Tuy nhiên, các loại vi rút chỉ có thể tồn tại, phát triển được trong các tế bào sống và trong điều kiện môi trường thích hợp.. Theo cách này thì sản xuất chế phNm NPV để trừ sâu hại khó
Trang 1TÌM HIỂU KỸ THUẬT NHÂN SINH KHỐI TẾ BÀO
SÂU KHOANG (S litura)
Lê Văn Trịnh
SUMMARY
Identification of culture technologies on cell propagation of S litura
Some trials to identify necessary factors for insect cell culture of Spodoptera litura have been done
in last year The result of trails had indicated that the medium of Ex-Cell 14420 with 10% FBS was appropriate for development of insect cell culture with density of cells reached to 4,2 x 1010 cells per mililit When cell culture with this medium including 10% FBS at pH= 7,0, the density of cells was as 3,6 x 1010 after six days of culturing If cells cultured in medium with pH were 6,5 and 7,5, the density of cells was significantly decreased Among of 5 mediums without FBS have been tested, it was identified that the medium of Ex- Cell 14420 was considered to be most appropriate for cell culture with its density up to 3,2 x 1010 cell/ml
Keywords: Spodoptera litura, insect cell culture, cell propagation
I §ÆT VÊN §Ò
Các chế phNm sinh học sử dụng tác nhân
vi rút NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) đều
rất chuyên tính và có hiệu quả cao trong
phòng trừ sâu khoang nói riêng và các sâu
hại cây trồng nông, lâm nghiệp nói chung
Tuy nhiên, các loại vi rút chỉ có thể tồn tại,
phát triển được trong các tế bào sống và
trong điều kiện môi trường thích hợp Vì
vậy, việc sản xuất chế phNm vi rút đòi hỏi
phải được thực hiện trên cơ thể sâu sống
hoặc trên các mô, tế bào sâu hại còn sống
Lâu nay, việc sản xuất NPV vẫn tiến
hành theo phương pháp thủ công, bằng cách
nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm vi
rút NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền
lọc và đem ra sử dụng Theo cách này thì
sản xuất chế phNm NPV để trừ sâu hại khó
có thể thực hiện với qui mô công nghiệp, vì
để nuôi được số lượng lớn một loài sâu hại
phục vụ sản xuất chế phNm là một vấn đề
hết sức khó khăn và phải có đủ điều kiện về
nhà xưởng, trang thiết bị
Ứng dụng công nghệ nuôi nhân sinh khối tế bào côn trùng để sản xuất chế phNm NPV với qui mô công nghiệp đã và đang bắt đầu phát triển tại một số nước trên thế giới Trong thời gian qua, chúng tôi đã tìm hiểu theo định hướng này, kết quả thu được bước đầu có nhiều triển vọng, mở ra định hướng mới trong việc ứng dụng công nghệ
tế bào để phát triển chế phNm sinh học bảo
vệ cây trồng
II VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU
1 Vật liệu nghiên cứu
- Thực liệu dòng tế bào sâu khoang được phát triển từ mô phôi của sâu khoang
- Các loại môi trường nuôi nhân tế bào côn trùng, các loại kháng sinh đặc dụng (như Gentamicine, Fujione) và huyết thanh phụ trợ FBS (fetal bovin serum) trong nuôi nhân do Công ty In-Vitrogen cung cấp
- Dụng cụ nuôi cấy tế bào, như: Bình nuôi cấy lọc khuNn loại 25 cm2 và 75 cm2
Trang 22 Phương pháp nghiên cứu
Việc nghiên cứu kỹ thuật nuôi nhân
sinh khối tế bào được tiến hành theo
phương pháp của Granados et al (2007) và
Agathos (1994) Các thí nghiệm được tiến
hành với các công thức môi trường có bổ
sung thành phần bổ trợ FBS khác nhau
Nhắc lại 5 lần, mỗi lần nhắc lại là 1 bình
