Phương pháp nghiên cứu ghiên cứu sự ny mầm của hạt: - Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi quả lên sự nảy mầm của hạt.. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất phụ gia hữu cơ lên sự nảy mầm c
Trang 1KỸ THUẬT GIEO HẠT LAN HỒ ĐIỆP HL3 PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG MỚI
Hoàng Thị Lan Hương, Nguyễn Xuân Linh,
Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Huy Hàm Summary
Multiplication of Phalaenopsis (HL3) from seed serve selecting
and creating of new variety
Seeds of Phalaenopsis anthura Stockhon (HL3) after 170 days self - pollination were sterilirated by
H 2 O 2 15% in 20 minutes and were cultured on MT medium supplemented with 50 g potato per lit After 7 - 8 weeks, the seed germinated into protocorm (1 - 2 mm size) The protocorm developed PLBs (protocorm - like bodies) with 12 weeks depending on the growth medium supplemented with cytokinins [(kinetin (KIN) and N6 - benzyladenine (BAP)], auxin [2,4 - dichlorophenoxyacetic (2,4D)]
An optimum of 12,3 PLBs from 1 protocorm on medium supplemented with 1,5mg/l BAP and 0,3mg/l 2,4D.Upon subculture in basal MT with 50 g potato/l, the PLBs differentiated into plantlet within 8 weeks
Keywords: Phalaenopsis anthura Stockhon, self - pollination, protocorm, cytokinins, auxin, PLBs,
plantlets
MT: Vacine and Went (VW)+ 7 g/l agar + 10 g/l sugar + 3 g/l charcoal
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Lan Hồ điệp có tên gọi Phalaenopsis,
thuộc họ phụ Vandae, là một trong những
loại phong lan được trồng phổ biến trên thế
giới, chiếm 80% tổng giá trị lan bán trên thị
trường Giống Phalaenopsis gồm 21 loài,
qua kết quả chọn lọc và lai tạo, hàng năm
số lượng loài này tăng lên không ngừng
Nhân giống từ hạt của những quả tự thụ
phấn không giữ được ưu thế đồng nhất của
cây hoa lan F1 mà bị phân ly mạnh ở thế hệ
F2 Chính vì vậy, để phục vụ cho công tác
tạo giống lan Hồ điệp mới, chúng tôi đã
nghiên cứu nhân giống HL3 từ hạt
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
Giống lan Hồ điệp HL3 - là giống lai
F1 (Phalaenopsis anthura Stockhon) nguồn
gốc từ Hà Lan có hoa trắng, môi đỏ, độ
bền của hoa lâu (10 - 11 tuần), có khả năng chống chịu bệnh thối nhũn, thời gian xuất hiện ngòng hoa vào đầu tháng 12 Giống được chọn lọc và đưa ra sản xuất từ Trung tâm Hoa cây cảnh - Viện Di truyền
Nông nghiệp
2 Phương pháp nghiên cứu
ghiên cứu sự ny mầm của hạt:
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi quả lên sự nảy mầm của hạt Quả được lấy từ cây mẹ khoẻ mạnh, ở các độ tuổi khác nhau (125 ngày, 140 ngày, 155 ngày và 170 ngày) Mẫu sau khi thu thập về, được khử trùng bằng H2O2 15%, trong 20 phút và được gieo trong môi trường MT (Vacine and Went (VW) + 7 g/l agar + 10 g/l sucrose + 3 g/l than hoạt tính)
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất phụ gia hữu cơ lên sự nảy mầm của hạt Quả
Trang 2lấy ở độ tuổi 170 ngày và được gieo vào
trong môi trường MT có bổ sung khoai tây
và chuối ở các nồng độ khác nhau
Số quả cấy đối với từng công thức thí
nghiệm là 5 - 7, mỗi quả được tính trọng
