Đánh giá ô nhiễm ấu trùng Sán Lá Gan nhỏ trên cá nước ngọt tại các chợ ở Hà Nội pptx

đánh giá ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá n-ớc ngọt tại các chợ ở Hà Nội Nguyễn Văn Đề Viện Sốt rét, KST-CT TƯ Điều tra tại 5 chợ ở Hà Nội: Chợ Đặng Trần Côn thuộc quận Đống Đa, c

đánh giá ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ

trên cá n-ớc ngọt tại các chợ ở Hà Nội

Nguyễn Văn Đề

Viện Sốt rét, KST-CT TƯ

Điều tra tại 5 chợ ở Hà Nội: Chợ Đặng Trần Côn thuộc quận Đống Đa, chợ Thanh Xuân Bắc thuộc quận Thanh Xuân, chợ Thành Công thuộc quận Ba Đình, chợ Văn Điển thuộc huyện Thanh Trì và chợ Phùng Khoang Thuộc huyện Từ Liêm Với 10 loài cá n-ớc ngọt đ-ợc xét nghiệm (Cá mè

Hypophthalmichthys molitrix, Rô phi Tilapia mossambica, Cá trắm Mylopharyngodon piceus, Cá trôi Cirrhina molitorella, Cá chày Squaliobabus curriculus, Cá chép Cyprinus carpio, Cá diếc Carassius carassius, Cá chuối Ophicephalus maculatus, L-ơn Fluta alba, Cá trê Clarias fuscus: mỗi loài xét nghiệm

60 con) có 7 loài d-ơng tính ấu trùng sán lá gan nhỏ Loài ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá tại chợ Hà Nội

đ-ợc xác định là loài Clonorchis sinensis bằng hình thái học và sinh học phân tử hệ gen ty thể.

sinh và gây bệnh tại đó Nhiễm sán lá gan,

I Đặt vấn đề:

ng-ời bệnh bị xơ gan và có thể bị ung th- Bệnh sán lá gan nhỏ Clononorchiasis và

đ-ờng mật Cholangiocarcinoma

Opisthorchiasis l-u hành ở nhiều nơi trên thế

Việt Nam là một n-ớc nông nghiệp có giới với 20 triệu ng-ời mắc và nhiễm bệnh có

nghề nuôi cá từ lâu đời và đặc biệt chủ yếu liên quan đến tập quán ăn gỏi cá hoặc ăn cá

nuôi cá bằng n-ớc thải, thậm chí có một số ch-a nấu chín

địa ph-ơng còn nuôi cá bằng phân ng-ời và Cá là nguồn thực phẩm không thể thiếu

tập quán ăn gỏi cá phổ biến ở nhiều nơi, là

đối với con ng-ời Hiện nay thực phẩm bị ô

yếu tố thuận lợi cho bệnh sán lá gan l-u hành nhiễm đang ở mức báo động, trong đó có cá

và gây ảnh h-ởng lớn đối với sức khoẻ và trở

Ô nhiễm cá chủ yếu gồm 3 nhóm nguyên

nên gánh nặng cho gia đình và xã hội Hiện nhân, đó là: nhóm hoá chất bảo quản cá, các

nay tại Việt Nam đã xác định ít nhất có 18 tỉnh

độc chất từ cá sinh ra (cá nóc, mật cá trắm )

có bệnh sán lá gan nhỏ l-u hành, có nơi tỷ lệ

và các hoá chất trong môi tr-ờng nuôi cá, đặc

nhiễm 37% nh- Nam Định, Phú Yên [2,5] Tại biệt là cá nuôi bằng n-ớc thải; nhóm vi

các địa ph-ơng này hầu hết cá nuôi ở ao đều trùng/siêu vi trùng và độc chất của chúng

nhiễm ấu trùng sán lá gan, có loài nhiễm tới xâm nhập vào cá; nhóm ký sinh trùng, trong

