Sự sao chép Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở mô ung thư vú doc

SỰ SAO CHÉP HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN HIP Ở MÔ UNG THƯ VÚ Phan Tôn Hoàng 1 , Tạ Thành Văn 2 1 Khoa Hóa sinh - Bệnh Viện Bạch Mai 2 Bộ môn Hóa - Hóa sinh - Trường Đại học Y Hà Nộ

SỰ SAO CHÉP HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN

(HIP) Ở MÔ UNG THƯ VÚ

Phan Tôn Hoàng 1 , Tạ Thành Văn 2

1 Khoa Hóa sinh - Bệnh Viện Bạch Mai

2 Bộ môn Hóa - Hóa sinh - Trường Đại học Y Hà Nội

t

I

Heparansulfat Interacting Pro ein (HIP) được tổng hợp với nhiều mức độ khác nhau ở các dòng tế bào

và mô đặc biệt ở dòng tế bào ung thư Điều đó cho phép chúng tôi đưa ra giả thiết: HIP được tăng cường

ổng hợp ở cả mức độ mRNA và pro ein tại mô ung thư vú Mục tiêu: Thiết kế mồi HIP và đánh giá mức

độ sao chép (mRNA) của HIP ở mô ung thư vú đối chiếu kết quả của các phương pháp xét nghiệm cận lâm

sàng khác Phương pháp: Tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA và khuếch đại gen mã hóa H P sử dụng mồi đặc hiệu Kết quả: Mồi HIP đã khuếch đại đặc hiệu gen mã hóa HIP mRNA của HIP được sao

chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú trong khi không phát hiện được ở mô u xơ Kết quả xét

nghiệm sinh học phân tử này tương ứng với các kết quả xét nghiệm XQ và tế bào học Kết luận: Mồi HIP

do chúng tôi thiết kế đã khuếch đại thành công gen mã hóa HIP và sự sao chép mRNA của HIP được tăng cường trong mô ung thư vú

Từ khóa: HIP/L29; ung thư vú; RNA thông tin

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Các protein gắn ái lực với heparin/heparansulfat

trên bề mặt màng tham gia điều hòa nhiều chức

năng quan trọng của tế bào như: phát triển, biệt

hóa và di căn [1] Năm 1996, Liu và cộng sự lần

đầu tiên đã tổng hợp được chuỗi ADN bổ sung

(cDNA) của heparansulfat interacting protein (HIP)

nhờ kỹ thuật sao chép ngược (RT - PCR) sử dụng

các cặp mồi được thiết kế từ trình tự mã hoá acid

amine của các phân đoạn HIP [6] cDNA của HIP

mã hoá phân tử protein có chiều dài 159 acid amin

với trọng lượng phân tử vào khoảng 18kDa, pI là

11,75 Sử dụng kỹ thuật Northern blot, các tác giả

đã xác định mRNA của HIP có chiều dài là 1,3kb

[6] Năm 1997, cũng chính nhóm các tác giả này đã

xây dựng mô hình nghiên cứu thực nghiệm in vitro

để nghiên cứu chức năng sinh học của HIP như: (1)

Tham gia quá trình liên kết tế bào - tế bào; (2) Gắn

đặc hiệu và chọn lọc với Heparin/Heparansulfate

(HP/HS) và (3) Tham gia điều hoà quá trình đông

máu HIP còn có khả năng tham gia quá trình điều

hoà liên kết tế bào - tế bào để thông qua đó tác

động đến quá trình di căn

HIP được tổng hợp ở nhiều mức độ khác nhau

tuỳ thuộc vào từng dòng tế bào cũng như từng

loại mô Các kết quả nghiên cứu cho thấy HIP

được tổng hợp nhiều ở các dòng tế bào nội mạc,

biểu mô, trong khi không phát hiện được ở dòng

tế bào sợi và tổ chức liên kết [6] Với việc sử dụng

dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại của bệnh nhân ghép tạng sử dụng cyclosporin A (CsA) trong mô hình nghiên cứu thực nghiệm in vitro, Tạ Thành Văn và cộng sự cho thấy HIP có khả năng điều hoà sự lưu trữ và giải phóng yếu tố phát triển

tế bào để thông qua đó tham gia vào quá trình điều hoà sự phát triển và biệt hoá của tế bào [2,

