Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống hoa violet châu Phi (Saintpaulia) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào ppt

Khi cuộc sống đang ngày càng được đô thị hoá, các loại hoa trồng chậu đã góp phần đáng kể trong việc cải tạo môi trường sống, đáp ứng nhu cầu trang trí, thay đổi không gian sống và làm c

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA VIOLET CHÂU PHI (Saintpaulia)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

Lê Đức Thảo1, Nguyễn Thị Kim Lý1

Summary

A study on rapid propagation protocol of Violet Châu Phi (Saintpaulia)

by tissue culture

Study on rapid propagation protocol of Violet Chau Phi (Saintpaulia) by tissue culture showed that

initial material is tender leaves The steriliration by HgCl2 0,1% in 6 minutes is the highest effect

MS medium + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l charcoal with supplementation of 1,0 mg/l BAP

is suitable to form callus from Violet Châu Phi leaves (94,45%) The optimal culture medium for regeneration and shoot multiplication from callus is MS medium + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza +

2 g/l charcoal supplemented with 0,3 mg/l BAP The best medium for root induction from invitro shoots was MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l charcoal with addition of 0,3 mg/l

, 100% shoots inducted roots from this medium with 37,8 roots/shoot and average length was 0,65 cm In nursery, the best suitable substrate for plantlets was coconut fiber with surviving ratio 100%, the high plant 3,53 cm and number leaves/plant 9,4 after one week observed

Keywords: Saintpaulia, rapid propagation, nursery, coconut fiber, plantlets, substrates

I ĐẶT VẤN ĐỀ1

Ngày nay, bên cạnh các loại hoa cắt,

các loại hoa trồng chậu trang trí ngày càng

được ưa chuộng và phổ biến, đặc biệt ở các

nước phát triển Khi cuộc sống đang ngày

càng được đô thị hoá, các loại hoa trồng

chậu đã góp phần đáng kể trong việc cải

tạo môi trường sống, đáp ứng nhu cầu

trang trí, thay đổi không gian sống và làm

cho cuộc sống con người gần gũi với thiên

nhiên hơn Có rất nhiều loại hoa trồng

chậu phổ biến và được người tiêu dùng ưa

chuộng như Begonia, Cineraria, Geranium,

Saintpaulia, Trong đó, cây Saintpaulia

hay còn gọi là Violet Châu Phi là loại cây

đẹp, đa dạng về màu sắc và đã được Viện

Di truyền Nông nghiệp nhập nội, thử

1

Viện Di truyền Nông nghiệp

nghiệm Kết quả cho thấy chúng sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện sinh thái Việt Nam Để đáp ứng việc cung cấp giống cho sản xuất với số lượng lớn, cây con khỏe và sạch bệnh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng qui trình nhân nhanh

giống Violet Châu Phi (Saintpaulia) bằng

phương pháp nuôi cấy mô tế bào

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu và mẫu ban đầu là những mNu

lá non, lá bánh tẻ của cây Violet Châu Phi kích thước mẫu 1 cm2

2 Phương pháp nghiên cứu

Cắt từ cây Violet Châu Phi các lá non, bánh tẻ rửa sạch bằng xà phòng, sau đó cắt

lá thành các mNu nhỏ cho vào các bình tam

giác rồi cho vào bầu cấy và tiến hành thao

tác khử trùng Trước tiên, rửa mẫu bằng

nước cất (đã khử trùng) 2 - 3 lần, khử trùng

sơ bộ bằng cồn 700C trong 30 giây Sau đó

loại bỏ hết nước và khử trùng bằng HgCl2

và H2O2 theo các công thức thí nghiệm Lấy

mẫu ra khỏi dung dịch khử trùng, tráng 3 -

5 lần bằng nước cất (đã khử trùng) rồi cấy

vào môi trường MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l

saccaroza Các mẫu lá sau 2 tuần theo dõi

được cấy chuyển vào môi trường tạo callus,

môi trường cơ bản: MS + 7,0 g/l agar + 20

g/l saccaroza + 2 g/l than Tiếp tục nghiên

cứu môi trường tạo chồi và ra rễ, tạo cây

hoàn chỉnh Cây con sau khi đưa ra khỏi

bình nuôi cấy được rửa sạch môi trường bám

dính ở rễ bằng nước sạch, sau đó giâm vào

khay bằng xốp với các giá thể khác nhau

- Điều kiện nuôi cấy: N hiệt độ nuôi cấy

25 - 280C, ánh sáng 1500 - 2000 Lux, thời gian 8 giờ/ngày

- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 3 lần nhắc lại Số liệu được xử lý thống kê trên chương trình IRRISTAT

