Xác định macker Satt 431 liên kết với gen kháng bệnh rỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow) ở giống đậu tương ĐT2000 potx

Số liệu kiểu hình của quần thể F2 được thu thập bằng cách đánh giá mức độ nhiễm bệnh và mức độ nhiễm bệnh tích luỹ theo thời gian chỉ số AUDPC của 12 cây F3 phát triển từ hạt giống thu t

Xác định macker Satt 431 liên kết với gen kháng bệnh rỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi

Sydow) ở giống đậu tương ĐT2000

Identification of SSR macker Satt 431 associated with rust resistance (Phakopsora

pachyrhizi Sydow) in cultivar DT 2000

Nguyễn Thị Bình 1 , Nguyễn Thị Thanh

Tuyết 1 , Trần Thị Trường 2 Phạm Tùng Anh 3 , Glen Lee Hartman 3

Abtract

The soybean cultivar DT 2000 was identified to have a consistent and high resistance level to soybean rust in field evaluations in Vietnam In order to utilize this resistance effectively for the marker-assisted selection (MAS) and molecular breeding, a mapping QTL project was conducted on a F3 population developed from the cross DT12 by DT 2000, and SSR marker Satt 431 on linkage group J had an association with the resistance in the form of low area under disease progress curve (AUPDC) and disease severity values The finding

of the marker Satt 431 is significant and useful for MAS in breeding programs to get rust resistant cultivars in Vietnam

I Đặt vấn đề Cây đậu tương là cây trồng có giá trị

quan trọng thứ hai trong các cây họ

đậu Tuy nhiên sản lượng vẫn còn thấp

so với nhu cầu tiêu dùng Một trong

những yếu tố hạn chế năng suất là sâu

bệnh hại trong đó có bệnh gỉ sắt Bệnh

gỉ sắt hại đậu tương do nấm

Phakopsora pachyrhizi Sydow, thuộc

họ Melampsoracea, bộ Uredinales, lớp

Urediniomycetes gây ra Đây là loài ký

sinh chuyên tính (Green 1984) Nấm gỉ

sắt đậu tương đầu tiên được phát hiện ở Nhật bản năm 1902 Bệnh lan rộng, phổ biến ở hầu hết các vùng trồng đậu trên thế giới ở đông bán cầu bệnh có thể làm giảm năng suất trung bình từ

10 – 30 %, có vùng năng suất giảm trên 50% (Bromfield 1980; Green 1984) ở Việt nam có những vụ bị hại nặng mất mùa đến 81% (Trung tâm đậu đỗ Định Trường 1985)

Nghiên cứu tính kháng bệnh gỉ sắt của tập đoàn đậu tương địa phương và nhập nội, chúng tôi đã xác định được một số giống kháng bệnh, trong đó có giống đậu tương ĐT 2000 Đây là một giống có tính kháng bền vững qua

1 Viện Bảo vệ thực vật

2 Viện cây lương thực cây thực phẩm

3 Trường Đại học tổng hợp

Illinois-nhiều vụ đánh giá Với sự phát triển

mạnh trong một vài năm gần đây về

sinh học phân tử, việc xác định các

marker phân tử có ích phục vụ cho

chọn giống kháng bệnh là con đường

đi ngắn , có hiệu quả cho việc chọn tạo

giống mới kháng bệnh năng suất cao

Vì vậy cần lập bản đồ gen kháng của

những giống kháng bệnh điển hình

như giống ĐT 2000, trên cơ sở tìm

kiếm các chỉ thị phân tử có liên kết

chặt với gen kháng Phương pháp

macker phân tử giúp chọn giống đậu

tương kháng bệnh và có tiềm năng

năng suất cao nhanh và hiệu quả, đáp

ứng nhu cầu cấp bách của thực tiễn sản

xuất hiện nay

II Vật liệu

và phương pháp nghiên cứu

1.Vật liệu nghiên cứu

Quần thể F2, F3 của cặp lai ĐT12

và ĐT2000

ADN cuả 154 cây thế hệ F2

Các hoá chất để chiết tách ADN:

