Nghiên cứu quy trình sản xuất astaxanthin và β glucan để bổ sung vào thức ăn cho cá dĩa đỏ

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1 Nghiên cứu các điều kiện để nuôi cấy nấm men Rhodosporidium sp phát triển sinh khối mạnh đồng thời sinh tổng hợp nhiều astaxanthin

triển sinh khối mạnh đồng thời sinh tổng hợp nhiều astaxanthin

- Giống nấm men được bảo quản trong glycerol 50% ở -20 o C

- Chủng nấm men sau khi lấy ra được hoạt hóa trong môi trường Hansen rồi đem nhân giống bậc 1

2.1.1 Nhân giống bậc 1 trên môi trường lỏng

Nước cất vừa đủ 1 lít Đối với môi trường rắn thì bổ sung thêm agar 20 g/lít trước khi hấp vô trùng ở 121°C, áp suất 1atm, trong 20 phút

Môi trường YM broth (Yeast Malt Broth)

Nước cất vừa đủ 1 lít Đối với môi trường rắn thì bổ sung thêm agar 20g/lít trước khi hấp vô trùng ở 121°C, áp suất 1 atm, trong 20 phút

- Nuôi cấy nấm men trong 100 ml môi trường Hansen/YM lỏng, tốc độ lắc 200 vòng/phút

- Đối với các thí nghiệm khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và thành phần môi trường thì tiến hành khảo sát trên môi trường Hansen

- Đối với thí nghiệm nâng quy mô nuôi cấy thì được lắc trong 2 ngày sau đó chuyển sang nuôi cấy bậc 2 trong quy mô 2 lít và 10 lít

2.1.2 Khảo sát đường cong tăng trưởng và hàm lượng astaxanthin của chủng nấm men

2.1.2.1 Khảo sát đường cong tăng trưởng ỉ Mục đớch:

Đường cong tăng trưởng là công cụ quan trọng giúp xác định thời điểm thu sinh khối và khảo sát khả năng tích lũy astaxanthin trong tế bào vi sinh vật ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau Việc nắm bắt các giai đoạn phát triển sẽ hỗ trợ tối ưu hóa quy trình sản xuất astaxanthin.

Sự tăng trưởng của vi sinh vật được hiểu là sự gia tăng số lượng tế bào trong quần thể, với tốc độ tăng trưởng phản ánh sự phát triển của vi sinh vật trong một khoảng thời gian nhất định Mỗi quần thể vi sinh vật có những đặc trưng sinh trưởng riêng khi được nuôi cấy trong hệ thống kín dưới các điều kiện môi trường cụ thể Quá trình này thường trải qua bốn giai đoạn chính: pha tìm tàn (lag phase), pha hàm mũ (log phase), pha ổn định (stationary phase) và pha suy tàn (death phase).

Bằng cách đo độ đục của môi trường nuôi cấy vi sinh vật (OD) tại các thời điểm khác nhau và sử dụng đồ thị chuẩn của mối tương quan tuyến tính giữa giá trị OD 610nm và mật độ tế bào log (N/ml), ta có thể tính toán giá trị log (N/ml) tương ứng Từ đó, chúng ta có thể xây dựng đồ thị đường cong tăng trưởng của vi sinh vật, thể hiện sự biến thiên của giá trị log (N/ml) theo thời gian.

Nuôi cấy vi sinh trong môi trường Hansen lỏng ở nhiệt độ phòng, tiến hành đo OD 610nm hai giờ một lần Khi giá trị OD 610nm giảm xuống, điều này cho thấy tế bào đã bước vào giai đoạn suy tàn và lúc này cần dừng quá trình nuôi cấy.

Từ chỉ số OD 610nm dựa vào đường tương quan tuyến tính suy ra mật độ tế bào log (N/ml)

Vẽ đồ thị thể hiện đường cong tăng trưởng log (N/ml) bằng phần mềm Microsoft Excel 2007

2.1.2.2 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng astaxanthin trong các giai đoạn của quá trình tăng trưởng

Thí nghiệm này nhằm xác định thời điểm tối ưu để thu hoạch sinh khối bằng cách đo hàm lượng astaxanthin cao nhất trong dịch nuôi cấy.