3, 7] Wang Y và cộng sự (1999) đã chỉ ra rằng mHIP và HIP protein được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư đại tràng Đồng thời sự tăng cường tổng hợp này tuỳ thuộc vào các giai đoạn phát triển và biệt hoá của khối u [8] Sự khác biệt về mức độ tổng hợp HIP đã cho phép tác giả đề nghị một khả năng là dùng HIP như là một dấu ấn đánh giá mức độ phát triển bất thường của

tế bào trong giai đoạn tiền ung thư đại tràng Cũng trong thời gian này nhóm các tác giả người ý cũng đã phát hiện ra rằng cả gen mã hoá HIP và HIP protein cũng được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư tuyến giáp trạng Lượng mARN và HIP protein đều được xác định là phụ thuộc vào quá trình phát triển và biệt hoá của

tế bào ung thư giáp trạng [4] Carson D và cộng

sự, tác giả của việc phát hiện ra HIP đã công bố:

Sự tổng hợp của HIP liên quan đến các dòng tế bào ung thư vú người đặc biệt là các dòng tế bào

có độ ác tính và di căn cao [5]

Cho đến nay, hầu hết các kết quả nghiên cứu đều chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở một số dòng tế bào và mô ung thư ở cả

mức độ mARN và protein Hơn nữa, mức độ thể

hiện HIP phụ thuộc vào giai đoạn phát triển và biệt

hoá của tế bào ung thư Điều đó cho phép chúng

tôi đưa ra giả thiết rằng HIP có thể được sử dụng

như là một dấu ấn để đánh giá mức độ phát triển

biệt hoá của một số dòng tế bào giúp cho việc

chẩn đoán sớm một số loại hình ung thư Chính vì

vậy công trình nghiên cứu này được tiến hành với

mục tiêu:

1 Thiết kế mồi HIP, xác định mức độ sao

chép (mRNA) của HIP ở mô ung thư vú sử

dụng kỹ thuật sao chép ngược (RT - PCR)

2 Đối chiếu kết quả mRNA của HIP với

các kết quả xét nghiệm cận lâm sàng: XQ và

tế bào học.

II ĐỐI TƯỢNG, HOÁ CHẤT VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu và tiêu chuẩn

chọn bệnh nhân

Gồm 3 trường hợp bị ung thư vú giai đoạn 3 đã

được chẩn đoán xác định của lâm sàng, cận lâm

sàng (mô bệnh học, XQ, hoá sinh) tại bệnh viện K

Trung ương Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: bệnh

nhân chỉ bị ung thư vú, không mắc bất kỳ loại hình

bệnh tật, ung thư nào khác

2 Hoá chất

Các hoá chất tách chiết RNA tổng số gồm:

Isogen, chloroform, isopropanol, ethanol, diethyl

-pyrocarbonat (DEPC) được mua từ Walko Các hoá

chất dùng để tổng hợp cDNA như random primer,

dNTP 10mM, PCR 5x buffer, dithionthritol 0,1M

(DTT), Moloney Murine Leukemia Virus - Reverse

Trancriptase (MMLV - RT), RNase out, được mua

từ Invitrogen Cặp mồi để khuếch đại gen HIP và

GAPDH được mua từ Invitrogen

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Lấy mẫu và tách chiết RNA tổng số

