai là sự hiểu biết về hoạt tính của vi sinh vật, vai trò của

vi sinh vật trong lên men sản xuất đồ uống có cồn, giai đoạn

được đánh dấu bằng việc đặt cơ sở khoa học cho quá trình

lên men sản xuất lớn các sản phẩm lên men truyền thống.

Giai đoạn 3 Thời kỳ phát triển lên men công

nghiệp (1941-1970)

Đây là giai đoạn phát triển công nghiệp kháng sinh,

hóa chất và kiểm soát môi trường, bao gồm sự xuất hiện của

các chất kháng sinh, những tiến bộ về di truyền học trong

việc chọn lọc các thể đột biến vi khuẩn, sự nghiên cứu các

điều kiện lên men tối ưu, kỹ thuật học lên men, việc tách và

tinh chế sản phẩm

Năm 1928, Alexander Fleming - nhà vi sinh vật học,

sinh lý học và dược học người Scotland, người đã phát minh

ra lysozym năm 1923, đã khám phá rằng các

chất benzylpenicillin (penicillin G) từ nấm

mốc Penicillium notatum có khả năng tiêu

diệt một số vi sinh vật gây bệnh rất hiệu quả

Đến 1940, penicillin, chất kháng sinh đầu tiên

được sản xuất ở quy mô công nghiệp bằng

phương pháp lên men và được ứng dụng rất

hiệu quả trong y học Ông đã cùng Howard

Florey and Ernst Boris Chain nhận Giải

thưởng Nobel về sinh lý học và y học năm

1945 Ông cũng có nhiều công trình công bố

về vi sinh vật học, miễn dịch học và hóa trị

liệu Từ đó đã mở ra hướng ứng dụng lên men

Hình 1.7: Selman A Waksman tại phòng thí nghiệm, Đại học Rutgers, nơi nghiên cứu phát minh ra chất kháng sinh actinomycin, 1940.

để sản xuất các loại kháng sinh và hàng loạt các chất khác như steroid, vitamin Nhiều nămsau này, những phát minh penicillin, streptomycin và phát triển thương mại các chất này đượcxem khởi đầu cho kỷ nguyên kháng sinh.

Ngay từ những năm 1940, Selman A Waksman, nhà vi sinh vật đất tại Trường Đại họcRutgers (Mỹ) đã thành công trong lĩnh vực kháng sinh nhờ phát minh ra nhiệu chất khángsinh mới từ vi khuẩn sợi (xạ khuẩn) như actinomycin D, neomycin, và đặc biệt là một loại

“thuốc tuyệt vời” và nổi tiếng đó là streptomycin

Kết hợp với việc phát triển các quá trình công nghiệp giữa các trường đại học Rutgers,Princeton, Columbia và Merck & Co., Inc đã sinh ra lĩnh vực mới kỹ thuật sinh hóa(biochemical engineering) Sau đó nhiều chất kháng sinh từ xạ khuẩn được phát hiện và trởthành “thuốc tuyệt vời” như chloramphenicol (1947), tetracyclin (1948), các kháng sinhmacrolid như erythromycin (1952), các kháng sinh glycopeptid như vancomycin (năm 1956),các kháng sinh aminoglycosid như gentamicin (1963), các kháng sinh β-lactam nhưcephamycin (1970) và carbapenem (1979), các kháng sinh ansamycin như rifamycin (1957)

và các kháng sinh polyen như nystatin (1950) Gần 15.000 chất trao đổi thứ cấp được pháthiện, trong đó có khoảng 12.000 chất kháng sinh, trong đó khoảng 70% từ xạ khuẩn, còn vikhuẩn chiếm 10% và nấm mốc chiếm 20% Năm 1957, bột ngọt (monosodium glutamat) đượcAjinomoto đưa vào sản xuất ở quy mô lớn bằng phương pháp lên men

Đặc trưng của giai đoạn thứ ba là sự phát triển của một nền công nghiệp vi sinh vật độc lập Người ta đã điều khiển được các quá trình siêu tổng hợp ở vi sinh vật và tạo ra được hàng loạt các chủng đột biến Nhờ đó đã sản xuất ở quy mô lớn các chất kháng sinh, mỳ chính, lysine và nhiều loại axit amin khác.

Giai đoạn 4 Giai đoạn phát triển công nghệ sinh học hiện đại (1980 đến nay)

Nhờ các phát minh rahiện tượng biến nạp (transformation) của Griffith (1928) và hiệntượng tiếp hợp của Lederberg và Tatum

(1946), chứng minh vật liệu di truyền là

DNA của Avery, MacLeod (1944), khám

phá ra cấu trúc của DNA của Watson và

Crick (1953) và phát hiện sự điều hoà tổng

hợp protein của Jacob & Monod (1957) đã

đặt nền móng cho kỹ thuật di truyền Từ năm

1973, Berg, Boyer & Cohen đề xuất kỹ thuật

di truyền Sau khi phát hiện ra enzyme cắt

giới hạn (restrictase) của Nathans, Smith &

Arber (1971), enzyme sao chép ngược của

Dulbecco, Temin, Baltimore (1975) và

enzyme endonuclease giới hạn của Werner

Arber (1978) đã đề xuất ra công nghệ DNA

tái tổ hợp dựa trên phát triển công nghệ gene

Như vậy, giai đoạn này được được đánh dấu

bằng sự phát hiện ra các enzyme cắt giới hạn

restrictase và các plasmid với sự gắn các

Hình 1.8: Chọn dòng (cloning) gen bằng plasmid ứng dụng trong công nghệ sinh

học.

gene lạ mang các thông tin tổng hợp các protein đặc biệt vào một cơ thể đã trở thành mộtphương pháp thông dụng và sự kiểm soát ngày càng tốt hơn sự biểu hiện của các gene này.

Từ những nghiên cứu sâu về bộ gene (genome) của vi khuẩn, người ta đã lập được bản

đồ gene giới hạn của nhiều loài vi sinh vật và cũng từ đó đã thiết lập được Ngân hàng gene

của nhiều loài sinh vật Với những nghiên cứu sâu sắc về genome của vi sinh vật đã góp phầnphát triển mạnh mẽ ngành công nghệ sinh học (Hình 1.8) Ngược lại, cũng nhờ những thànhcông của công nghệ di truyền đã góp phần phát triển mạnh mẽ công nghệ vi sinh vật

Ngày nay, sản xuất penicillin và cephalosporin công nghiệp vẫn được lên men bằng các

chủng của loài Penicillium chrysogenum và Aspergillus chrysogenum Hầu hết các chủng sản xuất được tuyển chọn bằng đột biến có định hướng Ví dụ, năm 1972, chủng P chrysogenum

của hãng Panlabs chỉ đạt 20.000 đv/ml sau 7 ngày lên men (tương đương 12 mg penicillin G,Na/ml), năm 1990, chủng cải biến đã đạt 70.000 đv/ml, năm 1993, đạt 100.000 đv/ml tăng

500 lần so với chủng P chrysogenum NRRL 1951 sản xuất ở mức độ công nghiệp đầu tiên

năm 1951 Hiện nay, các chủng sản xuất penicillin công nghiệp có hiệu suất rất cao khoảng150.000đ v/ml môi trường lên men Do hiệu suất tăng, nên giá thành penicillin G trên thế giớingày càng hạ

Công nghệ di truyền đã được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong lĩnh vực y tế, bảo

vệ sức khỏe con người Từ những năm 1980, cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, của

kỹ thuật gene, người ta có thể tạo ra các chủng vi sinh vật có những tính chất công nghệ tốt,thì kỹ thuật lên men càng phát triển mạnh, ứng dụng của lên men được mở rộng và sản phẩmcủa lên men trở nên rất đa dạng

Đặc trưng của giai đoạn thứ tư là các quá trình lên men theo hướng công nghệ sinh học tiến tới sản xuất các sản phẩm ở cấp độ công nghiệp sinh học, không những đa dạng các loại sản phẩm mà còn nâng cao hiệu quả kỹ thuật, hiệu quả kinh tế, chất lượng của sản phẩm đáp ứng yêu cầu của thị trường.

1.1.2.2 Một số thành tựu nổi bật hiện nay của công nghệ vi sinh vật

1 Đối với y học

- Sản xuất vaccin thế hệ mới: Vaccin ribosom, vaccin kỹ thuật gene, vaccin tạo ra từ cácthành phần của virus có rất nhiều ưu điểm: Rất an toàn vì không sử dụng trực tiếp vi sinhvật gây bệnh; giá thành hạ vì không phải nuôi virus trên phôi gà hay các tổ chức mô động vậtvốn rất phức tạp và tốn kém, giảm bớt được chi phí vận chuyển và chi phí kiểm tra trước khidùng Vaccin ribosome được chế tạo từ ribosome của từng loại vi khuẩn gây bệnh, ít độc vàtính miễn dịch cao; vaccin các mảnh virus được chế tạo từ glycoprotein của vỏ virus gây bệnhnhư gây bệnh cúm và vaccin tái tổ hợp được chế tạo từ vi khuẩn hay nấm men tái tổ hợp, cómang gene mã hoá việc tổng hợp protein kháng nguyên của virus hay vi khuẩn gây bệnh nàođó

- Sản xuất Insulin: Việc sản xuất insulin ở quy mô công nghiệp có lẽ là một trong nhữngthành công rực rỡ và sớm nhất của công nghệ gen Trước đây để có 100g insulin từ tụy tạng4000-5000 con bò, do vậy giá thành cao và cũng có bệnh nhân không nhạy cảm với protein

tách chiết từ động vật Bằng kỹ thuật di truyền thông qua vi khuẩn E coli đã thu nhận được

một lượng lớn insulin Dung tích nồi lên men 1000 lit, sau một thời gian ngắn nuôi cấy có thểthu được 200g insulin, tương đương với lượng insulin chiết xuất từ 8.000 đến 10.000 con bò

Thành công này hết sức có ý nghĩa và lý thú vì gene của con người có thể làm việc một cách

có hiệu quả trong genome của vi sinh vật

- Sản xuất Interferon: Interferon có bản chất protein, là yếu tố miễn dịch không đặc hiệu,

là chất giúp cơ thể có thể chống lại nhiều loại bệnh (có phổ tác dụng kháng virus rộng) Đểthu nhận interferon, người ta phải tách chiết chúng từ máu người nên rất tốn kém Bằngphương pháp tương tự như insulin, hiện nay người ta có thể điều chế một lượng lớn interferonthông qua cơ thể vi sinh vật đã được tái tổ hợp gene để phục vụ cho việc điều trị bệnh nhiễm

trùng Trước đây, người ta đã sử dụng tế bào E coli tái tổ hợp, thì ngày nay người ta đã sử dụng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp để thu nhận interferon và có hiệu suất cao gấp 10.000 lần so với E coli.

- Sản xuất các chất kháng sinh: Chất kháng sinh là một trong những loại thuốc thườngxuyên sử dụng trong điều trị bệnh, nhưng do sử dụng thuốc bừa bãi, nên nhiều loại thuốckhông còn hiệu quả do vi sinh vật nhờn thuốc Ngày nay, ngoài việc tìm kiếm các loại khángsinh từ tự nhiên mới, người ta sử dụng kỹ thuật di truyền tạo những chủng sản sinh các chấtkháng sinh có đặc tính chữa bệnh mới, các chất kháng sinh bán tổng hợp

2 Đối với nông nghiệp

- Tạo chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi sinh vật: Từ lâu, người ta đã sử dụng vi

khuẩn Bacillus thurigiensis để chống sâu hại hoa màu Tuy nhiên, chỉ hạn chế ở sâu xanh.

Hiện nay, nhờ công nghệ di truyền, người ta đã cải tạo nhiều nòi của loài này có khả năng diệtnhiều loại sau khác như sâu khoang, ấu trùng muỗi v.v Người ta đã xây dựng hàng loạt cácnhà máy sản xuất chế phẩm vi sinh vật diệt côn trùng, nhằm khắc phục sử dụng thuốc hoá họcảnh hưởng xấu đến cây trồng và gây ô nhiễm môi trường sinh thái

- Sản xuất phân bón cho cây trồng: Phân bón hữu cơ vi sinh đã mang lại hiệu quả kinh

tế cao, không những tạo độ phì cho đất, nâng cao năng suất cây trồng, mà góp phần cân bằngsinh thái, bảo vệ môi trường Nhiều loại vi sinh vật được sử dụng để tạo phân bón vi sinh:Azotobacterin, nitragin, phosphorin, góp phần tăng năng suất cây trồng

3 Đối với bảo vệ môi trường

- Giải quyết vấn đề năng lượng phục vụ con người: Nguồn năng lượng truyền thống(như than đá, thuỷ điện, dầu khí) ngày càng cạn dần và thậm chí có nơi lại không có nguồn tàinguyên này Công nghệ vi sinh vật đã góp phần đưa thêm nguồn năng lượng mới

Cồn (etanol được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như dịch thuỷ phân gỗ và

cellulose, đường và rỉ đường

Khí sinh học (biogas): Biogas thường chứa khoảng 60-80% khí metan (CH4) từ các phụ,phế phẩm nông nghiệp, các loại rác thải giàu cellulose cùng với phân, nước tiểu của người vàgia súc, gia cầm

- Bảo vệ môi trường, tạo cân bằng sinh thái: Công nghệ vi sinh vật đã tích cực tham giagiải quyết một số vấn đề thuộc lĩnh vực này nhằm giúp con người bảo vệ môi trường như sửdụng thuộc tính quý báu của vi sinh vật có khả năng phân giải các chất khó phân huỷ nhưhydrocarbon, các chất hữu cơ khó phân giải để thực hiện quá trình xử lý nước thải, chất thải.Ngoài công tác chọn giống vi sinh vật từ tự nhiên, bằng kỹ thuật di truyền, người ta đãtuyển chọn những chủng có hoạt tính phân giải cao, phân huỷ được những chất khó phân huỷnhư dầu mỏ, thuốc trừ sâu,

