Phát hiện virus viêm gan b trong huyết thanh người cho máu bằng kỹ thuật pcr Văn Đình Hoa, Võ Văn Huy Đại học Y Hà Nội Sàng lọc máu, các sản phẩm máu tốt là góp phần hạ thấp tỷ lệ các
Trang 1Phát hiện virus viêm gan b trong huyết thanh
người cho máu bằng kỹ thuật pcr
Văn Đình Hoa, Võ Văn Huy
Đại học Y Hà Nội
Sàng lọc máu, các sản phẩm máu tốt là góp phần hạ thấp tỷ lệ các bệnh lây nhiễm qua
đường máu: HIV, HBV, HCV ở nhiều nước tiên tiến, các kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành xét nghiệm sàng lọc thường quy đối với các cơ sở sử dụng máu và các sản phẩm máu
Với kỹ thuật PCR, chúng tôi phát hiện được 1 trong số 73 trường hợp (HBsAg(-)) đến khám sức khoẻ cho máu tại Viện Huyết học Truyền máu TW có DNA HBV(+) Số lượng còn ít nhưng phần nào nói lên giá trị của kỹ thuật PCR - một công cụ góp phần nâng cao
sự an toàn truyền máu
i Đặt vấn đề
Viêm gan do virus là một trong những
bệnh gây lây nhiễm cao và nguy hiểm cho
sức khoẻ các cộng đồng dân cư trên toàn
thế giới Có nhiều loại virus gây viêm gan
đã được phát hiện: HAV, HBV, HCV, HDV,
HEV, HGV Tỷ lệ mang HBsAg(+) của các
cộng đồng thuộc các châu lục, các vùng
địa lý rất khác nhau: Các nước châu Âu có
tỷ lệ thấp nhất, trung bình ở các nước châu
Mỹ, cao ở một số nước châu á, châu Phi,
rất cao ở thổ dân úc [2] Sự lây nhiễm
HBV, HCV từ người này sang người khác,
chủ yếu qua đường máu Những người bị
nhiễm HBV có thể bị viêm gan cấp, có thể
bị viêm gan mạn dẫn đến hậu hoạ xơ gan,
ung thư gan Những người bị viêm gan
mạn có nguy cơ bị ung thư gan tiên phát
rất cao, gấp 200 lần những người bình
thường [2,3] Nước ta nằm trong khu vực
lưu hành dịch địa phương cao, tỷ lệ người
mang HBsAg(+): 10-20% tuỳ theo nghề
nghiệp, đời sống sinh hoạt [3]
Cũng như các virus khác, HBV có nhiều
loại kháng nguyên khác nhau
Kháng nguyên bề mặt (HBsAg): là loại kháng nguyên được tổng hợp nhiều nhất trong số các kháng nguyên của HBV, xuất hiện sớm ở trong máu người bị nhiễm (có thể sau 6 ngày bị nhiễm), tăng dần và biến mất sau 4-8 tuần lễ từ khi có triệu chứng lâm sàng Nếu sau 6 tháng mà HBsAg vẫn dương tính thì có nguy cơ bị nhiễm HBV mạn tính Đa số các kỹ thuật xét nghiệm HBsAg hiện nay thường chỉ phát hiện được
từ tuần lễ thứ 4 đến tuần lễ thứ 8 [2]
Kháng nguyên lõi (HBcAg) có trong nhân tế bào gan bị nhiễm virus, kháng nguyên này không xuất hiện trong máu Kháng nguyên vỏ (HBeAg) xuất hiện sau HBsAg Vừa có HBsAg (+) vừa có HBeAg (+) là các đối tượng chủ yếu gây lây nhiễm mạnh nhất vì HBeAg là dấu hiệu của virus đang nhân lên
Trong các đường lây nhiễm HBV thì lây nhiễm qua truyền máu và các sản phẩm của máu đã và đang được cộng đồng hết sức quan tâm bởi lẽ nhu cầu về máu và sản phẩm của máu vừa ngày càng tăng
Trang 2cao trong điều trị vừa là môi trường rất dễ
bị nhiễm virus An toàn truyền máu càng
cao thì phòng tránh các bệnh lây nhiễm
nói chung và lây nhiễm HBV nói riêng
càng hiệu quả [4,8]
Các kỹ thuật xét nghiệm tiên tiến có độ
chính xác cao như ELISA, RIA chỉ phát
hiện được các kháng nguyên, kháng thể
chống HBV trong máu của người nhiễm
Sau khi xâm nhập, HBV phải có một thời
gian sinh sôi phát triển, phải có một
khoảng thời gian nhất định thì lượng kháng
nguyên phóng thích vào máu mới đủ để
các kỹ thuật tiên tiến ở trên phát hiện được
Mặt khác sau khi bị nhiễm cơ thể cũng
phải có một thời gian mới đáp ứng tạo
được một lượng kháng thể nhất định Giai
đoạn chưa có đáp ứng miễn dịch thường