- Lấy mẫu: Ngay sau khi bệnh nhân được phẫu

thuật cắt bỏ khối u, bệnh phẩm được chuyển đến

khoa Giải phẫu bệnh, làm chẩn đoán mô bệnh học

xác định ung thư trong khoảng thời gian 30 - 45

phút Mẫu được lấy vào lọ vô trùng, bảo quản ở

-800C

- Tách chiết RNA tổng số: nghiền 120 - 150 mg

bệnh phẩm với 1ml Isogen để trong cối sứ tạo

thành hỗn hợp dịch đồng nhất Dịch nghiền sau đó

được chuyển sang ống eppendorf để ở nhiệt độ phòng 5 phút, ly tâm ở 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, loại bỏ lớp lipít trên cùng, lấy phần dung dịch Thêm 0,2ml chloroform, lắc nhẹ nhàng

15 giây Tủa DNA sẽ xuất hiện, để ở nhiệt độ phòng 2 - 3 phút, ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, hút lấy phần dung dịch trên cùng Phần dung dịch này chứa RNA tổng số và được chuyển sang ống Eppendorf khác Thêm 0,5ml Isopropanol, lắc nhẹ nhàng 15 giây, để yên ở nhiệt

độ phòng 5 - 10 phút Tủa RNA xuất hiện, ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút Giữ lại phần cặn ở đáy ống, loại bỏ phần dung dịch Rửa tủa bằng ethanol 75%, ly tâm thu hồi tủa và hoàn tan bằng 20µl nước cất có DEPC (DEPC - water), thu được dung dịch RNA tổng số và bảo quản ở -70oC

3.2 Kỹ thuật tổng hợp ngược cDNA (RT-PCR)

cDNA được tổng hợp từ RNA tổng số với sự tham gia của enzym sao mã ngược MMLv - RT, mồi ngẫu nhiên (Random Primer) được pha loãng

20 lần, dNTP 10mM, DTT 0,1M, enzym ức chế phân huỷ RNA (RNAase out), PCR 5x buffer và nước cất dùng cho PCR có DEPC

- Tiến hành: Cho vào 1 ống eppendorf sạch: RNA tổng số: 5 µg

DEPC - water: 1 µl Trộn nhẹ nhàng, ủ 65oC trong 5 phút, trong đá lạnh 1 phút sau đó thêm:

Random primer: 2 µl dNTP 10mM: 5 µl

Để ở nhiệt độ phòng 10 phút, trong đá lạnh 1 phút sau đó thêm:

PCR 5X buffer: 4 µl DTT 0,1M: 1 µl RNAase out: 1 µl MMLV-RT: 1 µl Tổng thể tích phản ứng là: 20µl Quy trình nhiệt độ cần thiết cho quá trình tổng hợp cDNA trên máy PCR như sau: 370C: 55 phút; 700C: 15 phút và 40C để bảo quản tạm thời, và sản phẩm cDNA được bảo quản dài ngày ở -20oC

3.3 PCR khuếch đại gen mã hóa HIP ở

mô ung thư vú

Sau khi tổng hợp xong cDNA, gen mã hóa

GAPDH được sử dụng như là chất nội chuẩn để

đánh giá chất lượng sản phẩm cDNA và làm thước

đo chuẩn cho nồng độ cDNA sẽ được dùng trong

phản ứng PCR để khuếch đại gen mã hóa HIP Chu

trình nhiệt độ của phản ứng PCR như sau: 940C

trong 5 phút; 940C trong 30 giây; 550C trong 20

giây; 720C trong 20 giây; 720C trong 5 phút và với

35 chu kỳ Sản phẩm sau phản ứng PCR được điện

di trên gel agrose 1,5%, sử dụng Hae III làm

marker chuẩn

Nồng độ cDNA cho phản ứng khuếch đại gen

mã hóa HIP sẽ được ước định đảm bảo cho nồng

độ gen GAPDH trong mỗi mẫu thử tương đương

nhau dựa vào đậm độ của vạch điện di GAPDH của

mỗi mẫu thử Mồi HIP được thiết kế có trình tự

như sau: Mồi xuôi: 5' GCT TAT GGT GCA GAC ATG

G 3', và mồi ngược: 5' CGA AGT CTC ATC TAT AGA

GAC 5' Với cặp mồi này đoạn gen của HIP với

chiều dài 420 bp sẽ được khuếch đại Nhiệt độ gắn

mồi (Tm) của HIP được xác định trong khoảng

580C - 600C và chu kỳ (35 chu kỳ) nhiệt của phản ứng PCR là: 940C trong 5 phút; 940C trong 30 giây; 580C trong 20 giây; 720C trong 20 giây; 720C trong 5 phút; và 40C để bảo quản tạm thời Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5 sử dụng Hae III làm macker chuẩn