Cấy 100 àl huyền phự nấm men vào 100 ml mụi trường (sử dụng nguồn cacbon và nguồn nitơ tối ưu cho sự phát triển và tổng hợp astaxanthin)

Nuôi cấy lắc trong điều kiện nhiệt độ, ánh sáng tự nhiên (tốc độ lắc 200 vòng/ phút)

Ly tâm thu sinh khối vào các giai đoạn sinh trưởng khác nhau (pha log, pha ổn định, pha suy tàn)

Tách chiết sắc tố từ sinh khối khô

Xác định hàm lượng astaxanthin

Các chỉ tiêu cần ghi nhận: ã Trọng lượng sinh khối khụ (g/l) ã Hàm lượng astaxanthin (àg/g sinh khối khụ) ã Hàm lượng astaxanthin (àg/l thể tớch dịch nuụi cấy)

2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tích lũy sắc tố ở nấm men

Chuẩn bị môi trường Hansen lỏng ở các độ pH khác nhau từ 3,0 - 8,0 (cách nhau 0,5 đơn vị)

Phân phối 100 ml môi trường vào các bình (thể tích 250 ml), sau đó đem hấp khử trùng ở 121 0 C, 1 atm trong 15 phút

Cấy 0,1 ml dịch nuôi cấy nấm men sau 2 ngày nuôi trong môi trường Hansen với OD 610nm = 0.3 vào mỗi bình chứa 100 ml môi trường đã khử trùng Sau đó, các bình được nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên với tốc độ lắc thích hợp.

Ly tâm thu sinh khối vào giai đoạn sinh trưởng có hàm lượng astaxanthin cao nhất (dựa vào mục 2.1.2.2)

Các chỉ tiêu cần ghi nhận: o Trọng lượng sinh khối khô (g/l) o Hàm lượng astaxanthin (àg/g sinh khối khụ) o Hàm lượng astaxanthin (àg/l thể tớch dịch nuụi cấy)

2.1.3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng glucose

Môi trường nuôi cấy bao gồm các thành phần chính như Pepton (10 g/l), MgSO4 (3-5 g/l) và KH2PO4 (3 g/l), với hàm lượng glucose được điều chỉnh từ 30 đến 70 g/l (cách nhau 5 đơn vị) và pH được tối ưu hóa Thông tin chi tiết về các thành phần này được trình bày trong mục 2.1.3.1.

Phân phối 100 ml môi trường vào các bình (thể tích 250 ml), sau đó đem hấp khử trùng ở 121 0 C, 1 atm trong 15 phút

Cấy 0,1 ml dịch nuôi cấy nấm men đã được nuôi trong môi trường Hansen ở nhiệt độ phòng với OD610nm= 0.3 vào mỗi chai chứa 100 ml môi trường đã khử trùng Sau đó, các bình nuôi cấy sẽ được lắc trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên với tốc độ lắc thích hợp.

Ly tâm thu sinh khối vào giai đoạn sinh trưởng có hàm lượng astaxanthin cao nhất (dựa vào mục 2.1.2.2)

Các chỉ tiêu cần ghi nhận:

Trọng lượng sinh khối khô (g/l)

Hàm lượng astaxanthin (àg/g sinh khối khụ)

Hàm lượng astaxanthin (àg/l thể tớch dịch nuụi cấy)

2.1.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đạm hữu cơ (Pepton)

Môi trường được sử dụng bao gồm các thành phần như KH2PO4, MgSO4 (3-5 g/l) và Glucose tối ưu Hàm lượng Pepton trong môi trường được bổ sung với mức thay đổi từ 2 - 18 g/l, cách nhau 2 đơn vị, và được điều chỉnh về pH tối ưu Chi tiết về các thông số này được xác định ở mục 2.1.2.2.

Tiến hành các bước tương tự mục 2.1.2.1

2.1.2.4 Ảnh hưởng của hai ion kim loại Magiê và Kali

Môi trường 1 bao gồm các thành phần KH2PO4 (3 g/l), glucose tối ưu, pepton tối ưu và MgSO4 (3 g/l) Môi trường 2 tương tự như môi trường 1 nhưng không có KH2PO4 Môi trường 3 cũng giống như môi trường 1 nhưng không có MgSO4 Môi trường 4 tương tự như môi trường 1 nhưng loại bỏ cả KH2PO4 và được điều chỉnh về pH tối ưu Thông tin chi tiết được xác định trong phần 2.1.3.1.

