PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG NẤM Colletotrichum GÂY BỆNH THÁN THƯ CÀ PHÊ Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI HỌC VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ Nguyễn Thanh Hà, Hoàng Thị Ngát, Nguyễn Thu Hà, Lê
Trang 1PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG NẤM Colletotrichum
GÂY BỆNH THÁN THƯ CÀ PHÊ Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI HỌC VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ
Nguyễn Thanh Hà, Hoàng Thị Ngát, Nguyễn Thu
Hà,
Lê Thị Ánh Hồng và Phạm Xuân Hội
Summary
Isolation and identification of Colletotrichum caused anthracnose disease on coffee
in Vietnam based on morphological and molecular characters
The genus Colletotrichum consists of 900 species and is responsible for anthracnose on number of crops To determine which species of Colletotrichum are present in Vietnamese coffee plantation, a total of 55 Colletotrichum isolates were isolated from 111 anthracnose disease samples on leaves, twigs and berries at coffee plantation of Ba Vi and Buon Me Thuot Twenty eight isolates from coffee berry diseases were selected for identification based on morphological characters and PCR amplification of a region in the mitochondrial small subunit (mtSSU) using NMS1/NMS2 primers Basing on morphological and physiological studies, we classified these isolates into three groups named group 1, group 2 and group 3 corresponding to C gloeosporioides, C acutatum and possible
C capsici respectively In combining with molecular analysis, we reconfirmed with group 1 and group
2 but not with group 3 The group 3 with falcate conidia was found on coffee plantation of Ba Vi However, it was unable to identify by NMS1/NMS2 primers Since, different techniques supposed to
be address to identify these isolates
Keywords: Anthracnose, Colletotrichum, Coffee berry, PCR, Identification
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Chi Colletotrichum bao gồm hơn 900
loài, có phổ ký chủ rộng, là nguyên nhân
gây bệnh thán thư trên nhiều loài cây trồng
khác nhau Tuy nhiên, hiện nay trên thế
giới chỉ phân lập được 3 loài:
Colletotrichum kahawae, C gloeosporioides
và C acutatum từ các mẫu bệnh cà phê Loài
nấm C kahawae chỉ được phát hiện ở châu
Phi; có mức độ gây bệnh rất mạnh ở các giai
đoạn của cây từ lúc ra hoa đến khi quả chín,
gây khô cành từ ngọn xuống, quả khô và
rụng hàng loạt nên thường gọi là bệnh khô
cành khô quả Thiệt hại về năng suất do nấm
C kahawae có nơi, có lúc lên đến 80% [7]
Tại Việt Nam hiện nay bệnh thán thư đã có
mặt ở tất cả các vùng trồng cà phê trên cả
nước Tỷ lệ bệnh tại một số địa điểm trồng
cà phê ở Tây Nguyên biến động từ 7,02% - 13,57% năm 1996 và tăng lên 10,25% - 19,82% năm 1997 [4] Nguyên nhân gây bệnh thán thư ở cà phê Việt Nam cho đến nay được xác định là do các loài nấm
C gloeosporioides, C acutatum và C capsici
gây ra [1] Do tính đa dạng về đặc điểm hình
thái giữa các chủng nấm Colletotrichum rất cao nên việc phân loại nấm Colletotrichum
dựa trên đặc điểm sinh lý và hình thái học vẫn gặp nhiều hạn chế Trong nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp các đặc điểm hình thái và
kỹ thuật sinh học phân tử để nhận dạng sự có
mặt của các loài nấm Colletotrichum trên cà
phê ở Ba Vì và Buôn Mê Thuột, làm cơ sở cho các nghiên cứu đa dạng di truyền và
Trang 2hướng tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả
nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cà
phê Việt Nam
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu bệnh: 111 mẫu bệnh thán thư