lượng hạt bao gồm cả xơ Thời gian nảy mầm
được tính từ khi xuất hiện khoảng 10 thể
protocorm đầu tiên Số thể protocorm/mg hạt
được tính sau 40 ngày gieo
ghiên cứu nhân nhanh:
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất
điều tiết sinh trưởng BAP (N6 -
benzyladenine), KIN (kinetin) và 2,4D
(2,4 - dichlorophenoxyacetic) ở các nồng
độ khác nhau đến khả năng nhân nhanh
protocorm của hạt
- Nghiên cứu tác dụng của chất phụ gia
(chuối và khoai tây) lên sự nhân nhanh chồi
từ các thể protocorm
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với
3 lần nhắc lại, mỗi lần theo dõi 5 bình, mỗi
bình 10 mẫu cấy
Điều kiện thí nghiệm: Quá trình nuôi
cấy được tiến hành tại Trung tâm Hoa cây
cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp trong điều kiện hoàn toàn nhân tạo, có thể chủ động điều chỉnh ánh sáng, nhiệt độ, độ Nm theo ý muốn Trong thí nghiệm này ánh sáng được sử dụng là ánh sáng lạnh của đèn neon, thời gian chiếu sáng 10 h/ngày, cường độ chiếu sáng 2400 - 3000 lux, nhiệt độ 27 ± 10C, độ Nm 65 - 70%
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 (ghiên cứu sự nảy mầm của hạt
Quả lan phát triển chậm, thường phải qua 4 tháng mới chín và tách vỏ Số lượng hạt trong mỗi quả là khác nhau Hạt của chúng thường rất nhỏ, không có nội nhũ, trong điều kiện tự nhiên rất khó nảy mầm thành cây con nên thường phải gieo hạt trong môi trường vô trùng thích hợp mới có thể nảy mầm
Chính vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi quả và tác dụng của một số chất phụ gia (chuối, khoai tây) lên việc nuôi cấy hạt là nhằm mục đích tìm ra tuổi quả và môi trường thích hợp nhất
Bảng 1 Ảnh hưởng của tuổi quả tới sự nảy mầm của hạt
Tuổi quả
(ngày)
Trọng lượng hạt (mg/quả)
Thời gian nảy mầm (ngày)
Số protocorm/mg hạt
Chất lượng mẫu
125
140
155
170
61,9 76,4 121,7 132,9
25,1 ± 0,91 20,5 ± 0,98 17,7 ± 0,97 15,5 ± 0,82
15,7± 2,85 95,3± 9,77 135,7 ± 12,83 137,8 ± 11,68
+ ++
+++ +++
+: Thể protocorm nhỏ, xanh nhạt; ++: Thể protocorm nhỏ, xanh; +++: Thể protocorm to, xanh đậm
Tuổi quả ảnh hưởng rất lớn đến thời
gian nảy mầm và tỷ lệ nảy mầm của hạt
Nếu thu hoạch quả sớm, quả chưa chín
thành thục sẽ làm giảm độ nảy mầm của hạt
và kéo dài thời gian nảy mầm Quả 125 và
140 ngày, do hạt chưa hình thành đầy đủ
nên chủ yếu là xơ Còn quả ở độ tuổi 155
và 170 ngày, hạt đã chín thành thục, số hạt trên quả Qua bảng 1 cho thấy, quả của giống HL3 sau 170 ngày thụ phấn có độ nảy mầm cao nhất (137,8 protocorm/mg) và thời gian nảy mầm ngắn nhất (15,5 ngày)
Bảng 2 Ảnh hưởng của chất phụ gia lên sự nảy mầm của hạt
Trang 3Công thức Thời gian nảy mầm (ngày) Số protocorm/mg hạt Chất lượng mẫu
CH: Chuối + Thể protocorm nhỏ, xanh nhạt;
KT: Khoai tây ++ Thể protocorm nhỏ, xanh;
+++ Thể protocorm to, xanh đậm;
MT: VW + 7 g/l agar + 10 g/l sucrose + 3 g/l than hoạt tính
Hạt của giống lan Hồ điệp HL3 đều nảy
mầm ở tất cả loại môi trường Tuy nhiên ở
môi trường khác nhau thì thời gian nảy
mầm và sự nảy mầm khác nhau Qua bảng
2 cho thấy, môi trường có bổ sung chuối
(30 g CH, 50 g CH) hoặc tổ hợp chuối và