2.1.2.5 Ảnh hưởng của hàm lượng ion Magiê

Thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm KH2PO4 (3 g/l), glucose và pepton ở mức tối ưu, cùng với hàm lượng MgSO4 được điều chỉnh từ 1 đến 6 g/l, cách nhau 1 g/l pH của môi trường cũng được điều chỉnh về mức tối ưu để đảm bảo sự phát triển tốt nhất cho vi sinh vật.

2.1.2.6 Ảnh hưởng của hàm lượng ion Kali

Môi trường nuôi cấy được tối ưu hóa với các thành phần như MgSO4, glucose và pepton, đồng thời bổ sung hàm lượng KH2PO4 từ 1 đến 6 g/l, cách nhau 1 đơn vị pH của môi trường cũng được điều chỉnh về mức tối ưu để đảm bảo hiệu quả tối đa trong quá trình nuôi cấy.

2.1.4 Khảo sát quy trình nuôi cấy Rhodosporidium sp ở quy mô pilot trên môi trường rỉ đường

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu môi trường rỉ đường, một sản phẩm phụ của quá trình sản xuất đường với thành phần chứa 48-56% đường tổng cùng nhiều vitamin và khoáng chất Mục tiêu là bổ sung dinh dưỡng phù hợp cho quá trình nuôi cấy nấm men Rhodosporidium sp nhằm sinh tổng hợp và tích lũy astaxanthin Bốn chỉ tiêu được khảo sát bao gồm hàm lượng đường tổng, nồng độ urea (thay thế cho peptone), MgSO4 và KH2PO4, nhằm đánh giá ảnh hưởng của các thành phần này đến chất lượng sinh khối nấm men Chúng tôi cũng xem xét tỉ lệ bổ sung giống bậc 1, tỉ lệ pha loãng rỉ đường và dịch chiết giá đỗ, nồng độ khoáng bổ sung và thời điểm thu hoạch sinh khối nấm men.

Hình 2.1: Mô hình nuôi cấy nấm men 2 lít

Hình 2.2: Mô hình nuôi cấy nấm men 10 lít

Nội dung 2 Nghiên cứu các điều kiện để nuôi cấy vi tảo Haematococcus pluvialis

sinh tổng hợp nhiều astaxanthin ở điều kiện phòng thí nghiệm

Chủng tảo Haematococcus pluvialis, được nghiên cứu và phát triển bởi Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II tại TP Hồ Chí Minh, nổi bật với khả năng tổng hợp astaxanthin, một chất chống oxy hóa mạnh mẽ.

Astaxanthin chuẩn được sản xuất bởi Công ty DSM Nutritional Products Vietnam Ltd Hóa chất dùng cho phần phân tích vi sinh Môi trường BG11 [4], môi trường RM

Bảng 2.1: Thành phần môi trường BG11, RM, F2

Nếu là môi trường rắn thì có bổ sung thêm agar 25g/l

Khi môi trường thuận lợi, tế bào H.pluvialis phân chia nhanh chóng, nhưng khi điều kiện bất lợi xuất hiện, tế bào ngừng phân chia và bắt đầu tích lũy các hợp chất thứ cấp, với astaxanthin là hợp chất chủ yếu Để tối ưu hóa sự sinh trưởng của tế bào, các yếu tố như nhiệt độ, ánh sáng, độ thoáng khí và hàm lượng dinh dưỡng cần được duy trì ở mức tối ưu Khi chuyển sang giai đoạn kích thích tích lũy astaxanthin, các yếu tố này sẽ được điều chỉnh ra khỏi giới hạn tối ưu.

Quá trình tăng sinh vi tảo H pluvialis được thực hiện trong các chai duran

Hệ thống nuôi tảo bao gồm một lít chứa có ống dẫn khí vào và ra Khí được bơm vào sẽ đi qua hệ thống lọc bụi và syring lọc khuẩn trước khi vào môi trường nuôi tảo thông qua các ống thủy tinh đã được hấp khử trùng Để đảm bảo ánh sáng cho quá trình quang hợp, hệ thống sử dụng đèn LED với cường độ ánh sáng đạt 2,02 Klux.

