Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi bằng máy sắc ký lỏng cao áp HPLC Đoàn Thị Khang*, Phan Thanh Đạm, Đào Đức Hảo và D
Trang 1Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong nguyên
liệu và thức ăn chăn nuôi bằng máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Đoàn Thị Khang*, Phan Thanh Đạm, Đào Đức Hảo và Dương Thu Anh
Bộ môn Phân tích thức ăn và sản phẩm chăn nuôi, Viện Chăn nuôi
*Tác giả để liên hệ: TS Đoàn Thị Khang, Trưởng Bộ môn phân tích thức ăn & sản phẩm
chăn nuôi, Viện Chăn nuôi ĐT: (04) 8 385941/ 0912 008346
ABSTRACT Using HPLC for determination of aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 )
The method used is this study was AOAC (2000) After using colum Mycosep 226 aflazon for cleaning aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ) in the samples, the samples was put into HPLC for operation
It showed that: RSD of calibration was acceptable (< 2%) and R2 (determinant co-fficient) between standard samples and analysed sample was high (0.999) It meant that our laboratory can determine aflatoxin (B 1 , B 2 , G 1 , G 2 ) with an acceptable accuracy Use of AOAC method, we can determine the concentration of aflatoxin in a range from 0.3 to 20 ng/g sample
Key words: HPLC, materials, animal feeds
Đặt vấn đề Aflatoxin là sản phẩm từ loài nấm độc có tên là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, những loài nấm mốc có khả năng sinh độc này tồn tại, phát triển trong hạt ngô, đậu, lạc, hạt gòn… Điều kiện tốt nhất cho loài nấm mốc phát triển ở trong kho là
25-320C và độ ẩm trên 85% Với hàm lượng aflatoxin 100-400 µg/kg (ppb) đã có khả năng gây bệnh cho các loài vật nuôi như các bệnh về gan, với các con vật nuôi nhỏ thì rất nhạy với aflatoxin, đặc biệt là thuỷ cầm Chỉ với nồng độ aflatoxin >400 µg/kg (ppb) thì đã có thể gây chết vật nuôi (Van Egmond và cs., 1995)
ở Việt Nam với khí hậu nóng, ẩm là điều kiện tốt cho nấm mốc phát triển trên các loại nông sản, thực phẩm Nó là một nguyên nhân lớn gây giảm sức cạnh tranh của ngành chăn nuôi trong nước Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định độc
tố nấm mốc aflatoxin B1, B2, G1, G2 bằng máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để đảm bảo chọn lọc được các nguyên liệu sạch đáp ứng xuất, nhập khẩu cũng như phục vụ sản xuất thức ăn trong nước
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
ở đây chúng tôi tiến hành xác định aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, với tiêu chuẩn AOAC (AOAC-chapter 19, P.3-5-2000) (Mary W Truckses 1990) Dựa vào tính chất phân bố của các độc chất trong pha động và pha tĩnh khác nhau, chúng có
sự tương tác khác nhau do đó mà các chất khác nhau sẽ tách ra theo thời gian khác nhau trong cột tách Sau đó aflatoxin được phát hiện nhờ đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 ng/g cho mỗi aflatoxin B1,B2,G1,G2 Dùng đường chuẩn
Trang 2của từng loại aflatoxin mà ta tính được nồng độ của chúng, phương pháp đòi hỏi phải sạch mẫu để chạy trên máy sắc ký lỏng
Thông thường người ta dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch để làm sạch mẫu nghĩa là cho mẫu qua cột làm sạch, cột có đặc tính giữ lại aflatoxin trong cột, sau đó dùng accetontril rửa phân giải chất aflatoxin ra (Leo M.L Nollet, 1992) Phương pháp này đỏi hỏi lượng hoá chất rửa giải lớn từ 30 đến 50ml và làm khô mẫu bằng khí nitơ Dùng mẫu cho chạy trên máy để xác định hàm lượng aflatoxin
ở đây chúng tôi sử dụng cột làm sạch Mycosep # 226 columns có tác dụng ngược lại nghĩa là cột có tác dụng cho độc chất (aflatoxin, zearelerone, deoxynivalenol) đi qua còn giữ lại tạp chất với khả năng thu hồi của cột là 98,4% với aflatoxin và lượng mẫu đem làm khô chỉ có 1ml
Quy trình phân tích
Lắc với 100ml accetonitril: H 2 O
(9: 1)
Làm sạch mẫu bằng cột mycosep #226
(3000 vòng/phút, 10 phút)
Được dịch mẫu đã làm
sạch
Làm khô bằng nitơ Hàm lượng B1,
HPLC
Hoà tan mẫu với 0,1ml trifluoroacetic+ 0,9ml H 2 O:
acetone (9: 1) Thiết bị, hoá chất
Thiết bị
Máy sắc ký lỏng cao áp; Cột tách C18; Cột làm sạch mycosep #226; Đầu dò huỳnh quang; Máy ly tâm chân không
