NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THỰC NGHIỆM CỦA SẢN PHÂM CẤY MÔ TỪ CÂY ĐINH LĂNG POLYSCIAS FRUCTICOSA HARM. ARALIACEAE ppt

ARALIACEAE Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh *- Nguyễn Phương Dung** 1 TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu: Đánh giá tác dụng Dược lý của Đinh lăng từ phương pháp cấy mơ so với Đinh lăng từ phương

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THỰC NGHIỆM CỦA SẢN PHÂM

CẤY MƠ TỪ CÂY ĐINH LĂNG POLYSCIAS FRUCTICOSA HARM ARALIACEAE Nguyễn Trần Châu Đỗ Mai Anh *- Nguyễn Phương Dung** 1

TĨM TẮT

Mục đích nghiên cứu: Đánh giá tác dụng Dược lý của Đinh lăng từ phương pháp cấy mơ so với Đinh

lăng từ phương pháp nuơi trồng tự nhiên Chúng tơi tiến hành thử nghiệm dược lý này để phục vụ cho mục đích xây dựng một qui trình cung cấp Đinh lăng phong phú và ổn định hơn

Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm cĩ so sánh, lựa chọn ngẫu nhiên, thực hiện tại phịng thí

nghiệm Dược lý - Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược TP.HCM từ 12/2006 - 02/2007 Đánh giá tác dụng tăng lực bằng phương pháp chuột bơi Breckman, đánh giá khả năng chịu đựng stress nĩng của chuột nhắt trắng, đánh giá khả năng kháng viêm trên mơ hình gây viêm bằng formol và gây u hạt trên chuột nhắt trắng

Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, trọng lượng 20±2g, mua từ Viện Pasteur,

TP.HCM

Phương pháp đánh giá: Thời gian bơi, thời gian chịu đựng stress nĩng, thể tích chân chuột sau điều

trị, khối lượng viên gịn Amiant sau điều trị

Kết quả chính:

ƒ Tác dụng tăng lực: Thời gian bơi của chuột nhắt tăng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 95% so với lơ chứng sau

khi uống cao RDT và RTC 7 ngày

ƒ Các mẫu cao RDT và RTC đều cĩ tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột nhắt trắng ở nhiệt độ 420 C so với lơ chứng, đạt ý nghĩa thống kê ở mức 99%

ƒ Các mẫu cao RDT và RTC đều cĩ tác dụng kháng viêm so với lơ chứng đạt ý nghĩa thống kê ở mức 95%

Kết luận: Sản phẩm rễ Đinh lăng nuơi trồng nhân tạo trong 6 tháng thể hiện tác dụng tăng lực dài ngày,

chống stress nĩng và kháng viêm thực nghiệm tương tự như rễ cây Đinh lăng 5 năm tuổi trồng trong điều kiện tự nhiên.

ABSTRACT

STUDY ON SOME PHARMACOLOGICAL EFFECTS OF PRODUCTS FROM TISSUE

CULTURE OF POLYSCIAS FRUCTICOSA HARM ARALIACEAE

Nguyen Tran Chau Đo Mai Anh , Nguyen Phuong Dung et al * Y Học TP Hồ Chí Minh*

Vol.11- No- 2006: 126-130

Background and Aims.- For evaluating pharmacological effects of tissue-culture product of Polyscias

fructicosa in comparison with those from natural-culture form, we had carried out this study for the purpose

of setting up a more plentiful and stable process of supplying this medicinal plant

Study design and setting.- An experimental, randomized, controlled study was conducted in the Pharmacological Laboratory of Traditional Medicine Faculty, University of Medicine and Pharmacy in HCMC from 12/2006 to 02/2007 Evaluating physical strengthening effect with swimming test of Breckman and anti-thermal stress effect on mice Evaluating anti-inflammatory effect on mice with inflammation induced by formol and granulated proliferation by amiant

Subjects.- Swiss mice, body weight of 20 ± 2 g, purchased from Institute of Pasteur of HCMC

Outcome measures.- Swimming duration, suffering duration in thermal stress test, volume of foot and

weight of amiant cotton buds after the treatment

Results.-

ƒ Physical strengthening effect: swimming duration was significant increased after 7 days of administrating RDT and RTC extracts in comparison with control group (95%)

*,** Khoa Y Học Cổ Truyền – Đại Học Y Dược TP.HCM

126

127

ƒ Both RDT and RTC extracts have significantly prolonged survival duration of mice in thermal stress test in comparison with control group (99%)