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 %ghiên cứu phương pháp khử trùng hoa Violet Châu Phi

Đề tài đã sử dụng nguồn mẫu ban đầu

từ lá cây Violet Châu Phi để tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm Mẫu được khử trùng bằng hợp chất HgCl2 và H2O2 Sau 2 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả thể hiện trong (bảng 1)

Bảng 1 Hiệu quả của các phương pháp khử trùng

Ghi chú: CT1: HgCl2 0,1% trong 3 phút; CT2:HgCl2 0,1% trong 5 phút; CT3: HgCl2 0,1% trong 7 phút; CT4: H2O2 15% trong 10 phút; CT5: H2O2 20% trong 10 phút; CT6: H2O2 25% trong 10 phút Qua bảng 1 cho thấy: Hiệu quả khử

trùng mẫu giữa các công thức có sự biến

động như sau:

- Đối với chất khử trùng H2O2: Khi

khử trùng ở các nồng độ khác nhau với

cùng thời gian khử trùng là 10 phút thì tỷ

lệ mẫu sống khác nhau, tỷ lệ mẫu chết

tăng tỷ lệ thuận với nồng độ khử trùng và

tỷ lệ nhiễm lại tỷ lệ nghịch với nồng độ

khử trùng Tỷ lệ mẫu sống, sạch cao nhất khi khử trùng ở nồng độ 25% đạt 33,3%

- Đối với chất khử trùng HgCl2: Khi khử trùng ở các thời gian khác nhau với cùng nồng độ là 0,1% có tỷ lệ sống của các mẫu khác nhau Tỷ lệ mẫu sống, sạch cao nhất khi khử trùng trong 5 phút đạt 60%

Như vậy, phương thức khử trùng tốt nhất

là sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian khử

trùng là 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất

2 %ghiên cứu môi trường tạo callus hoa

Violet Châu Phi

Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tạo callus từ các mẫu lá sau khi khử trùng Sau 3 tuần nuôi cấy, kết quả được thể hiện ở bảng 2

Bảng 2 Ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon)

đến quá trình hình thành callus

Ghi chú: CT1: 0 BAP (mg/l) + 0 α − ΝΑΑ (mg/l); CT2: 0,5 BAP (mg/l) + 0 α − ΝΑΑ (mg/l); CT3: 0,5

BAP (mg/l) + 0,5 α − ΝΑΑ (mg/l); CT4: 1,0 BAP (mg/l) + 0 α − ΝΑΑ (mg/l); CT5: 1,0 BAP (mg/l) + 0,5 α − ΝΑΑ (mg/l); CT6: 1,5 BAP (mg/l) + 0 α − ΝΑΑ (mg/l); CT7: 1,5 BAP (mg/l) + 0,5 α − ΝΑΑ (mg/l)

Qua kết quả ở bảng 2 cho thấy:

Các phytohormon có ảnh hưởng rất tích

cực đến quá trình hình thành callus Khi cấy

các mẫu đã khử trùng vào môi trường MS

không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng thì

tỷ lệ mẫu tạo callus thấp đạt 59,09%, mặt

khác hình thái callus không tốt

Khi cấy mẫu vào môi trường có bổ sung

0,5 mg/l BAP thì tỷ lệ mẫu tạo callus tăng

cao, chiếm 86,36%, hình thái callus tốt nhưng

kích thước vẫn nhỏ Khi bổ sung cả 0,5 mg/l

α−ΝΑΑ thì tỷ lệ mẫu tạo callus giảm đi còn

60%, hình thái callus không được tốt, callus

màu xanh vàng, kích thước lại nhỏ

Khi tăng nồng độ BAP lên 1,0 mg/l thì

tỷ lệ mẫu tạo callus đạt 94,45%, hình thái

callus tốt, callus có màu xanh, kích thước

lại lớn và rắn Nhưng khi bổ sung 0,5 mg/l

α−ΝΑΑ thì tỷ lệ mẫu tạo callus thấp, hình

thái callus không được tốt có màu xanh, kích thước nhỏ, rắn

Khi tăng nồng độ BAP lên 1,5 mg/l thì cả

2 công thức (có bổ sung α − ΝΑΑ và không

bổ sung α - NAA) có tỷ lệ mẫu tạo callus giảm xuống Ở công thức CT6 là 81,8% và công thức CT7 có bổ sung 0,5 mg/l

α − ΝΑΑ có 22,73%, hình thái kém hơn, callus thường có màu vàng nâu và nhanh chóng chuyển sang màu nâu đen