kéo dài từ 2-26 tuần (gọi là giai đoạn cửa
sổ) Trong giai đoạn chưa có triệu chứng
lâm sàng, chưa có đáp ứng miễn dịch, việc
phát hiện sự có mặt của HBV rất khó khăn
Kỹ thuật PCR (polymerase chain
reaction) của Karry Mullis là một phát kiến
quan trọng của sinh học phân tử giúp phát
hiện các genom của các virus, có nghĩa là
phát hiện được sự có mặt của chúng kể cả
khi chúng không hoặc chưa gây hại gì
Mục tiêu:
- Dùng kỹ thuật PCR để phát hiện
genom virus viêm gan B trong huyết thanh
- Phát hiện DNA HBV trong huyết thanh của các đối tượng cho máu
ii Đối tượng, phương pháp nghiên cứu
1 Đối tượng nghiên cứu:
- Hoàn chỉnh kỹ thuật: 30 mẫu huyết thanh có HBsAg(+) và 30 mẫu huyết thanh
có HBsAg(-) (kỹ thuật ELISA)
- Đối tượng nghiên cứu: 73 mẫu huyết thanh có HBsAg(-) của các đối tượng cho máu (HIV-, HBV-, HCV-), trong số 73 mẫu huyết thanh này có 52 mẫu của các đối tượng cho máu nhân đạo, 21 mẫu của các
đối tượng đến khám sức khoẻ để cho máu tại Viện Huyết học Truyền máu trung ương
2 Phương pháp, kỹ thuật nghiên cứu:
- Lấy máu tách huyết thanh
- Chiết tách DNA từ huyết thanh bằng phương pháp Ethanol/ Chloroform và Boom
- Tiến hành phản ứng PCR trên máy của hãng Perkin Elmer với Primer của hãng Takara Nhật Bản có trình tự nucleotid:
C1 sense, 21 mer 5' CCT CCA AGT TGT GCC TTG GG3' (nt 1741-1760) C2 antisense, 21 mer
3' CGT GAG TCC GTT CGA TAA GA5' (nt 1932-1951)
- Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di
trên thạch Agarose 1,5% có Ethilium
bromide Marker 100, 200, 300, 400 và
500 nm
iii Kết quả
Tất cả các mẫu huyết thanh đều tuần tự tiến hành theo các bước: chiết tách DNA
Trang 3pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng
260nm, 280nm, tiến hành phản ứng PCR,
kiểm tra xác định PCR bằng điện di trên
thạch Agarose
1 Phát hiện DNA HBV ở 30 mẫu
huyết thanh có HBsAg(+)
Bảng 1: PCR phát hiện DNA trong
huyết thanh các đối tượng HBsAg(+)
PCR
n DNA HBV (+) DNA HBV (-)
Nhận xét: cả 30 trường hợp HBsAg(+)
đều phát hiện được DNA HBV
2 Phát hiện DNA HBV ở các mẫu
huyết thanh có HBsAg(-)
2.1 Kết quả phát hiện DNA HBV
Bảng 2: PCR phát hiện DNA trong huyết thanh các đối tượng có HBsAg(-)
PCR
n DNA HBV (+) DNA HBV (-)
30 1 29
Nhận xét: 30 mẫu huyết thanh này là của người đến khám sức khoẻ tại Viện Huyết học Truyền máu TW có HBsAg(-) với ELISA 01 trường hợp có DNA HBV (+) Trường hợp này được kiểm tra lần 2 vẫn cho kết quả DNA HBV (+) mặc dầu chưa
có biểu hiện gì về lâm sàng
2.2 Kết quả kiểm tra PCR bằng điện di trên thạnh Agarose
100 nm
200 nm
300 nm
400 nm
500 nm
A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 29 30 M
ảnh 1: Điện di kiểm tra DNA HBV
Chú thích: A: Mẫu chứng âm tính B: Mẫu chứng dương tính
Mẫu dương tính: 12
Mẫu âm tính: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30
Mẫu M: Marker
Trang 43 Kết quả PCR phát hiện DNA của 73
mẫu huyết thanh nghiên cứu
Bảng 3: Kết quả PCR DNA HBV
DNA HBV
(-)
DNA HBV (+)
Tổng số
Nhận xét: Trong số 73 mẫu huyết thanh
HBsAg(-) với ELISA thì có 72 mẫu cho kết
quả DNA HBV (-), 1 trường hợp có DNA
HBV (+): 1/73 Trường hợp có DNA HBV
(+) là một trong số các đối tượng đến khám
sức khoẻ để cho máu Tất cả các trường
hợp đến hiến máu nhân đạo (52) đều cho
kết quả DNA HBV (-)
iv Bàn luận
PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử
có độ chính xác cao để phát hiện genom
của virus HBV, nghĩa là phát hiện được sự
có mặt của virus ở người bị nhiễm mặc dầu
lúc đó chưa có các kháng nguyên hoặc