ƒ Both RDT and RTC extracts have had anti-inflammatory effect significantly on mice in comparison with control group (95%)

Conclusion.- The product of 6-month old root of Polyscias fructicosa that grown under

artificial-culture conditions had exerted the physical strength enhancement effect, thermal stress and anti-inflammatory effects equivalent to 5-year root that grown in natural conditions

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đinh Lăng là một cây thuốc được sử dụng

lâu đời và có trong Dược điển Việt Nam

Nhiều công trinh nghiên cứu về thành phần

hóa học và tác dụng dược lý cho thấy Đinh

Lăng gần giống Nhân Sâm, đặc biệt là tác

dụng tăng lực, tăng sức đề kháng, tăng khả

năng thích nghi Một trong các nguyên nhân

khiến cho các chế phẩm chứa Đinh lăng còn

khá ít trên thị trường là do nguồn nguyên liệu

còn hạn chế, nếu trồng theo phương pháp tự

nhiên thì cần phải 3 - 5 năm mới thu hoạch rễ

Để góp phần thúc đẩy việc sử dụng Đinh

lăng trong sản xuất dược phẩm, chúng tôi đã

tiến hành nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu

mới bằng phương pháp nuôi cấy mô và thủy

canh Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi

nghiên cứu một số tác dụng dược lý thực

nghiệm của sản phẩm nuôi cấy mô từ Đinh

lăng

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là:

Nghiên cứu tác dụng tăng lực của các dịch

chiết lấy từ Đinh lăng nuôi cấy mô và thủy

canh trên chuột nhắt trắng

Nghiên cứu khả năng chịu đựng strees

nóng của các dịch chiết lấy từ Đinh lăng nuôi

cấy mô và thủy canh trên chuột nhắt trắng

Nghiên cứu tác dụng kháng viêm của các

dịch chiết lấy từ Đinh lăng nuôi cấy mô và

thủy canh trên chuột nhắt trắng

Các thực nghiệm dược lý được tiến hành

tại Labo thí nghiệm – Khoa Y học cổ truyền –

ĐH Y Dược TP HCM

PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu Thân cành mang mầm ngủ của

cây Đinh lăng do Trung tâm Sâm và Dược liệu

TP HCM cung cấp

Cây con Đinh lăng được nuôi cấy trong ống nghiệm tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh

lý Thực vật – ĐH KHTN

Mẫu nghiên cứu

ƒ RDT: Dịch chiết cồn rễ Đinh lăng được tạo

ra trong môi trường lỏng từ Callus

ƒ RTC: Dịch chiết cồn rễ Đinh lăng được tạo

ra trong môi trường thủy canh

Mẫu đối chiếu

ƒ LTN: Dịch chiết cồn lá Đinh lăng thu hái từ cây 5 năm tuổi trồng tại vườn thuốc của Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM

ƒ RTN: Dịch chiết cồn rễ Đinh lăng thu hái

từ cây 5 năm tuổi trồng tại vườn thuốc của Trung tâm Sâm và Dược liệu TPHCM

Súc vật

Chuột nhắt trắng trưởng thành, khỏe mạnh, giống đực, chủng ddY, trọng lượng trung bình

20 ± 2g, mua tại Viện Pasteur Tp HCM, nuôi trong điều kiện ổn định về chế độ dinh dưỡng

Phương pháp nghiên cứu Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu [1]

ƒ Xác định độ ẩm (DĐVN 3, Phụ lục 5.16)

ƒ Định tính Saponin bằng phản ứng hoá học, sắc ký lớp mỏng (DĐVN 3, Phụ lục 4.4)

ƒ Định lượng Saponin toàn phần bằng phương pháp cân theo phương pháp Namba [9 ]

Chuẩn bị mẫu thử

ƒ Chiết xuất các mẫu nghiên cứu và mẫu đối chiếu bằng phương pháp ngấm kiệt qua 2 phân đoạn cồn 96O và cồn 45O, bốc hơi dung môi để thu được hỗn hợp cao mềm

ƒ Liều thử nghiệm: 200mg cao mềm /kg thể trọng chuột nhắt

Nghiên cứu tác dụng dược lý

ƒ Nghiên cứu tác dụng tăng lực bằng phương pháp chuột bơi kiệt sức [6]

ƒ Nghiên cứu tác dụng chịu đựng stress

nóng trên chuột nhắt trắng ở nhiệt độ 420C ± 1

[6]