Hình 2.3 Mô hình tăng sinh sinh khối H pluvialis

Dụng cụ điều chỉnh khí

Quá trình gây stress được thực hiện ở trạng thái tĩnh trong erlen 250 ml và

50 ml với thời gian chiếu sáng khác nhau tùy thuộc vào các nghiệm thức Điều kiện nuôi cấy

H pluvialis là loài vi tảo khá nhạy cảm với những thay đổi của môi trường nên trong quá trình nuôi cấy những thông số sau cần được kiểm soát chặt chẽ (bảng 2.2)

Bảng 2.2: Một số thông số ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của H.pluvialis

Cường độ ánh sáng 2 Klux

Thời gian chiếu sáng 12 giờ sáng : 12 giờ tối

Tốc độ khí Đảo đều tảo

Hàm lượng dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của H.pluvialis là thấp, do đó việc pha chế theo cách thông thường có thể dẫn đến hiện tượng kết tủa Để đảm bảo hiệu quả tối ưu cho các thí nghiệm, cần pha môi trường ở dạng stock Thể tích giống ban đầu nên được bổ sung từ 10% đến 20% so với thể tích yêu cầu.

2.2.2 Xác định đường cong sinh khối khô

Nguyên tắc Ở những môi trường khác nhau tế bào sinh trưởng ở một tốc độ khác nhau nên lượng sinh khối thu được sẽ khác nhau

- Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD 610 nm và trọng lượng sinh khối khô của tế bào (mgml)

Pha loãng dịch nuôi vi tảo trong môi trường BG11, RM, F2 sao cho độ đục ở OD 610 nm đạt giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5

Tiến hành ly tâm ở tốc độ 4500 vòng/phút trong 5 phút để thu thập sinh khối vi tảo từ từng môi trường với các giá trị OD đã nêu Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần để đảm bảo tính chính xác và lấy giá trị trung bình.

Sau khi thu được sinh khối, tiến hành sấy khô ở nhiệt độ 105 độ C trong 2 giờ cho đến khi đạt trọng lượng ổn định Quá trình này được thực hiện 3 lần và sinh khối sau sấy sẽ được cân để ghi nhận kết quả.

Tính trọng lượng sinh khối khô trên 1ml môi trường (mg/ml)

Dựng đường tương quan tuyến tính giữa các giá trị OD 610 và trọng lượng tế bào khô (mg/ml)

- Xác định đường cong sinh khối khô

Để nuôi vi tảo hiệu quả, cần thực hiện trong điều kiện tối ưu và đo OD (optical density) sau mỗi 24 giờ Khi giá trị OD giảm, quá trình nuôi sẽ dừng lại Từ giá trị OD, chúng ta có thể suy ra trọng lượng sinh khối khô thông qua đường tương quan tuyến tính Cuối cùng, hãy vẽ đồ thị biểu diễn đường cong sinh khối khô để phân tích kết quả.

2.2.3 Xác định đường cong tăng trưởng

Sự sinh trưởng của vi sinh vật diễn ra qua bốn pha chính: tiềm tàng, lũy thừa, ổn định và suy tàn Mật độ tế bào trong từng pha này có sự khác biệt rõ rệt, điều này có thể được quan sát thông qua độ hấp thu ánh sáng tại cùng một bước sóng.

- Dựng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD 610 nm và mật độ tế bào log (N/ml)

Pha loãng dịch nuôi vi tảo trong môi trường được xác định là tối ưu sao cho độ đục ở OD 610 đạt giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5

Tiến hành đếm trực tiếp tế bào vi tảo bằng buồng đếm hồng cầu ở các nồng độ tương ứng với các giá trị OD đã nêu, thực hiện hai lần để tính giá trị trung bình.