khoai tây (30 gKT + 30 gCH) có ảnh hưởng
không rõ rệt lên sự nảy mầm của hạt, còn ở
nồng độ cao, chúng kìm hãm độ nảy mầm
của hạt Trong khi đó, môi trường có bổ
sung khoai tây (30, 50, 100, 150 g KT) đều
kích thích hạt nảy mầm nhanh hơn (4,2 -
5,9 ngày) so với đối chứng
Môi trường thích hợp nhất để gieo hạt
của giống HL3: MT + 50 gKT/l
2 (ghiên cứu nhân nhanh
- hân nhanh protocorm: Phương pháp
nhân nhanh protocorm từ hạt là phương
pháp rất hữu hiệu để làm tăng nhanh nguồn
mẫu ban đầu Phương pháp này đặc biệt có ý
nghĩa đối với những quả lai quý hiếm, khó
đậu quả, số lượng hạt trong quả ít
Trong đời sống thực vật, tỷ lệ
auxin/cytokinin có một vai trò quan trọng
trong sự biệt hóa các cơ quan và quyết định
đến sự sinh trưởng và phát triển của cây Vì vậy, trong kỹ thuật vi nhân giống các nhà nghiên cứu đều thống nhất rằng tổ hợp auxin và cytokinin cho hiệu quả tốt hơn sự tác động riêng lẻ (Mathws & Rao, 1980; Yam & Weatherhead, 1991; Teng et al., 1997) Tuy nhiên, trong một số trường hợp
sự tác động riêng rẽ của cytokinin cũng cho
hệ số nhân cực đại (Bhojwani, 1980) bởi có thể ở một số loại cây trồng, bản thân mẫu nuôi cấy tự tổng hợp đủ auxin cho nên không cần cung cấp auxin ngoại sinh (Robert J.Weaver, 1972)
Nghiên cứu tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ hoặc kết hợp ở các nồng độ khác nhau lên mẫu cây lan Hồ điệp là nhằm mục đích tìm ra tổ hợp tối ưu nhất cho hệ số nhân cao nhất trong ống nghiệm
Sau khi hạt nảy mầm (khoảng 7 - 8 tuần) các thể protocorm được cấy vào môi trường MT có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau
Trang 4Bảng 3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh
trưởng lên sự nhân nhanh protocorm
(sau 12 tuần)
Nồng độ của các
chất điều hòa sinh
trưởng mg/l
Tỷ lệ tạo protocorm mới (%)
Hệ số nhân (lần)
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 40,7 70,7 85,3 82,0 62,0
0 3,5 ± 1,02 6,5 ± 1,14 9,5 ± 1,91 7,2 ± 0,76 4,4 ± 1,00
1,0
1,5
2,0
2,5
31,3 61,3 74,0 76,7 68,0
3,2 ± 0,48 3,5 ± 0,68 4,8 ± 0,87 7,7 ± 0,64 5,4 ± 0,64
BAP + 2,4D 1,5 + 0,3
1,5 + 0,5
1,5 + 0,7
1,5 + 1,0
87,3
72,0 Không phản ứng Không phản ứng
12,3 ± 1,22
4,8 ± 0,62
0
0 KIN + 2,4D 2,0 + 0,3
2,0 + 0,5
2,0 + 0,7
2,0 + 1,0
75,3 64,0 Không phản ứng Không phản ứng
7,1 ± 0,66 5,5 ± 0,67
0
0
Qua bảng 3 cho thấy, cytokinin hoặc tổ
hợp cytokinin và auxin có ảnh hưởng tích
cực đến quá trình phát sinh protocorm mới
Ở công thức đối chứng, mẫu không phát
sinh protocorm mới, nhưng ở những công
thức sau hệ số nhân tăng lên rõ rệt
Thí nghiệm đối với BAP cho thấy, tỷ
lệ tạo protocorm và hệ số nhân đạt giá trị
cao nhất ở nồng độ 1,5 mg/l lần lượt là
85,3% và 9,5 lần Còn môi trường có bổ
sung kinetin, tỷ lệ tạo protocorm cao nhất
là 76,7%, hệ số nhân là 7,7 lần ở nồng độ
2,0 mg/l
Mẫu được cấy trong môi trường có sự
kết hợp giữa BAP và 2,4D; KIN và 2,4D
cũng làm tăng sự hình thành protocorm của
mẫu Tuy nhiên, nếu kết hợp với 2,4D ở nồng độ cao (0,7 và 1,0 mg/l) mẫu không
có phản ứng Kết quả tốt nhất là ở môi trường có 1,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l 2,4D, 87,3% mẫu nuôi cấy tạo PLBs với hệ số nhân là 12,3 lần