Hoá chất
Accetonitril; Methanol; Trifluoroacetic; Acetone
Nguyên lý hoạt động
Xác định độc chất Aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp với tiêu chuẩn AOAC (AOAC-chapter 19, P.3-5-2000)
Dựa vào tính chất phân bố của aflatoxin trong pha động và pha tĩnh khác nhau, chúng
có sự tương tác khác nhau do đó mà các chất khác nhau sẽ bị tách ra theo thời gian khác nhau trong cột tách Sau đó aflatoxin được phát hiện nhờ đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 ng/g cho mỗi aflatoxin Dùng đường chuẩn của từng loại aflatoxin mà ta tính được nồng độ của chúng, phương pháp đòi hỏi phải làm sạch mẫu để chạy trên máy sắc ký lỏng ở đây chúng tôi sử dụng cột làm sạch Mycosep #226 columns có tác dụng cho độc chất (aflatoxin, zearelerone, deoxynivalenol) đi qua, giữ lại tạp chất với khả năng thu hồi của cột là 98,4% với aflatoxin và lượng mẫu đem làm khô
Trang 3là 1ml Hoà tan mẫu với 0,1ml trifluoroacetic + 0,9ml H2O: acetone Phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp với
- Cột tách C18 (250mm, 4,6mm, 5mm)- Tốc độ dòng 0.8ml/phút
- Pha động H2O: Methanol (3: 2)
- Đầu dò huỳnh quang (l ex = 365,l cm =450nm)
- Lượng bơm mẫu 20ml
- Nhiệt độ cột tách 400C
* Đối tượng xác định độc chất là các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi
- Khô dầu đậu tương, khô dầu lạc
- Cỏ khô, phụ phẩm nông nghiệp
- Các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm
Kết quả và thảo luận Sắc đồ Aflatoxin
Hình 1- Sắc đồ aflatoxin chuẩn được chạy trên máy
Qua sắc đồ của aflatoxin chuẩn cho thấy khả năng tách các aflatoxin là rất tốt Chúng tôi tiến hành chạy 5 lần cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu < 2%
và của diện tích peak là <5%
Hình 2- Sắc đồ aflatoxin chuẩn ở các nồng độ khác nhau 5;10; 20ppb
5 ppb
10 ppb
20 ppb
Trang 4Tiến hành xây dựng đường chuẩn ở các nồng độ 5; 10; 20ppb để lập đường chuẩn Qua đó thấy rằng độ tuyến tính các nồng độ khác nhau của các aflatoxin là rất tốt R đều đạt 0,999 Kết qủa này cho thấy rằng sự ổn định của máy HPLC là rất cao
Hình 3- Sắc đồ aflatoxin chuẩn ở các nồng độ khác nhau Chúng tôi đã tiến hành xử lý mẫu trên các loại nguyên liệu, thức ăn chăn nuôi và cho kết quả tốt: Khả năng tách peak tốt và hầunhư không có peak lạ
Trang 5Hình 4- Sắc đồ aflatoxin trong các loại nguyên liệu thức ăn chăn nuôi
Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độ thu hồi của tất cả quá trình phân tích (xác định độ sai số hệ thống của phương pháp) chúng tôi tiến hành chạy mẫu chuẩn (mẫu thêm một lư-ợng chuẩn đã biết 2,5ppb) với 5 lần lặp lại Từ đó tính được độ lệch trung bình so với giá trị thực tế là ± 10% cho kết quả tốt như phương pháp đưa ra là độ thu hồi từ 90,6 đến 100% Kết quả này hoàn toàn phù hợp với TCVN (TCVN 6910: 1: 2001) (2001)
Bảng 1: Kiểm tra độ thu hồi khi thêm 2,5ppb của mỗi loại aflatoxin vào nguyên liệu
Loại độc chất aflatoxin µg/kg (ppb)
Tên mẫu
Bột sắn
Afla B 1
Afla G 1
Khô dầu lạc Afla B1
Afla B 2
Trang 6Mẫu ngô 0 5.7845 0 2.8526
Bảng 2: Kiểm tra độc tố aflatoxin trong một số mẫu ngô (ppb)
Tên độc chất (ppb)
Tên mẫu
Bảng 3: Thành phần độc chất trong khô đỗ (ppb)
Bảng 4: Thành phần độc chất trong thức ăn chăn nuôi (Đơn vị: ppb)
Trang 7Tên mẫu Aflatoxin B 1 Aflatoxin B 2 Aflatoxin G 1 Aflatoxin G 2
Kết luận
Đã xây dựng được quy trình tối ưu cho phương pháp xác định độc chất aflatoxin B1,
B2, G1, G2 trong các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi
Phòng Phân tích đã phân tích được thành phần độc chất aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi
Các thông số kỹ thuật, độ chính xác đều phù hợp với phương pháp phân tích và hãng sản xuất
Tài liệu tham khảo
Leo M.L Nollet 1992 Food analysis by HPLC
Mary W Truckses 1990 AOAC Methods (17th Version) 2000 chapter 19,.P: 3 - 5
TCVN 6910:1: 2001 (ISO: 5725-1:1994) 2001 Độ chính xác của phương pháp đo và kết quả đo
Van Egmond H.P, Heisterkamp S.H và Paulsh W.E.E.C 1995 Xác định aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi, phụ phẩm và các chất nhiễm bẩn /