Kết quả của quá trình xử lý này góp phần làm cho môi trường trong sạch hơn, tạo được

sự cân bằng sinh thái

1.1.3 Đặc điểm của các quá trình lên men

1.1.3.1 Đặc điểm

1 Nhiều loại sản phẩm sản sinh trong dịch lên men

Về thực chất, biến đổi của cơ chất do tác động của enzyme do vi sinh vật tạo ra, thườngkhông tạo ra một enzyme mà nhiều enzyme khác nhau Do đó, sản phẩm của quá trình lênmen gồm nhiều thành phần, bên cạnh thành phần chính, còn có một số thành phần phụ Điềunày làm cho mỗi một sản phẩm lên men sẽ có những nét đặc trưng khác nhau, thí dụ hương vịđặc trưng của từng loại bia

2 Vi sinh vật hoạt động giữa các pha trong môi trường lên men

Nếu trong dịch lên men có tồn tại nhiều pha, thí dụ như lỏng-khí, thì vi sinh vật thườnghoạt động ở bề mặt giao tiếp giữa các pha Như vậy, việc làm gia tăng diện tích tiếp xúc giữacác pha là một yêu cầu quan trọng Thường thì pha lỏng là một dung dịch nước

3 Sự phù hợp nồng độ cơ chất và sản phẩm trong môi trường lên men

Nồng độ của cơ chất và sản phẩm trong thiết bị lên men thường không cao Một trongcác lý do quan trọng là nồng độ cao của các chất này có thể ức chế quá trình lên men (thí dụhàm lượng đường cao hay rượu cao đều ảnh hưởng xấu đến lên men rượu) Một lý do khác lànồng độ tối ưu của cơ chất và sản phẩm cho sự hoạt động của vi sinh vật thường trong mộtkhoảng tương đối hẹp

4 Sự thích ứng của vi sinh vật với môi trường lên men

Vi sinh vật có thể điều chỉnh (trong một phạm vi nhất định) các tiến trình bên trong cơthể mình để đáp ứng với môi trường bên ngoài Như vậy, cho ta thấy một mặt, quá trình lênmen có tính khá linh hoạt có thể đáp ứng với một số biến động của môi trường lên men, mặtkhác môi trường lên men có thể có những tác động đáng kể đến sản phẩm thu được Nho trêncùng một thửa ruộng, thu hoạch trong hai năm khác nhau sẽ có chất lượng vang khác nhau,ngay cả khi các điều kiện khác về lên men đều được giữ giống hệt nhau

5 Sựthích ứng của vi sinh vật với điều kiện lên men

Các chủng vi sinh vật dùng trong công nghiệp lên men thường khá nhạy cảm với môitrường (pH, nhiệt độ, lượng oxy,…) Do đó, việc duy trì môi trường và điều kiện lên men tối

ưu là công việc rất quan trọng Hiện nay việc duy trì này thường được thực hiện một cách tựđộng bởi các hệ thống đo lường và điều khiển tiên tiến

6 Sự thoái hóa của chủng giống sản xuất

Các chủng giống vi sinh vật bị thoái hóa sau khi hoạt động một thời gian, tính chất của

vi sinh vật bị thay đổi theo chiều hướng xấu đi, năng suất và chất lượng của sản phẩm bị giảm

đi Nếu sử dụng các phương pháp lên men liên tục thì thời gian hoạt động liên tục cũng bị hạnchế, không thể dài như nhiều ngành công nghiệp khác

1.1.3.2 Ưu điểm và hạn chế của lên men

1 Ưu điểm

So với các chuyển hóa được thực hiện bằng phương pháp hóa học, ta thấy lên men cómột số điểm vượt trội sau:

- Điều kiện phản ứng ôn hòa hơn: Nhiệt độ, áp suất và pH của môi trường lên menthường trong khoảng giá trị của môi trường tự nhiên, do đó ôn hòa hơn khá nhiều so với cácphản ứng hóa học Nhờ vậy, chi phí năng lượng để sản xuất chỉ ở mức thấp.

- Số giai đoạn để chuyển hóa nguyên liệu thành sản phẩm trong lên men thường ít hơn

so với sản xuất hóa học Phần lớn các biến đổi chính thường chỉ xẩy ra tại thiết bị lên men

- Nguyên liệu trong lên men thường có nguồn gốc tự nhiên, chủ yếu là các sản phẩm từsản xuất nông nghiệp, như ngũ cốc, thậm chí là phế phẩm như mật rỉ Do đó thường có sẵn và

có khả năng tái tạo được

- So với phương pháp hóa học, chất thải của lên men ít độc hại hơn, kỹ thuật xử lý cácchất thải này cũng dễ dàng hơn, cho nên ảnh hưởng đến môi trường ít hơn nhiều so với côngnghiệp hóa học

Từ các đặc điểm trên, chi phí để sản xuất thường không cao, giá thành của sản phẩmthấp Đổi với thực phẩm, các sản phẩm lên men thường có giá trị dinh dưỡng cao hơn so vớinguyên liệu ban đầu: nhiều chất bổ dưỡng hơn, nhiều vitamin hơn, dễ tiêu hóa hơn, ít độc tố

và chất kháng dinh dưỡng hơn

2 Hạn chế

- Do các tiến trình trong vi sinh vật khá nhạy cảm với điều kiện môi trường nên để sảnxuất một sản phẩm có các tính chất ổn định, ta cần khống chế điều kiện và môi trường lênmen một cách rất chặt chẽ Đây là một điều khó khăn do phải theo dõi và điều khiển khánhiều thông số cùng một lúc

- Việc giữ cho môi trường lên men không bị tạp nhiễm là việc tương đối khó khăn vì visinh vật tồn tại ở mọi nơi

- Trong lên men ở quy mô lớn, việc duy trì sự đồng nhất trong toàn bộ thiết bị lên men

là một việc phức tạp, khó thực hiện

1.1.4 Khái niệm về lên men công nghiệp

Việc sử dụng các quá trình lên men sản xuất các thực phẩm lên men nhờ vi sinh vật cónguồn gốc từ xa xưa, thường được sản xuất thủ công, nhỏ lẻ và mang sắc thái kinh nghiệm vàbản sắc riêng của từng dân tộc Sau đó, do nhu cầu thị trường, nhiều sản phẩm được sản xuấtvới số lượng lớn có tính chất thương mại với độ phức tạp và giá cả đa dạng như cồn sinh học,các loại axit hữu cơ, enzyme, vaccin và protein trị liệu, thì nhiều sản phẩm lên men mới đượcđược sản xuất với số lượng lớn theo hướng công nghiệp

Lên men công nghiệp là việc sử dụng có chủ đích quá trình lên men các vi sinh vật cũngnhư các tế bào động vật và thực vật, để tạo ra các sản phẩm có ích cho con người Các nguyêntắc công nghiệp cơ bản và thiết kế quy trình tương tự nhau trong tất cả các ứng dụng, nhưng

sự thích nghi về khía cạnh sinh học, kỹ thuật, kinh tế và môi trường cần thiết cho mỗi sảnphẩm là điểm cơ bản của quá trình lên men công nghiệp (xem mục 4.1, chương 4) Quá trìnhlên men được thực hiện trong các thiết bị lên men hoặc bình phản ứng sinh học lớn, thường cóthể tích vài nghìn lít Lên men công nghiệp là một phần của nhiều ngành công nghiệp, baogồm vi sinh, thực phẩm, dược phẩm, công nghệ sinh học và hóa chất

Các sản phẩm lên men được ứng dụng trong thực phẩm cũng như trong ngành côngnghiệp nói chung, ví dụ một số hóa chất thương phẩm như axit acetic, axit citric và etanol

thành phần tế bào và enzyme cũng như nhiệt độ, pH và oxy cho quá trình lên men hiếu khí,việc thu hồi sản phẩm thường liên quan đến nồng độ của dung dịch loãng; các enzyme đượcsản xuất thương mại, như lipase, invertase và rennet, gần như được tạo ra bằng cách lên menvới vi sinh vật biến đổi gene và trong một số trường hợp, mục tiêu sản xuất lại là sinh khối,như protein đơn bào, nấm men bánh mỳ và vi khuẩn axit lactic để sản xuất pho mát Nóichung, quá trình lên men có thể được chia thành bốn loại:

(1) Sản xuất sinh khối (vật liệu tế bào sống được),

(2) Sản xuất các chất trao đổi ngoại bào (hợp chất hóa học),

(3) Sản xuất các thành phần nội bào (enzyme và các protein khác) và

(4) Chuyển hóa cơ chất (trong đó cơ chất được biến đổi chính là sản phẩm) Tuy nhữngquá trình lên men này không phải khác biệt nhau, mà cung cấp cho ta cơ sở để hiểu sự khácbiệt trong cách tiếp cận khi sử dụng các sinh vật có thể là vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, tảo,

tế bào động vật hoặc tế bào thực vật, trong quá trình lên men với các điều kiện lên men khácnhau như mức độ oxy hòa tan, mức độ dinh dưỡng, pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy.Trong hầu hết các quá trình lên men công nghiệp, các vi sinh sinh vật hoặc tế bào thựcvât và động vật nuôi cấy trong môi trường lỏng hoặc lên men diễn ra trên bề mặt ẩm của môitrường xốp Ngoài ra, cần quan tâm đến quá trình sản xuất công nghiệp liên quan đến quátrình lên men, như để tránh ô nhiễm quá trình nuôi cấy, môi trường lên men, không khí vàthiết bị lên men phải được khử trùng; kiểm soát bọt có thể đạt được bằng cách phá hủy bọt cơhọc hoặc các chất chống tạo bọt hóa học hoặc đo và kiểm soát áp suất, nhiệt độ, tốc độ khuấy

và độ nhớt của thiết bị lên men

Yếu tố quan trọng đối với quá trình lên men công nghiệp là nâng cấp quy mô lên men từquy trình trong phòng thí nghiệm sang quy trình công nghiệp Trong lĩnh vực vi sinh vật họccông nghiệp đã chứng minh những gì hoạt động tốt ở quy mô phòng thí nghiệm có thể hoạtđộng kém hoặc hoàn toàn không hoạt động khi thử lần đầu tiên ở quy mô lớn, cho nên khôngthể lấy các điều kiện lên men đã hoạt động trong phòng thí nghiệm áp dụng ngay cho các thiết

bị quy mô công nghiệp, mà phải nâng cấp từ quy mô phòng thí nghiệm sang quy mô sản xuấtthử (pillot) đạt yêu cầu mới chuyển sang quy mô sản xuất công nghiệp

Một quy trình lên men công nghiệp thành công đòi hỏi đội ngũ chuyên gia đa ngành kếthợp các nguyên tắc sinh học và các kỹ thuật để phát triển và mở rộng quy mô các quy trìnhlên men Đội ngũ này tham gia vào việc phân lập và sử dụng các loại vi sinh vật cần thiết chosản xuất công nghiệp, như môi trường và điều kiện nuôi cây thích hợp, thiết kế thiết bị lênmen và xây dựng các phương pháp và điều kiện tốt nhất để thu hồi sản phẩm sinh học

Như vậy, mục đích của lên men công nghiệp là các kết quả nghiên cứu công nghệ tất cảcác giai đoạn liên quan đến quá trình lên men từ phân lập và cải biến các chủng giống ứngdụng công nghiệp, tạo môi trường nuôi cấy thích hợp và tối ưu hóa điều kiện lên men, thiết kế

và điều kiện hoạt động thiết bị lên men (hay thiết bị phản ứng sinh học), xây dựng kỹ thuậttách chiết và thu hồi sản phẩm sinh học

1.2 Mục đích của quá trình lên men

1.2.1 Đảm bảo yêu cầu và chất lượng sản phẩm lên men

Mục đích của quá trình lên men là đáp ứng được yêu cầu đặt ra cho lên men một sảnphẩm cụ thể đáp ứng được yêu cầu sản xuất Để quá trình lên men vận hành ổn định, đạt hiệuquả, năng suất cao, chất lượng tốt, chi phí thấp, ta cần đáp ứng các yêu cầu sau:

- Chủng vi sinh vật dùng trong lên men phải có hoạt tính mạnh, ổn định Thông thườngcác vi sinh vật đã được tuyển chọn, thuần hóa và cải biến để phù hợp với điều kiện lên mensản xuất

- Vi sinh vật cần được cung cấp đầy đủ các dưỡng chất cho sự sinh trưởng, phát triển vàsinh tống hợp các sản phẩm mong muốn Các dưỡng chất này gồm các nguồn cung cấpcacbon, nitơ, vitamin, khoáng cũng như các nguyên tố vi lượng khác

- Môi trường lên men cần được duy trì thường xuyên ở điều kiện tối ưu Các thông sốnhư nhiệt độ, áp suất, pH, lượng oxy phải được thường xuyên theo dõi và khống chế ở giá trịtối ưu

- Cần phải có những biện pháp để có sự đồng nhất trong toàn bộ môi trường lên men.Điều này đặc biệt quan trọng khi thiết bị lên men có kích thước lớn, các thành phần của môitrường lên men có khối lượng riêng chênh lệch đáng kể

- Cần hạn chế sự nhiễm tạp đến mức thấp nhất Môi trường lên men, thiết bị lên men,các thiết bị phụ trợ, không khí cần được khử trùng một cách nghiêm ngặt

1.2.2 Ứng dụng của các quá trình lên men

Quá trình lên men phụ thuộc vào việc ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm trong từnglĩnh vực cụ thể mà trước đây do các ưu điểm của lên men nên từ chỗ chỉ được dùng trong chếbiến thực phẩm, ngày nay kỹ thuật này được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Sauđây là một số hướng ứng dụng chính như sau:

1 Trong công nghệ thực phẩm

Thực phẩm được xem là một ứng dụng truyền thống của lên men Với phương pháp này

ta có thể tạo ra nhiều loại thực phẩm khác nhau Theo Takabio, trên thế giới có khoảng 3500loại thực phẩm được sản xuất bằng các phương pháp lên men truyền thống Các nhóm sảnphẩm chính là: (a) Thức uống có cồn như rượu, bia; (b) Các sản phẩm sữa: sữa chua, phô mai,(c) Các sản phẩm từ đậu nành: tương, chao, tempeh, miso, nước tương, (d) Các sản phẩm rau:rau muối chua, kim chi, (e) Các sản phẩm từ thịt, cá: nem chua, salami, nước mắm và (g) Chếbiến trà, cacao

2 Trong công nghệ dược phẩm

Bắt đầu được dùng năm 1940 trong sản xuất penicillin, cho đến nay, lên men đã đượcứng dụng trong sản xuất nhiều loại dược phẩm Một số thí dụ trong lĩnh vực này là:

- Kháng sinh: ngoài penicillin, còn có tetracylin, streptomycin, chloramphenicol,…

- Vitamin: B2và B12được sản xuất chủ yếu bằng lên men Các vitamin C, H, E, K cũng

có thể sản xuất bằng con đường ấy nhưng không có ưu thế bằng các phương pháp hóa học

- Vaccin: lên men là một trong 3 phương pháp chính trong sản xuất vaccin

- Steroid: nổi bật nhất là cortisone

3 Trong sản xuất hóa chất

Nhiều loại hóa chất có thể được sản xuất bằng lên men từ những loại nguyên liệu rẻ tiền

Ta có thể kể đến: (a) Etanol, butanol, aceton, (b) Một số axit hữu cơ: axit citric, axit lactic,

axit fumaric,…(c) Enzyme: amylase, protease, pectinase,… và (d) Polymer: xanthan, dextran,polyhydroxyalkanoate (PHA).