trên thân, lá và quả được thu thập từ năm
2006 đến năm 2007 Trong số mẫu thu
thập, 90 mẫu bệnh thu từ 8 tiểu vùng
trồng cà phê tại hai xã Sơn Đà và Tản
Lĩnh thuộc Trung tâm Nghiên cứu Cà phê
chè Ba Vì và 21 mẫu bệnh còn lại thu tại
Trại Cà phê thuộc Viện KHKT Nông Lâm
Tây Nguyên
- Mẫu đối chứng: Isolate C gloeosporioides
PR220 phân lập từ Olea Europaea (Mỹ) và
isolate C acutatum 397 phân lập từ
Fragaria x Ananssa (Mỹ)
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Phân lập các mẫu nấm
Colletotrichum
Mẫu bệnh được rửa dưới vòi nước
chảy cho trôi hết đất và chất bNn Sau đó
mẫu được khử trùng bằng NaOCl 1% trong
5 phút, tráng bằng cồn 70%, rửa bằng nước
cất 3 lần và thấm khô bằng giấy thấm Cắt
mẫu cấy với kích thước 0,5 - 0,7 mm tại
mép vùng bị bệnh (bao gồm cả vùng bệnh
và vùng không bệnh) và đặt mẫu cấy lên
đĩa môi trường PDA có chứa kháng sinh
Streptomycin (100 µg/ml) (10 mẫu
cấy/đĩa) Ủ ở nhiệt độ 220C ± 2 Sau khi
nấm mọc, tách sợi nấm chuyển sang môi
trường PDA Tạo chủng thuần bằng
phương pháp cấy bào tử đơn
2.2 hận dạng nấm
+ Dựa trên đặc điểm hình thái học: Màu
sắc khuNn lạc, hình thái bào tử được mô tả
sau 7 ngày cấy trên môi trường PDA
+ Kích thước bào tử: 25 bào tử được đo chiều dài và chiều rộng bằng kính hiển vi điện tử Leica với độ phóng đại 40 x 16 lần
Tỷ lệ chiều dài/chiều rộng được tính và được phân nhóm để thuận lợi cho mục đích
so sánh dựa theo tiêu chuNn của Sander [6]
2.3 Tốc độ phát triển của nấm
Từ các mẫu nấm 7 ngày tuổi, cắt mẫu cấy với kích thước đồng đều nhau đường kính 5 mm, đặt trên môi trường PDA để ở nhiệt độ 250C Mỗi isolate nhắc lại 3 lần
Đo đường kính phát triển của khuNn lạc hàng ngày trong 5 ngày
2.4 Tách chiết AD tổng số
Sau khi chủng nấm nuôi cấy đạt 7 ngày tuổi, tách lớp màng nấm và khối bào tử, nuôi cấy lắc (220 v/p) trong 100 ml môi trường lỏng theo Sreenivasaprasad [9] ở nhiệt độ 270C để trong 3 ngày Chúng tôi thu sinh khối và tiến hành tách chiết ADN của nấm dựa trên phương pháp của J.L Cenis (1992) [5]
2.5 Phản ứng PCR đặc hiệu
Sử dụng cặp mồi NMS1 (CAGCAGT GAGGAATATTGGTCAATG)/NMS2 (GC GGATCATCGAATTAAATAACAT) để nhân đoạn ADN đặc hiệu vùng tiểu ti thể (mtSSU)
cho mỗi loài nấm Colletotrichum [2,10] Các chủng nấm Colletotrichum được
nhận dạng bằng phản ứng PCR với việc
sử dụng cặp mồi NMS1/NMS2 và sợi khuôn là ADN tổng số của các chủng nấm Phản ứng PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng thể tích 25 µl chứa 1 µl ADN của nấm (20 - 30 ng), 2,5 µl dung môi phản ứng 10X, 0,2 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 1 mM của mỗi primer, 1U Taq polymerase (Promeaga) Chương trình chạy phản ứng PCR: Được bắt đầu ở 950C trong 3 phút; 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ được thiết lập như sau: 950C trong 1’, 500C trong 1,15’, 720C trong 2’ và cuối cùng tại
Trang 3720C trong 10’ Sản phNm PCR được tách
trên bản gen 1% agarose trong dung dịch
TBE 1X Sau khi điện di, gen được
nhuộm với ethidium bromide và quan sát
dưới đèn UV
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Phân lập nấm
Qua điều tra khảo sát, bệnh thán thư
xuất hiện chủ yếu trên quả cà phê, tuy cũng
có mặt ở các bộ phận khác của cây như lá
và cành với tần số thấp hơn Trên lá vết
bệnh là những đốm khô cháy, màu nâu hoặc
nâu tái, với những quầng đồng tâm Vết
bệnh trên quả và cành là những đốm rộng
có màu nâu, nâu đen, lõm và khô (hình 1)
Hình 1 Triệu chứng bệnh thán thư trên quả và lá cà phê
Kết quả phân lập các chủng nấm gây bệnh thán thư trên cà phê ở Ba Vì và Buôn
Mê Thuột được thể hiện ở bảng 1
Bảng 1 Các isolate Colletotrichum được phân lập tại Ba Vì và Buôn Mê Thuột