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Kết quả chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng

Bệnh nhân được thăm khám lâm sàng xác định kích thước khối u, tính chất khối u, sau đó được chỉ định làm xét nghiệm thông thường về hoá sinh máu và nước tiểu nhằm phát hiện các bệnh phối hợp khác Các kết quả xét nghiệm máu và nước tiểu đều bình thường cho thấy những bệnh nhân trong nghiên cứu này không mắc những bệnh lý khác Trong khi đó kết quả chẩn đoán giải phẫu bệnh cho thấy trong số 3 trường hợp có 1 trường hợp ung thư biểu mô tuyến và hai trường hợp ung thư biểu mô ống (hình 1) Hình ảnh XQ khẳng định

cả ba trường hợp ung thư đều ở giai đoạn 3 với các dấu hiệu xâm lấn mô xung quanh (chưa xâm lấn da) kèm theo hiện tượng vôi hóa (hình 2)

(A) (B) Hình 1 Hình ảnh tế bào học của ung thư vú

Ung thư biểu mô thể ống xâm nhập (A) và ung thư biểu mô tuyến di căn hạch (B), hình ảnh phóng đại

100 lần

(A) (B)

Hình 2 Hình ảnh XQ của ung thư vú

Khối u có đường kính lớn hơn 5 cm, ranh giới không rõ ràng, xâm lấn các tổ chức xung quanh kèm

theo vôi hoá ác tính (A và B)

2 Đánh giá sản phẩm quá trình sao chép

(mRNA) của HIP ở mô ung thư vú

Gen mã hóa GAPDH được khuếch đại và được

sử dụng như là chất nội chuẩn để đánh giá chất

lượng sản phẩm cDNA và làm căn cứ để tính nồng

độ cDNA sẽ được dùng trong phản ứng PCR để

khuếch đại gen mã hóa HIP Trọng lượng phân tử

của sản phẩm khuếch đại GAPDH khoảng 350 bp

cho thấy việc tách chiết RNA tổng số từ mô ung

thư vú và kỹ thuật RT - PCR thành công cho kết

quả tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng khuếch

đại gen mã hóa HIP ở phản ứng tiếp theo (hình3)

Hình 3 Kết quả PCR khuếch đại gen mã

hóa GAPDH

Gen mã hóa GAPDH được sử dụng như một

gen nội chuẩn Kết quả cho thấy sản phẩm cDNA

ốt, đảm bảo cho phản ứng khuếch đại gen mã

hóa HIP 1, mẫu bệnh phẩm u xơ vú; 2 - 4 mẫu

bệnh phẩm ung thư; và 5, nước cất

t

,

Nồng độ cDNA trong phản ứng khuếch đại gen

mã hóa HIP sẽ được ước định đảm bảo cDNA mã

hóa GAPDH trong mỗi mẫu thử phải tương đương

nhau Kết quả cho thấy mRNA của HIP được tăng

cường sao chép (giếng 1 - 6) ở mô ung thư vú

trong khi không phát hiện được ở mẫu bệnh phẩm

u xơ (giếng 7 và 8), (hình 4)

Hình 4 Kết quả điện di sản phẩm PCR sử

dụng mồi HIP

T, nước cất; M, marker chuẩn; 1 và 2; 3 và 4;

5 và 6 là mẫu ung thư vú với nồng độ cDNA: 1 và 1,5µl 7 và 8 là mẫu cDNA của mô u xơ cũng ở hai nồng độ 1 và 1,5µl Mũi tên chỉ là gen HIP