Tính số lượng tế bào trên 1ml môi trường (N/ml)

Dựng đường tương quan tuyến tính giữa các giá trị OD 610 và mật độ tế bào log (N/ml) [46]

- Xác định đường cong tăng trưởng

Nuôi vi tảo ở các điều kiện tối ưu và đo OD 610 sau mỗi 24 giờ đến khi thấy

OD giảm thì dừng Từ giá trị OD suy ra mật độ tế bào dựa vào đường tương quan tuyến tính

Vẽ đồ thị đường cong tăng trưởng log (N/ml)

2.2.4 Xác định thời điểm dừng quá trình gây stress

Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào vi tảo chuyển sang giai đoạn bào nang, bắt đầu quá trình tích lũy astaxanthin trong nhân tế bào Khi phát triển thành bào nang trưởng thành, tế bào sẽ có màu đỏ.

Sử dụng kính hiển vi để theo dõi sự thay đổi kích thước, hình thái và màu sắc trong tế bào H.pluvialis từ khi bắt đầuquá trình gây stress

Quá trình này sẽ dừng lại khi tế bào phát triển thành bào nang trưởng thành.

Nội dung 3 Nghiên cứu quy trình tách chiết astaxanthin từ Rhodosporidium sp và vi tảo Haematococcus pluvialis

và vi tảo Haematococcus pluvialis

2.3.1 Quy trình tách chiết astaxanthin từ nấm men sử dụng dung môi hữu cơ

Rửa sạch tế bào nấm men trong đệm PBS

Ly tâm, thu sinh khối sạch

Xử lý sinh khối với HCl ở nồng độ thích hợp trong 45 phút

Bổ sung dung môi tách chiết

Lắc hỗn hợp chiết liên tục ở tốc độ 200 vòng/phút trong 1 giờ, ở 30 o C

Ly tâm thu dịch nổi có chứa astaxanthin Đuổi dung môi, sấy khô chân không và thu nhận chế phẩm astaxanthin

2.3.2 Phương pháp tách chiết astaxanthin từ Haematococcus pluvialis

Thành tế bào của H pluvialis chứa 70% carbohydrate và 3% cellulose, trong đó có sự tích lũy astaxanthin bên trong DMSO, với khả năng phá vỡ thành tế bào, sẽ nâng cao hiệu quả của quá trình chiết xuất.

Các tế bào nang H.pluvialisđược xử lí với 5%KOH trong 30% methanol

(v/v) ở 70 °C trong 5 phút Sau đó ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4

27 °C, phần tủa được rửa sạchvới 2 ml nước cất và bổ sung vài giọt acid acetic để đưa pH về trung tính [45]

- Tách chiết astxanthin bằng DMSO và acetone

Phần sinh khối khôsau khi loại chlorophyll sẽ ủ trong 10ml DMSO ở 55 o C

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi chứa DMSO Thực hiện phá thành tế bào 2 lần với DMSO

Thêm vào phần tủa 5ml acetone, vortex kĩ sau đó ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi (chiết 2-3 lần đến khi phần cặn hết sắc tố)

Hòa trộn tất cả dịch chiết DMSO và acetone vào bình lắng, sau đó thêm 1 phần petrolium ether với 2 phần dịch chiết cùng 10ml nước cất Nếu sắc tố không tách pha, hãy bổ sung 5ml NaCl bão hòa Cuối cùng, thu lấy lớp petrolium ether chứa sắc tố ở phía trên.

Thêm nước vào dịch chiết sắc tố với tỉ lệ 1:1 và loại bỏ pha nước chứa acetone và DMSO Thu thập dịch chiết sắc tố trong lớp petroleum ether phía trên Lặp lại quy trình này từ 3 đến 5 lần để loại bỏ hoàn toàn DMSO và acetone.

Thêm Na2SO4 khan vào dung dịch để loại bỏ nước và thu được dịch chiết chứa sắc tố trong pha petroleum ether Sau đó, bổ sung petroleum ether cho đến khi đạt được thể tích mong muốn Cuối cùng, đo độ hấp thu của dịch chiết tại bước sóng 468nm.