4 Trong sản xuất nông nghiệp

Các ứng dụng quan trọng nhất của lên men trong nông nghiệp là sản xuất thức ăn giasúc phục vụ cho chăn nuôi, sản xuất phân bón vi sinh, thuốc trừ sâu vi sinh

5 Trong năng lượng

Lên men được dùng trong sản xuất etanol (xăng sinh học) và khí metan (biogas) ở quy

mô lớn

6 Trong bảo vệ môi trường

Lên men là một phương pháp đơn giản, hữu hiệu và có chi phí thấp trong xử lý nướcthải và rác thải

1.3 Phân loại quá trình lên men

1.3.1 Cơ sở phân loại các quá trình lên men

Lên men là một quá trình phong phú và đa dạng về nhiều mặt, do đó chúng ta có nhiều

kỹ thuật lên men khác nhau Ta có thể phân loại chúng theo một số cách dựa vào các tiêu chísau:

- Dựa vào loại vi sinh vật dùng để lên men, ta có lên men bằng vi khuẩn, nấm men, haynấm mốc Cũng có khi người ta sử dụng phối hợp hai loại vi sinh vật hay thậm chí nhiều hơnnữa

- Tùy theo vai trò của oxy khi lên men, ta có lên men hiếu khí và lên men kỵ khí Tuyvậy cũng có trường hợp, trong quá trình lên men, có giai đoạn hiếu khí và cũng có giai đoạn

kỵ khí

- Dựa vào tính liên tục của quá trình lên men, ta có thể tiến hành lên men từng mẻ (giánđoạn) hoặc liên tục Một dạng lên men liên tục đặc biệt là cơ chất không được bổ sung mộtcách liên tục mà được đưa vào môi trường lên men theo từng đợt (fed-batch)

- Sản phẩm chính thu được từ quá trình lên men có thể là sinh khối của vi sinh vật (nhưnấm men), có thể là sản phẩm của quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, cũng có thể là sựchuyển hóa của nguyên liệu ban đầu (steroid, xử lý nước thải)

Dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật và kỹ thuật lên men, người ta đưa rakhái niệm 8 kiểu lên men nói chung như sau:

1 Lên men theo mẻ (batch fermentation): là một hệ thống nuôi cấy khép kín, môitrường dinh dưỡng không thay đổi và lên men trong thời gian xác định trong điều kiện lênmen tối ưu: ôxy hòa tan, chất chống tạo bọt, pH môi trường được kiểm soát trong quá trìnhlên men Nghĩa là, quá trình lên men được thực hiện trong một thời gian nhất định hoặc chođến khi các chất dinh dưỡng cạn kiệt thì thu hoạch và tách sản phẩm Quá trình lên men theo

mẻ có ưu điểm là ít bị nhiễm bẩn và biến đổi, vận hành đơn giản và giảm nguy cơ ô nhiễm,nhưng có các nhuợc điểm sau: (a) Phải làm sạch thiết bị và hệ thống lên men mỗi lần lên men;(b) Mỗi quá trình lên men chỉ có khoảng thời gian ngắn có năng suất; (c) Cơ chất sử dụng banđầu cao, nhưng không cao cả quá trình; (d) Tổng thời gian lên men sản xuất không cao dophải gián đoạn; (e) Chi phí vận hành lớn hơn cho việc chuẩn bị và bảo quản chủng giống; (g)Tần suất khử trùng tăng lên cũng ảnh hưởng đến thiết bị đo và đầu dò; (h) Môi trường khử

trùng mới và chủng giống thuần khiết phải được thực hiện cho mỗi đợt lên men; và (i) Hiệusuất của sản phẩm mong muốn cũng có thể bị thay đổi.

2 Lên men liên tục (continuous fermentation): là một hệ thống lên men khép kín,không xác định thời gian lên men, môi trường dinh dưỡng mới được bổ sung liên tục hoặcgián đoạn vào thiết bị lên men và lượng tương đương của môi trường đã sử dụng có vi sinhvật được rút ra liên tục hoặc gián đoạn để phục hồi tế bào hoặc sản phẩm lên men Kết quả là,khối lượng môi trường và nồng độ các chất dinh dưỡng ở mức tối ưu được duy trì do đượcvận hành một cách tự động Máy lên men liên tục có công dụng tối đa trong thời gian dài đểđạt năng suất cao, giảm thời gian lên men và giảm chi phí vận hành Ở Phương thức liên tục,môi trường khởi đầu và giống bổ sung vào thiết bị lên men, sau khi giống phát triển, thiết bịlên men được cung cấp môi trường dinh dưỡng vào và dịch lên men được rút ra với tốc độgiống nhau để duy trì một thể tích dịch lên men không đổi trong thiết bị lên men Ở phươngthức lên men liên tục có quay vòng tế bào, khối lượng tế bào được đưa trở lại thiết bị lên menbằng cách sử dụng màng các vi lọc giữ lại tế bào vi khuẩn hoặc sợi nấm Quá trình lên menliên tục thường được thực hiện theo những cách sau: (a) Lên men một giai đoạn, (b) Lên menquay vòng và (c) Lên men nhiều giai đoạn (chi tiết xem mục 4.1.4)

3 Lên men theo mẻ bổ sung (fed batch fermentation):là kiểu cải tiến của quá trìnhlên men theo mẻ, cơ chất được bổ sung định kỳ theo từng đợt trong quá trình lên men, do đóchất chất luôn ở nồng độ tối ưu Điều này là cần thiết vì một số chất chuyển hóa thứ cấp bị ứcchế chất dị hóa bởi nồng độ cơ chất cao (như glucose, các hợp chất carbohydrat hoặc nitơkhác) có trong môi trường Vì lý do này, các yếu tố quan trọng của môi trường dinh dưỡngđược bổ sung với số lượng thấp trong giai đoạn đầu của quá trình lên men và các chất nền nàytiếp tục được bổ sung với liều lượng nhỏ trong giai đoạn sản xuất Phương pháp này thườngđược sử dụng để sản xuất các chất như penicillin Yoshida (1973) lần đầu tiên đưa ra thuậtngữ này để cho cơ chất vào môi trường khi chất dinh dưỡng cạn kiệt, để duy trì chất dinhdưỡng ở mức tối ưu Quá trình lên men theo mẻ có bổ sung có thể có ba loại: (a) Nuôi cấytheo mẻ bổ sung khối lượng thay đổi: Cùng một môi trường được thêm vào dẫn đến tăng khốilượng (b) Nuôi cấy theo mẻ bổ sung khối lượng cố định: Một dung dịch rất đậm đặc của cơchất giới hạn được thêm vào với một lượng rất ít dẫn đến thể tích môi trường tăng không đáng

kể (c) Nuôi cấy theo mẻ bổ sung quay vòng: Vì không thể đo nồng độ cơ chất bằng cácphương pháp trực tiếp trong quá trình lên men, điều này cần thiết để kiểm soát quá trình nuôidưỡng, nên thường sử dụng các phương pháp gián tiếp Ví dụ, trong sản xuất axit hữu cơ, giátrị pH có thể được sử dụng để xác định tốc độ sử dụng glucose

4 Lên men kỵ khí (anaerobic fermentation): là quá trình lên men được thực hiệntrong điều kiện không có oxy, nhưng vi sinh vật kỵ khí có 2 loại: kỵ khí bắt buộc không thể

chịu được oxy (như vi khuẩn Clostridium sp chỉ hoạt động trong điều kiện thiếu oxy) và vi

sinh vật kỵ khí ưa thích: vẫn hoạt động trong điều kiện thiếu oxy và tạo ra lượng sản phẩmmong muốn tối ưu (như vi khuẩn axit lactic có thể chịu được một lượng nhỏ oxy hay nấmmen yêu cầu sục khí ban đầu để tạo ra sản lượng tế bào cao trước khi tạo điều kiện lên men kỵkhí) Điều kiện kỵ khí trong thiết bị lên men được tạo ra bằng cách rút oxy có trong khônggian đầu bằng máy bơm xả và bơm một số khí trơ như nitơ, argon, v.v hoặc bằng cách xả nó

5 Lên men hiếu khí (aerobic fermentation):là quá trình lên men được thực hiện với

sự có mặt của oxy Trong hầu hết các quy trình thương mại và phần lớn các sản phẩm phục vụcon người được sản xuất bằng loại lên men này Quá trình lên men có thể là nuôi cấy bề mặthoặc nuôi cấy tĩnh và chìm

6 Lên men bề mặt (surface fermentations): là những quá trình lên men mà ở đó cơchất có thể là chất rắn hoặc chất lỏng, vi sinh vật phát triển trên cơ chất và hút các chất dinhdưỡng từ cơ chất Những loại lên men này là phù hợp khi các sản phẩm được sản xuất dựatrên quá trình lên men từ bào tử Nhược điểm vi sinh vật tiếp xúc với các điều kiện lên menkhông đồng đều, cả oxy và chất dinh dưỡng

7 Lên men chìm (submerged fermentations): là những quá trình trong đó chất dinhdưỡng là chất lỏng và vi sinh vật phát triển bên trong cơ chất Các điều kiện nuôi cấy đượcthực hiện đồng nhất với sự trợ giúp của thiết bị phân phối khí và cánh khuấy Hầu hết các quátrình lên men công nghiệp thuộc loại này Cơ chất luôn ở trạng thái lỏng và môi trường nhưvậy còn được gọi là môi trường lên men lỏng

8 Lên men trạng thái rắn (solid state fermentation, SSF hay lên men xốp, LMX):

là sự phát triển của vi sinh vật trên vật liệu rắn ẩm khi không có hoặc gần không có nước tự

do Trong những năm gần đây SSF đã cho thấy nhiều hứa hẹn trong việc phát triển một số quytrình và sản phẩm sinh học, SSF đã được sử dụng một cách mơ hồ như lên men ở trạng tháirắn hoặc lên men cơ chất rắn Tuy nhiên, để phân biệt giữa hai quá trình, quá trình lên men cơchất rắn là quá trình lên men nguồn cacbon chỉ khi không có hoặc gần như không có nước tự

do, còn quá trình lên men trạng thái rắn là quá trình lên men sử dụng cơ chất tự nhiên như trênhoặc cơ chất trơ được sử dụng làm chất rắn bổ sung Quá trình lên men cơ chất rắn SSF quy

mô lớn, người ta thường sử dụng ba loại thiết bị lên men: Thiết bị phản ứng sinh học khaynuôi (tray bioreactor), thiết bị phản ứng sinh học khối ủ (packed-bed bioreactors) và thiết bịphản ứng sinh học dạng thùng quay (rotating drum bioreactors) (chi tiết xem mục 4.1.2)

1.3.2 Phân loại quá trình lên men theo tính chất cơ lý

Phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý của vi sinh vật nuôi cấy đối với oxy, người ta coi cácquá trình đó là hiếu khí, kỵ khí hay kỵ khí không bắt buộc (hiếu khí tùy tiện) Để thực hiệnđược những quá trình này người ta đưa ra các phương pháp lên men dựa vào các phương phápnuôi cấy:

1 Phương pháp lên men bề mặt (surface fermentation): Thường vi sinh vật pháttriển trên bề mặt môi trường Ví dụ, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường thạch tronghộp Petri hay phát triển trên môi trường dịch thể trong bình nuôi Phương pháp này đã được

sử dụng trong lên men sản xuất amylase, axit citric từ nấm Aspergillus niger và oxy được

cung cấp trực tiếp từ không khí

2 Phương pháp lên men trên môi trường xốp (solid-state fermentation): Môitrường thường ở thể rắn và vi sinh vật cũng phát triển trên bề mặt vật liệu nuôi cấy Oxy đượccấp trực tiếp không khí như nuôi bề mặt Phương pháp này thường được sử dụng trong ủ mốclàm tương, nuôi mốc trên môi trường cơm để đường hoá trong quá trình làm rượu Phươngpháp này được sử dụng trong ủ rác (composting) làm phân bón hữu cơ…