Trong 7 công thức thí nghiệm thì CT4 (1,0 mg/l BAP, không bổ sung NAA) là thích hợp nhất để tạo callus từ lá bánh tẻ cây hoa Violet Châu Phi

3 %ghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến quá trình tái sinh và nhân nhanh chồi từ callus

Các callus tạo thành được chuyển sang

các môi trường có nồng độ BAP khác nhau

để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi

Sau 4 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả

thể hiện bảng 3

Bảng 3 Ảnh hưởng của BAP đến quá trình

tái sinh chồi từ callus

Công thức Tỷ lệ tái sinh

(%)

Số chồi tái sinh trung bình (chồi/mẫu)

Ghi chú: CT1: Bổ sung 0,1 mg/l BAP;

CT2: Bổ sung 0,3 mg/l BAP;

CT3: Bổ sung 0,5 mg/l BAP;

CT4: Bổ sung 0,7 mg/l BAP

Qua bảng 3 cho thấy: Ở CT1 có nồng độ

0,1 mg/l BAP cho tỷ lệ callus tái sinh chồi

73,33%, số chồi tái sinh trung bình đạt 7,73

chồi/mẫu, hình thái chồi tốt Trong công

thức CT2 có nồng độ 0,3 mg/l BAP cho tỷ lệ

callus tái sinh đạt cao nhất là 93,33%, số

chồi tái sinh trung bình cũng đạt cao nhất là 10,5 chồi/mẫu, hình thái chồi tốt 3 công thức CT3, CT4 tiếp tục tăng dần nồng độ BAP thì tỷ lệ tái sinh giảm dần tương ứng 66,67% và 46,67% Nồng độ BAP càng tăng thì càng nhiều callus sùi to và rắn chắc và không phát triển thành chồi rõ ràng, nếu để lâu một số callus chuyển sang màu nâu đen,

số lượng chồi/mẫu cũng giảm xuống tương ứng 7,1 và 4,43 chồi/mẫu

Như vậy, trong 4 công thức thí nghiệm tái sinh chồi từ callus thì công thức CT2 (bổ sung 0,3 mg/l BAP) có tỷ lệ callus tái sinh chồi là cao nhất (93,33%) và tỷ lệ chồi tái sinh đạt trung bình 10,5 chồi/mẫu cấy Hình thái chồi xanh, tốt

4 %ghiên cứu môi trường ra rễ Violet Châu Phi

Trong thí nghiệm ra rễ này chúng tôi sử dụng α− NAA để nghiên cứu sự ra rễ của chồi in vitro Sau 4 tuần nuôi cấy, chúng tôi được kết quả ở bảng 4

Công

thức

Tỷ lệ ra rễ

(%)

Số rễ/cây (cái)

Chiều dài trung bình

CT1 100 10,2 0,41 Cây cao, thân còi, lá hơi nhỏ, xanh nhạt, rễ

yếu, nhỏ, màu trắng

CT2 100 23,7 0,53 Cây thấp, thân hơi còi, lá to, xanh đậm, rễ

không đều, nhỏ, màu trắng nâu

CT3 100 27,2 0,63 Cây cao, thân mập, lá to màu xanh đậm, rễ

đồng đều, to, màu nâu

CT4 100 37,8 0,65 Cây cao, thân mập, lá to, xanh đậm, rễ đồng

đều, to, màu trắng nâu

CT5 100 19,25 0,45 Cây thấp, thân còi, lá nhỏ, xanh đậm, rễ không

đồng đều, nhỏ yếu, màu trắng

CV(%)

LSD 0,05

2,5 1,3

1,7 0,07

Ghi chú: CT1: Bổ sung 0 mg/l NAA CT2: Bổ sung 0,1 mg/l NAA; CT3: Bổ sung 0,2 mg/l NAA;