ƒ Nghiên cứu tác dụng kháng viêm bằng mô

hình gây viêm bằng formol và gây u hạt thực

nghiệm trên chuột nhắt trắng

Phương pháp xử lý thống kê kết quả thực

nghiệm [2]

Dùng chương trình MS-Excel trên máy tính

để: Loại các giá trị bất thường; Xác định các giá

trị thống kê mô tả M và S; So sánh giá trị trung

bình có dữ liệu tương ứng từng cặp “t-Test:

Paired Two Sample for Means”; So sánh giá trị

trung bình có phương sai khác nhau “t-Test:

Two Sample Assuming Unequal Variances”

Ký hiệu ý nghĩa thống kê trong các bảng

biểu :

*: Đạt ý nghĩa thống kê 95% so với lô

chứng

**: Đạt ý nghĩa thống kê 99% so với lô

chứng

#: Đạt ý nghĩa thống kê 95% so với lô

dùng dịch chiết LTN

##: Đạt ý nghĩa thống kê 99% so với lô

dùng dịch chiết LTN

$: Đạt ý nghĩa thống kê 95% so với lô

dùng dịch chiết RTN

$$: Đạt ý nghĩa thống kê 99% so với lô

dùng dịch chiết RTN

KẾT QUẢ

Tiêu chuẩn nguyên liệu

Bảng 1: Độ ẩm và hàm lượng Saponin toàn phần

trong các mẫu cao mềm

Các mẫu cao mềm đều đạt yêu cầu về độ

ẩm (không quá 20%) Khi tiến hành định tính

Saponin bằng các phản ứng tạo bọt, Salkowski,

Fontan-Kaudel Kahlenberg, Liebermann đều

cho thấy sự có mặt của các hợp chất Saponin

Triterpen trong nguyên liệu

Định tính Saponin bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng: mẫu RDT và RTC có các vết Rf

tương đồng với mẫu đối chiếu là LTN và RTN

Tác dụng tăng lực:

Bảng 2: Thời gian bơi (phút) của chuột thực

nghiệm sau khi uống các mẫu cao 60 phút và 7 ngày

Thời gian bơi (phút)

T 0 T 60 T 7ngày

P

Chứng 10 10.75

± 1.61

8.63 ± 1.95

10.13

± 1.54

P T0 - T60 < 0.05

P T0 - T7

<0.05

2.26

5.38 ± 0.75

9.38 ± 2.61

P T0 - T60 < 0.05

P T0 - T7

<0.05

2.0 7.3 ± 1.61 10.5 ± 3.21 P0.05 T0 - T60 <

P T0 - T7

<0.05 RDT 10 10.45

± 2.57 9.55 ± 1.93 12 ± 3.12 P0.05 T0 - T60 >

P T0 - T7

<0.05

2.01 6.4 ± 1.55 9.4 ± 2.07 P0.05 T0 - T60 <

P T0 - T7

<0.05

Hình 1: Thời gian bơi (phút) của các lô dùng dịch

chiết thử nghiệm

Sau 7 ngày sử dụng RDT và RTC, thời gian bơi của chuột tăng so với chứng có ý nghĩa thống kê, độ tin cậy 95%

Tỉ lệ thời gian bơi so với ban đầu

Bảng 3: Tỷ lệ thời gian bơi của chuột nhắt trắng

sau khi uống thuốc 60 phút và 7 ngày so với ban đầu

128

129

Hình 2: Tỷ lệ thời gian bơi của chuột nhắt trắng

sau khi uống thuốc 60 phút và 7 ngày so với ban

đầu

Tỷ lệ thời gian bơi sau khi uống RDT và

RTC 60 phút và 7 ngày không có sự khác biệt

thống kê so với mẫu LTN và RTN

RDT và RTC có tác dụng tăng lực so với lô

chứng dài ngày so với lô chứng có ý nghĩa

thống kê ở mức 95% Tác dụng tăng lực của

RDT và RTC không khác biệt thống kê so với

LTN và RTN

Tác dụng Anti-stress nóng

Bảng 4: Thời gian sống của chuột thực nghiệm

trong điều kiện nhiệt độ cao (42˜ 0 C ± 1)

Thời gian sống (phút) % (so với chứng)

**

131.8%

**

112.48%

Hình 3: Thời gian chịu đựng stress nóng của chuột

thực nghiệm

Các mẫu RDT và RTC đều có tác dụng kéo

dài thời gian sống của chuột thực nghiệm ở

nhiệt độ 420C, so với lô chứng đạt ý nghĩa

thống kê ở mức 99% So sánh với RTN thì thời gian sống sót của chuột uống RTD và RTC không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê

Tác dụng kháng viêm

Thời điểm

C

Ban đầu 0.73± 0.04

100%

0.76±

0.05 100%

0.76 ± 0.04 100%

0.79 ± 0.03 100%

0.0

7 ± 0.0

4 100

% Sau 1

ngày

1.21 ± 0.03 166.7%

1.14±

0.04 150.9

%

1.16 ± 0.042 152.5%

1.14 ± 0.042 144.4%

1.1

6 ± 0.0

42 160 3% Sau 2

ngày

1.27 ± 0.042 174.5%

1 ± 0.071 132.1

%

0.98 ± 0.072 127.9%

1 ± 0.087 127%

1.0

6 ± 0.0

85 145 8% Sau 3

ngày

1.17 ± 0.042 160.8%

0.91

± 0.06 120.8

%

0.89 ± 0.068 116.4%

0.95 ± 0.097 120.6%

0.9

5 ± 0.0

43 131 0% Sau 4

ngày

1.11 ± 0.07 152.9%

0.9 ± 0.05 108.8

%

0.84 ± 0.042 109.8%

0.85±

0.087 107.9%

0.8

6 ± 0.0

42 119

% Sau 5

ngày 1.07 ± 0.08*

147.1%

0.8 ± 0.05

**

105.3

%

0.81 ± 0.03 **

106.6%

0.84 ± 0.08 **

106.3%

0.7

6 ± 0.0

4 ** 107 2%

Bảng 5: Thể tích chân chuột nhắt (ml) sau khi gây

phù bằng formol

Hình 4: Mức độ giảm thể tích chân chuột nhắt sau

5 ngày điều trị so với ngày thứ nhất sau khi gây phù bằng formol

Các mẫu RDT và RTC đều có tác dụng

kháng viêm cấp so với mẫu chứng đạt ý nghĩa

thống kê ở mức 99% Mẫu RDT không có sự

khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so LTN và RTN

Trọng lượng u hạt (mg)

Lô thí

nghiệm Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Chứng 75 ± 0 29 100% 29.7 ± 0.12 100%

LTN 66 ± 0.51 ** 88.28% 28.1 ± 0.07 ** 94.61%

RTN 72 ± 0.37 ** 96.26% 28.6 ± 0.05 ** 96.29%

RDT 67 ± 0.33 ** # $ 90.11% 28.4 ± 0.05 * 95.62%

RTC 68 ± 0.32 ** # $ 90.67% 28.3 ± 0.07 * 95.32%

Bảng 6: Trọng lượng u hạt (mg) cấy dưới da lưng

chuột thực nghiệm

Hình 5: Trọng lượng của viên gòn Amiant tươi

Trọng lượng u hạt tươi của lô dùng cao

RDT và RTC đều thấp hơn lô chứng đạt ý

nghĩa thống kê ở mức 99% So với RTN, trọng

lượng u hạt của lô chuột uống RDT và RTC

giảm có ý nghĩa thống kê, độ tin cậy 95%

Hình 6: Trọng lượng của viên gòn amiant sau khi

sấy khô

RDT và RTC có tác dụng giảm khối lượng dịch rỉ viêm so với lô chứng có ý nghĩa thống

kê ở mức 95%

So với RTN và LTN, trọng lượng u hạt khô của lô uống RDT và RTC không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê

BÀN LUẬN – KẾT LUẬN

Tiêu chuẩn nguyên liệu nghiên cứu

Các mẫu RDT và RTC có các thành phần tương tự như các mẫu thu hái từ cây Đinh lăng

5 tuổi nuôi trồng bằng phương pháp tự nhiên Điều này chứng tỏ các sản phẩm thu nhận từ phương pháp nuôi cấy mô thực vật vẫn bảo toàn đặc tính ban đầu của cây ngoài tự nhiên Hàm lượng Saponin toàn phần trong mẫu RDT cao hơn 1,1% so với rễ cây tự nhiên

Tác dụng tăng lực

So với lô chứng, ở liều 200mg/kg thể trọng, RDT và RTC có tác dụng chống nhược sức và phục hồi thể lực sau khi dùng thuốc liên tục 7 ngày, đạt ý nghĩa thống kê ở mức 95% So với các mẫu cao lá và rễ tự nhiên, không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê, cho thấy mẫu RDT và RTC có tác dụng tăng lực tương tự như ở cây ngoài tự nhiên