90% Vậy, những địa ph-ơng khác, kể cả Hà

đó có sán lá và một số giun truyền qua cá Cá

Nội, tình hình cá nhiễm ấu trùng sán lá gan

là vật chủ trung gian của nhiều loài giun sán

nhỏ ra sao? để có góp phần đ-a ra giải pháp gây bệnh cho ng-ời (Fish born helminthes)

trong vệ sinh an toàn thực phẩm, việc nghiên [3]

cứu đánh giá ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ Mầm bệnh giun sán truyền qua cá xâm trong cá tại chợ ở Hà Nội là hết sức cần thiết nhập vào ng-ời qua đ-ờng ăn uống một cách hiện nay, nhằm mục đích:

thụ động do ăn phải cá có ấu trùng sán còn

- Xác định ô nhiễm ấu trùng sán lá gan sống d-ới hình thức ăn gỏi cá hoặc ăn cá

nhỏ truyền cho ng-ời trong cá n-ớc ngọt tại ch-a nấu chín kỹ

một số chợ ở Hà Nội

Khi ng-ời ăn phải ấu trùng sán lá gan

trong cá, ấu trùng theo đ-ờng mật vào gan ký

sán lá gan nhỏ bằng sinh học phân tử

+ Soi tìm ấu trùng sán d-ới kính lúp hoặc

II Đối t-ợng và ph-ơng pháp

kính hiển vi vật kính 10

nghiên cứu:

Xác định thành phần loài bằng hình thái

1 Chọn mẫu và cỡ mẫu nghiên cứu:

học theo Miyazaki 1991 và Ooi 2001 [7]

- Chọn ngẫu nhiên các mẫu cá n-ớc ngọt

Các ấu trùng sán đ-ợc rửa bằng n-ớc bán tại chợ ở Hà Nội đại diện cho các quận

muối sinh lý và chụp ảnh qua kính hiển vi, nội thành và ngoại thành

o

đồng thời l-u mẫu ở nhiệt độ 20 C Thẩm định

- Xét nghiệm kiểm tra 10 loài cá n-ớc ngọt

loài bằng ph-ơng pháp sinh học phân tử hệ cho mỗi chợ và mỗi loài 60 con

gen ty thể với kỹ thuật PCR

2 Địa điểm nghiên cứu:

Tóm tắt các b-ớc của ph-ơng pháp sinh

Đa, cách trung tâm Hà Nội 5 km về phía Tây -

! Chọn mồi chung và mồi đặc hiệu;

Nam

! Thực hiện phản ứng PCR;

- Chợ Thanh Xuân Bắc thuộc quận Thanh

! Dòng hoá sản phẩm;

Xuân, cách trung tâm Hà Nội 9 km về phía

! Giải trình tự;

Tây - Nam

! Phân tích, xử lý theo ch-ơng trình Sinh-tin

- Chợ Thành Công thuộc quận Ba Đình,

học cách trung tâm Hà Nội 6 km về phía Tây -

chất Genomic-Tip Kit (QIAGEN Inc.) theo qui

- Chợ Văn Điển thuộc huyện Thanh Trì,

trình của nhà sản xuất Mô tả rút gọn nh- sau: cách trung tâm Hà Nội 15 km về phía Nam

mẫu vật bảo quản trong cồn 70% đ-ợc lấy ra

- Chợ Phùng Khoang thuộc huyện Từ

và cho cồn bay hơi hết trong ly tâm chân Liêm, cách trung tâm Hà Nội 10 km về phía

không, sau đó rửa nhiều lần trong PBS Mẫu Tây - Nam

vật đ-ợc nghiền kỹ và xử lý với các dung môi

Xét nghiệm tìm ấu trùng sán lá gan nhỏ theo qui trình tách chiết Hàm l-ợng ADN sử trên cá theo ph-ơng pháp tiêu cơ nhân tạo dụng cho mỗi phản ứng PCR (50 microlit) là

ty thể đ-ợc chọn làm đích nghiên cứu Cặp

- HCL 11ml;

mồi (primer) dùng trong nhân bản ADN đích

- N-ớc muối sinh lý 8,5%: 1000ml

bằng phản ứng PCR (polymerase chain

5'TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT3',và + Đ-ợc nghiền nhỏ trong cối xay thịt

+ Ngâm vào dung dịch tiêu cơ ít nhất 4 giờ

+ Lọc bã và làm lắng cặn

m ồ i n g - ợ c : J B 4 5 R : 5’TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG3' Các trình tự t-ơng ứng với đoạn ADN nghiên 62

cứu từ một số quần thể thuộc họ lạc theo ph-ơng pháp kháng sinh và chỉ thị

Opisthorchiidae và giống Paragonimus đã màu (SAMBROOK và RUSSELL, 2001)

đ-ợc công bố (Blair và cs, 1997 LE và cs, ADN của plasmid có chứa PCR đ-ợc tách 2002) và đăng ký tại Ngân hàng Gen chiết với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid (http://www.ncbi.nim.nih.gov) đ-ợc sử dụng Extraction Kit (QIAGEN Inc.) Chuỗi ADN