Tris - HCL, EDTA, NaCL, Ethanol

384 macker SSR: Các marker này

được chọn từ 20 nhóm liên kết và cách

nhau một khoảng cách là 20cM

Các hoá chất và thiết bị phục vụ

nghiên cứu macker đa hình và thu thập

số liệu kiểu gen: máy chạy phản ứng

PCR, máy soi gel bằng tia UV, hoá

chất : agarose, ethidium bromide, Tag

polymerase, dNTPs, PCR buffer,

peptone

2 Phương pháp nghiên cứu

Tạo quần thể lai phương pháp lai hữu

tính

Tách chiết ADN từ mẫu lá non thu thập trên cây của giống bố mẹ ĐT 12 và

ĐT 2000, và ADN của các cây F2 theo phương pháp CTAB (Keim et al, 1988) Xác định các marker đa hình và thu thập số liệu kiểu gen bằng phương pháp công nghệ sinh học và được tiến hành tại phòng thí nghiệm bệnh cây của khoa Nông học trường Đại học tổng hợp Illinois-Hoa kỳ

Số liệu kiểu hình của quần thể F2 được thu thập bằng cách đánh giá mức

độ nhiễm bệnh và mức độ nhiễm bệnh tích luỹ theo thời gian (chỉ số AUDPC) của 12 cây F3 phát triển từ hạt giống thu thập trên cây F2 tương ứng Thí nghiệm được thực hiện ở vườn thực nghiệm của viện Bảo vệ thực vật trong vụ Đông năm 2006 Dùng phần mềm SAS để kiểm tra tính phân bố chuẩn của số liệu về chỉ

số bệnh tích luỹ theo thời gian (AUDPC) và mức độ nhiễm bệnh trung bình của các dòng trong quần thể lai F3 Sử dụng phần mềm MapQTL

để tìm marker có liên kết chặt với gen kháng bệnh sử dụng số liệu kiểu gen

và kiểu hình của quần thể F2

III kết quả nghiên cứu

1 Kết quả tạo các quần thể lai

Dựa vào kết quả đánh giá tính kháng bệnh gỉ sắt của tập đoàn đậu tương địa phương và nhập nội đã tiến hành từ năm 2000-2005, chúng tôi đã tiến hành lai tạo được 3 tổ hợp lai giữa giống ĐT 2000 và 3 giống nhiễm bệnh

nặng:

ĐT 12 x ĐT2000

V74 x ĐT2000

Williams x ĐT2000

2 Kết quả xác định các marker đa

hình

Chiết tách ADN của 4 giống cây bố

mẹ: ĐT12, V74, Williams 82, ĐT2000

và hai giống đối chứng là PI 230970

và PI 437323, với hàm lượng 5000

g/l/cá thể, tiến hành thí nghiệm cho bắt cặp lần lượt 384 marker SSR với ADN của các giống bố mẹ để chọn macker SSR đa hình Marker nào cho kết quả băng ADN của hai giống bố

mẹ lệch nhau thì macker đó là đa hình, còn macker nào cho kết quả băng ADN của giống bố mẹ chạy ngang bằng nhau thì đó là marker không đa hình (hình 1)

Hình 1 Marker SSR gây đa hình trên ADN của các bố mẹ

Chú thích: Băng ADN của 6 giống đậu tương bố mẹ thu được sau phản ứng PCR với các marker SSR Đối với mỗi marker, sáu mẫu ADN được sắp xếp theo trình tự như sau: V 74, ĐT 2000, ĐT 12, Williams 82, PI 230 970, và PI 437323

Hàng 1 (trên): Sử dụng 8 marker: trong đó marker 1(Satt 306), 2 (Satt 303), 3

(Satt 319), 4 (Satt 321) cho kết quả không gây đa hình đối với ADN của bố mẹ, các marker còn lại: 5 (Sat 384), 6 (Sat 385), 7 (Satt 165), và 8 (Satt 276) cho kết quả gây đa hình đối với ADN của bố mẹ