2.3.3 So sánh phương pháp tách chiết bằng bột thủy tinh và DMSO

- Tách chiết bằng bột thủy tinh

Nghiền 0,005g sinh khối tảo khô đã được loại chlorophyll trong 0,01g bột thủy tinh, sau đó chiết 2 lần với acetone, ly tâm thu dịch ở 5000 vòng/phút trong 10 phút [70]

Gom chung tất cả dịch chiết acetone vào bình lóng, sau đó thêm 1 phần petrolium ether với 2 phần dịch chiết và 10ml nước cất Nếu sắc tố không tách pha, bổ sung 5ml NaCl bão hòa Cuối cùng, thu lấy petrolium ether chứa sắc tố ở phía trên.

Để loại bỏ hoàn toàn acetone trong dịch chiết sắc tố, hãy thêm nước vào dịch chiết với tỉ lệ 1:1 và loại bỏ pha nước chứa acetone và DMSO Sau đó, thu dịch chiết sắc tố từ pha petroleum ether phía trên Lặp lại quy trình này từ 3 đến 5 lần để đảm bảo acetone được loại bỏ hoàn toàn.

Thêm Na 2 SO 4 khan để loại nước, thu dịch nổi sắc tố trong pha petrolium ether Thêm petrolium ether để tất cả đạt một thể tích nhất định

Sau khi loại bỏ chlorophyll, 0,005 g sinh khối khô sẽ được tách chiết theo quy trình đã trình bày Độ hấp thu của các dịch chiết sẽ được đo tại bước sóng 468 nm.

2.3.4 Phương pháp đánh giá hàm lượng astaxanthin của Rhodosporidium sp và vi tảo Haematococcus pluvialis

2.3.4.1 Định tính astaxanthin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC)

Sau khi tách chiết sắc tố, tiến hành chạy sắc kí lớp mỏng để xác định sự có mặt của astaxanthin trong dịch chiết Cách thực hiện quy trình này bao gồm các bước cụ thể để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong việc phát hiện astaxanthin.

Bản sắc ký cần được kẻ hai đường viết chì cách đáy và đỉnh 1cm, sau đó chấm sắc tố lên một trong những đường kẻ Điểm chấm phải được thực hiện đậm và để khô tự nhiên Yêu cầu chiều dài của bản sắc ký là 10cm.

- Cho hệ dung môi acetone:hexan tỉ lệ 1:4 vào bồn sắc kí, cho bản sắc kí vào khi hệ dung môi đã bão hòa

- Lấy giấy sắc kí ra khỏi bồn khi dung môi chạy tới điểm cách đỉnh 1cm, đánh dấu mực dung môi

- Sau khi giấy khô hoàn toàn, đo khoảng cách di chuyển của số tố, tính R f của sắc tố

Kết quả phân tích sắc ký cho thấy mẫu sắc tố tách chiết được so sánh với mẫu astaxanthin thương mại từ công ty DSM Nutritional Products Vietnam Ltd.

2.3.4.2 Định tính astaxanthin bằng phương pháp quét bước sóng

Sau khi tách chiết sắc tố, quá trình quét bước sóng từ 300 nm đến 600 nm được thực hiện để xác định sự hiện diện của astaxanthin trong dịch chiết Kết quả sau đó sẽ được so sánh với bước sóng hấp thụ cực đại của astaxanthin, là 468 nm.

2.3.4.3 Định lượng astaxanthin theo công thức Kelly-Harmon (1972)

Dựa vào độ hấp thụ ở bước sóng 468 nm của dịch chiết thu được có thể tính được hàm lượng astaxanthin theo công thức sau:

X = (CT 2.2) [8,27] trong đú; X: hàm lượng astaxanthin (àg/g)

A 468 : Độ hấp thu của dịch chiết sắc tố trong dung môi ether dầu hỏa ở 468 nm

V: thể tích dịch chiết sắc tố (ml)

E 1cm: độ hấp thu dung dịch astaxanthin 1% trong dung môi PE (với cuvette 1cm)

G: trọng lượng sinh khối nấm men/tảo (g)

- Hàm lượng Astaxanthin được xác định bằng phương pháp của Kelly-Harmon (1972) hoặc phương pháp HPLC.