để so sánh đối chiếu đ-ợc giải trình tự trên máy giải trình tự động

ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) và thực hiện

Chạy PCR, giải trình tự và chọn chuỗi so

với số l-ợng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm

sánh:

thu đ-ợc kết quả chính xác Sắp xếp, đối ADN đích đã đ-ợc nhân bản bằng PCR

chiếu trình tự t-ơng ứng của đoạn gen bằng tiêu chuẩn với bộ hoá chất PCR Master Mix

hệ ch-ơng trình máy tính AsemblyLIGN 1.9 Kit (Promega) Chu trình nhiệt của PCR trên

và Mac Vector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ)

Trình tự axit amin đ-ợc dịch mã theo bảng mã 0

gồm các b-ớc nh- sau: 94 C - 5 phút trong 1

di truyền mt-DNA số 21 của sán dẹt 0

chu kỳ; tiếp theo là 35 chu kỳ ở 94 C - 1 phút,

(platyhelminth mtDNA genetic code) giới

50 C - 1 phút và 72 C - 1 phút; chu kỳ cuối kéo

thiệu trong Ngân hàng Gen

0 dài 10 phút ở 72 C Sản phẩm PCR đ-ợc tinh

Các chuỗi cox1 của Clonorchis sp của

chế bằng bộ hoá chất QIAquick PCR

Việt Nam sẽ đ-ợc so sánh với các loài của Purification Kit (QIAGEN Inc.) và đ-ợc dòng

Trung Quốc và Hàn Quốc

hoá vào vector pCR2.1 của bộ hoá chất

TA-cloning Kit (Invitrogen Inc.) Vector pCR2.1 III Kết quả nghiên cứu

tiếp nhận sản phẩm PCR đ-ợc chuyển nạp 1 Xét nghiệm cá tại 5 chợ ở Hà Nội vào dòng tế bào IVNaF' và chọn lọc khuẩn

Chợ Thành Công

Chợ Đặng Trần Côn

Chợ Thanh Xuân

Chợ Văn

Điển

Chợ Phùng Khoang

Tổng S

T

T

Tên chợ Tên loài cá Số

XN

(+) Số

XN

(+) Số

XN

(+) Số

XN

(+) Số

XN

(+) Số

XN (+)

1 Cá mè

Hypophthalmichthys

molitrix

2 Rô phi

Tilapia mossambica

(6.7%)

(1,7%)

3 Cá trắm

Mylopharyngodon piceus

10 1 (10

%)

10 2 (20%)

10 0 15 3

(20%)

15 2 (13,3%)

60 8 (13,3%)

4 Cá trôi

Cirrhina molitorella

(6,7%)

(1,7%)

5 Cá chày

Squaliobabus curriculus

6 Cá chép

Cyprinus carpio

(6,7%)

15 1 (6,7%)

60 2 (3,3%)

7 Cá diếc

Carassius carassius

10 0 10 1

(10%)

10 6 (60%)

15 2 (13,3%)

15 4 (26,7%)

60 13 (21,7%)

8 Cá quả

Ophicephalus maculatus

10 0 10 1

(10%)

10 0 15 1

(6,7%)

(3,3%)

9 L-ơn

Fluta alba

10 Cá trê

Clarias fuscus

(13,3%)

15 2 (13,3%)

60 4 (6,7%)

Tổng số 100 1 (1%) 100 4 (4%) 100 6 (6%) 150 11 (7,3%) 150 9 (6%) 600 31 (5,2%)

Ghi chú: Số (+) là mẫu có ấu trùng sán lá gan nhỏ.

Bảng 1: Kết quả xét nghiệm tìm ấu trùng sán lá gan nhỏ trên 10 loài cá n-ớc ngọt

63

Nhận xét: Trong số 10 loài cá ở chợ Hà Nội đ-ợc xét nghiệm, có 7 loài nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ với tỷ lệ 1,7 - 21,7%, trung bình 5,2% Tất cả 5 chợ đ-ợc điều tra đều có cá nhiễm ấu trùng sán lá gan, trong đó chợ Văn Điển có tới 7 loài cá nhiễm ấu trùng Nh- vậy, tại Hà Nội cũng

có thể bị nhiễm sán lá gan, nếu ăn cá ch-a nấu chín

Hình 1: ấu trùng (Metacercaria) sán lá gan nhỏ trong cá

2 Thẩm định thành phần loài sán lá gan nhỏ bằng sinh học phân tử:

Giải trình trình tự nucleotit và axit amin của ấu trùng sán lá gan trên cá

NUCLEOTIT

CsNgTH :TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATGTGTTAATATTGCCGGGGTTTGGTATGATTAGTCACATTTGTACTACTTTAACAGGTAAAGATTCGTTGTTTGGTTATGGGGGCTTGGT : 113