3 Phương pháp lên men chìm (immersed cultivation): Đây là phương pháp nuôicấy phổ biến trong công nghiệp sản xuất các chế phẩm sinh học Phương pháp này khôngnhững chỉ sử dụng nuôi cấy các chủng vi sinh vật mà ngày nay người ta còn dùng nuôi cấycác tế bào động, thực vật Nguyên tắc nuôi cấy chìm, các vi sinh vật phát triển trong môitrường dịch thể, đối với các vi sinh vật kỵ khí thì người ta không cấp khí, còn đối với vi sinhvật hiếu khí người ta thường cấp khí để cung cấp oxy cho vi sinh vật phát triển Tuỳ theo nhucầu oxy của từng loại vi sinh vật mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau để tănglượng oxy hoà tan trong môi trường: tăng cường lượng khí cấp, sử dụng cánh khuấy với cáctốc độ khác nhau, dùng cánh chắn làm tan bọt khí lớn …

4 Phương pháp lên men bằng tế bào cố định: Các tế bào được cố định trên chấtmang là các chất hữu cơ (như algenat, chitosan, polyacrelamid ) hoặc các chất vô cơ có lỗxốp (như zeolit, diaomit ) thực hiện quá trình lên men Phương pháp này sử dụng để sản xuấtenzyme, chuyển hóa các chất hữu cơ

1.3.3 Phân loại quá trình lên men theo nguyên lý vận hành

Nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất các sản phẩm của các chất hoạt hoá sinh học là quátrình tinh vi và phức tạp nhất để thu nhận các sản phẩm tổng hợp vi sinh Tổng hợp sinh họccác chất hoạt hoá sinh học do vi sinh vật tạo ra phụ thuộc vào một số yếu tố như nhiệt độ, pHcủa môi trường và canh trường phát triển, nồng độ hoà tan, thời gian nuôi cấy, kết cấu và vậtliệu thiết bị

Phụ thuộc vào các phương pháp ứng dụng để đánh giá hoạt động thiết bị lên men dùng

để cấy chìm vi sinh vật và được chia ra một số nhóm theo các dấu hiệu sau:

1 Theo phương pháp nuôi cấy: Các thiết bị hoạt động liên tục và gián đoạn

2 Theo độ tiệt trùng: Các thiết bị kín và các thiết bị không đòi hỏi độ kín nghiêm ngặt

3 Theo kết cấu: Các thiết bị lên men có bộ khuếch tán và tuabin, có máy thông gió dạngquay, có bộ đảo trộn cơ học, có vòng tuần hoàn bên ngoài; các thiết bị lên men dạng tháp, có

hệ thông gió kiểu phun

Theo phương pháp cung cấp năng lượng và tổ chức khuấy trộn, thông gió các thiết bịcung cấp năng lượng cho pha khí, pha lỏng và pha tổng hợp Thực tế trong lên men côngnghiệp hầu như tất cả các quá trình lên men sản xuất các chất có hoạt tính sinh học đều đượctiến hành bằng phương pháp lên men gián đoạn và trong điều kiện vô trùng

1.2.4 Phân loại quá trình lên men theo cơ chế điều chỉnh động học

Trong điều kiện hiện nay, ở mức độ sản xuất công nghiệp, phương pháp nuôi cấy cácchủng vi sinh vật sinh kháng sinh cũng như các chất có hoạt tính sinh học khác thường đượcthực hiện bằng phương pháp nuôi cấy chìm Đó là phương pháp nuôi cấy chủng sản trong môitrường dinh dưỡng dịch thể, được cấp không khí vô trùng và đảo trộn liên tục Từ đó có thểcải biến thành các phương thức lên men theo phương pháp nuôi cấy chìm các chủng vi sinhvật như sau:

1 Lên men theo mẻ:Cả quá trình phát triển của vi sinh vật diễn ra chỉ trong một nồilên men, sau khi giải phóng dịch nuôi cấy của mẻ trước, rửa sạch cho môi trường lên men mới,sau thanh trùng lại tiếp tục lên men mẻ mới

2 Lên men theo mẻ có bổ sung: Nuôi cấy vi sinh vật trong nồi lên men chỉ có 60% thể tích dịch lên men, sau một thời gian lên men nhất định, bổ sung thêm lượng môitrường mới cho đủ 100% thể tích môi trường lên men.

30-3 Lên men nhiều bình lên men: Vi sinh vật được phát triển trong các bình lên menliên tiếp Dịch nuôi cấy của một giai đoạn phát triển nhất định của vi sinh vật sẽ được chuyển

từ nồi lên men thứ nhất sang nồi thứ hai, sau đó từ nồi thứ hai sang nồi thứ ba, v.v… Khi nồilên men được giải phóng, nhanh chóng bổ sung môi trường và cấy giống mới Với cách nuôicấy vi sinh vật này có thể sử dụng dung tích bình lên men hợp lý hơn

4 Lên men liên tục: Giống như phương pháp lên men chiều sâu, nhưng vi sinh vậtphát triển trong điều kiện dòng chảy của môi trường dinh dưỡng và dịch nuôi cấy liên tục vào

và ra khỏi nồì lên men, cho phép luôn giữ sự sinh trưởng của vi sinh vật ở một giai đoạn nhấtđịnh Giai đoạn sinh trưởng đó được xác định là giai đoạn vi sinh vật sinh tổng hợp lượng sảnphẩm cao nhất Hiện nay, phương pháp lên men liên tục đang được nghiên cứu phát triểnbằng cách: các chủng sản được cố định (immubilization) tế bào trên các chất mang khác nhaunhư alginat-Na, chitosan, Ưu điểm của phương pháp này là kiểm soát được quá trình lênmen, tiết kiệm được nguyên liệu sản xuất và không đòi hỏi dung tích bình lên men lớn

1.4 Các công đoạn chính trong quá trình lên men

1.4.1 Sự cần thiết thiết kế một quá trình lên men

Công nghệ sinh học vi sinh vật là ngành công nghệ nhằm khai thác tốt nhất khả năng kỳdiệu của vi sinh vật, tạo ra điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật hoạt động với hiệu suất caonhất Tuy nhiên, trong công nghiệp sinh học ngày nay không những sản phẩm công nghệ lênmen có hiệu suất lên men cao mà đòi hỏi phải đảm bảo chất lượng thuốc theo quy định, đảmbảo an toàn thực phẩm, đảm bảo an toàn sinh học, đặc biệt là các sinh vật biến đổi di truyền

Ở đây, ngoài chất lượng sản phẩm (hoạt tính sinh học), thì chúng ta còn phải quan tâm đếncác cấp độ tinh sạch của sản phẩm theo mục đích và yêu cầu sử dụng Yêu cầu chung về độtinh sạch của sản phẩm công nghệ sinh học được phân loại sơ bộ như sau: (a) Sản phẩm thuốctiêm và thuốc uống cho người theo Tiêu chuẩn Dược điển; (b) Sản phẩm thuốc thú y theo tiêuchuẩn thuốc thú y; (c) Thực phẩm theo Tiêu chuẩn Vệ sinh an toàn thực phẩm; (d) Sản phẩmthuốc bôi ngoài da (theo quy định của Dược điển); Mỹ phẩm (theo tiêu chuẩn quy định sảnphẩm bôi ngoài da); (e) Sản phẩm kỹ thuật-nguyên liệu thô để điều chế các sản phẩm khác(theo tiêu chuẩn cơ sở)

Nhìn chung, quy trình lên men sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học trong côngnghiệp thường được tiến hành theo 2 giai đoạn (Hình 1.9) sau đây:

Giai đoạn 1 Giai đoạn lên men:

- Chuẩn bị giống vi sinh vật: Chủng giống sản xuất phải đảm bảo yêu cầu chất lượngcủa chủng công nghiệp

- Nhân giống: Chuẩn bị môi trường nhân giống phù hợp cho các chủng sản xuất và mụcđích sản xuất Thông thường giống có chất lượng tốt phải sinh trưởng phát triển tốt, cho sinhkhối cao Tùy thuộc vào quy mô sản xuất, các bước nhân giống như sau: Hoạt hoá trên máylắc (giống mẹ), nhân giống cấp 1, cấp 2 phụ thuộc vào lượng giống cấy vào bình lên men

Hình 1.9: Sơ đồ quá trình lên men (upstream process) và quá trình thu hồi (downstream process ) của quá trình lên men sản xuất sản phẩm công nghê sinh học (Dashmeet,2018).

- Lên men: Chuẩn bị môi trường lên men phù hợp với dung tích bình lên men, thôngthường môi trường chiếm 2/3 dung tích bình lên men Nếu lên men đòi hỏi vô trùng thì phảikhử trùng môi trường, bình lên men và các thiết bị phụ trợ và cấp khí vô trùng Quá trình lênmen phụ thuộc vào thời gian thế hệ của giống sản xuất, chỉ khi nào sản phẩm mong muốn(sinh khối, sản phẩm trao đổi chất, enzyme ) đạt cao nhất thì dừng quá trình lên men

Giai đoạn 2 Thu hồi sản phẩm

- Xử lý dịch lên men bằng các kỹ thuật: (a) Phá vỡ tế bào, (b) Ổn định, (c) Thanh trùng,(d) Khử trùng Pastreur và (e) Keo tụ.

- Phân tách sinh khối và dịch lên men bao gồm các kỹ thuật: (a) Lọc, (b) Lắng và (c) Lytâm

- Cô đặc sản phẩm bao gồm các kỹ thuật: (a) Lọc màng, (b) Kết tủa, (c) Bay hơi, (d)Chiết xuất và (e) Kết đông

- Tinh sạch sản phẩm bao gồm các kỹ thuật: (a) Kết tủa, (b) Chiết xuất, (c) Lọc tiếptuyến (diafiltration), (d) Hấp phụ và (e) Sắc ký

- Hoàn thiện sản phẩm bao gồm các kỹ thuật: (a) Làm khô, (b) Sấy phun (prilling), (c)Đùn (extrusion), (d) Tạo hạt và (e) Tạo viên

Lựa chọn quá trình thu hồi thường dựa trên các tiêu chí sau đây: (1) Sản phẩm là nộibào hay ngoại bào; (2) Nồng độ sản phẩm trong dịch lên men; (3) Tính chất vật lý và hóa họccủa sản phẩm mong muốn; (4) Mục đích sử dụng của sản phẩm; (5) Tiêu chuẩn tinh khiết tốithiểu được chấp nhận; (6) Mối nguy hại sinh học (bio-hazard) của sản phẩm và dịch lên men;(7) Các tạp chất có trong dịch lên men và (8) Giá trị trường cho sản phẩm

1.4.2 Chuẩn bị lên men

1.4.2.1 Các khâu cần chuẩn bị cho một quá trình lên men

Để thực hiện lên men sản xuất ở mức độ công nghiệp, quá trình chuẩn bị phức tạp, đòihỏi phải cẩn trọng trong từng khâu:

a Kiểm tra chất lượng chủng giống sản xuất đảm bảo chủng phát triển tốt và có năngsuất cao

b Chuẩn bị các nguyên liệu để làm môi trường từ giai đoạn nhân giống đến giai đoạnlên men phù hợp

c Kiểm tra hệ thống lên men phù hợp cho từng mức độ sản xuất: Máy lắc, hệ thốngbình nhân giống cấp 1, cấp 2, hệ thống bình lên men, các dụng cụ và thiết thu hồi sản phẩmsau lên men

d Chuẩn bị các dụng cụ kiểm tra phù hợp như máy đo pH, đo oxy hòa tan, máy đo nhiệt

độ, dụng cụ lấy mẫu, dung cụ và môi trường cần thiết để kiểm tra mức độ sinh trưởng pháttriển của vi sinh vật,

e Chuẩn bị các chất bổ sung cần thiết như dung dịch điều chỉnh pH, các chất bổ sungkhác trong quá trình lên men

1.4.2.2 Chuẩn bị giống cho quá trình lên men

bọt v.v Thông thường, chế độ lên men đã định sẵn được lập trình bằng máy tính và kiểmsoát toàn bộ quá trình lên men, các thông số lên men nhận được, được ghi lại trên máy tính đểtìm được điều kiện lên men tối ưu.

b Cấp độ sản xuất thử nghiệm (pillot)

Ở cấp độ này, ngoài hệ thồng lên men cấp độ phòng thí nghiệm thì dung tích bình lênmen thông thường từ 50 đến 300 lit Thông qua quá thử nghiệm ở cấp độ này, đánh giá chấtlượng và năng suất chủng giống sản xuất, đánh giá các điều kiện lên men có phù hợp cho sảnxuất lớn ở mức độ công nghiệp không?

c Cấp độ sản xuất ở quy mô công nghiệp

Lên men sản xuất ở mức độ công nghiệp, thông thường dung tích bình lên men từ 1.000lit đến 30.000 lit, cho nên phải có lượng giống phù hợp cho bình lên men tương ứng Thôngthường lượng giống đưa vào chiếm1/10 thể tích môi trường lên men, do đó phải nhân giốngcấp 1 và cấp 2 Để đảm bảo cho quá trình lên men lớn, tránh gây gây lãng phí cho sản xuất,thống thường người ta làm 2 bình nhân giống, kiểm tra chất lượng giống và kiểm tra nhiễmtạp trước khi cấy giống vào bình lên men

2 Quá trình chuẩn bị giống cho lên men

Bước 1 Kiểm tra chất lượng giống

Chủng giống sản xuất phải đảm sạch, vô trùng, đảm bảo chất lượng mới đưa vào sảnxuất, do đó phải kiểm tra chất lượng giống trong phòng thí nghiệm trước khi đưa vào sản xuất.Giống được bảo quản trong tủ lạnh sâu hay giống đang sản xuất, đều phải kiểm tra chấtlượng trước khi sử dụng, vì hiện nay chủng giống có năng suất cao thường được chọn lọcbằng phương pháp gây đột biến hay bằng kỹ thuật gen, do đó dễ bị thoái hóa (hay gọi là lạigiống)