Hàng 2 (dưới): Marker 6 (Satt 330) cho kết quả không gây đa hình đối với ADN của bố mẹ Các marker còn lại gây đa hình: 1 (Satt 300), 2 (Sat 217), 3 (Sat 271), 4 (Sat 294), 5 (Sat 406), 7 (Sat 409), và 8 (Satt 455)

Kết quả chọn được 140 macker đa

hình với ADN của các bố mẹ nói trên và

85 macker đa hình với ADN của cặp lai

ĐT12 và ĐT2000 thuộc 19 nhóm liên

kết (bảng 1) Trong đó nhiều nhất là các macker ở nhóm D1b, ít nhất là nhóm A2 và nhóm K

Bảng 1 Các marker đa hình đối với cặp lai ĐT12 x ĐT2000 (2006 – 2007)

Nhóm

Nhóm

Nhóm

Sat 674

Sat 172

Sat 036

Nhóm

Nhóm

Nhóm

3 Kết quả bước đầu tìm các

marker có liên kết chặt với gen

kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương

ĐT2000

* Thu thập số liệu kiểu gen

Dựa vào kết quả của phần 2 , 85

marker đa hình sẽ được tiến hành phản

ứng PCR với 154 mẫu ADN của các cá

thể trong 1 quần thể F2 thuộc tổ hợp lai

ĐT12 x ĐT2000 Các băng ADN đa

hình ở các cá thể này sẽ được ghi lại

thành số liệu kiểu gen:

- a là ký hiệu đối với cá thể có băng

ADN cao hơn

ADN thấp hơn

băng ADN cao và băng ADN thấp

* Thu thập số liệu kiểu hình

Chỉ số nhiễm bệnh ở giai đoạn sinh

trưởng R6 và chỉ số bệnh tích luỹ theo

thời gian AUDPC của của mỗi dòng

(12 cá thể) trong quần thể F3 là số liệu

kiểu hình đại diện cho mỗi cá thể trong

quần thể F2 Dùng phần mềm SAS để

kiểm tra tính phân bố chuẩn của số

liệu kiểu hình, kết quả được thể hiện

trên hình 2 và hình 3 cho thấy mức độ

nhiễm bệnh (severity) và chỉ số bệnh

tích luỹ theo thời gian (AUDPC) có sự

dao động lớn Mức độ nhiễm bệnh và

chỉ số AUDPC đều có phân bố chuẩn,

như vậy số liệu của 2 tính trạng này có

sự phân bố bình thường (normal distribution) Điều này cũng cho thấy

cả mức độ nhiễm bệnh và chỉ số AUDPC đều là tính trạng số lượng (qualitative trait) do nhiều QTL quy định Mức độ nhiễm bệnh của quần thể F3 dao động trong khoảng 20 đến

75, chỉ số bệnh trung bình của các dòng là 38 Chỉ số AUDPC trung bình của các dòng là 492.8 và dao động trong khoảng 255 đến 1109

Hình 2 Sự phân bố tính trạng chỉ số

bệnh tích luỹ theo thời gian của các dòng lai của quần thể F3 (ĐT 12 x ĐT

2000)

Kết quả phân tích số liệu kiểu gen

và kiểu hình bằng phần mềm MapQTL

để tìm marker liên kết với gen kháng

0 5 10 15 20 25

0 0

Area Under Disease Progress Curve (AUDPC)