Địa điểm Mẫu bệnh thu thập Số lượng isolate nấm phân lập được
Thiệt hại do bệnh thán thư gây ra chủ
yếu từ các mẫu bệnh trên quả Vì vậy chúng
tôi chọn các isolate phân lập từ quả để phục
vụ cho các nghiên cứu tiếp theo
2 #hận dạng nấm
2.1 hận dạng nấm dựa vào đặc điểm
hình thái học
Các isolate Colletotrichum nghiên
cứu có đặc điểm hình thái và sinh lý rất
đa dạng Điểm dễ phân biệt nhất là đặc điểm bào tử của các isolate được chia thành 3 nhóm với hình thái khác nhau Nhóm 1 bao gồm 26 isolate có bào tử hình trụ thẳng, hai đầu tròn, hoặc nhọn một đầu; nhóm 2 gồm 01 isolate có bào
tử hình thuôn mảnh, nhọn hai đầu (isolate BMTQ18) và nhóm 3 là isolate với bào tử có hình lưỡi liềm (isolate BV8.80b) (hình 2)
Hình 2 Hình thái bào tử nấm Colletotrichum: (a) 9hóm 1; (b) 9hóm 2; (c) 9hóm 3
Kích thước bào tử cũng là một chỉ tiêu
quan trọng để phân loại các chủng nấm
Colletotrichum Kích thước bào tử rất đa dạng
dao động từ 12,38 - 25,26 x 3,53 - 7,46 (µm),
Trang 4nhưng phần lớn các isolate Colletotrichum với
hình thái bào tử thuộc nhóm 1 có kích thước
thuộc nhóm 6 (32,14%), các isolate còn lại rải
rác rơi vào nhóm 2 đến nhóm 9 Trong khi các
isolate Colletotrichum có hình thái bào tử
thuộc nhóm 2 (BMTQ18) và thuộc nhóm 3 (BV8.80b) đều có tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thuộc nhóm 10 Kết quả kích thước bào tử các
isolate Colletotrichum phân lập được tổng kết
ở hình 3
Hình 3 Phân nhóm bào tử nấm của các isolate Colletotrichum
theo nguyên tắc của Sanger
Dựa vào hình thái và kích thước bào tử,
chúng tôi phân loại 26 isolate thuộc nhóm 1
là loài C gloeosporioides và isolate nhóm 2
(BMTQ18) là loài C acutatum Theo Olga
[11], C acutatum có bào tử ngắn và mảnh
hơn bào tử của loài C gloeosporioides
Những kết quả nghiên cứu bệnh thán thư
trên cà phê Arabica của Kenny [7] cũng
cho thấy rằng, các loài C gloeosporioides
có bào tử hình trụ, tròn hai đầu hoặc nhọn
một đầu, còn loài C acutatum có bào tử
hình thoi
Chúng tôi nhận thấy các đặc điểm hình
thái khuNn lạc không thể hiện sự liên quan
đến hình thái bào tử Ví dụ, các isolate có
hình thái bào tử thuộc nhóm 1, khuNn lạc
rất đa dạng từ màu sắc khuNn lạc (trắng
bông, trắng bNn, trắng xám, xám, .), đến
dạng sợi nấm (bông xốp, chắc mịn ) và mép khuNn lạc phát triển đều hoặc không đều (hình 4)
Ở nhiệt độ 250C, các isolate
Colletotrichum phân lập được có tốc độ
phát triển dao động từ 4,45 mm/ngày đến 7,13 mm/ngày Trong khi hầu hết các isolate bào tử dạng 1 có tốc độ phát triển khuNn lạc lớn hơn 5,5 mm/ngày thì isolate
có bào tử thuộc dạng 2 và dạng 3 (BV8.80b) có tốc độ phát triển < 5 mm/ngày, tương ứng là 4,45 ± 0,52 mm/ngày và 4,72 ± 0,00 mm/ngày (hình 5) Theo nghiên cứu của Olga [11] và
Kenny [7] thì loài C acutatum có tốc độ
phát triển của khuNn lạc < 5 mm/ngày,
còn C gloeosporioides có tốc độ phát
triển khuNn lạc > 5 mm/ngày
Nhóm tỷ lệ chiều dài/chiều rộng
Nhóm
1
Nhóm
2
Nhóm
3
Nhóm
4
Nhóm
5
Nhóm
6
Nhóm
7
Nhóm
8
Nhóm
9
Nhóm
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Trang 5Hình 4 Một số dạng hình thái khuDn
lạc của nấm Colletotrichum:
(a) BMTQ18; (b) BV6.49; (c) BV6.50;
(d) BV4.24 (4); (e) BV1.6; (f) BV3.20 (1)
Hình 5 So sánh tốc độ phát triển của khuDn lạc
tại nhiệt độ 25 0 C
2.2 hận dạng nấm dựa vào phản
ứng PCR
Kết quả chạy PCR cho thấy tất cả các
phản ứng PCR sử dụng sợi khuôn là các ADN
tổng số isolate Colletotrichum đều cho sản
phNm PCR là các băng ADN đặc hiệu có chiều
dài trùng với chiều dài của C gloeosporioides
đối chứng (750 bpp), trừ isolate BMTQ18 có
sản phNm PCR là các băng ADN đặc hiệu có
chiều dài trùng với chiều dài của isolate