Bước 2 Hoạt hóa giống

Giống thường được bảo quản trong ống nghiệm ở tủ lạnh sâu hay trong tủ lạnh, cho nêntrước khi sử dụng phải lấy ống ra từ từ, tránh gây sốc nhiệt, ảnh hưởng đến chất lượng củagiống Sau đó, giống được cấy truyền sang môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm (mỗiloại giống có thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau đã được lựa chọn).Giống được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp cho đến khi giống mọc tốt lấy ra, dùng quecấy cấy giống vào bình tam giác có môi trường lên men (thường tỷ lệ môi trường bằng 1/10thể tích bình) và nuôi trên máy lắc ở nhiệt độ phù hợp Thời gian nuôi phù thuộc vào từng loại

vi sinh vật (đối với vi khuẩn là 24-48 giờ, nấm men, nấm sợi 48-72 giờ, xạ khuẩn 96-120 giờ)

và sau đó lấy ra kiểm tra chất lượng giống, trước khi đưa vào sản xuất

Bước 3 Nhân giống

Để đảm bảo chất lượng giống tốt cho quá trình lên men thì giống phải có khả năng sinhtrưởng phát triển tốt (cho sinh khối nhiều) và thời gian cấy giống vào bình lên men thì giốngsinh trưởng, phát triển đang ở pha tăng tốc (pha log) là tốt nhất

Cách làm: Giống đã được hoạt hóa trên máy lắc được cấy 1-5% sang bình nhân giốngcấp 1 có môi trường nhân giống đã được lựa chọn (thường tỷ lệ môi trường bằng 2/3 thể tíchbình) và nuôi cấy có sục khí và khuấy trộn ở nhiệt độ phù hợp cho đến khí giống phát triển tốtthì cấy truyền sang bình lên men với tỷ lệ 10% so với môi trường lên men, nếu lên men trên

bình nhân giống cấp 1, còn lên men lớn hơn nữa thì cấy sang bình nhân giống cấp 3, thể tíchbình gấp 10 lần bình nhân giống cấp 2 sao cho lượng giống cấy vào bình lên men đạt 10% thểtích môi trường lên men trong bình lên men.

Cần chú ý: Thiết bị và quá trình thao tác đều phải đảm bảo vô trùng Với bình nhângiống nhỏ (nhân giống cấp 1) thì chuẩn bị môi trường cho vào bình, sau đó đi khử trùng trongnồi áp suất, còn bình nhân giống lớn (cấp 2 và cấp 3) thì khử trùng ngay trong nồi lên men.Phải kiểm tra chất lượng giống (đặc biệt là nhiễm tạp) ở các công đoạn trước khi cấy sangbình nhân giống tiếp theo

1.4.3 Vận hành quá trình lên men

1.4.3.1 Động học của quá trình lên men vi sinh vật

Quá trình lên men được bắt đầu từ khí cấy tiếp giống từ từ bình nhân giống vào bình lênmen đã có môi trường nuôi cấy thích hợp đã được khử trùng và khử trùng đồng bộ hệ thốngthiết bị lên men (xem Mục 3.3, chương 3) Các chỉ tiêu cần theo dõi là động học của quá trìnhlên men gián đoạn (hệ kín) trong môi trường nuôi cấy chìm (xem Hình 1.10 và Hình 1.11)

Hệ “kín” ở đây có nghĩa là môi trường không đổi mới Khi cấy vào môi trường dinhdưỡng, vi khuẩn sẽ sinh sôi nẩy nở cho đến lúc hàm lượng một chất nào đó cần thiết chochúng ở môi trường giảm đến mức thấp nhất, khi đó sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩngiảm dần và đình trệ, mặc dù tế bào vẫn tiếp tục vài lần phân chia, nhưng cho các thế hệ tếbào bé hơn và khối lượng nhỏ hơn Nếu trong cả thời kỳ đó, chất dinh dưỡng không được bổsung thêm và các sản phẩm trao đổi chất cũng được loại bỏ thì ta có quần thể tế bào trongkhông gian sống có giới hạn Sự sinh trưởng trong hệ “kín” như vậy phải tuân theo những quyluật chi phối không chỉ với cơ thể đơn bào mà còn đối với cả cơ thể đa bào nữa

Động thái của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn trong hệ “kín” có thể biểu thị bằng đồthị (hình 1.10) Đồ thị này được biểu thị sự phụ thuộc của log số tế bào với thời gian Đồ thịnày có thể chia thành bốn pha liên tiếp, có thể tóm tắt các pha như sau:

a Pha lag (tiền phát):là pha tính từ lúc bắt đầu cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc độsinh trưởng cực đại Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là chưa có khả năng sinhsản), nhưng thể tích và khối lượng tế bào vi sinh vật tăng lên do quá trình sinh tổng hợp cácchất diễn ra mạnh mẽ Một số enzyme xúc tác cho quá trình phân giải tăng, tế bào chất tăng

Hình 1.10: Đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật

(Theo Orbit Biotech).

Ở pha lag, số lượng tế bào (X) không tăng, tức là bằng Xođược đặc trưng khi x = 0,khi đó: dx/dt = x x = 0 Độ dài của pha lag phụ thuộc vào các yếu tố sau đây:

- Tuổi của giống: Tuổi của quần thể giống cấy vào môi trưởng nuôi mà chúng đang ởgiai đoạn sinh trưởng nào ảnh hưởng rõ rệt đến pha lag Thực nghiệm trong môi trường vàđiều kiện nuôi cấy như nhau cho thấy, nếu cấy giống đang ở pha log (pha sinh trưởng pháttriển theo luỹ thừa) thì pha lag sẽ ngắn Ngược lại, nếu giống cấy ở pha lag hay pha suy thoáithì pha lag sẽ kéo dài Thông thường tế bào càng già thì pha lag càng dài Trong pha lag diễn

ra việc xây dựng lại các tế bào ở giai đoạn nghỉ thành các tế bào sinh trưởng logarit (sinhtrưởng theo luỹ thừa)

- Lượng giống cấy: Nói chung lượng giống cấy nhiều thì pha lag ngắn và ngược lại.Trong công nghiệp lên men, tỷ lệ giống cấy vào môi trưởng lên men thường ở mức 1/10

- Thành phần môi trường: Thông thường môi trường có thành phần giàu dinh dưỡng(môi trường có cơ chất tự nhiên) thì pha lag ngắn Trong công nghiệp lên men, người ta sửdụng thành phần môi trường lên men không khác nhiều so với môi trường nhân giống

b Pha log (tăng tốc):là pha vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, nghĩa là

sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trình N = No 2ct hay X = Xo ct Kích thướccủa tế bào, thành phần hoá học, hoạt tính sinh lý v.v… nói chung không thay đổi theo thờigian Tế bào ở trạng thái động học và được coi như là “những tế bào tiêu chuẩn” Ở pha log, xtăng theo thời gian theo cấp số nhân và ln X tỷ lệ thuận với thời gian, ở suốt pha này thì hằng

số sinh trưởng x là không đổi và cực đại đối với điều kiện nuôi cấy cụ thể và đối với mộtchủng vi sinh vật nhất định Như vậy thì: X = (ln X2– ln X1) / (t1– t2)

c Pha cân bằng:Số lượng vi sinh vật đạt đến cực đại và không đổi theo thời gian Số

tế bào mới sinh ra bằng số tế bào chết đi Chính ở pha này x = 0, do đó: dx/dt = 0

d Pha suy vong:Trong pha này, số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo luỹ thừa

Số lượng vi sinh vật x giảm dần, tế bào tự phân giải do các enzyme nội bào và các chất ngoại

bào Người ta có thể xác định tỷ suất chết của quần thể

Thời gian của quá

trình quá trình sinh trưởng,

phát triển của vi sinh vật

còn phụ thuộc vào thời

gian thế hệ của từng loại vi

sinh vật

Ngoài theo dõi động

thái sinh trưởng phát triển

của vi sinh vật, còn theo

dõi động thái quá trình lên

men (Hình 1.11): Sự biến

động của pH, nguồn

cacbon, nguồn nitơ, nồng

độ oxy hòa tan, hàm lượng

các sản phẩm (các loại

Hình 1.11: Động thái lên men sinh tổng hợp vancomycin của Streptomyces orientalis trong bình lên men Bioflo 5000

enzyme, các chất trao đổi bậc sơ cấp, các chất trao đổi thứ cấp, v,v,,) Theo lý thuyết, các sảnphẩm là các chất trao đổi thứ cấp thường sinh ra nhiều hơn, khi đồ thị sinh trưởng, phát triểntrước khi chuyển sang pha cân bằng, còn các sản phẩm là các chất trao đổi thứ cấp đạt cực đạisau khi đã chuyển sang pha cân bằng.

1.4.3.2 Điều khiển quá trình lên men

1 Xác định sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật

Có nhiều cách thông qua việc xác định sự biến đổi số lượng và chất lượng vi sinh vật đểhiểu được sự sinh trưởng của vi sinh vật, biết được tốc độ sinh trưởng và thời gian thế hệ

a Xác định số lượng tế bào(đối với vi khuẩn và nấm men)

Phương pháp đơn giản nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính hiển

vi bằng buồng đếm hồng cầu của Petroff-Hausser Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãngvào phòng đếm, đậy lá kính (lamelle/ cover glass) lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượngdưới kính hiển vi Khuyết điểm của phương pháp này là không xác định được với các mẫu có

số lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không cao vì không phân biệt được giữa tế bàosống và tế bào chết

Để xác định số lượng tế bào sống người ta thường dùng phương pháp cấy dịch phaloãng lên bề mặt môi trường thạch đĩa Sau khi nuôi cấy đếm số khuẩn lạc tạo thành rồi nhânvới nồng độ pha loãng sẽ tính ra mật độ tế bào trong môi trường lên men

b Xác định khối lượng tế bào (sinh khối)

Đối với xạ khuẩn hay nấm sợi thường xác định bằng phương pháp cân trọng lượng khôthuyệt đối với cách làm như sau: Lấy một lượng dịch lên men lọc qua giấy lọc và sấy trong tủsấy ở 105oC đến trọng lượng không đổi Xác định trọng lượng của giấy lọc có sinh khối đãsấy trừ đi trong lượng giấy lọc đối chứng thì xác định được khối lượng của tế bào trong 1 mldịch lên men

2 Đo nhiệt độ và điều khiển nhiệt độ

Tùy thuộc sinh lý chủng nuôi cấy trong khi lên men mà phải giữ nhiệt độ thích hợptrong khoảng giao động 0,1 - 0,20oC Để đáp ứng được yêu cầu đó người ta cho nước nónghoặc nước đã được làm lạnh chảy trong một vỏ kép hay trong bộ phận trao đổi nhiệt thích hợpđặt ở bên trong hay bên ngoài bình lên men

Ngày nay kỹ thuật điều chỉnh nhiệt độ đã có thể tự động hóa bằng cách lắp máy điềunhiệt vào một điểm có nước chảy từ vỏ kép hoặc ống xoắn của nồi lên men chảy ra có nhiệm

vụ chỉ huy thông qua một rơ le hai tiếp điểm hoặc thiết bị để đốt nóng hay van điều chỉnhnước lạnh hoặc nước nóng tới

3 Đo pH và điều chỉnh pH

Đo pH thực hiện bằng điện cực cắm trực tiếp và môi trường và cần thiết sẽ điều chỉnhbằng axít hoặc kiềm Việc tự động cho dung dịch axít hoặc kiềm để giữ pH lên men ở giá trịtối ưu được thực hiện bằng những phương pháp đã dùng trong công nghiệp hóa học nhưngphải dùng các điện cựu đặc biệt để có thể chịu được khử trùng và đặt trực tiếp trong nồi lênmen

Điện cực thủy tinh gồm một dâyAg/AgCl bão hóa KCl dạng rắn, đồng thời nó làm tăng

độ bền của điện cựu thủy tinh Vì sẽ đọng lại thành những hạt rất nhỏ trên bề mặt điện cựu

trong quá trình khử trùng Điện cực chuẩn ở phần dưới có một đoạn nối làm bằng vật liệu rắn

và xốp như amiăng hay sứ

Để đảm bảo cách điện và kím cho nồi lên men những điện cực đó được đệm bằnggioăng Teflon và silicon và lắp trên một tấm thép không rỉ hàn vào nồi lên men Để bảo vệmáy đo hết sức dễ vỡ đó, người ta đặt nó vào trong một ống trụ bằng thép không rỉ đáy hở cókhoan lỗ cho phép môi trường khuấy tiếp xúc với điện cực có điện trở nội khoảng 300 đến

500 mΩ

Trong những nồi lên men khử khuẩn bằng hơi nước trực tiếp đến áp suất 1- 2 atm

(120-130oC) như ở những nồi lớn nhất cực thăm dò chịu áp lực kiểm 764-31B/H cho phép sử dụngmột điện cực phối hợp ở phần đáy nồi lên men Một đối áp đặt trên mặt của chất điện giảichuẩn, do một áp kế chỉ, để chống lại sự xâm nhập của môi trường nén dưới áp suất, chui quámàng xốp của đoạn nối chứa chất điện giải của điện cựu

Trong những nồi lên men công nghiệp dung tích lớn, toàn bộ điện cực (điện cực thuỷtinh, điện cực chuẩn, điện cực bù trừ nhệt độ) được lắp đặt trên một mặt bích bằng thép không

gỉ, ghép bằng bulong trên thành đứng của nồi lên men ở chiều cao thích hợp và cách điệnbằng một đệm Teflon Toàn bộ điện cực đo pH được nối vào một máy ghi pH ở một máykiểm soát nối với một van điện tử điều khiển việc cho axit hay kiềm vào nồi lên men