Nội dung 4 Nghiên cứu quy trình tách chiết b-glucan từ sinh khối nấm men

Rửa sạch tế bào tảo và nấm men trong đệm PBS, sau đó ly tâm để thu sinh khối sạch Tiếp theo, xử lý sinh khối với NaOH ở nhiệt độ cao trong 1 giờ, sau đó thêm nước lạnh để ngừng phản ứng Ly tâm thu vỏ tế bào nấm và bảo quản ở 4°C Rửa vỏ tế bào nấm nhiều lần bằng kiềm ấm để loại bỏ tạp chất, sau đó ly tâm thu b-glucan Cuối cùng, sấy khô để thu nhận chế phẩm b-glucan và thực hiện bộ kit định lượng β-glucan trong nấm (K-YBGL 04/2008).

Nội dung 5 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung astaxanthin vào thức ăn với việc tăng cường màu sắc ở cá dĩa đỏ Symphysodon sp (so sánh với sản phẩm astaxanthin thương mại)

Thí nghiệm được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của astaxanthin chiết xuất và xác định liều lượng phù hợp để bổ sung vào thức ăn cho cá dĩa đỏ Symphysodon sp Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin hữu ích cho việc cải thiện dinh dưỡng và sức khỏe của loài cá này.

Đối tượng thí nghiệm là cá dĩa đỏ Symphysodon sp., được nuôi dưỡng trong bể và lựa chọn những cá có kích thước đồng đều để tiến hành thí nghiệm Những con cá có kích thước 6 cm, tương đương với 3 tháng tuổi, được chọn lọc đảm bảo khỏe mạnh và không có dị tật.

+ Thức ăn chính cho cá dĩa đỏ: Thức ăn chế biến (tim bò 97,9%;2,1% vitamin tổng hợp) + Các test kiểm tra chất lượng nước như pH, oxy, độ cứng

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn với một yếu tố, bao gồm ba nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần Mỗi lần lặp lại sử dụng một bể kiếng chứa 30 con cá dĩa đỏ Quá trình thí nghiệm diễn ra trong điều kiện chất lượng nước được kiểm soát chặt chẽ, với pH đạt 6,5, nhiệt độ từ 28 đến 30 độ C, và độ cứng nước trong khoảng 8 đến 10 độ dH.

Bảng 2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm

A-CX Thức ăn được bổ sung astaxanthin chiết xuất (sản phẩm của đề tài) với lượng 90 mg/kg thức ăn

A-TT Thức ăn được bổ sung astaxanthin bán trên thị trường với lượng 90 mg/kg thức ăn ĐC Thức ăn không được bổ sung astaxanthin

Để bổ sung hàm lượng astaxanthin vào thức ăn cho cá, tim bò được xay nhuyễn và hòa tan sắc tố trong nước ấm (60 độ C) Sau đó, hỗn hợp được trộn đều cho đến khi có màu đỏ cam Tim bò được ép thành miếng mỏng và bảo quản ở nhiệt độ từ -5 đến 0 độ C để cá ăn dần.

Trong thí nghiệm kéo dài 90 ngày, cá được cho ăn hai lần mỗi ngày bằng thức ăn có trộn astaxanthin, với lượng thức ăn được điều chỉnh theo nhu cầu Thức ăn đối chứng bao gồm tim bò và vitamin tổng hợp Trước khi bắt đầu thí nghiệm, mẫu 30 cá được thu thập để đánh giá chỉ số màu sắc.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện 31 lần đo chỉ số màu sắc mỗi 2 tuần Sau khi kết thúc thí nghiệm, chúng tôi sẽ so sánh các kết quả thu được từ các nghiệm thức khác nhau để xác định liều bổ sung astaxanthin hiệu quả nhất cho thức ăn của cá dĩa.

Chỉ số màu sắc của cơ thịt cá hồi (SalmoFan TM) được đánh giá lần đầu tiên trước khi nuôi và sau đó được kiểm tra định kỳ mỗi 2 tuần một lần.

Hình 2.4 Quạt màu dùng so sánh màu sắc cho cơ thịt cá hồi (Diler và ctv, 2002)

+ Các chỉ tiêu chất lượng nước: Hàm lượng oxy hòa tan (mg/L), pH, nhiệt độ nước, hàm lượng amonia (mg/L), NO 2

Kết quả dự kiến đạt được là liều lượng, bổ sung hiệu quả nhất của astaxanthin vào thức ăn cho cá dĩa đỏ.