IV BÀN LUẬN

Ung thư vú phát sinh từ các tế bào biểu mô của các ống tuyến vú (sinh sữa và dẫn sữa) là chủ yếu Ung thư vú liên quan chặt chẽ với các tuyến nội tiết nên được gọi là bệnh phụ thuộc nội tiết Nguyên nhân chính gây ra ung thư vú hiện nay chưa được khẳng định Để chẩn đoán và phát hiện ung thư vú nhiều phương pháp và các kỹ thuật đã

và đang áp dụng trong đó phải kể đến: thăm khám lâm sàng, chẩn đoán mô bệnh học, chẩn đoán hình ảnh và chẩn đoán hoá sinh

Ngày nay các kỹ thuật chẩn đoán gen đang được nghiên cứu áp dụng trong ung thư Các kỹ thuật chẩn đoán gen không chỉ giới hạn ở việc xác định sự có mặt các gen gây ung thư mà còn xác định sự biến đổi bất thường của quá trình sao chép các gen đích cụ thể Chính sự thay đổi bất thường này là biểu hiện rối loạn sớm nhất của quá trình bệnh lý học ung thư trước khi thể hiện ra ở mức độ tế bào để có thể chẩn đoán được bằng các

kỹ thuật tế bào học Chính vì vậy, các kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử có tác dụng phát hiện sớm, chính xác bệnh lý ung thư để có thể áp dụng những biện pháp điều trị can thiệp sớm nhất và hiệu quả

Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy HIP là một protein màng gắn đặc hiệu với HS thông qua

đó tham gia điều hòa các quá trình lưu giữ, giải phóng các protease và yếu tố phát triển tế bào HIP chỉ được tổng hợp ở các dòng tế bào nội mạc biểu mô mà không phát hiện thấy ở các dòng tế bào sợi và tổ chức liên kết Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng 3 mẫu mô ung thư vú ở giai đoạn 3 và 1 mẫu u xơ để đối chứng Kết quả xét nghiệm hóa sinh máu và nước tiểu giúp loại trừ một số trường hợp bệnh lý khác RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu mô tươi theo một quy trình chuẩn và sau đó sử dụng để tổng hợp cDNA Kết quả PCR sử dụng mồi GAPDH đã khuếch đại thành công đoạn gen mã hoá GAPDH có chiều dài

350 bp cho thấy sản phẩm cDNA thu được tốt và

có thể sử dụng để đánh giá mức độ sao chép của HIP Trong phản ứng khuếch đại gen mã hóa HIP, lượng cDNA được ước định sao cho gen mã hóa