C acutatum đối chứng (650 bp) (hình 6)
Kết hợp kết quả nghiên cứu nhận dạng nấm Colletotrichum qua các chỉ tiêu hình
thái và phương pháp phân tử thông qua phản ứng PCR sử dụng cặp mồi
N MS1/N MS2 cho phép chúng tôi kết luận các isolate có bào tử thuộc nhóm 1 là loài
C gloeosporioides và isolate có bào tử
thuộc nhóm 2 là loài C acutatum
Sử dụng cặp mồi N MS1/N MS2 có thể
nhận dạng được 2 loài C gloeosporioides
và C acutatum gây hại trên cà phê
Hình 6 Kết quả nhận dạng nấm Colletotrichum gây hại trên cà phê Việt 9am thông qua phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 9MS1/9MS2 và AD9 tổng số của các chủng nấm Colletotrichum (1) và (17): Marker; (2) đối chứng C acutatum; (3) đối chứng
C gloeosporioides; (4 - 12, 15 - 16) isolate từ Ba vì; (13 - 14) isolate BMTQ18, BMTQ10
50 0bpp 750bpp
50 0bpp
75 0bpp
1 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17
Trang 6T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6
Riêng isolate có bào tử thuộc nhóm 3 (BV8.80b) không nhận dạng được bằng cặp
mồi NMS1/NMS2 vì có kích thước băng DNA trùng với kích thước băng của isolate C gloeosporioides Tuy nhiên, những đặc điểm hình thái học của isolate BV8.80b tương tự với những đặc điểm hình thái học của loài C capsici [8] Mặc dù trên thế giới, loài này
chưa được công bố liên quan đến bệnh thán thư cà phê, nhưng tại Việt Nam, TS Trần Kim Loang đã phân lập được loài này trên cà phê tại Tây Nguyên năm 1998 [3] Có thể giải thích một nguyên nhân của điều này là cà phê được trồng xen cạnh những cây chủ
của nấm C capsici Đây đang là vấn đề sẽ được quan tâm trong các nghiên cứu tiếp theo
của chúng tôi
IV KẾT LUẬN
Từ 111 mẫu cà phê bị bệnh thán thư thu thập được tại Ba Vì và Buôn Mê Thuột,
chúng tôi đã phân lập được 55 isolate Colletotrichum, trong đó chiếm phần lớn từ quả cà
phê (37 isolate) Các isolate phân lập từ quả cà phê bệnh được chúng tôi sử dụng cho các nghiên cứu nhận dạng đến cấp độ loài Bằng sự kết hợp các đặc điểm hình thái học, sinh lý học cùng với kết quả của phương pháp PCR chúng tôi đã phân loại được 26 isolate thuộc về
C acutatum, một isolate thuộc vùng Ba Vì được giả thiết là loài C capsici Trong tương
lai, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về isolate này Thêm nữa, chúng tôi còn phải tiến hành đánh giá độc tính của các isolate nấm phân lập được qua việc lây nhiễm trên
cây con
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 9guyễn Thị Hằng Phương, Lê Thị Ánh Hồng, Jamshid Fatehi và Olga Vinnere, 2003 Phân loại một số loài thuộc chi Colletotrichum thu thập từ Việt Nam và Thái Lan
Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2003 358 - 363
2 Trần Kim Loang và cộng sự, 1998 Kết quả nghiên cứu bệnh khô cành, khô quả trên
cà phê chè catimor Tạp chí Khoa học, Công nghệ và Quản lý kinh tế số 6, 253 - 255
3 Gina M Sander và Korsten L., 2003) A comparative morphological study of South African avocado and mango isolates of Colletotrichum gloeosporioides Can J Bot 81,
877 - 885
4 Kenny, M K., Galea, V.J., Scott, P.T và Price, T.V, 2006 A comparison of Colletotrichum species associated with berry diseases of Coffea arabica L Pest and
disease incursions: Risks, threats and management in Papua New Guinea Canberra, ACIAR Technical Reports No.62, 192 - 199
5 Sreenivasaprasad, S.; Averil E Brown và Mills, P.R., 1993 Coffee berry disease
pathogen in Africa: Genetic structure and relationship to the group species
Colletotrichum gloeosporioides Myco Res 97(8): 995 - 1000
Trang 7T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7
#gười phản biện: #guyễn Văn Viết