CsNgND : :

113 CsHNmeta : T G :

113 Cs(CN) : C :

113 Cs(Kor) : C :

113 120 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220

CsNgTH : GTTGGCTATGTTTGCTATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTTAGCTCGGTTACTATGATTA : 226 CsNgND : :

226 CsHNmeta : :

226 Cs(CN) : :

226 Cs(Kor) : :

226 * 240 * 260 * 280 * 300 * 320 *

CsNgTH : TAGGTGTGCCTACGGGGATCAAGGTTTTTTCATGATTATATATGCTT -GCTGGAACTCGGGAGCGTCTATGAGATCCAATCATGTGGTGGATAATCGGGTTTGTGGTGCTT : 336 CsNgND : - :

336 CsHNmeta : - :

336 Cs(CN) : - :

336 Cs(Kor) : - :

336 * 360 * 380 * 400 * 420 * 440

CsNgTH : TTCACTATAGGCGGGGTTACTGGGATAGTTCTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTGTTATTGCTCATTTTCATTATGTTCTATCTTT : 443 CsNgND : : 443

CsHNmeta : T : 443

Cs(CN) : T : 443

Cs(Kor) : T : 443

64

AXIT AMIN

* 20 * 40 * 60 * 80

CsNgTH : FFGHPEVYVLILPGFGMISHICTTLTGNDSLFGYGGLVLAMFAIVCLGSVVWAHHMFTVGLDLGTAVFFSSVTMIIGVPTGIKVFS : 86 CsNgND : : 86

CsHNmeta : : 86

Cs(CN) : : 86

Cs(Kor) : : 86

* 100 * 120 * 140

CsNgTH : WLYML-AGTRERLWDPIMWWIIGFVVLFTIGGVTGIVLSASVIDALFHDTWFVIAHFHYVLS : 147 CsNgND : - : 147

CsHNmeta : - : 147

Cs(CN) : - : 147

Cs(Kor) : - : 147

các chợ ở Hà Nội đ-ợc thẩm định bằng sinh Hà Nội điều trị đã thải ra môi tr-ờng với khối học phân tử (kỹ thuật PCR với hệ gen ty thể) l-ợng trứng sán đáng kể, làm ô nhiễm nguồn

là loài Clonorchis sinensis, hệ số t-ơng đồng n-ớc thải mà việc nuôi cá bằng n-ớc thải là

về nucleotid là 98,9 % và axit amin là 100% phổ biến ở Hà Nội Đó là khả năng ô nhiễm cá

so với loài Clonorchis sinensis của Trung bởi mầm bệnh giun sán ngay tại Hà Nội Bên

sinensis trên ng-ời tại Thanh Hoá và Nam n-ớc ngọt đ-ợc mang từ các nơi về Hà Nội

Định thì hệ số t-ơng đồng về nucleotit của không thể kiểm soát đ-ợc [3]

mẫu nghiên cứu là 99,3% và t-ơng đồng về

Các ấu trùng sán lá gan nhỏ thu thập từ axit amin là 100%

các mẫu cá n-ớc ngọt tại chợ Hà Nội đ-ợc

xác định là loài Clonorchis sinensis T-ơng tự

IV Bàn luận:

nh- thành phần loài sán lá gan nhỏ ở đồng

1 Sự ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ bằng Bắc Bộ đã đ-ợc xác định tr-ớc đây (sán

trùng thu thập trên cá tại vùng l-u hành bệnh) Tại 5 chợ ở Hà Nội, với 600 cá n-ớc ngọt

[4,6] Nh- vậy, chúng ta có thể điều tra ấu

đ-ợc xét nghiệm bao gồm 10 loài, có 7 loài

trùng sán lá gan trên cá để h-ớng tới xác định d-ơng tính ấu trùng sán lá gan nhỏ: cá diếc

vùng có bệnh l-u hành

13/60 (21,7%), cá trắm 8/60 (13,3%), cá trê

4/60 (6,7%), cá chép 2/60 (3,3%), cá quả

2/60 (3,3%), cá rô phi 1/60 (1,7%) và cá trôi

V Kết luận 1/60 (1,7%) Theo điều tra trớc đây (1976

-2000) tại vùng l-u hành bệnh sán lá gan nh- 1 Tại chợ ở Hà Nội, có 7/10 loài cá n-ớc Nam Định, có 7 trong 10 loài cá đ-ợc xác ngọt nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ: cá diếc