kháng thể chống lại HBV trong máu
[1,6,7] Một số nước tiên tiến trên thế giới
đã sử dụng kỹ thuật PCR thường quy trong
sàng lọc HIV, HBV, HCV như Đức, Mỹ,
Nhật, do đó họ đã hạ thấp được tỷ lệ viêm
gan do truyền máu một cách rõ rệt [9]
Các bệnh lây nhiễm qua máu và các
sản phẩm của máu đã được nhiều tác giả
nghiên cứu Công tác sàng lọc để đảm bảo
an toàn truyền máu luôn được đặt ra cho
ngành [4]
Hiện nay các trung tâm truyền máu của
nước ta đã tiến hành sàng lọc máu bằng
kỹ thuật ELISA, chỉ một vài cơ sở sử dụng
kỹ thuật PCR với tính chất nghiên cứu
Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật PCR để phát
hiện DNA HBV ở những người cho máu đã
phát hiện được 1 trong 73 trường hợp
1/73 mẫu của các đối tượng đến khám sức khoẻ để cho máu nhưng cũng phần nào nói lên được vai trò của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện HBV Có thể nói PCR là một công cụ góp phần tăng khả năng sàng lọc, hạ thấp thêm bệnh viêm gan do truyền máu Tuy nhiên, kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật cao nên giá thành còn đắt hơn so với ELISA
v Kết luận
- PCR là kỹ thuật có giá trị phát hiện
được sự có mặt của HBV trong thời kỳ mà cơ thể chưa có đáp ứng miễn dịch
- Đã phát hiện được một trường hợp có DNA HBV (+) trong 73 trường hợp của những người hiến máu nhân đạo và đến khám sức khỏe để cho máu có HBsAg(-)
Tài liệu tham khảo
1 Vũ Triệu An (1995) “Một kỹ thuật y sinh học hiện đại: phương pháp PCR” Thông tin Y học: tập 3, số 7: 10-12
2 Nguyễn Thị Kim Liên (2000) “ý nghĩa lâm sàng và tiên lượng viêm gan virus B dựa vào một số thông số miễn dịch” Luận
án Tiến sĩ Y học - Đại học Y Hà Nội
3 Nguyễn Thị Nga (1995) “Góp phần nghiên cứu tỷ lệ mang HBsAg trên một số nhóm người, mối liên quan với an toàn truyền máu và ung thư gan” Luận án Tiến
sĩ Y học - Đại học Y Hà Nội
4 Đỗ Trung Phấn (1995) “Cung cấp máu và an toàn truyền máu: hai nhiệm vụ khẩn thiết hiện nay” Y học Việt Nam: Số
9, 15-18
5 Carman-WF, Van-Deusen-FJ, Mimmis-LT (1997) “The prevalence of surface antigen variants of hepatitis B virus
Trang 5in Papua New Guine, South Africa and
Sardinia”
6 Gomes-Sa, Yoshida-CF, Niel-C
(1996) “Detection of hepatitis B virus DNA
in hepatitis B surface antigen conditions”
Acta-Virol June, 40(3), 8-133
7 Huo-TI, et al (1996) “Polemerase
chain reaction analysis for viral nucleic
acids in acute sporadic hepatitis patients
negative for serum hepatitis B surface
antigen and antibodies to hepatitis C
virus” Chung-Hua-I-Hsueh-Tsa-Chih-Taipei December: 58(6): 379-384
8 Koerner-K, et al (1998) “Estimated risk of transmission of hepatitis C virus by blood transfusion” Vox Sang, 74: 213-216
9 Shottsted-V, et al (1997) “Routine PCR screening for HBV, HCV and HIV-I genome in a large blood donation services: experiences and initial results” Beitr-infusion-Tranfusionmed 34: 22-27
Summary
HBV Detection in serum of blood donors by PCR
Well-screening blood and blood products helps reduce the ratio of blood-transmitted diseases such as HIV, HBV, HCV, etc In developed countries, molecular biology techniques have become routine screening tests in laboratories using blood and blood products
Using PCR, we have found that one out of 73 cases (HBsAg(-)) having health checks and donating blood at the National Institute of Hematology and Blood Transfusion has DNA HBV(+) This number is small but it can still demonstrate the value of PCR, a tool contributing to enhance blood transfusion safety