Tế bào được nuôi cấy trong bình cổ vếch
Corning lọc khuNn có diện tích 25 cm2
Nguồn tế bào cho thí nghiệm có hàm lượng
1,5 x 107 tế bào/ml Sau 6 ngày nhân nuôi ở
nhiệt độ ổn định tùy theo từng thí nghiệm
Sau đó, theo dõi mật độ tế bào trong các lần
nhắc lại
III KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
1 Tỷ lệ thành phần huyết thanh bổ trợ
cho phát triển tế bào
Tiến hành thí nghiệm nuôi nhân tế bào
sâu khoang trên 2 loại môi trường có chứa
các thành phần huyết thanh bổ trợ khác
nhau Kết quả nêu trong bảng 1 cho thấy khi
nuôi nhân tế bào trên môi trường Ex-Cell
14420 có chứa 10% chất bổ trợ FBS thì hàm
lượng tế bào đạt mức cao nhất, đạt tới 4,2 x
1010 tế bào trong 1 mililit Đồng thời, có tỷ
lệ tế bào sống đạt tới 97,2% và tỷ lệ tế bào
có hình dạng tiêu chuNn đạt tới 82,3%
Trong khi đó, nếu nuôi nhân tế bào trong môi trường Ex-Cell 14420 có chứa 10% huyết thanh bò thì cũng đạt hàm lượng
tế bào khá cao, tới 3,1 x 1010 tế bào/ml, tỷ lệ
tế bào sống đạt tới 92,5% và tỷ lệ tế bào tiêu chuNn đạt được là 72,6% Trong khi đó, nếu không có 10% chất bổ trợ (FBS hoặc huyết thanh bò) mà chỉ có môi trường Ex-Cell 14420 thì cũng chỉ đạt hàm lượng tế bào là 2,7 x 1010 tế bào/ml và tỷ lệ tế bào sống đạt 96,6% và tỷ lệ tế bào tiêu chuNn đạt 80,3%
Khi nuôi nhân trên môi trường Schneider
0146 cũng diễn ra xu hướng tương tự như đối với việc nuôi nhân tế bào trong môi trường Ex-Cell 14420 Khi nuôi nhân tế bào trong môi trường Schneider 0146 có bổ sung 10% FBS thì hàm lượng tế bào đạt khá cao, lên tới 2,6 x 1010 tế bào/ml và đạt tỷ lệ tế bào sống tới 95,5% và tỷ lệ tế bào tiêu chuNn tới 78,3% Còn sử dụng 10% huyết thanh bò thì hàm lượng tế bào đạt 2,4 x 1010 tế bào/ml và
tỷ lệ tế bào sống đạt 89,1% và tỷ lệ tế bào tiêu chuNn đạt 65,6% Nếu chỉ dùng môi trường nuôi nhân là Schneider 0146 không có 10% thành phần bổ trợ thì chỉ đạt hàm lượng 1,2 x
1010 tế bào/ml với tỷ lệ tế bào sống là 94,5%
và tỷ lệ tế bào có hình dạng tiêu chuNn chỉ đạt 78,0%
Bảng 1 Hàm lượng tế bào sau nuôi nhân trên các môi trường chứa huyết thanh khác nhau
(Viện BVTV, 2010)
Công
thức Môi trường nuôi nhân
Hàm lượng tế bào (tb/ml)
% tế bào sống
% tế bào tiêu chuẩn
1 Ex-Cell 14420 chứa 10% FBS 4,2 x 1010 d 97,2 82,3
2 Ex-Cell 14420 chứa 10% huyết thanh bò 3,1 x 1010 c 92,5 72,6
3 Schneider 0146 chứa 10% FBS 2,6 x 1010 b 95,5 78,3
4 Schneider 0146 chứa 10% huyết thanh bò 2,4 x 1010 ab 89,1 65,6
5 Ex-Cell 14420 (Đ/c 1) 2,7 x 1010 b 96,6 80,3
6 Schneider 0146 (Đ/c 2) 1,2 x 1010 a 94,5 78,0
Trang 3Bảng 1 cho thấy, môi trường Ex-Cell
14420 có chứa 10% thành phần bổ trợ là
FBS hoặc huyết thanh bò để nuôi nhân tế
bào sâu khoang là rất thích hợp hơn so với
môi trường Schneider Với các môi trường
này việc nuôi nhân tế bào sâu khoang có thể
cho phép đạt tương ứng là 3,1 x 1010 và 4,2 x
1010 tế bào/ml Tuy nhiên, trong thực tế nếu
sử dụng huyết thanh bò sẽ găp nhiều khó
khăn trong việc đảm bảo tiêu chuNn chất
lượng ổn định
2 Điều kiện pH của môi trường nuôi nhân
Điều kiện pH của môi trường nhân nuôi
có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát
triển của tế bào Theo Freshney (1987) và
Weiss et al (1981), hầu hết các loại tế bào
côn trùng trong quá trình phát triển số
lượng đều yêu cầu pH môi trường ở mức
trung tính Nếu điều kiện của môi trường