4 Đo oxy và điều chỉnh lượng oxy hòa tan

Tế bào sử dụng oxy để hô hấp và làm giảm lượng oxy trong môi trường Vì thế trongnuôi cấy hiếu khí phải cung cấp oxy một cách đều đặn Thiếu oxy nhất thời tại một thời điểmnào đó trong môi trường sẽ dẫn đến sự phá vỡ quá trình trao đổi chất của tế bào Vi sinh vật

sử dụng oxy trong môi trường lỏng Lượng oxy hoà tan trong nước thường là rất ít Phải cungcấp oxy sao cho tốc độ hoà tan của nó bằng tốc độ tiêu thụ oxy của vi sinh vật

Cung cấp oxy cho các tế bào nuôi cấy chìm là một quá trình chuyển dịch chất, trong đóoxy được chuyển từ bóng không khí vào môi trường dinh dưỡng và từ đó vào tế bào Trongthực tiễn, người ta thường sử dụng tỷ số của thể tích không khí/thể tích nồi lên men/phút là 1 :

1 : 1 Trong các bình lên men và bình nhân giống đều có hệ thống khuấy tuỳ thuộc vào yêucầu của từng loại vi sinh vật, vào từng điều kiện nuôi cấy để nhằm thu được hiệu suất tối đa

1.4.4 Xử lý dịch lên men thu sản phẩm

1.4.4.1 Các giai đoạn khác nhau trong tách chiết

1 Đơn vị hoạt động

Các quá trình sinh học (bioprocess) có thể chia nhỏ vào hàng loạt các bước được gọi làđơn vị hoạt động (operations) Mỗi đơn vị hoạt động có thể xuất hiện lại trong quá trình theoquá trình mà ở đó các điều kiện và thiết bị hoạt động khác nhau, do đó được gọi là đơn vị hoạtđộng

Một loạt các kỹ thuật được yêu cầu cho quá trình làm sạch và thu nhận các sản phẩm,

do các sản phẩm khác nhau về kích thước, hình dạng và bản chất Thông thường môi trườnglên men trong bình lên men thì kích thước của sản phẩm lên men thường nhỏ, còn lượng nướcrất lớn (Hình 1.12) Tuy có rất nhiều kỹ thuật được sử dụng, nhưng phụ thuộc vào đặc tínhcủa sản phẩm (nội bào hay ngoại bào, tính chất hóa lý) mà lựa chọn kỹ thuật, các bước phântách và tính sạch sản phẩm phù hợp (Hình 1.13), ví dụ tùy thuộc vào sự nhạy cảm của rất

nhiều loại sản phẩm, đặc biệt là protein với điều kiện môi trường, đưa thêm các nhu cầu vềđặc tính của quá trình phân tách được sử dụng trong quá trình sản xuất enzyme.

Hình 1.12: Đặc điểm của môi trường lên men trong bình lên men.

Xác định được đơn vị hoạt động phù hợp rất quan trọng vừa giảm thiểu số lượng cácgiai đoạn liên quan đến quá trình làm sạch sản phẩm để duy trì năng suất cao và kết quả cuốicùng sẽ vô nghĩa, nếu một vài bước có năng suất thấp được kết hợp vào trong quá trình thuhồi

Hình 1.13: Các giai đoạn và kỹ thuật sử dụng trong quá trình thu hồi sản phẩm

công nghệ sinh học.

2 Quá trình thu hồi trong nhiều giai đoạn hoạt động

Quá trình thu hồi bao gồm một số đơn vị hoạt động được sử dụng rộng rãi trong kỹthuật hóa học Quá trình được sử dụng thông dụng nhất là tách chiết và tinh chế các sản phẩm,

có thể được phân thành các giai đoạn chính như sau:

- Phân tách rắn-lỏng hoặc làm trong (clarification): Khi xem xét nhận một sản phẩm từ

tế bào, cần thiết phải loại bỏ các mảnh vỡ tế bào không mong muốn, thường thực hiện bằngcách lọc hay ly tâm

- Cô đặc: Liên quan đến sự phân tách sơ bộ các sản phẩm cần thiết bằng cách sử dụngcác thành phần có những đặc tính khác sản phẩm (hấp phụ, chiết xuất lỏng, kết tủa), nhưngvới khối lượng lớn thì các phương pháp tương đối không chọn lọc được sử dụng

- Tinh sạch: Các kỹ thuật có độ chọn lọc cao (sắc ký, siêu lọc, kết tủa phân đoạn), kỹthuật mới được sử dụng

- Lập công thức: Chiết xuất các sản phẩm cuối cùng để nhận được một sản phẩm đồngnhất bằng cách sử dụng các kỹ thuật như kết tinh, tiếp đó ly tâm hoặc lọc và sấy khô

1.4.4.2 Quá trình thu hồi các sản phẩm công nghệ sinh học

Trong quá trình thu hồi các phân tử sinh học có thể phân thành 5 giai đoạn như sau: Xử

lý sơ bộ, phân tách rắn/lỏng, cô đặc, tinh sạch và hoàn thiện sản phẩm Trong mỗi giai đoạn

đã có nhiều đơn vị hoạt động bao gồm các kỹ thuật sử dụng dưới đây:

Giai đoạn 1, tiền xử lý bao gồm các kỹ thuật: (a) Phá vỡ tế bào, (b) Ổn định, (c) Thanhtrùng, (d) Khử trùng Pastreur và (e) Keo tụ

Giai đoạn 2, phân tách rắn/lỏng bao gồm các kỹ thuật: (a) Lọc, (b) Lắng và (c) Ly tâm.Giai đoạn 3, cô đặc bao gồm các kỹ thuật: (a) Lọc màng, (b) Kết tủa, (c) Bay hơi, (d)Chiết xuất và (e) Kết đông

Giai đoạn 4, tinh sạch bao gồm các kỹ thuật: (a) Kết tủa, (b) Chiết xuất, (c) Lọc tiếptuyến (diafiltration), (d) Hấp phụ và (e) Sắc ký

Giai đoạn 5, hoàn thiện sản phẩm bao gồm các kỹ thuật: (a) Làm khô, (b) Sấy phun(prilling), (c) Đùn (extrusion), (d) Tạo hạt và (e) Tạo viên

Lựa chọn quá trình thu hồi thường dựa trên các tiêu chí sau đây: (1) Sản phẩm là nộibào hay ngoại bào; (2) Nồng độ sản phẩm trong dịch lên men; (3) Tính chất vật lý và hóa họccủa sản phẩm mong muốn; (4) Mục đích sử dụng của sản phẩm; (5) Tiêu chuẩn tinh khiết tốithiểu được chấp nhận; (6) Mối nguy hại sinh học (bio-hazard) của sản phẩm và dịch lên men;(7) Các tạp chất có trong dịch lên men và (8) Giá trị trường cho sản phẩm

Trình tự của quá trình thu hồi sản phẩm công nghệ sinh học được thực hiện theo cácbước sau: (1) Loại bỏ các chất không hòa tan, (2) Phá vỡ tế bào (Ly tâm, máy đồng nhất hóa-homogenizer), (3) Chiết xuất, (4) Cô đặc (kết tinh, đông lạnh), (5) Tinh sạch (sắc ký) và (6)Hoàn thiện sản phẩm (chiến lược tiếp thị, tạo hạt, đóng chai)

Trong quá trình tách chiết sản phẩm công nghệ sinh học, cũng cần quan tâm đến những

ưu và nhược điểm của các kỹ thuật sử dụng, nó liên quan đến chất lượng, năng suất và giáthành sản phẩm (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Các kỹ thuật thường sử dụng, ưu và nhược điểm của các kỹ

thuật trong thu hồi sản phẩm

1 Ly tâm Chi phí vốn và bảo trì cao Sử dụng năng lượng khá cao

2 Siêu lọc hay thẩm thấu

ngược Năng lượng thấp, phân tách tách trên cơ sở trọng lượngphân tử Tắc nghẽn là một vấn đề lớn với các màng lọc

3 Bốc hơi và sấy khô Chi phí năng lượng cao, được giảm trong các thiết bị mới,

nhưng chi phí đầu tư cao

4 Chiết xuất bằng dung môi Hiệu quả, nhưng chỉ ứng dụng đặc hiệu

5 Kết tủa Bị giới hạn bởi chi phí của chất phản ứng và hoặc chi phí

tái sinh chất phản ứng

6 Keo tụ (cao, trung bình và

thấp) Thường rẻ và có hiệu quả, ở đây không bao giờ được ápdụng

7 Chưng cất Sử dụng năng lượng cao, nhưng lượng sản phẩm thu hồi

cao hơn khi nhiệt lượng thấp

8 Trao đổi ion Phân tách tốt nhưng kỹ thuật đắt tiền, các loại nhựa có thể

được tái sinh được

9 Kết tinh Cần dung dịch khởi đầu khá tinh khiết

1.4.4.3 Những vấn đề tồn tại ảnh hưởng đến quá trình thu hồi

1 Do nguồn nguyên liện sản xuất

Nguồn nguyên liệu đề cập đến loại cây trồng hoặc sản phẩm, như dầu thực vật thải, mà

nó được sử dụng như là nhiên liệu sinh học và năng lượng sinh học hay chuyển đối thànhnhiên liệu sinh học và năng lượng sinh học Mỗi loại nguyên liệu có ưu và nhược điểm nhấtđịnh cho sinh trưởng và nhu cầu năng lượng của vi sinh vật, sử dụng như thế nào để cho năngsuất mong muốn là cần quan tâm nghiên cứu

Nguyên liệu cụ thể được xem xét bao gồm: Phế thải nông nghiệp (vật liệu còn sót lại từcây trồng như các thân cây, lá và vỏ cây); chất thải lâm nghiệp (gỗ thừa và mùn cưa từ cácnhà máy gỗ xẻ, những cây bị chết và cành cây); chất thải sinh hoạt (rác thải hộ gia đình và cácsản phẩm giấy); chất thải chế biến thực phẩm và các ngành công nghiệp khác (nấm men, malt,phụ phẩm sản xuất giấy) và cây trồng năng lượng (cây và cỏ phát triển nhanh) cũng được pháttriển cho mục đích này

Nếu quá trình lên men được thực hiện mà không có bất kỳ hình thức hỗ trợ xử lý sinhkhối, sẽ hạn chế khuấy hoặc sục khí, thì chỉ tiếp cận ở 3-7% (trọng lượng/ thể tích) trọnglượng sinh khối khô Nếu không đề xuất hình thức hỗ trợ sinh khối thì không vượt qua giớihạn này

Hỗ trợ sinh khối cho phép các vi sinh vật yếm khí phát triển chậm duy trì trong mộtbình lên men ở nồng độ cao Ví dụ, lignocellulose như chất mang sinh khối cho sản xuất axitlactic bằng cách lên men trên môi trường xốp (trạng thái rắn)

a) Nếu quá trình lên men được thực hiện mà không có bất kỳ hình thức hỗ trợ sinh khối,hạn chế khuấy hoặc sục khí thì chỉ đạt 3-7% (w/v) trọng lượng sinh khối khô

b) Trong thực tế, quá trình lên men vi khuẩn sản xuất protein đơn bào chất huyền phùđạt 3% (w/v), ở đó nồng độ chất huyền phù đạt 60% (w/vol) sinh khối ướt và 40% chất lỏng.c) Theo tiêu chuẩn, nồng độ các sản phẩm cho quá trình thu hồi, dựa trên các quá trìnhhóa học thông thường, được trình bày trên bảng 1.2 Dựa trên dữ liệu này để lựa chọn cácbước của quá trình thu hồi và xử lý loại bỏ hay tái sử dụng bùn thải hợp lý

Bảng 1.2: Nồng độ các sản phẩm tiêu biểu trong dịch lên men chuyển

sang giai đoạn thu hồi

Protein đơn bào (nấm men, trọng lượng sinh khối khô) 30-50

d) Môi trường lên men thường không ổn định, nếu không kiểm soát tốt dễ bị nhiễmtrùng, do đó sinh khối có thể tăng trưởng mạnh, nhưng nồng độ sản phẩm trong môi trường

lên men lại giảm đáng kể, làm thay đổi tính chất vật lý cuat dịch lên men ảnh hưởng đến quátrình thu hồi sản phẩm.

e) Tương tự quá trình thu hồi sau khi lên men chậm cũng ảnh hưởng đến chất lượng sảnphẩm trong qua trình thu hồi, do vây cần thiết phải bảo quản dịch lên men (ở khoảng 5oC)ngay sau khi kết thúc quá trình lên men, nhất là các enzyme và các sản phẩm có khối lượngnhỏ trong dịch lên men Thời gian suy giảm đáng kể sản phẩm xảy ra sau 20 phút ở nhiệt độlên men

b) Tỷ lệ lớn các chế phẩm vi sinh vật mẫn cảm với hóa chất, thì phải quan tâm đên việc

sử dụng các chất phản ứng, pH và nhiệt độ Sản phẩm là chất rắn cũng có vấn đề trong quátrình thu hồi, cụ thể các chất rắn thông thường phải được thu hồi mà không bị ô nhiễm dothiết bị hỗ trợ trong quá trình phân tách

c) Nhiều chất không cần phải tách chiết thành nguyên liệu tinh khiết, quá trình lên mencồn, enzyme và một số loại dược phẩm (vi dụ một số loại vaccin) Tuy nhiên, cũng cần loại

bỏ các chất có các đặc tính không mong muốn, ví dụ như chất pyrogen -chất gây sốt trongtrong các dược phẩm tiêm và axit nucleic trong trường hợp các protein đơn bào cho người tiêudùng

d) Vấn đề chính phát sinh khi phân tách các thành phần đặc hiệu từ các vật liệu có tinhchất hóa học và lý học tương tự khác là cần thiết (ví dụ, tách chiết các enzyme sạch khỏi cácprotein khác) trong trường hợp phải sử dụng hiệu ứng hóa lý đặc hiệu của sản phẩm

e) Một ví dụ nổi bật về hạn chế của phương pháp có sẵn để thực hiện quy trình đã lựachọn là sản xuất rượu, đó là etanol và các hợp chất hữu cơ hòa tan dễ bay hơi khác mà quaphương pháp chưng cất chỉ là bước phân tách sơ bộ của quá trình thu hồi các sản phẩmthương mại

3 Xử lý nước thải và tái chế bùn

a) Quá trình xử lý nước thải và quay vòng bùn thải, nhìn chung không khác so với cácquá trình xử lý nước thải của các công nghiệp khác, ngoại trừ hoạt động quy mô lớn

b) Thể tích bùn nhận được là lớn (ví dụ: 4500m3/ngày cho 50.000 tấn/protein đơn bàonăm) Theo Somejina et al (1997), BOD (nhu cầu oxy sinh học) dao động từ 10.000 đến30.000 ppm, so với 250 ppm dòng nước thải vào mùa khô điển hình cho nhà máy xử lý nướcthải đô thị Tuy nước thải có nhu cầu oxy cao, nhưng bùn thải lại không khác so với chất thảikhác

c) Một vấn đề cũng cần xem xét sự xuất hiện các sinh vật gây bệnh và các chất có hoạttính sinh lý cần xử lý và kiểm soát, đảm bảo các mối nguy hiểm được loại bỏ trước khi thảivào môi trường chung

d) Tái chế bùn cho lên men là hấp dẫn, ở chỗ nó thu nhận các vật liệu không tiêu thụđược trong môi trường lên men và hạn chế tối đa chất thải ra môi trường, mà sử dụng để sảnxuất protein đơn bào hay etanol.