Chỉ số bệnh tích luỹ theo thời gian(AUDPC ) Tần

suất

ở giống đậu tương ĐT2000 cho thấy

đối với tính trạng kiểu hình của vết

bệnh TAN/RB (kháng / nhiễm),

marker Satt 619 thuộc nhóm liên kết

A1 đã có chỉ số LOD (chỉ số biểu hiện

mức độ liên kết có ý nghĩa đối với

gene được nghiên cứu) bằng 2.4 Vì

chỉ số LOD phải lớn hơn 2.5 mới cho

thấy marker liên kết có ý nghĩa với

gene quy định tính trạng nghiên cứu

Tuy nhiên, chúng tôi vẫn nêu kết quả

này vì 2.4 là tương đối cao Đây sẽ là

tiền đề cho nghiên cứu trong thời gian

tới, tiếp tục tìm kiếm ở các vùng lân

cận nằm quanh marker này để tìm ra

marker SSR cho chỉ số LOD cao hơn,

hoặc dùng các marker khác hiện đại và

chính xác hơn như SNP, nhằm tìm ra

marker liên kết với gen quy định tính trạng kiểu vết bệnh

Hình 3 Sự phân bố tính trạng mức độ

nhiễm bệnh trung bình của các dòng lai F3 (ĐT 12 x ĐT 2000)

Bảng 3 Kết quả tìm các macker có liên kết chặt với gen

kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT2000

Mức độ đa dạng của các cá thể trong quần thể % Phản ứng với bệnh (RB,

Chỉ số bệnh tích luỹ theo

được phát hiện là có liên kết với (một

hoặc nhiều) gene quy định hai tính

trạng là mức độ nhiễm bệnh và

AUDPC với chỉ số LOD lần lượt là

tính kháng bệnh gỉ sắt ở giống đậu

tương ĐT2000 Như vậy bước đầu có

thể kết luận gen kháng bệnh gỉ sắt ở

giống đậu tương ĐT2000 thuộc nhóm

liên kết J

Trên thế giới, các nhà khoa học đã

xác định được vị trí của gene kháng

bệnh Rpp1, Rpp2 và Rpp4 Rpp1 nằm

ở nhóm liên kết G và có liên kết chặt với marker Sct_187 và cách marker này 0.8 cM (Hyten et al 2007) Rpp2 cũng đã xác định ở nhóm liên kết J (tài liệu đang xuất bản) Gene liên kết với tính trạng mức độ nhiễm bệnh và chỉ

số AUDPC của ĐT 2000 mà chúng tôi tìm được liên hệ chặt với marker Satt431 cũng ở nhóm liên kết J Tuy nhiên, do khoảng cách giữa hai marker lớn hơn 20 cM nên đây có thể

là hai gene (QTL) khác nhau

IV kết luận và đề nghị

Tần suất

Chỉ số nhiễm bệnh trung bình

1 Kết luận

1.1 Đã tạo được 24 quần thể lai F2

và 2 quần thể F3 của 3 tổ hợp lai giữa

giống làm mẹ là giống đậu tương

ĐT12, Williams82, V74 nhiễm bệnh

gỉ sắt nặng và giống đậu tương

ĐT2000 kháng bệnh làm vật liệu

nghiên cứu

1.2 Đã tuyển chọn được 85 macker

SSR gây đa hình ở ADN của giống bố

mẹ để nghiên cứu thu thập số liệu kiểu

gen ở các cá thể F2

1.3 Xác định được gen kháng bệnh

gỉ sắt ở giống đậu tương ĐT 2000 nằm

ở nhóm liên kết J vì marker Satt 431 có

liên kết chặt với gen kháng thuộc nhóm

liên kết J

2 Đề nghị

Cần nghiên cứu tìm thêm các

macker khác có liên kết với gen kháng

bệnh ở giống đậu tương ĐT2000 để phục vụ chọn giống kháng bệnh

Tài liệu tham khảo

1 Trung tâm Đậu đỗ Định Tường

1983 Bệnh gỉ sắt đậu tương(Phakopsora

pachyrhizi Sydow) Báo cáo khoa học

năm 1983

2 Frederik, R., Synder,C., Peterson,

G., and Bonde, M 2002 Polymeraza

chain reaction assays for the detection and discrimination of the soyabean rust pathogen P Pachyrihizi and P Meibromiea Phytopathology

92:217-227

3 Hartman, G L., Miles, M R., and

Fredrick, R D., 2005 Breeding for

resistance to soybean rust Plant Dis

89:664-666