Nội dung 6 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung b-glucan vào thức ăn với việc tăng cường sức đề kháng ở cá dĩa đỏ

Thí nghiệm nhằm đánh giá hiệu quả của β-glucan và xác định được liều lượng thích hợp để bổ sung β-glucan vào thức ăn cho cá dĩa đỏ

Đối tượng thí nghiệm là cá dĩa đỏ được nuôi dưỡng trong bể, sau đó lựa chọn những cá có kích thước đồng đều để tiến hành thí nghiệm Các cá được chọn có kích thước 6 cm, tương đương với 3 tháng tuổi, đảm bảo khỏe mạnh và không có dị tật.

+ Thức ăn chính cho cá dĩa đỏ: Thức ăn chế biến (tim bò 97,9%;2,1% vitamin tổng hợp) + Các test kiểm tra chất lượng nước như pH, oxy, độ cứng

Để đánh giá ảnh hưởng của β-glucan trên cá dĩa, thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp cho ăn, với cá được nuôi trong bể kính có mật độ 30 con/bể, kích thước 1,2 x 0,6 x 0,6 m Các điều kiện chất lượng nước trong suốt quá trình thí nghiệm được duy trì ổn định, với pH = 6,5, DO = 5 – 6 mg/l, nhiệt độ từ 28 – 30 độ C và độ cứng nước là 3.

Trước khi tiến hành thử nghiệm β-glucan, cá dĩa được cho ăn thức ăn có trộn β-glucan với liều lượng tối đa là 1% Mục đích của việc này là để thực hiện thí nghiệm an toàn và xác định rằng β-glucan không gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của cá.

Thí nghiệm được thực hiện để đánh giá ảnh hưởng của β-glucan lên số lượng bạch cầu của cá dĩa, bao gồm 1 nghiệm thức đối chứng (không bổ sung β-glucan) và 3 nghiệm thức bổ sung β-glucan với liều lượng 0,1%, 0,5% và 1% trong 30 ngày Trong suốt thời gian thí nghiệm, cá được cho ăn 2 lần/ngày bằng thức ăn có trộn β-glucan Sau 30 ngày, cá ở mỗi nồng độ được chọn ngẫu nhiên để đếm số lượng bạch cầu trong máu, nhằm so sánh và đánh giá mức độ tăng cường miễn dịch.

Phương pháp đếm bạch cầu bắt đầu bằng việc lấy máu từ mang cá và pha loãng 20 lần với dung dịch đếm bạch cầu Lazarus, bao gồm acid acetic, xanh methylene và nước cất Dung dịch này giúp làm tan hồng cầu, tạo điều kiện thuận lợi cho việc quan sát dưới kính hiển vi Sau khi pha loãng, cần lắc dung dịch để làm vỡ hồng huyết cầu Cuối cùng, buồng đếm được lau sạch, thêm nước và để yên trong 3 phút cho bạch cầu lắng xuống, sau đó tiến hành đếm bằng buồng đếm Neubauer.

Số lượng bạch cầu : tổng số bạch cầu đếm được trong 4 khu vực

Sau 30 ngày cho cá ăn thức ăn có bổ sung β-glucan, cá được nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila với nồng độ 10^5 cfu/ml Phương pháp gây nhiễm này được thực hiện để nghiên cứu tác động của β-glucan trong việc tăng cường sức đề kháng của cá.

Aeromonas hydrophila được sử dụng để gây nhiễm cho cá bằng cách tiêm 0,1 ml vi khuẩn với nồng độ 10^5 cfu/ml vào bụng cá Trong khi đó, cá đối chứng được tiêm bằng nước muối sinh lý để so sánh hiệu quả nhiễm trùng.

Sau khi gây nhiễm, hai nghiệm thức được thực hiện: nghiệm thức NT1 cho cá ăn thức ăn bổ sung β-glucan, trong khi nghiệm thức NT2 cho cá ăn thức ăn bình thường không có β-glucan Tỉ lệ sống sót của cá được theo dõi trong khoảng thời gian từ 7 đến 10 ngày để kết thúc thí nghiệm, với mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần.

+ Số lượng bạch cầu và tỉ lệ sống cá thí nghiệm