Khả năng đáp ứng với môi trường nhiệt độ cao

RDT và RTC có tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột thí nghiệm trong môi trường nhiệt độ 420C (12,48% , 11,83%) so với lô chứng, đạt ý nghĩa thống kê ở mức 99% Khả năng đáp ứng với môi trường nhiệt độ cao của

lô chuột uống RDT và RTC tương tự với lô uống RTN

Tác dụng kháng viêm

Các mẫu cao RDT và RTC đều có tác dụng làm giảm thể tích chân chuột bị gây phù bằng formol ( 38,11% , 53,19%) so với mẫu chứng giảm ( 19,62% ) sau 5 ngày điều trị, đạt ý nghĩa thống kê ở mức 99% Chứng tỏ mẫu cao RDT

và RTC có khả năng giảm sự bài tiết dịch rỉ viêm trên mô hình gây viêm cấp

Trọng lượng u hạt tươi của lô uống RDT và RTC kém hơn lô chứng 9,89%, 9,33% đạt ý nghĩa thống kê ở mức 95% sau 10 ngày dùng

130

131

thuốc Đồng thời, không khác biệt có ý nghĩa

thống kê so với lô uống RTN

Mặc dù nuôi cấy mô trong khoảng thời

gian khá ngắn (toàn bộ quy trình mát khoảng 6

tháng), các sản phẩm nuôi cấy mô rễ cây Đinh

lăng (RDT và RTC) vẫn thể hiện tác dụng tăng

lực, chống stress và kháng viêm thực nghiệm

tương tự như cây Đinh lăng 5 năm tuổi Vì thế,

phương pháp nuôi cấy mô kết hợp với thủy

canh có nhiều triển vọng trong việc chủ động

tạo nguồn nguyên liệu Đinh lăng ổn định, đáp

ứng nhu cầu sản xuất các chế phẩm chứa Đinh

lăng ở quy mô lớn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bộ Y tế, (2002), Dược điển Việt Nam 3, NXB Y học, trang

PL-98, PL-128, PL-129

2 Công trình nghiên cứu KHYD 1983, Bộ Y Tế, 1994

3 Đặng Văn Giáp, (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng

chương trình MS-Excel, NXB Giáo dục, trang 29-63

4 Đỗ Tất Lợi 1986 Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam NXB

Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội, 268

5 Đỗ Trung Đàm, (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của

thuốc, NXB Y học, trang 11-24

6 Eun-Joo Hahn, Yun-Soo Kim, Kee-Won Yu, Cheol-Seung

Jeong, Kee-Yoeup Paek, Adventitious Root Cultures of Panax

ginseng C.V Meyer and Ginsenoside Production through

Large-Scale Bioreactor System, J Plant Biotechnology(2003) Vol

5(1) pp 16

7 Kim Y-S.; Hahn E-J.; Yeung E.C.; Paek K-Y., In Vitro Cellular

and Development Biology - Plant, Volume 39, Number 2,

March 2003, pp 245-249(5)

8 Namba,T.,Yoshizaki,M.,Tomimori, T., Kobashi, K., Mitsui,

K., and Hase,J.,(1974), Fundamental Studies on the Evaluation

of the Crude Drugs.III, Chemical and Biochemical Evaluation of

Ginseng and Related Crude Drugs, Yakugaku Zasshi, Vol 94,

No 2, , p 252-259

9 Nguyễn Ngọc Dung, (1998), Nhân giống cây Đinh lăng

(Polyscía fruticosa L Harms) thông qua con đường tạo phôi

sôma trong nuôi cấy in-vitro Tuyển tập các công trình nghiên

cứu Khoa học 1993- 1998, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, NXB

Nông nghiệp, trang 442-445

10 Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, Nguyễn Thới

Nhâm, 2001, Tác dụng dược lý cao toàn phần chiết xuất từ rễ và

lá Đinh lăng( Polyscía fruticosa L.Harms Araliacea) Công

trình nghiên cứu khoa học 1987-2000, Viện Dược Liệu, NXB

Khoa Học và Kỹ Thuật, trang 241-244

11 Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, quyển II, nhà xuất bản

Trẻ, năm 2003, trang 668

12 Tran Cong Luan et al, (2001), Screening for medical plants of

Araliaceae family which have effect of strengthening and

antistress, Proceeding of Pharma Indochina II, p 329

132