10 Các khâu chính cần chuẩn bị cho một quá trình lên men

11 Tại sao nói, giống sản xuất có ý nghĩa quan trọng nhất cho quá trình lên men Cáccấp độ chuẩn bị giống cho quá trình lên men

12 Động học quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên mentrong hệ “kín” bao gồm mấy pha chính và vì sao các pha lại liên tiếp nhau

13 Ngoài theo dõi động học quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật còn theo cácyếu tố nào của quá trình lên men để điều chỉnh quá trình lên men

14 Giai đoạn thu hồi sản phẩm có ý nghĩa hết sức quan trọng trong lên men sản xuấtsản phẩm công nghệ sinh học, vì sao?

15 Quá trình thu hồi sản phẩm thường có mấy giai đoạn và ý nghĩa của từng giai đoạntrong công nghệ thu hồi sản phẩm lên men

16 Những vấn đề tồn tại ảnh hưởng đến quá trình thu hồi sản phẩm trong công nghệ lênmen sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học

Mục tiêu người học cần đạt

1 Sự khác nhau giữa giữa vi sinh vật học, vi sinh vật học ứng dụng, vi sinh công nghiệp

và công nghệ vi sinh, công nghệ vi sinh công nghiệp; sự khác nhau giữa công nghệ lên mentruyền thống và công nghệ lên men hiện đại như thế nào

2 Sự khác nhau giữa khái niệm lên men công nghiệp và công nghệ lên men; mục đíchchính của các quá trình lên men và hướng ứng dụng chính trong sản xuất và đời sống.

3 Cách phân loại các quá trình lên men dựa vào các tiêu chuẩn gì để thiết kế được cácquá trình lên men phù hợp

4 Các công đoạn chính của các quá trình lên men và tiêu chí để lựa chọn các quá trìnhlên men Một quy trình lên men sản xuất sản phẩm công nghệ sinh học trong công nghiệpthường được tiến hành theo mấy giai đoạn, ý nghĩa của các giai đoạn

5 Các khâu chính cần chuẩn bị cho một quá trình lên men Tại sao nói, giống sản xuất

có ý nghĩa quan trọng nhất cho quá trình lên men Các cấp độ chuẩn bị giống cho quá trình lênmen

6 Vận hành một quá trình lên men cần theo dõi động học quá trình sinh trưởng pháttriển của vi sinh vật còn theo các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy để điều chỉnh quátrình lên men

7 Giai đoạn thu hồi sản phẩm lên men có ý nghĩa hết sức quan trọng trong lên men sảnxuất sản phẩm công nghệ sinh học, các giai đoạn và ý nghĩa của từng giai đoạn trong côngnghệ thu hồi sản phẩm lên men

Tài liệu đọc bổ trợ

Nguyễn Thành Đạt (2002) Giáo trình vi sinh vật học, tập 1 và 2, NXB Giáo dục HN.

Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh (2010) Cơ sở Công nghệ vi sinh vật và ứng dụng, NXB

Giáo dục, Hà Nội

Glazer, Alexander N., & Hiroshi Nikaido (2007) Microbial Biotechnology: Fundamentals of Applied Microbiology 2d ed New York: Cambridge University Press Peter F Stanbury, Allan Whitaker, Stephen J Hall (2016) Principles of Fermentation Technology, Butterworth-Heinemann.

Humphrey A E, Lee S E (1992) Industrial Fermentation: Principles, Processes, and

Products Riegel's Handbook of Industrial Chemistry.

Chương 2.

GIỐNG VÀ CÁC GIẢI PHÁP GIỐNG

PHỤC VỤ SẢN XUẤT

2.1 Chủng công nghiệp và yêu cầu chất lượng của chủng công nghiệp

2.1.1 Khái niệm về chủng công nghiệp

2.1.1.1 Chủng giống vi sinh vật

Trong công nghệ lên men, ngoài điều kiện cần có một quy trình công nghệ hợp lý, thìvấn đề chất lượng giống là khâu quan trọng, quyết định hiệu quả kinh tế của quy trình sảnxuất Trong lên men công nghiệp, người ta sử dụng các vi sinh vật thuộc nhóm cơ thể nhân sơ(nhân nguyên thuỷ) như vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam và nhóm cơ thể nhân thật nhưnấm men, nấm sợi, tảo

Vi sinh vật sống khắp mọi nơi trên Trái đất, ngay cả nơi mà điều kiện sống tưởng chừnghết sức khắc nghiệt vẫn thấy có sự phát triển của vi sinh vật (ở đáy đại dương, ở nhiệt độ 85-

90oC, ở môi trường có pH = 10-11, trong dung dịch bão hoà muối, đồng hóa dầu mỏ, phenol,khí thiên nhiên )

Trong 1g đất lấy ở tầng canh tác thường có khoảng 1-22 tỷ vi khuẩn; 0,5-14 triệu xạkhuẩn; 3 - 50 triệu vi nấm; 10- 30 nghìn vi tảo Trong 1 m3không khí phía trên chuồng giasúc thường có 1- 2 triệu vi sinh vật, trên đường phố có khoảng 5000, nhưng trên mặt biển chỉ

có khoảng 1 - 2 vi sinh vật mà thôi

Vi sinh vật sống trong đất và trong nước tham gia tích cực vào quá trình phân giải cácchất hữu cơ biến chúng thành CO2và các hợp chất vô cơ khác dùng làm thức ăn cho cây trồng.Các vi sinh vật cố định nitơ thực hiện việc biến khí nitơ (N2) trong không khí thành hợp chấtnitơ (NH4+ ) cung cấp cho cây cối Vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất khó tanchứa P, K, S và tạo ra các vòng tuần hoàn trong tự nhiên Vi sinh vật còn tham gia vào quátrình hình thành chất mùn

Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân giải các phế phẩm nông nghiệp, phế thải đôthị, phế thải công nghiệp cho nên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường Các visinh vật gây bệnh thì lại tham gia vào việc làm ô nhiễm môi trường ở nơi có điều kiện vệ sinhkém

Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong lĩnh vực năng lượng (sinh khối hoá thạch nhưdầu hoả, khí đốt, than đá) Trong các nguồn năng lượng mà con người hy vọng sẽ khai thácmạnh mẽ trong tương lai có năng lượng thu từ sinh khối, khối lượng chất sống của sinh vật

Vi sinh vật là lực lượng sản xuất trực tiếp của ngành công nghiệp lên men, bởi chúng cóthể sản sinh ra rất nhiều sản phẩm trao đổi chất khác nhau Nhiều sản phẩm đã được sản xuấtcông nghiệp (các loại axit, enzyme, rượu, các chất kháng sinh, các axit amin, các vitamin ).Hiện nay người ta đã thực hiện thành công công nghệ di truyền ở vi sinh vật Đó là việcchủ động chuyển một gen hay một nhóm gen từ một vi sinh vật hay từ một tế bào của các visinh vật bậc cao sang một tế bào vi sinh vật khác Vi sinh vật mang gene tái tổ hợp nhiều khimang lại những lợi ích to lớn bởi có thể sản sinh ở quy mô công nghiệp những sản phẩmtrước đây chưa hề được tạo thành bởi vi sinh vật

Trong công nghiệp tuyển khoáng, nhiều chủng vi sinh vật đã được sử dụng để hoà tancác kim loại quý từ các quặng nghèo hoặc từ các bãi chứa xỉ quặng.

Vi sinh vật có hại thường gây bệnh cho người, cho gia súc, gia cầm, tôm cá và cây trồng.Chúng làm hư hao hoặc biến chất lương thực, thực phẩm, vật liệu, hàng hoá Ngoài ra, chúngsản sinh các độc tố, trong đó có những độc tố hết sức nguy hiểm

2.1.1.2 Tuyển chọn chủng sản xuất dựa trên mục tiêu sử dụng sản phẩm

Sự sinh trưởng của vi sinh vật và các tế bào khác tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau,mỗi giống có thể được thực hiện nhờ một hay một vài quá trình lên men khác nhau dựa trêncác điều kiện cần thiết và các loại sản phẩm tối ưu khác nhau Như vậy, quá trình lên men dựatrên một hay nhiều cách sau đây: (a) Sản xuất sinh khối (tế bào) như nấm men; (b) Chiết xuấtcác sản phẩm trao đổi chất như axit amin, protein (cả enzyme), vitamin, rượu v.v để ngườivà/hoặc động vật sử dụng hoặc sử dụng trong nông nghiệp như sản xuất phân bón cho câytrồng; (c) Cải biến các hợp chất hóa học (thông qua chuyển hóa sinh học); (d) Sản xuất cácsản phẩm tái tổ hợp; (e) Sản xuất nhiên liệu sinh học từ nguyên vật liệu thực vật

1 Sinh khối vi sinh vật

Sinh khối vi sinh vật được sản xuất mức độ thương mại như protein đơn bào (single cell

protein-SCP) bằng các tảo đơn bào như loài Chlorella hoặc Spirulina phục vụ nhu cầu con

người và động vật hoặc tế bào nấm men sử dụng cho công nghiệp làm bánh Sinh khối vi

khuẩn và Fusarium graminearum sử dụng làm thức ăn bổ sung cho động vật.

2 Các chất trao đổi của vi sinh vật

a Các chất trao đổi sơ cấp

Trong pha tăng tốc, vi sinh vật sản sinh hàng loạt các chất cần thiết cho sinh trưởng củachúng như các nucleotid, axit nucleic, axit amin, protein, cacbohydrat, lipid, v.v hoặc các sảnphẩm phụ của quá trình trao đổi chất nhường năng lượng như etanol, aceton, butanol,v.v Đây được mô tả như là pha thích nghi (tropophase) và sản phẩm thường được gọi là cácchất trao đổi sơ cấp Một số sản phẩm được thương mại được chỉ ra trên bảng 2.1

Bảng 2.1.Một số ví dụ các chất trao đổi sơ cấp được thương mại hóa

Chất trao đổi sơ

Etanol Saccharomyces cerevisiae, Đồ uống cò cồn

Axit citric Aspergillus niger Công nghiệp thực phẩm

Aceton và butanol Clostridium acetobutyricum Dung môi hữu cơ

Lysin Corynebacterium glutamacium Bổ sung dinh dưỡng

Axit glutamic Corynebacterium glutamacium Tăng hương vị

Riboflavin Ashbya gossipii,

Eremothecium ashbyi Dinh dưỡng

Vitamin B12 Propionibacterium shermanii Dinh dưỡng

Dextran Leuconostoc mesenteroides Công nghiệp và nông nghiệpXanthan gum Xanthomonas campestris Công nghiệp khai thác dầu mỏ

b Các chất trao đổi thứ cấp

Các vi sinh vật sản sinh hàng loạt các sản phẩm khác chất trao đổi sơ cấp Trong phanày, không có vai trò rõ ràng trong quá trình trao đổi chất của cơ thể vi sinh vật được sản sinh

ra, pha này còn được gọi là pha tự phát (idiophase) và sản phẩm tạo ra được gọi là chất traođổi thứ cấp.