CT4: Bổ sung 0,3 mg/l NAA; CT5: Bổ sung 0,5 mg/l NAA

Qua bảng 4 cho thấy: 100% các chồi

Violet Châu Phi đều ra rễ dù được cấy

trong môi trường có bổ sung hay không

bổ sung α−NAA, điều đó chứng tỏ trong

các chồi, auxin nội sinh cũng đủ để kích

thích quá trình tạo rễ của chồi Tuy nhiên

khi bổ sung α−NAA với các mức nồng

độ thay đổi chúng tôi nhận thấy ở nồng

độ 0,3 mg/l thì số lượng rễ trung bình

được tạo ra lớn nhất đạt 37,8 rễ/cây, so

với đối chứng là 10,2 rễ/cây Về độ dài

và chất lượng rễ thì từ công thức đối

chứng, khi không bổ sung α − ΝΑΑ đến

khi bổ sung α − ΝΑΑ 0,1 mg/l - 0,3mg/l

thì độ dài và chất lượng rễ tăng lên rõ rệt

Nhưng khi tăng nồng độ α − ΝΑΑ lên

0,5 mg/l thì độ dài và chất lượng rễ giảm

Tuy nhiên theo quan sát thí nghiệm

chúng tôi nhận thấy ở các công thức có

bổ sung α − ΝΑΑ thì các rễ đều có sức

sống cao hơn so với các rễ ở công thức

đối chứng

Như vậy, môi trường bổ sung 0,3 mg/l

α − ΝΑΑ là thích hợp nhất cho việc ra rễ của chồi Violet Châu Phi

5 %ghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển, tỷ lệ sống của cây hoa Violet Châu Phi

Đây là giai đoạn đưa cây con trong nuôi cấy từ môi trường nhân tạo ra ngoài môi trường tự nhiên, chính là chuyển cây sống

từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái sống

tự dưỡng và chịu nhiều tác động của các yếu tố môi trường tự nhiên biến động (thời tiết, đất đai ) Ở giai đoạn vườn ươm, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau đến tỷ

lệ sống của cây con Các cây con được đưa

ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar bám ở rễ

và được ươm vào 4 loại giá thể Sau 3 tuần theo dõi, kết quả theo dõi được trình bày ở bảng 5

Bảng 5 Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây ngoài vườn ươm

(sau 4 tuần)

CT1: Cát; CT2: Dớn; CT3: Trấu hun; CT4: Xơ dừa

Qua bảng 5 cho thấy: Qua 4 tuần đầu

theo dõi có sự biến động về tỷ lệ sống của

cây ở các giá thể, ở giá thể cát đạt tỷ lệ thấp nhất 76,7%, trên giá thể dớn tỷ lệ sống đạt

90% Còn 2 loại giá thể trấu hun và xơ dừa

đạt 100% Về chỉ tiêu chiều cao cây và số lá

không có sự sai khác đáng kể giữa các CT

Cây trồng trên giá thể xơ dừa đạt chiều cao trung bình cao nhất 6,53 cm

Sơ đồ qui trình nhân giống hoa Violet châu Phi

T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam

7

IV KẾT LUẬN VÀ §Ò NGHN

1 Kết luận

- Vật liệu ban đầu là những mNu lá bánh tẻ cây hoa Violet Châu Phi (Saintpaulia), sử

dụng loại hóa chất khử trùng là HgCl2 0,1% với thời gian khử trùng là 5 phút cho hiệu quả khử trùng cao nhất

- Môi trường có thành phần dinh dưỡng khoáng cơ bản MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l than có bổ sung 1,0 mg/l BAP là thích hợp nhất để tạo callus từ lá cây

Violet Châu Phi (Saintpaulia) (Tỷ lệ mẫu tạo callus trên môi trường này đạt 94,45%)

- Môi trường tối ưu cho tái sinh và nhân nhanh chồi từ callus là môi trường cơ bản

MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l than có bổ sung 0,3 mg/l BAP

- Các chồi in vitro ra rễ thuận lợi nhất trên môi trường MS + 7,0 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 g/l than có bổ sung 0,3 mg/l α − ΝΑΑ, trong môi trường này 100% chồi ra

rễ, số rễ trung bình là 37,8 (rễ/chồi) và chiều dài rễ trung bình 0,65 cm

- Giá thể thích hợp nhất để thích nghi cây in vitro trong giai đoạn vườn ươm là giá thể xơ dừa với tỷ lệ sống 100%, chiều cao cây trung bình 3,53 cm và số lá/cây là 9,4 cái sau 1 tuần đầu theo dõi

2 Đề nghị

Áp dụng quy trình để sản xuất cây con giống phục vụ sản xuất

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Trần Văn Minh, 1996 Công nghệ sinh học thực vật NXB Nông nghiệp

2 6guyễn Quang Thạch, 6guyễn Thị Lý Anh và cộng sự, 2007 Giáo trình sinh học

nông nghiệp NXB Nông nghiệp

3 Bhojwani S.S and Razdan M.K, 1983 Plant tissue culture, Theory and practice,

Elsevirer science publishers, Amterdam

4 Pierik R.L.M., 1987 In vitro culture of higher plant Martinus nijhoff publishers,

Dordrech The Netherlands

%gười phản biện: Trần Duy Quý