GAPDH phải được tương đương nhau đối với tất cả

các mẫu ung thư và u xơ Sử dụng mồi HIP do

nhóm chúng tôi thiết kế, gen mã hóa HIP đã được

khuếch đại thành công và đặc hiệu Kết quả cho

thấy mRNA của HIP được tăng cường tổng hợp ở

cả 3 mẫu mô ung thư vú trong khi không phát

hiện được ở mô u xơ Kết quả này tương ứng với

các kết quả thăm khám lâm sàng và cận lâm sàng

Hình ảnh XQ khẳng định đây là các trường hợp

ung thư ác tính, ranh giới không rõ, có biểu hiện

xâm lấn và vôi hóa Kết quả chẩn đoán tế bào học

cho thấy đây là các trường hợp ung thư biểu mô

tuyến và biểu mô thể ống Phát hiện này phù hợp

với các kết quả nghiên cứu của tác giả nước ngoài

trong đó mức độ sao chép mRNA của HIP phụ

thuộc vào từng dòng tế bào và mức độ ác tính của

chúng Kết quả nghiên cứu bước đầu này cho phép

chúng tôi đi sâu hơn nữa nhằm khẳng định mRNA

của HIP đặc hiệu với mô ung thư vú và mức độ

sao chép phụ thuộc vào từng giai đoạn phát triển

của khối u Hướng nghiên cứu này có ý nghĩa thực

tiễn vô cùng quan trọng bởi hai lý do: (1) Phát

triển phương pháp chẩn đoán sớm ung thư vú nhờ

kỹ thuật sinh học phân tử; (2) Tạo kháng thể

kháng HIP nhằm ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn

dịch hàng loạt (Tissue Array) để chẩn đoán sàng

lọc nhanh, hàng loạt cho các mô sinh thiết vú góp

phần chẩn đoán sớm ung thư bởi lẽ sự thay đổi về

gen và protein bao giờ cũng là sự thay đổi sớm

nhất trước khi xuất hiện sự thay đổi hình thái tế

bào

V KẾT LUẬN

Những kết quả thu được từ nghiên cứu cho

chúng tôi rút ra kết luận:

1 Tách chiết RNA tổng số từ mô ung thư vú và

tổng hợp thành công cDNA

2 Thiết kế thành công mồi HIP, sử dụng mồi

HIP để xác định mức độ sao chép ở mô ung thư

vú

3 Kết quả thu được cho thấy mRNA của HIP

được tăng cường sao chép trong mô ung thư vú và

tương ứng với các kết quả XQ và tế bào học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Tạ Thành Văn (1998) Heparin: Sự

tương tác với Protein Tạp chí nghiên cứu Y học 6,

69 - 72

2 Tạ Thành Văn (2004) Phân lập và nghiên

cứu sự đáp ứng của dòng tế bào sợi từ mô lợi phì đại với bFGF và heparin Y học Việt Nam 299, 38 -

43

3 Tạ Thành Văn và M.C Farach- Carson (2004) Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng của

protein tái tổ hợp (rHIP) trên sự phát triển dòng tế bào sợi phân lập từ mô lợi phì đại Tạp chí nghiên

cứu Y học 6, 55 - 60

4 De Nigris, F., Visconti, R., Fusco, A., et

al (1998) Overexpression of the HIP gene

coding for a heparin/heparan sulfate - binding protein in human thyroid carcinomas Cancer Res

58, 4745 - 4751

5 Jacobs, A L., Julian, J A., Sahin, A A., and Carson, D D (1997)

Heparin/Heparansulfate interacting protein expression and functions in human breast cancer cells and normal breast epithelia Cancer research

57, 5148 - 5154

6 Liu S., Smith, E Scott; Julian, J.; Rohde, H.L; Karin, J Norman., and Carson,

D D (1996) cDNA Cloning and expression of

HIP, a novel cell surface heparan sulfate/heparin - binding protein of human uterine Epithelial cells and cell lines Journal of biological chemistry 271,

11817 - 11823

7 Van-Thanh, T., Carson, D.D., Farach - Carson, M.C et al (2002) Heparansulfate

interacting protein (HIP/L29) negatively regulates growth responses to basic fibroblast growth factor

in gingival fibroblasts Journal of Dental Research

81, 247 - 252

8 Wang, Y., Cheong, D., Chan, S., Chuan Hooi, S (1997) Heparin/heparan sulfate

interacting protein gene expression is up - regulated in human colorectal carcinoma and correlated with differentiation status and metastasis Cancer Res 59, 2989 - 2994

Summary

HEPARANSULFAT INTERACTING PROTEIN (HIP) TRANSCRIPT IN BREAST

CANCER TISSUES

Heparan sulfate interacting protein (HIP/L29) was first identified from a human uterine adenocarcinoma cell line HIP is expressed at different levels in a variety of human cell line and normal tissues In addition, HIP was found to be up expressed in some cancer cell lines including thyroid, breast cancer cell lines and HIP expression was tightly depended on malignant level of each cancer cell types and colon cancer cell line

and tissues Objectives: To evaluate HIP transcript in breast cancer tissue Methods: total RNA extraction and RT - PCR for HIP mRNA determination Results: HIP transcript was up regulated in breast cancer tissue and correlated with clinical data Conclusion: HIP transcript was up regulated in breast

cancer tissue This finding provides preliminary data to develop a new technique for fast screening of breast cancer as new method for early cancer diagnosis

Keywords: HIP/L29; breast cancer; transcript