Nhiều chất trao đổi thứ cấp được sinh ra từ các chất trung gian và sản cuối cùng của quá

trình trao đổi chất sơ cấp Một số sản phẩm như vậy của nhóm vi khuẩn Enterobacteriaceae

không trải qua quá trình trao đổi thứ cấp Một số chất trao đổi thứ cấp được liệt kê trên bảng2.2

Bảng 2.2 Một số ví dụ các chất trao đổi thứ cấp đã được thương mại hóa

Chất trao đổi

Penicillin Penicillium chrysogenum Kháng sinh chống vi khuẩn Gram (+)Erythromycin Streptomyces erythreus Kháng sinh chống vi khuẩn Gram (-)Streptomycin Streptomyces griseus Kháng sinh chống vi khuẩn Gram (-)Cephalosporin Cephalosporium acremonium Điều chế kháng sinh bán tổng hợpGriseofulvin Penicillium griseofulvin Kháng sinh chống nấm

Cyclosporin A Tolypocladium inflatum Ngăn cản miễn dịch

Gibberellin Gibberella fujikuroi Chất điều hòa sinh trưởng thực vậtQuá trình trao đổi chất thứ cấp có thể bị kiềm chế trong trường hợp nào đó Glucosekiềm chế quá trình sản xuất các chất kháng sinh actinomycin, penicillin, neomycin vàstreptomycin; phosphat kiềm chế quá trình sản xuất streptomycin và tetraxyclin Do vậy, môitrường nuôi cấy để sản xuất các chất trao đổi thứ cấp cần phải được lựa chọn cẩn thận

3 Sản xuất enzyme

Bảng 2.3.Một số enzyme được sản xuất ở mức độ công nghiệp

Aspergillus oryzae Amylase

Aspergillus niger Glucoamylase

Trichoderma reesii Cellulase

Saccharomyces cerevisiae Invertase

Kluyveromyces fragilis Lactase

Saccharomycopsis lipolytica Lipase

Các loài Aspergillus Pectinase và protease

Các loài Bacillus Protease

Mucor pusillus Rennet vi sinh vật

Mucor meihei Rennet vi sinh vật

Sản xuất enzyme ở mức độ công nghiệp cần thiết cho sản xuất thực phẩm và đồ uống.Enzyme cũng được sử dụng trong chẩn đoán bệnh, phân tích công nghiệp và ngày nay cònđược bổ sung vào bột giặt (cellulase, protease, lipase) Enzyme có thể được sản xuất bằngcách nuôi cấy vi sinh vật, thực vật và động vật Nhiều enzyme thực vật và động vật có thểđược sản xuất bằng lên men vi sinh vật Trong khi phần lớn enzyme được sản sinh trong pha

tiền phát, nhưng một số như amylase (nhờ Bacillus stearothermophilus) được sinh ra trong

pha tự phát (idiophase) và là chất trao đổi thứ cấp Một số enzyme tiêu biểu được sản xuấtthông qua quá trình lên men được liệt kê trên bảng 2.3.

3 Các sản phẩm thực phẩm

Rất nhiều sản phẩm của công nghiệp thực phẩm như sữa chua, phomat, thịt lên men,bánh mỳ hay các loại bánh khác, đồ ưống có cồn, dấm, rau quả muối chua, nước mắm v.v được sản xuất thông qua quá trình lên men vi sinh vật Hiệu quả của chủng vi sinh vật sửdụng và quá trình lên men liên tục được cải tiến nhằm đưa ra các sản phẩm có chất lượngđược thị trường chấp nhận với giá cả hợp lý hơn

4 Các sản phẩm tái tổ hợp

Công nghệ DNA tái tổ hợp đã chuyển gen từ bất kỳ cơ thể nào đó vào vi sinh vật khác

và tạo ra cơ thể vi sinh vật chuyển gene và sau đó sản sinh các sản phẩm gen Các chủng

Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, các nấm men và thậm chí cả nấm sợi cải biến

gene hiện nay cũng đang được sử dụng để sản xuất interferon, insulin, albumin huyết thanhngười và hàng loạt các sản phẩm khác

5 Chuyển hóa sinh học

Việc sản xuất các hợp chất có cấu trúc tương tự từ một chất cụ thể nào đó trong quátrình lên men là sự chuyển hóa (còn gọi là chuyển hóa sinh học) Một ví dụ cổ điển nhất làquá trình này là sản xuất axit acetic từ etanol

Tế bào thực vật cố định cũng có thể sử dụng để chuyển hóa sinh học Việc sử dụng

alginat như là chất polymer làm chất cố định, digitoxin từ Digitalis lanata được chuyển hóa

thành digoxin, một chất có tác dụng chữa bệnh với nhu cầu rất lớn Tương tự như vậy,

codeinon được chuyển hóa thành codein và tyrosin nhờ Mucuna pruriens và sau đó được

chuyển hóa thành DOPA (l-3,4-dihydroxyphenylalanine)

2.1.1.3 Tuyển chọn chủng dựa trên quá trình lên men

1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật

Ngoài yếu tố quan trọng là thành phần môi trường dinh dưỡng, một số yếu tố vật lý cóthể tác động đến sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật

Vi sinh vật được phân bố khắp nơi, cho nên khả năng thích ứng của vi sinh vật phụthuộc và điều kiện sống khác nhau như nhiệt độ, độ ẩm, thông khí, pH môi trường và nguồndinh dưỡng Từ đó người ta phân chúng thành những nhóm vi sinh vật tương ứng nhằm tạođiều kiện thuận lợi cho chúng phát triển

a Nhiệt độ

Nhiệt độ môi trường với vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết, vì nhiệt độ không chỉ đơnthuần ảnh hưởng đến cường độ phát tiển của từng loại vi sinh vật mà chính khả năng sinhtrưởng của chúng ở nhiệt độ đó Mỗi loại vi sinh vật đều có nhiệt độ phát triển tối thiểu, tốithích và tối đa mà chúng có thể chịu được khác nhau

Dựa vào khả năng của vi sinh vật phát triển trong khoảng nhiệt độ tối ưu khác nhau,người ta phân chia vi sinh vật thành các nhóm sau: Vi sinh vật ưa lạnh (psychrophylic) sinhtrưởng ở nhiệt độ tối ưu dưới 20oC; vi sinh vật ưa ấm (mesophylic) từ 25 đến 45oC; vi sinh vật

ưa nhiệt (thermophylic) từ 45 đến 70oC và vi sinh vật cực ưa nhiệt (superthermophylic) tối ưutrên 70oC

Sự phân định các nhóm vi sinh vật theo nhiệt độ trên không phải là tuyệt đối mà thườnggiới hạn giữa các nhóm có phần xen cài lên nhau Tuy nhiên, phần lớn các vi sinh vật là visinh vật ưa ấm Nấm sợi và nấm men là những vi sinh vật ưa mát, nghĩa là thường từ 20 đến

30oC, tối ưu ở 25 đến 26oC, nhưng cũng có một số loài sống được ở 45oC, cũng có loài sốngđược ở 1oC

Ngày nay, người ta phát hiện được nhiều loài có thể sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ rấtcao, như các chủng ở suối nước nóng, miệng núi lửa Gấn đây, khoa học đã phát hiện thấy các

vi khuẩn cổ sống ở đáy biển, ở nguồn nước nóng có thể chịu được nhiệt độ lên tới 250oC, với

áp suất 256 atm, ví dụ như loài Pyroditium occultum.

Trong quá trình phân lập và nuôi cấy vi sinh vật cũng cần chú ý đến nguồn vị trí lấymẫu mà nuôi cấy thích hợp Điều đó cũng có nghĩa là, tuỳ thuộc vào mục đích sử dụng màngười ta phân lập các chủng vi sinh vật ở những nơi có điều kiện sống tương ứng Ví dụ,trong xử lý rác thải yếu tố nhiệt độ rất quan trọng, vì với nguyên lý “càng nóng, càng tốt” thì

vi sinh vật ưa nhiệt sẽ phát triển và thúc đẩy nhanh quá trình phân giải các chất trong bể ủ,đồng thời khi nhiệt độ hạ xuống sau ủ, các vi sinh vật ưa nhiệt sẽ chết làm cho bể ủ sạch.Người ta phân lập các chủng chịu được nhiệt độ cao ở những đống rác ủ thích hợp

b Độ ẩm(đối với việc nuôi trên môi trường xốp)

Thành phần nước chiếm từ 70-90% khối lượng cơ thể vi sinh vật, tất cả các quá trìnhphân huỷ thức ăn và các phản ứng chuyển hoá các chất trong tế bào đều diễn ra với sự có mặtcủa nước Thiếu nước, vi sinh vật không phát triển được và lúc này vi sinh vật chỉ tồn tại ởdạng nghỉ hoặc bào tử

Nuôi vi sinh vật trên môi trường xốp cần quan tâm đến lượng nước phù hợp (độ ẩmthường 60-70%) Đặc biệt trong quá trình lên men xử lý rác thải, nhiệt độ đống ủ tăng lên,lượng nước bốc hơi nhanh dẫn đến tình trạng thiếu nước cho nên phải bổ sung thêm nước saocho vi sinh vật phát triển bình thường

c Oxy (không khí)

Phụ thuộc vào khả năng sử dụng oxy, người ta chia vi sinh vật thành 3 nhóm chính: (1)

Vi sinh vật hiếu khí: Phát triển ở hiệu thế oxy hoá cao (nhu cầu oxy cao); (2) Vi sinh vật yếmkhí: Phát triển ở hiệu thế oxy hoá thấp (không cần oxy) và (3) Vi sinh vật yếm khí tuỳ tiện:Phát triển ở cả hiệu thế oxy hoá cao và hiệu thế oxy hoá thấp

Trong tế bào vi sinh vật hiếu khí có đầy đủ hệ thống men hô hấp, trong quá trình oxyhoá dùng phân tử oxy làm chất nhận hydro (H+), còn trong quá trình oxy hoá được thực hiệnnhờ sự tham gia của các enzym dehydrolase, chúng dùng các chất hữu cơ có liên kết khôngbão hoà làm chất nhận H+

Với đặc tính của từng nhóm vi sinh vật, nghiên cứu điều kiện nuôi cấy vi sinh vật là cầnthiết Ví dụ, trong quá trình xử lý rác thải việc lựa chọn các loại vi sinh vật vừa có hoạt tínhphân giải nhanh, vừa tạo điều kiện nuôi phù hợp với từng biện pháp xử lý là rất quan trọng vàcần thiết như phương pháp ủ hiếu khí cần cung cấp lượng oxy thích hợp, phương pháp chônlấp rác thải hoặc lên men sinh metan cần tạo điều kiện kị khí hoàn toàn

d pH môi trường

pH môi trường nuôi cấy vi sinh vật rất quan trọng, vì mỗi loại vi sinh vật có khả năngsinh trưởng phát triển ở pH môi trường khác nhau Người ta chia vi sinh vật thành các nhóm

theo khả năng phát triển ở các pH môi trường như sau: pH từ 2 - 4 là nhóm axit mạnh; 4 - 5:nhóm axit; 5 - 6: nhóm axit yếu; 6 - 7: nhóm trung tính; 7 - 8: nhóm kiềm nhẹ; 8 - 9: nhómkiềm và pH trên 9: nhóm kiềm mạnh.

Đa số các vi sinh vật sinh trưởng phát triển bình thường trong phạm vi pH trung tính, có

loại chịu được pH thấp như Thiobacillus ferrooxydans có thể sinh trưởng ở pH 1-2, nấm mốc

chịu được pH 4-5 Ngược lại, nhiều loài có thể sinh trưởng ở môi trường kiềm, pH 10

Sự thay đổi pH là do hàm lượng ion H+trong môi trường tạo nên Hàm lượng H+trongmôi trường ảnh hưởng đến sự hoạt động của các enzym trong tế bào ảnh hưởng đến quá tìnhtrao đổi chất của chúng Dựa vào khả năng chịu pH khác nhau của vi sinh vật, người ta thayđổi pH tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển hoặc ức chế khả năng phát triển cuả chúng

e Áp suất

Phần lớn vi khuẩn không chịu ảnh hưởng của sự thay đổi áp suất, vì chúng được bảo vệnhờ thành tế bào cứng Nếu thành tế bào này bị phá huỷ, thì chất nguyên sinh bị giải phóng rabên ngoài do áp suất bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài Nếu ta tạo tế bào trần bằngcách dùng lyzozyme bóc vỏ tế bào, thì cần giữ cân bằng áp suất bằng cách đưa vào dung dịchđường saccharose 20%, nếu không chất nguyên sinh bị nổ vỡ Tuy nhiên, điều đó không đúngvới nhiều loại vi khuẩn có thể thích nghi với môi trường chứa đến 35g NaCl trong 1 lít Tuỳtheo sự mẫn cảm của chúng đối với áp suất thẩm thấu mà người ta chia thành các nhóm:

- Vi khuẩn không ưa mặn (non-halophiles) phát triển trong môi trường có nồng độ muối dưới 0,2 M NaCl (tương đương 1,2%) như vi khuẩn Enterobacteria, Pseudomonas

- Vi khuẩn ưa mặn (halophiles) cần nồng độ muối trên 0,2 M đối với các loài ưa mặn trung bình (P mariana), ưa mặn cực đoan trên 1,5 M NaCl (khoảng 9%) NaCl và phát triểntối ưu ở nồng độ 2-4 M NaCl (12-23%) như Halococcus morrhueae, Halobacterium salinarium

- Vi sinh vật chịu mặn (Halotolerants) như Staphylococcus, một số nấm men và nấm mốc, một số Lactobacillus.

g Ánh sáng và tia năng lượng

Ánh sáng chỉ có tác dụng gây những biến đổi trong tế bào một khi ánh sáng đó được tếbào hấp thụ, còn độ gây hại phụ thuộc vào mức năng lượng trong lưỡng tử của ánh sáng đượchấp thụ Mức năng lượng trong lưỡng tử lại phụ thuộc gián tiếp vào chiều dài bước sóng củatia chiếu

Các lưỡng tử bức xạ gây nên mức biến đổi hoá học của các nguyên tử và phân tử cóchiều dài bước sóng khoảng 10.000 Ǻ, trong đó có ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại, tia X, tiaGamma, tia vũ trụ Các tia trên được gọi là tia bức xạ ion hoá

Tia vũ trụ, tia Gamma và tia Rơnghen có năng lượng rất lớn Các tia này gọi là tia bức

xạ ion hoá Những bức xạ có chiều dài sóng lớn thì năng lượng lại nhỏ hơn, không đủ gây nênnhững biến đổi hoá học như tia hồng ngoại

Ánh sáng mặt trời là nguồn tia chiếu tự nhiên, đó là phổ ánh sáng có độ dài bước sóng

từ 400-8000 Ǻ Nhiều vi sinh vật có sắc tố quang hợp (diệp lục, khuẩn lục và các loạicarotinoit) lại sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời để quang hợp Ánh sáng mặt trời còn cótác dụng đến sự hình thành bào tử, tổng hợp sắc tố, sự chuyển động hướng sáng ở một số visinh vật