chỉ đạt pH ≤ 6,0 kết hợp với nhiệt độ nuôi
cấy thấp ≤ 200C thì các enzym tái tổ hợp
không hoạt động và quá trình phân chia tế
bào không diễn ra Ngược lại, nếu pH cao
(pH ≥ 7,2) kết hợp nhiệt độ ≥300C thì quá
trình phân chia tế bào bị ức chế vì các
enzym bị phân rã
Nghiên cứu khả năng phát triển số
lượng tế bào trong điều kiện pH môi
trường nuôi nhân khác nhau và được điều
chỉnh trước khi nuôi nhân bằng NaOH Tế
bào được nuôi cấy trong môi trường
Ex-Cell 14420 và Schneider có chứa 10%
thành phần bổ trợ FBS Nguồn tế bào khi
đưa vào thí nghiệm có hàm lượng 2,1 x 106
tế bào/ml theo tỷ lệ dịch tế bào và môi
trường là 1: 3
Kết quả thu được sau 6 ngày nhân nuôi (Bảng 2) cho thấy khi pH môi trường nuôi nhân là 7,0 hoặc 7,5 thì hàm lượng tế bào tăng lên rõ rệt ở cả 2 loại môi trường Với môi trường nuôi nhân là Ex-Cell
14420 có hoặc không bổ sung FBS thì sau
6 ngày ở điều kiện pH = 6,5 đạt hàm lượng tế bào tương ứng là 6,9 x 109 và 5,9
x 109 tế bào/ml Nhưng khi nuôi nhân ở môi trường pH = 7,0 thì hàm lượng tế bào tăng lên một cách đáng kể, đạt tới 3,6 x
1010 và 3,2 x 1010 tế bào/ml (tương ứng)
và khi pH = 7,5 thì mật độ tế bào có giảm
đi, đạt 1,2 x 1010 và 1,0 x 1010 tế bào/ml (tương ứng)
Còn với môi trường nuôi nhân tế bào là Schneider 0146 thì hàm lượng tế bào ở pH môi trường là 7,0 và 7,5 cũng cao hơn đáng
kể so với hàm lượng tế bào thu được khi nuôi nhân ở môi trường có pH = 6,5 Tương ứng với pH = 6,5 thì hàm lượng tế bào ở môi trường Schneider có thêm 10% FBS là 1,4 x
109 tế bào/ml và không bổ sung thêm 10% FBS là 1,0 x 109 tế bào/ml Khi nuôi nhân bằng môi trường này có bổ sung 10% FBS ở
pH = 7,0, thì sau 6 ngày hàm lượng tế bào đạt được là 2,1 x 109 tế bào/ml và ở môi trường không có FBS thì hàm lượng tế bào đạt được là 1,3 x 109 tế bào/ml Khi pH = 7,5 thì số liệu tương ứng là 0,8 và 0,7 x 1010 tế bào/ml
Như vậy, tùy theo từng loại môi trường nuôi cấy khác nhau hàm lượng tế bào thu được có khác nhau, nhưng điều kiện pH của môi trường nuôi nhân thích hợp là 7,0 Điều này cũng phù hợp với công bố của Freshney R (1987)
Trang 4Bảng 2 Hàm lượng tế bào thu được khi môi trường nuôi nhân có pH khác nhau
(Viện BVTV, 2010)
Công
thức Môi trường nuôi nhân
Hàm lượng tế bào (tb/ml)
1 Ex-Cell 14420 + 10% FBS 6,9 x 109 3,6 x 1010 1,2 x 1010
2 Ex-Cell 14420 5,6 x 109 3,2 x 1010 1,0 x 1010
3 Schneider 0146+ 10% FBS 1,4 x 109 2,1 x 1010 0,8 x 1010
4 Schneider 0146 1,0 x 109 1,3 x 1010 0,7 x 1010
3 Môi trường thích hợp cho nuôi nhân
tế bào sâu khoang
Tiến hành đánh giá khả năng phát triển
sinh khối tế bào ở các môi trường khác
nhau không có 10% huyết thanh bổ trợ
FBS Kết quả theo dõi nêu ở bảng 3 cho
thấy ở nhiệt độ nuôi nhân là 270C tế bào
phát triển tốt ở môi trường Ex- Cell 14420 đạt tới mật độ 3,02 x 1010 tế bào/ml, sau đó
là môi trường Schneider 0146 đạt mật độ 1,46 x 1010 tế bào/ml Với các môi trường IPL-41; TNM- FH và môi trường TC-100 cho hiệu quả nhân sinh khối tế bào thấp hơn, với mật độ tế bào tương ứng là 1,60 x
109 ; 1,68 x 109 và 0,96 x 109 tế bào/ml
Bảng 3 Mật độ tế bào ở các môi trường nuôi nhân khác nhau (Viện BVTV, 2010)
Công thức thí nghiệm Môi trường nuôi nhân Mật độ tế bào sau 6 ngày nuôi nhân (tế bào/ml)
1 Ex- Cell 14420 3,02 x 1010 c
2 Schneider 0146 1,46 x 1010 d
3 IPL- 41 1,60 x 109 b