định nhiễm ấu trùng sán lá gan, đặc biệt tỷ lệ 13/60 (21,7%), cá trắm 8/60 (13,3%), cá trê

[1,2] Nh- vậy, tại Hà Nội, nếu ăn cá ch-a nấu 2/60 (3,3%), cá rô phi 1/60 (1,7%) và cá trôi

gan Hiện nay, các nhà hàng phổ biến các

2 ấu trùng sán lá gan trên cá ở Hà Nội món lẩu cá, cá rán ch-a kỹ, cá hấp ch-a kỹ,

đ-ợc thẩm định loài bằng kỹ thuật PCR với hệ thậm chí cả gỏi cá nên nguy cơ nhiễm sán lá

gen ty thể là Clonorchis sinensis

gan có thể xẩy ra ngay tại Hà Nội

Hình 2: Kết quả thẩm định bằng sinh học phân tử

65

sinh học phân tử hệ gen ty thể Tạp chí Y học TàI liệu tham khảo

Thực hành, Số 477/2004 Trang 57 - 625.

1 Lê Văn Châu, Kiều Tùng Lâm, Nguyễn

5 Nguyen Van De, KD Murrell, Le Dinh Văn Đề, Đặng Thanh Sơn, Đinh Thị Mai,

Cong, Phung Dac Cam, Le Van Chau, Thạch Thị Sự: Xác định vật chủ dự trữ mầm

Nguyen Duy Toan A Dalsgaard The Food -

bệnh và vật chủ trung gian sán lá gan Kỷ yếu

borne Trematode zoonoses of Vietnam The

công trình nghiên cứu khoa học Viện Sốt rét

current status of parasitic deaseases in

KST - CT - TƯ Tập 2 - 1991-1996 Trang 63 -

Vietnam Southeast asian Journal of Tropical

68

Medicine and Public Health Volume 34

2 Nguyễn Văn Đề, Kiều Tùng Lâm, Lê

Supplement 1, 2003: 12 - 34

Văn Châu, Lê Đình Công, Đặng Thanh Sơn,

6 Lê Thanh Hoà, Nguyễn Văn Đề,

Hà Viết Viên, Nguyễn Thị Tân và ctv: Nghiên

Nguyễn Bích Nga, Đặng Thanh Sơn, Lê Đình

cứu bệnh sán lá và sán dây Thông tin phòng

Công: Giám định loài sán lá gan bé Clo ở Việt

chống Sốt rét và các bệnh ký sinh trùng Số

Nam bằng sinh học phân tử hệ gen ty thể 2,1998 Trang 29 - 33

Tạp chí Phòng chống Sốt rét và KST Số

3 Nguyễn Văn Đề: Mầm bệnh ký sinh

4/2002 Trang 30 - 35

trùng trong thực phẩm ở Việt Nam Tạp chí

7 Ooi HK, Chen CI, Lin SC, Tung KC,

Thông tin Y - D-ợc Số 9/2003 Trang 11 -15

Wang JS, Kamiya M.: Metacercariae in

4 Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà: Giám

fishes of Sun Moon Lake which is an

định Metacercaria loài sán lá gan bé

endemic area for Clonorchis sinensis in Clonorchis sinensis ký sinh trên cá n-ớc ngọt

Taiwan Southeast Asian J Trop Med Hyg

ở Hà Nội và Nam Định bằng ph-ơng pháp

Publ Hlth 1997 28 (Suppl 1): 222 - 223

Summary

Hanoi MARKEtS

On 10 fresh water fish species (Hypophthalmichthys molitrix, Tilapia mossambica, Mylopharyngodon piceus, Cirrhina molitorella, Squaliobabus curriculus, Cyprinus carpio, Carassius carassius, Ophicephalus maculatus, Fluta alba, Clarias fuscus) from 5 markets in

Hanoi City ( the Dang Tran Con market in Dong Da district, the North Thanh Xuan market in Thanh Xuan district, the Thanh Cong market in Ba Dinh district, the Van Dien market in Thanh Tri

district and the Phung Khoang market in Tu Liem district) were examined to find Clonorchis metacercaria The results showed that 7 of 10 species were infected The Clonorchis sp metacercaria samples were identified as Clonorchis sinensis by morphology and molecular

methods with mitochondrial genome

66