Như vậy, môi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh protocorm là: MT + 1,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l 2,4D
- hân nhanh chồi: Sau khi nhân
nhanh các thể protocorm, chúng tôi nghiên cứu tác dụng của chất phụ gia lên sự hình thành chồi từ các thể protocorm bằng cách cấy các thể protocorm vào môi trường MT
có bổ sung khoai tây và chuối ở các nồng
độ khác nhau
Bảng 4 Ảnh hưởng của chất phụ gia lên hệ
số nhân chồi (sau 8 tuần)
Công thức Hệ số nhân
(lần)
Tỷ lệ tạo chồi (%)
Khoai tây và chuối đều ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ tạo chồi Qua bảng 4 cho thấy, ở tất cả các công thức có
Trang 5bổ sung khoai tây đều cho hệ số nhân và
tỷ lệ tạo chồi cao hơn so với đối chứng và
đạt cao nhất ở công thức 50 g/l khoai tây
Tuy nhiên, nếu bổ sung ở nồng độ cao, sự
hình thành chồi từ cụm protocorm giảm
đi Còn ở những công thức có bổ sung
chuối hoặc tổ hợp chuối và khoai tây thì
hệ số nhân và tỷ lệ tạo chồi giảm đi theo
tỷ lệ nghịch với nồng độ Hệ số nhân và tỷ
lệ tạo chồi thấp nhất ở công thức 150 g/l
khoai tây + 150 g/l chuối lần lượt là 4,1
lần và 17,3%
Môi trường thích hợp nhất cho nhân
nhanh cây con là: MT + 50 g/l khoai tây
IV KẾT LUẬN
- Gieo hạt: Quả lan 170 ngày tuổi,
không bị sâu bệnh được khử trùng bằng
H2O2 15% trong 20 phút Sau 9,6 ngày hạt
nảy mầm với số lượng 142,9 mầm/mg hạt
trong môi trường MT + 50 g/l khoai tây
- Nhân nhanh: Hạt sau 7 - 8 tuần gieo
phát triển thành thể tiền chồi có kích thước
2 mm Lấy thể tiền chồi này cấy vào môi
trường MT + 1,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l
2,4D Sau 12 tuần từ một thể tiền chồi phát
sinh ra 12,3 PLBs
Sau khi nhân nhanh protocorm, cấy
chuyển các protocorm này vào môi trường
MT + 50 g khoai tây/l, sau 8 tuần hình
thành chồi con với hệ số nhân là 8,4 chồi/
cụm protocorm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 1guyễn Quang Thạch, 1guyễn Thị Lý
Anh, 1guyễn Thị Lâm Hải, 2005 Kỹ
thuật chọn tạo, nhân nhanh và nuôi trồng lan Hồ điệp, NXB Nông nghiệp
2 Rod Santa Ana III, 2001 Rio grand
valleya leader in orchid production, research, Agricultural Communications Taxas A$M University system
3 Teng, W.L.; 1icloson, L.; Teng, M.C,
1997 Micropropagation of Spathoglotis
plicata Plant Cell Rep, pp 831 - 835
4 Yam, T.W.; Weatherhead, M.A, 1991
Leaf - tip culture of several native orchids of Hong Kong Lindleyana 6,
pp 147 - 150
(gười phản biện: Trần Duy Quý
Trang 6T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6
... tínhHạt giống lan Hồ điệp HL3 nảy
mầm tất loại mơi trường Tuy nhiên
mơi trường khác thời gian nảy
mầm nảy mầm khác Qua bảng
2 cho thấy, mơi trường... Thạch, 1guyễn Thị Lý
Anh, 1guyễn Thị Lâm Hải, 2005 Kỹ
thuật chọn tạo, nhân nhanh nuôi trồng lan Hồ điệp, NXB Nông nghiệp
2 Rod Santa Ana III, 2001 Rio grand...
Nghiên cứu tác dụng chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ kết hợp nồng độ khác lên mẫu lan Hồ điệp nhằm mục đích tìm tổ hợp tối ưu cho hệ số nhân cao ống nghiệm
Sau hạt nảy mầm (khoảng