4 TNM- FH 1,68 x 109 b
Như vậy, trong số 5 loại môi trường tham
gia thí nghiệm, khi nhân nuôi tế bào ở
Ex-Cell 14420 nhiệt độ 270C thì môi trường Ex-
Cell 14420 cho hiệu quả nhân sinh khối tế
bào tốt nhất Sau đó là môi trường Schneider
0146 Còn các môi trường IPL-41; TNM-FH
và TC-100 cho hiệu quả thấp hơn hẳn Kết
quả thí nghiệm này cũng chứng tỏ việc bổ
sung huyết thanh bổ trợ là cần thiết giúp cho
quá trình phát triển sinh khối của tế bào sâu
khoang đạt hiệu quả cao như của Granados và
Mc Kenna (1995) đã chỉ rõ
IV KÕT LUËN
1 Khi nuôi nhân tế bào trên môi
trường Ex-Cell 14420 có chứa 10% chất
bổ trợ FBS thì hàm lượng tế bào đạt mức cao nhất, đạt tới 4,2 x 1010 tế bào trong 1 mililit, tỷ lệ tế bào sống đạt tới 97,2% và
tỷ lệ tế bào có hình dạng tiêu chuNn đạt tới 82,3%
2 Với môi trường nuôi nhân là Ex-Cell 14420 có hoặc không bổ sung FBS thì sau 6 ngày ở điều kiện pH = 6,5 đạt hàm lượng tế bào tương ứng là 6,9 x 109 và 5,9
x 109 tế bào/ml N hưng ở môi trường pH = 7,0 thì hàm lượng tế bào đạt tới 3,6 x 1010 khi có bổ sung 10% FBS và đạt 3,2 x 1010
tế bào/ml nếu không bổ sung 10% FBS và khi pH = 7,5 thì mật độ tế bào giảm đi, chỉ đạt 1,2 x 1010 và 1,0 x 1010 tế bào/ml (tương ứng)
Trang 53 Trong số 5 loại môi trường tham gia
thí nghiệm, thì môi trường Ex- Cell 14420 đạt
cao nhất, tới mật độ 3,02 x 1010 tế bào/ml
Sau đó là môi trường Schneider 0146, đạt
1,46 x 1010 tế bào/ml Các môi trường
IPL-41; TN M- FH và môi trường TC-100 cho
hiệu quả nhân sinh khối tế bào thấp hơn, với
mật độ tế bào tương ứng là 1,60 x 109 ; 1,68 x
109 và 0,96 x 109 tế bào/ml
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Viện Bảo vệ thực vật 2001 Báo cáo
tổng kết đề tài khoa học cấp Nhà nước
KHCN.02.07B (1996-2000): Nghiên
cứu áp dụng công nghệ vi sinh (vi
khuNn, vi nấm, virut) để sản xuất chế
phNm sinh học BVTV trong phòng trừ
sâu hại cây trồng 134 trang
2 Việt H T., Cảm 4.V và nnk 2002 Một
số kết quả nghiên cứu về N PV (N uclear
Polyhedrosis Virus) và khả năng sử
dụng trong phòng trừ sâu hại cây trồng
Tuyển tập công trình nghiên cứu bảo vệ
thực vật 2000- 2002 N XB N ông
nghiệp, Hà N ội, Trang 113- 130
3 Agathos S.4 1994. Large scale insect
cell production Book: Inscet Cell
Maramorosch K and Mclntosh CRC
Press, Tokyo Pg 89- 103
4 Elanchezyan K 2009 Insect cell culture
and biotechnology Current Biotica
Vol.3 N o.3 2009 Tamil N adu
Agriculturl University Publising House
Pg 458- 489
5 Freshney R 1987 Culture of animal
cell Manual of basic technique Second
edited; Wiley- Liss, N ew York 397 pages
6 Granados R.R and Mc Kenna K.A
1995 Insect cell culture methods and
their use in virus research Baculorvirus expression systems and biopesticides Editors: Shuler M.L., Wood H.A., Granados R.R., Hammer D.A Wiley - Liss, Inc N ew York 1995 Pg 13-40
7 Maiorella B., Inlow D., Shauger A Ad Harano D 1988 Large scale insect cell
culture for recombinant protein production Biotechnology Journal N o
6 (1988) Pg 1406-1410
8 Weiss S.A., Smith G.C., Kalter S.S and Vaughn J.L 1981 Improved method for
the production of insect cell cultures in large volume In Vitro Jounal N o 17
Pg 495- 502
Người phản biện:
TS Nguyễn Văn Vấn
Trang 6T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6
Trang 7T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
